Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC stellen ein konstantes

Identifizierung der T-Lymphozyten und der interdigitierenden dendritischen Zellen Bei den Untersuchungen für diese Arbeit wurde auf Gewebeschnitten der Rattenmilz die Membrankontakte von T-Lymphozyten mit DC in vivo analysiert. Als Grundlage dieser Arbeit wurde das etablierte, kongene Modell (WONIGEIT, 1979) eingesetzt, da es eine

Identifizierung injizierter T-Lymphozyten erlaubte, ohne eine vorherige Markierung der Zellen vornehmen zu müssen. So blieben die Oberflächenmoleküle auf den Zellen unbeeinträchtigt und ermöglichten immunhistochemische Mehrfachfärbungen.

Durch die Verwendung von immunhistologischen Färbungen konnten T-Lymphozyten, sowie DC in den Kompartimenten und die Anzahl der Membrankontakte zwischen den beiden Zelltypen in vivo nachgewiesen werden. DC in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe, auf die in dieser Arbeit Bezug genommen wurde, werden aufgrund ihrer charakteristischen Morphologie mit zahlreichen Zellausläufern auch als interdigitierende dendritische Zellen (IDC) bezeichnet (STEINMAN et al., 1997). Neben der Morphologie und der Lokalisation exprimieren IDC, die durch ihre Kapazität zur Auslösung einer T-Zellabhängigen Immunantwort einen reifen Phänotyp der DC darstellen, MHC Klasse II und Adhäsionsmoleküle wie das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) auf ihrer Zelloberfläche. Mit Antikörpern gegen ICAM-1 oder gegen den MHC Klasse II konnten so die IDC gut identifiziert werden, obwohl bisher kein spezifischer Antikörper in der Ratte bekannt ist. Es konnten mit beiden Antikörpern gleiche Anteile an Membrankontakten festgestellt werden (etwa 80%), wobei im weiteren der Antikörper gegen ICAM-1 verwendet worden ist. Bei der Auswertung von Immunhistologien bleibt die Morphologie der Organe erhalten und ermöglicht so eine Zuordnung der Zellen in bestimmte Kompartimente. Im Gegensatz hierzu werden beim Einsatz von durchflußzytometrischen (FACS^) Messungen die Zellen aus ihren Gewebeverbänden herausgelöst betrachtet (WESTERMANN u. PABST, 1992). Membrankontakte, wie sie im Falle dieser Arbeit beschrieben werden, können so nicht ausgewertet werden.

Probleme beim Nachweis der Membrankontakte

Wenn man 24h nach der Injektion die periarterioläre lymphatische Begleitscheide (PALS) der Milz immunhistologisch betrachtet, befinden sich 80% der T-Lymphozyten in Membrankontakt zu IDC. Die bei der Darstellung der Zellen verwendete APAAP-Technik kann durch die Signalverstärkung über Brückenantikörper zu einem Farbniederschlag führen.

Es ist nicht auszuschließen, dass sich dadurch ein Farbring um die Zellen bildet, der in die Wertung der Zellkontakte eingeht und zu falsch-positiven Ergebnissen führt. Der Einsatz der

konfokalen Mikroskopie ermöglicht die Darstellung ganzer T-Lymphozyten und eine Minimierung der Farbniederschläge. In der konfokalen Mikroskopie konnten über 60%

Membrankontakte zwischen den T-Lymphozyten und IDC beobachtet werden. Um eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse der Immunhistologie mit der konfokalen Mikroskopie zu erreichen, wurden computergestützt durchschnittlich 15 Schichten von 0,5µm Dicke durch eine Histologie gelegt (gescannt). Davon wurden die 9 mittleren Schichten ausgewählt und übereinander projiziert, so dass diese „Teilprojektion“ einem Gewebeschnitt im Durchlichtmikroskop entsprach. Dieses Vorgehen ermöglichte es, einzelne Zellen auszuwählen, erst in der Teilprojektion Membrankontakte festzustellen und diese nachfolgend in den unter- und oberhalb liegenden Schichten zu verfolgen. Interessanterweise ließ sich bei diesem Vorgehen feststellen, dass von den 40% der T-Lymphozyten, die in der Teilprojektion keinen Membrankontakt hatten, noch etwa die Hälfte unter- und oberhalb der Teilprojektion Membrankontakt zu einer IDC hatte. Finden wir also in der Immunhistologie 80%

