III. Material und Methoden
6. Darstellung der Membrankontakte auf immunhistologisch gefärbten Gewebeschnitten
6.1. Darstellung der Membrankontakte zwischen naiven oder memory CD4+
T-Lymphozyten mit interdigitierenden dendritischen Zellen in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe
Die Färbung und Fixierung der Präparate erfolgte nach bereits etablierter Methode (WESTERMANN et al., 1997). Die Fixierung wurde durch eine 10 minütige Inkubation (bei -20°C) in Methanol und Azeton zu gleichen Teilen vorgenommen. Anschließend erfolgte eine Spülung mit 0,05% Tween 20 in TBS. In einem ersten Schritt wurde der monoklonale Antikörper gegen das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1, 1A29) in einer Verdünnung von 1:300 (in 0,9% NaCl und 5% Rattenserum) für 30 Min auf die Objektträger aufgebracht, das sowohl von dendritischen Zellen wie auch von B-Lymphozyten exprimiert wird. Alternativ dazu wurde der monoklonale Maus-Antikörper anti-IgD in einer Verdünnung von 1:100 (in 0,9% NaCl und 5% Rattenserum) verwendet. Nach zweimaligem Waschen in PBS erfolgte eine zweite Inkubation für 30 Min mit einem Brückenantikörper
Kaninchen-anti-Maus in der Verdünnung von 1:50 (in PBS und 5% Rattenserum). Nach zweimaligem Waschen in PBS wurde der Brückenantikörper erneut für 15 Min aufgetragen und wieder abgespült. Anschließend wurde zur Wiedererkennung der injizierten Spender-T-Lymphozyten des PVG.7B Stammes der biotinylierte Antikörper His 41 (1:100, 30 Min, in PBS und 20%
Mäuseserum), gefolgt von Avidin-Peroxidase (30 Min) verwendet. Für die Anfärbung der Spenderzellen in braun wurde Diaminobenzidin eingesetzt. Die dendritischen Zellen (s.Abb.1, S. 53), beziehungsweise die B-Lymphozyten (s.Abb.4, S. 60) wurden mit dem Substrat Fast Blue in blau sichtbar gemacht. Anschließend wurden die Gewebeschnitte in 70%igem Ethanol (30 Min) fixiert und luftgetrocknet. Hämatoxylin diente in den meisten Fällen als Gegenfärbung. Die Präparate wurden mit Dako-Glycergel eingedeckelt und wie in 9.1.
beschrieben ausgewertet.
6.2. Darstellung der Membrankontakte von Effektor Lymphozyten mit IDC in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe
Die Gewebeschnitte der Milz, der Lymphknoten und der Peyerschen Platten der Empfängertiere nach Injektion von aktivierten Lymphknotenzellen wurden untersucht. Diese wurden bei -20°C für 10 Min in gleichen Teilen Methanol/Aceton fixiert und danach in TTBS gewaschen.
Alle nachfolgenden Inkubationsschritte erfolgten 30 Min bei Raumtemperatur (RT) in einer feuchten Kammer. Die Objektträger wurden mit dem primären Antikörper inkubiert, um die injizierten LEW.7B(BH)-Lymphozyten (mAb His41) und die Expression von ICAM-1 (mAb 1A29) auf den dendritischen Zellen darzustellen. Nach zweimaligem Waschen in TTBS wurden die Zellen mit dem sekundären Antikörper Z259 (Kaninchen-anti-Maus, 1:50 in PBS + 5% RS) inkubiert. Nach erneutem Waschen in TTBS wurde der tertiäre Antikörper (D651, Maus-APAAP, 1:50 in TBS-Tween) auf die Präparate gegeben. Zur Verstärkung des Signals wurde die Inkubation mit dem sekundären und tertiären Antikörper für jeweils 15 Min wiederholt. Das Oberflächenantigen, an das der primäre Antikörper (His41) gebunden hatte, wurde durch die Inkubation des APAAP-Substrates mit Fast Blue in blau visualisiert (WESTERMANN u. PABST, 1996; WILLFUHR et al., 1989). Nach gründlichem Spülen
wurden die Präparate in 70%igem Ethanol für 30 Min fixiert und für weitere 30 Min vor dem Ventilator getrocknet.
