B. Effektor T-Lymphozyten in Zellzyklus und Proliferation
3. Die Anteile der Ki-67 + und BrdU + T-Lymphozyten sind erhöht zu finden, wenn
Wie im ersten Teil beschrieben, befinden sich 80±10% der injizierten T-Lymphozyten, aber auch 60±5% der endogenen T-Lymphozyten in Membrankontakt mit den IDC. Abb.10 zeigt eine 3fach Färbung der Milz, in der deutlich die T-Lymphozyten in blau und die IDC mit ihrer charakteristischen Morphologie in braun zu erkennen sind. Die schwarzen Pfeilköpfe weisen
auf injizierte His41+ T-Lymphozyten hin, die in Membrankontakt zu einer IDC liegen.
Deutlich zu erkennen ist ein T-Lymphozyt mit Membrankontakt zu einer IDC, der sich durch einen roten (BrdU+) Zellkern hervorhebt (schwarzer Pfeil). Auch endogene Zellen sind zu beobachten, die eine rote Zellkernfärbung aufweisen (weiße Pfeilköpfe). Sie sind ein Indiz dafür, dass sich sowohl injizierte, als auch empfängereigene Zellen zum Zeitpunkt der Organentnahme in der S-Phase des Zellzyklus befunden haben. Im folgenden wurde ausgewertet, ob sich vermehrt T-Lymphozyten in der S-Phase des Zellzyklus oder in allen Phasen des Zellzyklus außer G0 nachweisen lassen, wenn sie einen Membrankontakt zu IDC aufweisen. Dabei wurden die Zeitpunkte 24h und 72h nach der Injektion der T-Lymphozyten ausgewählt, da sich frühestens nach 24h die DNS-Replikation und nach 48h die Zellteilung nachweisen lassen.
3.1. T-Lymphozyten, die in der Milz einen Membrankontakt zu IDC aufweisen, befinden sich signifikant erhöht im Zellzyklus und in der S-Phase
Vergleicht man in der Milz die injizierten T-Lymphozyten, die einen Membrankontakt mit IDC haben, mit solchen, die keinen haben, so lässt sich sowohl bei Ki-67+ Zellen, wie auch bei den BrdU+ Zellen ein signifikanter Unterschied feststellen. Wie es in Abb.11 zu erkennen ist, sind bereits 24h nach der Injektion 28,9±7,3% der T-Lymphozyten mit einem Kontakt Ki-67+ gegenüber 20,2±8,9% T-Lymphozyten ohne Kontakt zu einer IDC. In der Darstellung der Einzeltiere wird deutlich, dass zwar die Anteile der Zellen im Zellzyklus zwischen 20 bis 50%
schwanken können, aber doch deutlich mehr Zellen mit Kontakt das Ki-67-Antigen exprimieren. 72h nach der Injektion sinkt der Anteil der Zellen im Zellzyklus auf 13±5,1% ab, aber auch hier befinden sich signifikant mehr Zellen im Zellzyklus, wenn sie gleichzeitig einen Membrankontakt zu einer IDC aufweisen. Der Anteil der T-Lymphozyten, die während der S-Phase BrdU eingebaut haben, liegt deutlich niedriger: nach 24h bei etwa 8%, nach 72h bei noch etwa 4%. Doch auch hier lässt sich ein signifikanter Unterschied feststellen, wenn man Zellen mit und ohne Kontakt vergleicht. Diese Ergebnisse scheinen darauf hinzuweisen,
dass T-Lymphozyten auf Kontakte zu IDC angewiesen sind, um im Zellzyklus zu verbleiben und in geringerem Maße zu proliferieren.
Abb. 10
Injizierte, proliferierende T-Lymphozyten befinden sich in Membrankontakten zu IDC.
Auf einem Gewebeschnitt der Rattenmilz ist ein Ausschnitt der PALS gezeigt. Die Milz wurde 72 Stunden nach Injektion von polyklonal über den TCR und CD28 aktivierten T-Lymphozyten entnommen (s.5.2. und 5.3.). Eine Stunde zuvor wurde den Tieren BrdU i.v. in die Schwanzvene injiziert, um die Proliferation von Zellen nachweisen zu können. Die injizierten T-Lymphozyten zeigen durch die Anfärbung mit dem mAb His41 eine intensive blaue Membranfärbung. IDC sind über ihre hohe Expression des ICAM-1 in braun dargestellt.
Proliferierende Zellen zeigen durch den Nachweis des während der S-Phase in die DNS eingebauten BrdU eine intensive rote Kernfärbung. Deutlich zu erkennen ist ein injizierter T-Lymphozyt in Membrankontakt zu einer IDC, der einen intensiv roten, BrdU+ Zellkern aufweist (schwarzer Pfeil). Die schwarzen Pfeilköpfe verweisen auf Membrankontakte zwischen den injizierten T-Lymphozyten und den IDC. Auch endogene Zellen haben BrdU eingebaut und weisen eine rote Kernfärbung auf (weiße Pfeilköpfe). (APAAP-Technik, 1000fache Vergrößerung)
24h n ach In jektio n
M em branko n takt zu d en dritisch en Z ellen
ohne m it
Ki-67+ T-Lymphozyten an den injizierten T-Lymphozyten [%]
10
T-Lymphozyten mit einem Membrankontakt mit IDC weisen einen erhöhten Anteil von Ki-67+Zellen auf.