Membrankontakte, die zum Teil durch Farbniederschläge um die Zellen zustande kommen können, so können wir doch aus den Ergebnissen der konfokalen Mikroskopie schließen, dass weit über 60% der T-Lymphozyten Membrankontakte aufweisen müssen. Überlappungen (falsch-positive Ergebnisse), d.h. dass durch die Lichtführung im Mikroskop Zellen einen Kontakt aufweisen, die sich auf unterschiedlichen Ebenen befinden, ließen sich in nur weniger als 5% der Fälle nachweisen. Die Vorhersage, dass sich eine T-Zelle in der Teilprojektion in Kontakt zu einer DC befindet, trifft mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit zu. Durch diese Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass sich der Hauptteil der in der Milz einwandernden naiven T-Lymphozyten in Membrankontakt zu IDC befindet.

Naive, Effektor und CD4⁺ Gedächtnis T-Lymphozyten weisen in allen lymphatischen Organen zu 80% Membrankontakte mit IDC auf.

Übereinstimmend mit der Beobachtung, dass in allen sekundär lymphatischen Organen ein dichtes Netzwerk von IDC durch die Zellareale ausgebildet wird, durch das die T-Lymphozyten kontinuierlich rezirkulieren (STEINMAN et al., 1997), befinden sich jeweils etwa 80% Membrankontakte zwischen injizierten T-Lymphozyten und den IDC. Keinen Einfluss scheint auch die Herkunft der Antigene zu haben, da die Milz Antigene aus dem Blut,

die Lymphknoten aus den von ihnen drainierten Geweben und die Peyerschen Platten über M-Zellen aus dem Darm erhalten (JANEWAY et al., 1999). Den sekundär lymphatischen Organe ist die Aufgabe gemein, durch ihre spezialisierte Aufteilung in T- und B-Zellkompartimente die Auslösung und Regulation von Immunantworten zu unterstützen und zu erleichtern. In den lymphatischen Organen wird ein konzentriertes Zusammentreffen von T-Lymphozyten auf der Suche nach ihrem spezifischen Antigen und Antigen-spezifischen IDC ermöglicht.

Mit der Aktivierung der T-Lymphozyten gehen phänotypische Veränderungen einher, die mit einer Veränderung der Expression von Adhäsionsmolekülen und Aktivierungsmarkern verbunden ist (BODE, 1998). Damit unterscheiden sich Effektor T-Lymphozyten deutlich von naiven T-Lymphozyten. Memory T-Lymphozyten in der Ratte werden durch die niedrige Expression des CD45RC von naiven T-Lymphozyten unterschieden, wobei nach neueren Erkenntnissen ein Teil der memory T-Lymphozyten wieder die hohe Isoform des CD45RC exprimieren kann (BELL u. SPARSHOTT, 1990). Da Adhäsionsmoleküle für die spezifische Einwanderung in lymphatische oder nicht-lymphatische Organe und für die Interaktion mit anderen Zellen wie auch den DC verantwortlich gemacht werden, wurden naive, Effektor und memory T-Lymphozyten auf die Anzahl ihrer Membrankontakte zu IDC untersucht. Bislang gibt es in der Literatur keine Daten zu der Anzahl der Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und DC. Aufgrund der Reexpression der hohen Isoform des CD45RC kann eine

„Verunreinigung“ der hier betrachteten naiven Zellpopulation nicht vollständig ausgeschlossen werden. Da sich aber die Membrankontakte zwischen naiven und memory T-Lymphozyten mit den IDC nicht signifikant unterscheiden, ist diese Verunreinigung höchstwahrscheinlich nicht relevant.