Um das eingebaute BrdU zu detektieren, wurden die Präparate mit Formamid und NaOH denaturiert. Dazu wurden 190ml Formamid auf 70°C erwärmt und dann 8 Min mit 100mmol/l NaOH gemischt. In diesem Gemisch wurden die Objektträger 30 sec inkubiert. Nach Waschen in 70°C warmen TTBS wurden die Präparate für 15 Min in 70°C warmen Formamid mit 7,5mmol/l Trinatriumcitrat inkubiert. Darauf erfolgte ein Spülen in eiskaltem TBS für 15 Min und eine Fixierung mit 1% Formaldehyd bei RT. Des weiteren wurden sie mit TTBS gewaschen und 10 Min mit 0,2% Glutaraldehyd bei RT fixiert. Nach erneutem Spülen in TTBS wurden die Objektträger über Nacht mit 50µl Anti-BrdU-Antikörper (1:500, in TBS + 5% Rattenserum, 1:2) im Kühlschrank inkubiert. Nach Abspülen des überschüssigen Antikörpers mit TTBS wurden die Objektträger mit dem APAAP-Komplex inkubiert und die Inkubationsschritte ein zweites Mal für jeweils 15 Min wiederholt. Zur Darstellung des BrdU wurden 2mg Fast Red mit 3ml APAAP vorsichtig vermischt und für 10 Min bei RT stehen gelassen. Anschließend wurden die Präparate für genau 25 Min damit inkubiert. Wie in Abb.10 (s. S. 73) zu erkennen ist, waren die injizierten T-Lymphozyten nach dieser Färbung in blau, BrdU+ Zellen anhand eines roten Kernes zu erkennen. Dendritische Zellen stellten sich durch den Nachweis des ICAM-1 auf ihrer Oberfläche in braun dar. Nach gründlichem Waschen mit TTBS wurden die Präparate mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die fertigen Präparate wurden mit Dako Glycergel eingedeckelt.
6.3. Herstellung und Färbung von Blutzytospots
Um die injizierten Zellen im Blut der Empfängertiere zu detektieren und auszuzählen, wurden 500µl Blut mit 10ml Schwinzerlyse versetzt und für 10 Min inkubiert. Anschließend wurden die Leukozyten zentrifugiert (400xg, 10 Min, RT). Diese Zellen (1 x 106 Zellen/ml) wurden in Antiklotting-Medium (0,9%NaCl, 2,5mmol/l EDTA, 5% BSA bei pH 7,2) aufgenommen und bei 200xg für 8 Min bei RT in einer Zytozentrifuge auf Objektträger aufgebracht.
Anschließend wurden diese getrocknet und bis zur immunzytologischen Färbung (s. 6.4.) bei -20°C gelagert.
6.4. Darstellung der Zellen im Zellzyklus
Der monoklonale Antikörper MIB5 reagiert mit dem nukleären Protein „Ki-67“, das während aller aktiven Phasen des Zellzyklus (G1-M2) in der Ratte exprimiert wird und mit der Zellproliferation assoziiert wird (GERLACH et al., 1997). Die Spezifität des Antikörpers in der Immunhistochemie und bei anderen Analysen ist von CATTORETTI et al. (1992) und SCHLUTER et al. (1993) beschrieben worden.