Membrankontakte endogener T-Lymphozyten

Da sich kongene, injizierte T-Lymphozyten wie empfängereigene T-Lymphozyten verhalten, müssten auch endogene T-Lymphozyten in hohem Maße Membrankontakte zu DC aufweisen.

In den T-Zellarealen liegen endogene T-Lymphozyten dicht gedrängt beieinander, was sich durch eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin darstellen lässt. Ein Hauptteil der endogenen T-Lymphozyten (über 60%) liegt ebenfalls in Membrankontakt mit den ICAM-1-positiven IDC.

Dieses unterstützt die aus der Elektronenmikroskopie gewonnenen Beobachtungen, dass IDC ein Netzwerk formen, durch das die T-Lymphozyten kontinuierlich rezirkulieren und so

spezifische Klone für das präsentierte Antigen herausfiltern können (STEINMAN et al., 1997). Die niedrigere Frequenz (60% versus 80%) der Membrankontakte im Vergleich zu den injizierten T-Lymphozyten kann teilweise durch die fehlende Färbung der T-Lymphozyten erklärt werden, da nur die IDC durch den ICAM-1 Antikörper nachgewiesen werden.

Auswirkung der Membrankontakte auf die T-Lymphozyten

Interessant sind diese Ergebnisse im Hinblick darauf, dass die Aktivierungsstadien der T-Lymphozyten, wie sie hier beobachtet worden sind, unterschiedliche Ansprüche an die Membrankontakte stellen. So sind naive T-Lymphozyten abhängig von der Präsentation ihres spezifischen Antigens in Zusammenhang mit einem MHC-Peptid-Komplex und kostimulatorischen Molekülen, um zu proliferieren, sich in Effektorzellen zu differenzieren (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998) und benötigen damit den ständigen Kontakt zu zahlreichen IDC in den lymphatischen Organen. Effektor T-Lymphozyten sind bereits aktiviert und potentiell schädlich für den Organismus. Nach erfolgreicher Eliminierung des Antigenstimulus ist es wichtig, die Ansammlung einer großen Anzahl von Effektorzellen zu verhindern. Zur Aufrechterhaltung der Homöostase wird nach Aktivierung des TCR das Fas-Molekül (CD95) hochreguliert. Die Bindung von Fas/CD95 durch FasL/CD95L auf den IDC führt zur Aktivierung des programmierten Zelltods (Apoptose) und damit zur Beendigung der Immunantwort (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998).

Memory T-Lymphozyten, die bei einer Sekundärantwort schneller Effektorfunktionen (Sekretion von IFN-γ, IL-4, IL-5 nach 12-24h, Proliferation bei geringen Antigen-Konzentrationen) exprimieren können, könnten durch die Membrankontakte mit IDC in Abwesenheit des Antigens überleben (LONDON et al., 1999). Aber auch für die Auslösung einer sekundären Immunantwort benötigen memory T-Lymphozyten die Präsentation des spezifischen Antigens durch eine IDC. Auch die unterschiedliche Herkunft und Behandlung der naiven, memory (Ductus thoracicus durch Separation) und Effektor (Lymphknoten durch polyklonale Aktivierung über den T-Zellrezeptor und CD28) T-Lymphozyten scheint für das Phänomen der Membrankontakte eine untergeordnete Rolle zu spielen.

Dynamik der Membrankontakte

Die T-Zellareale können nach Betrachtung der Membrankontakte von naiven, memory und Effektor T-Lymphozyten mit IDC als Kompartimente eingeordnet werden, in denen die Membrankontakte ein sehr robustes Phänomen darstellen. IDC bilden dabei ein dichtes Netzwerk aus, durch das sich die T-Lymphozyten während ihrer Wanderung bewegen und zahlreiche Kontakte aufnehmen können. GUNZER et al. (2000) konnten in einem 3-D-Kollagengel ebenfalls zeigen, dass sich T-Lymphozyten in ständigem Kontakt zu IDC befinden. Interessanterweise konnten sie zeigen, dass die Kontakte dynamischer Natur (im Minutenbereich) sind und T-Lymphozyten von einer IDC zur nächsten wandern, bevor sie aktiviert werden. Dieses Modell könnte eine Erklärung für die hohe Anzahl Membrankontakte bieten, die sich in vivo finden lassen. LORD et al., (1999) berechnen über die Dissoziationskonstanten der beteiligten Moleküle ein kinetisches Modell, in dem durch die niedrige Affinität viele verschiedene Antigen-präsentierende Zellen abgesucht werden können. Die von uns gemachte Beobachtung, dass zu verschiedenen Zeitpunkten 80% der T-Lymphozyten Membrankontakte mit IDC in einem Antigen-unspezifischen Modell aufweisen, unterstützt diese dynamische Sicht. Die Anzahl der Membrankontakte ist unabhängig von den verschiedenen beobachteten Zeitpunkten (24h, 48h, 72h und 96h) der Untersuchung. Diese Feststellung lässt vermuten, dass diese Kontakte zu jeder Zeit stattfinden.

Übereinstimmend mit der hohen Anzahl der Membrankontakte ist die Beobachtung von vorübergehenden, kurz andauernden (transienten) Kontakten zwischen T-Lymphozyten und DC, wenn kein spezifisches Antigen präsentiert wird (HAUSS et al., 1995; INGULLI et al., 1997). Die transiente Bindung der Zellen könnte erklären, wie T-Lymphozyten während ihrer Wanderung durch die lymphatischen Gewebe eine möglichst hohe Anzahl von DC nach ihrem Antigen absuchen können.

Keine Ausbildung von Zellaggregaten (Kluster) von T-Lymphozyten mit IDC im in vivo Modell

Die Möglichkeit zur physikalischen Überwachung und Beobachtung der anatomischen Lokalisation von T-Lymphozyten und IDC in den Kompartimenten der lymphatischen Organen erlaubt einige Schlussfolgerungen in Hinblick auf die Antigen-Präsentation in vivo in den Geweben. So wird aus verschiedenen Studien berichtet, dass IDC Zellaggregate (Kluster)

mit T-Lymphozyten (INGULLI et al., 1997; KUDO et al., 1997) oder B-Lymphozyten (DUBOIS et al., 1997; KUSHNIR et al., 1998) ausbilden. In dieser Miniaturumgebung können IDC die Proliferation von ruhenden T-Lymphozyten einleiten, wobei die Ausbildung der Zellaggregate ein Adhäsionsmolekül abhängiges Phänomen zu sein scheint. In der untersuchten Antigen-unspezifischen Situation lassen sich hingegen keine oder nur sehr kleine Kluster (weniger als 5 T-Lymphozyten/IDC) zwischen den injizierten T-Lymphozyten und den IDC finden. Das Fehlen von großen Klustern mit mehr als 5 T-Lymphozyten an einer IDC im Gewebe kann durch verschiedene Beobachtungen erklärt werden. Die Wanderungsdynamik der T-Lymphozyten im Gewebe vermindert das stabile Binden an die IDC und favorisiert das Ablösen der Zellen. Die Beweglichkeit der T-Lymphozyten ist stark erhöht und ist in der Gegenwart von IDC verlängert, vermutlich hervorgerufen durch Zytokine, die von den IDC sezerniert werden (TANG und CYSTER, 1999). Diese locken nicht nur naive oder Effektor T-Lymphozyten in IDC-enthaltende Kompartimente, sondern fördern auch eine ungerichtete Migration in den Kompartimenten. Auch wurde vorwiegend aus Antigen-spezifischen in vitro Kulturen über die Ausbildung von Klustern berichtet. In diesen Kulturen fehlt jedoch die dreidimensionale Miniaturumgebung mit extrazellulärer Matrix und retikulären Zellen, die das Grundgerüst der Organe stellen und die Wanderungsdynamik und die Position von wandernden Zellen deutlich beeinflusst. GUNZER et al. (2000) konnten in einem, dem Gewebe nachgeahmten 3D-Kulturgel ebenfalls keine Ausbildung von Klustern feststellen.