Zur Darstellung der Ki-67+-Zellen wurden Zytospots vom Blut (s. 6.3.) und 5-7µm dicke Gefrierschnitte der Milz und der Lymphknoten nach Injektion von naiven, memory (s. 5.1.) und aktivierten (s. 5.2.) T-Lymphozyten immunhistochemisch angefärbt. Dabei wurde, wie bereits für die Darstellung von BrdU (siehe 6.2.) beschrieben, zuerst eine Oberflächenfärbung und nach Denaturierung die Färbung des Zellkernantigens durchgeführt. Nach dem Trocknen der Gewebeschnitte und Einkreisen mit dem PAP-Pen wurden die Präparate für 10 Min bei -20°C in einem Gemisch von Methanol/Aceton zu gleichen Teilen fixiert und danach zweimalig in PBS gewaschen. Im weiteren wurden die Objektträger für 30 Min bei RT mit 50µl des primären Antikörpers inkubiert, um auf der Oberfläche der Zellen ICAM-1 (1A29, 1:300, in 0,9%NaCl und Rattenserum, zu gleichen Teilen) zu identifizieren. Nach zweimaligem Spülen in PBS wurden die Präparate bei 4°C für 45 Min in Paraformaldehyd (PFA) fixiert und anschließend zweimal in TBS gewaschen. Daraufhin wurden die Gefrierschnitte mit dem sekundären Antikörper, einem Kaninchenantikörper gegen Maus-Ig (1:50, in PBS und 5%Rattenserum, 1:2) für 30 Min auf dem Schüttler inkubiert und einmal in TBS/Tween abgewaschen. Eine weitere Inkubation erfolgte mit einem Maus-APAAP-Antikörper für 30 Min bei RT. Die letzten beiden Inkubationsschritte wurden jeweils für 15 Min wiederholt. Die Identifizierung der injizierten LEW.7B(BH) Lymphozyten erfolgte durch die Inkubation mit dem biotinylierten, monoklonalen Antikörper His41 (His41-Biotin in PBS und 20% Mäuseserum, 1:100), wie bereits unter 6.2. beschrieben. Die Inkubation erfolgte für 1h bei 4°C in einer feuchten Kammer. Zur Visualisierung des biotinylierten His41 wurden die Präparate für 45 Min bei RT mit Streptavidin alkalische Phosphatase (in PBS und 5%
Rattenserum) inkubiert, in TBS gewaschen und für 10 Min in Benzidin (4ml TBS/Tween mit 80µl H2O2 und 160µl Benzidin) inkubiert. Anschließend wurden die Oberflächenantigene
durch 25minütige Inkubation des APAAP-Substrates und Fast Blue in blau visualisiert, gewaschen, für 30 Min mit 70%igem Ethanol fixiert und anschließend getrocknet.
Zur Darstellung des Zellkernantigens Ki-67 wurden die Zellen in EDTA (0,372g/l, pH 7,2) in 90°C warmen Wasserbad für 45 Min denaturiert. Daraufhin erfolgte ein zweimaliges Spülen in eiskaltem TBS für jeweils 10 Min. Über Nacht wurde der Antikörper zur Darstellung von Ki-67 (Mib5, 1:5000, in PBS, 1% BSA und 0,1NaN3) auf die Objektträger aufgebracht.
Nachdem der überschüssige Antikörper durch Spülen mit PBS entfernt worden ist, erfolgte die Visualisierung des APAAP-Komplexes mit Fast Red, so dass proliferierende Zellen durch einen roten Kern zu identifizieren waren. Wie in der Darstellung des BrdU in 6.2. stellen sich dendritische Zellen durch die Expression von ICAM-1 in braun, injizierte T-Lymphozyten in blau dar. Mib+ Zellen lassen sich durch einen roten Zellkern differenzieren (ähnlich der Abb.10, S.73, keine eigene Darstellung).
Nach einer Gegenfärbung für 30 sec mit Hämatoxylin wurden die fertigen Präparate mit Glycergel eingedeckelt.
6.5. Darstellung der BrdU+ Effektor T-Lymphozyten
Wie unter 5.2. beschrieben, wurden Lymphknotenzellen gewonnen und mit Antikörpern gegen den TCR und CD28 (1:2 bis 1:5 abhängig von der Charge) für 30 Min auf Eis inkubiert. Um herausfinden zu können, welcher Anteil der injizierten T-Lymphozyten sich innerhalb der untersuchten Organe in der S-Phase befindet, wurde abweichend von dieser Beschreibung dem Kulturmedium kein BrdU zugesetzt. Zur Kreuzvernetzung der Antikörper wurden die Zellen für 72h bei 37°C und einer 5% CO2-Konzentration in Kulturflaschen inkubiert, die zuvor mit Ziegenantikörpern gegen Maus-Ig (3µl/ml) beschichtet worden waren.
Die Injektion erfolgte wie in 5.2. beschrieben in die Schwanzvene. Nach 24h (n=2) und 72h (n=10) wurden die Tiere durch Entbluten getötet und die Organe entnommen. Eine Stunde vor der Entblutung erfolgte unter Ethernarkose eine intravenöse Injektion von 5mg BrdU/ 100g Körpergewicht. Alle Zellen, die sich innerhalb dieser Stunde in der S-Phase befunden haben, haben BrdU eingebaut. Es wurden Gewebeschnitte angefertigt und die Darstellung der Zellen erfolgte wie bereits in 6.2. beschrieben.