Vergleich der Membrankontakte im Rattenmodells mit einem Mausmodell

Es stellt sich die Frage, ob es sich bei den bisher nachgewiesenen Membrankontakten zwischen T-Lymphozyten und IDC um speziesspezifische Effekte in der Ratte handeln kann.

Um einen Vergleich zu den Immunhistologien der Ratte erstellen zu können, wurden die Membrankontakte der endogenen T-Lymphozyten (Gegenfärbung mit Hämatoxylin) mit IDC in der Maus ausgewertet, die über einen Antikörper gegen DEC-205 (NLDC-145) nachgewiesen worden sind. Endogene T-Lymphozyten in der Maus weisen zu etwa 60%

Membrankontakte zu diesen IDC in der Milz auf. Dabei ist allerdings zu beachten, dass DC keine phänotypisch oder funktional einheitliche Gruppe bilden (GRABBE et al., 2000).

Diskutiert wird dabei zum einen die Abstammung von einer myeloiden Stammzelle, die sich

unter verschiedenen Kulturbedingungen sowohl in Makrophagen (M-CSF), als auch bei Zugabe des GM-CSF und verschiedenen Zytokinen wie IL-4 oder TGF-β in dendritische Zellen differenzieren kann. Aber auch die Abstammung von einer lymphoiden Stammzelle, die sich in Lymphozyten und DC differenzieren kann, konnte nachgewiesen werden. In der Milz werden lymphoide und myeloide DC-Populationen aufgrund der Expression von CD8α, 33D1 und DEC-205 unterschieden (SALOMON et al., 1998). So sind DC der myeloiden Abstammung, Cd8α^-, DEC-205^-/low CD11b+, vorwiegend in der Marginalzone anzutreffen.

Diese führen zur Produktion eines unterschiedlichen Zytokinprofils in T-Lymphozyten und sind verantwortlich für die Einleitung von T-Zellabhängigen Immunantworten. Lymphoide DC, Cd8α⁺, DEC-205⁺ CD11b^-, die zu hohen Anteilen in Milz, Thymus, Lymphknoten und Peyersche Platten anzutreffen sind, sind für die Induktion von Toleranz zuständig (CELLA et al., 1997). Finden wir also in der Maus eine Größenordnung von 60% Membrankontakten, so könnte eine Begründung sein, dass der verwendete Antikörper DEC-205 nur DC der myeloiden Abstammung erfasst. Im Gegensatz zu den spezifischen Markern in der Maus, exprimieren alle IDC eines reifen Phänotyps ungeachtet ihrer Herkunft oder Funktion hohe Level an MHC Klasse I und II und kostimulatorische Moleküle wie ICAM-1 (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Definition der IDC und einem einheitlichen spezifischen Marker für IDC in der Ratte ist deshalb die Arbeit auf den ausgereiften Phänotyp beschränkt und ermöglicht dadurch eine eindeutige Identifikation. In diesem Sinne ist es von Vorteil gewesen, sich die Expression von ICAM-1 und MHC Klasse II zunutze zu machen, die, unabhängig von der myeloiden oder lymphoiden Abstammung oder den Kulturbedingungen, auf allen IDC des reifen Phänotyps einheitlich ist.

In der Ratte scheint der Unterschied zwischen verschiedenen Phänotypen der DC keinen Einfluss auf die Anzahl der Membrankontakte zu haben.