Jeweils 24h und 72h nach Injektion von aktivierten T-Lymphozyten wurde die Milz entnommen, tiefgefroren und T-Lymphozyten und IDC immunhistochemisch anfärbt. Zusätzlich wurden Zellen, die sich im Zellzyklus befinden, über das nukleäre Zellkernantigen Ki-67 (mAb Mib5) nachgewiesen.
Der Prozentsatz (y-Achse) gibt an, welcher Anteil der His41+ Lymphozyten sich im Zellzyklus befindet. Die x-Achse gibt Auskunft, ob die T-Lymphozyten Membrankontakt gezeigt haben.
Signifikant mehr T-Lymphozyten befinden sich im Zellzyklus, wenn sie einen Kontakt zu einer IDC aufweisen. Zusätzlich sind Daten nach Injektion von naiven und memory T-Lymphozyten erhoben worden, die allerdings aufgrund von sehr geringen Zellzahlen aus n=5 Versuchen zu einer Summe zusammengefasst worden sind (schwarze Raute). Gezeigt sind Einzeltiere aus n=5-6 unabhängigen Versuchen. Das Sternchen (*) verweist auf eine Signfikanz von p<0,05, die mit dem Wilcoxon-Test berechnet wurde.
72h nach Injektion
Membrankontakt zu dendritischen Zellen
ohne mit
BrdU+ T-Lymphozyten unter den injizierten T-Lymphozyten [%]
2
T-Lymphozyten mit einem Membrankontakt mit IDC sind zu einem erhöhten Anteil BrdU+. Wie für Abb. 11 beschrieben wurden T-Lymphozyten polyklonal aktiviert, injiziert und nach 24h und 72h die Milz entnommen und tiefgefroren. Injizierte T-Lymphozyten wurden über den mAb His41 und die IDC über ICAM-1 identifiziert. Zusätzlich wurden Zellen, die sich in der S-Phase befanden, über das Thymidinanalogon BrdU nachgewiesen. Der Prozentsatz gibt an, welcher Anteil der His41+ Lymphozyten, die einen Membrankontakt zu IDC haben, sich in der S-Phase befindet. Signifikant mehr T-Lymphozyten proliferieren, wenn sie einen Kontakte zu einer IDC aufweisen. Zusätzlich sind Daten nach Injektion von naiven und memory T-Lymphozyten erhoben worden, die allerdings aufgrund von sehr geringen Zellzahlen aus n=5 Versuchen zu einer Summe zusammengefasst worden sind (schwarze Raute). Gezeigt sind Einzeltiere aus n=2-10 unabhängigen Versuchen. (*, p<0,05;
Wilcoxon-Test)
3.2. Ki-67+ T-Lymphozyten sind gleichmäßig über die PALS verteilt, T-Lymphozyten mit BrdU-Einbau befinden sich hingegen vorwiegend im äußeren Anteil der PALS.
Wie in Abb.5 gezeigt wurde, finden Membrankontakte von T-Lymphozyten zu B-Lymphozyten vorwiegend im äußeren Anteil der PALS statt. Auf ihrer Wanderung gelangen sowohl T-, als auch B-Lymphozyten in diesen Randbereich zwischen Follikeln und PALS.
Die Kontakte zwischen CD4+ T-Lymphozyten und B-Lymphozyten sind entscheidend für die Einleitung einer humoralen Immunantwort, also der Enddifferenzierung der B-Lymphozyten in Plasmazellen und der Produktion von spezifischen Antikörpern. Nach ihrer Aktivierung im inneren Anteil der PALS wandern T-Helferzellen in den äußeren Anteil der PALS und in die Follikel, wo sich Antigen-spezifische B-Lymphozyten befinden. Betrachtet man nun in Abb.13 den Anteil der injizierten Lymphozyten, die einen Membrankontakt zu IDC aufweisen, in Abhängigkeit von der Lokalisation, also dem inneren oder äußeren Anteil der PALS, so lässt sich feststellen, dass sich im äußeren Anteil mehr Lymphozyten in der S-Phase (BrdU+) befinden als im inneren Anteil. Im Gegensatz dazu lässt sich bei Lymphozyten im Zellzyklus (Mib5+) kein signifikanter Unterschied feststellen. Etwa 30% der T-Lymphozyten befinden sich in der gesamten PALS gleichmäßig verteilt im Zellzyklus. Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis könnte die gegenseitige Aktivierung der CD4+ T-, wie auch der B-Lymphozyten in diesem Randbereich der PALS sein, der zu einem erhöhten Anteil an BrdU+ Zellen unter den injizierten T-Lymphozyten führen könnte.
72h nach Injektion
Anteil der Mib+ T-Lymphozyten an injizierten T-Lymphozyten10
Anteil der BrdU+ T-Lymphozyten an injizierten T-Lymphozyten 2
Abb. 13
In der äußeren PALS befinden sich signifikant mehr BrdU+ T-Lymphozyten als in der inneren PALS, wohingegen sich kein Unterschied der Verteilung der Ki-67+ T-Lymphozyten feststellen lässt.
Jeweils 24h und 72h nach Injektion von kongenen, polyklonal aktivierten T-Lymphozyten wurde die Milz entnommen und Immunhistologien angefertigt. Der Nachweis der T-Lymphozyten wurde über den mAb His41, der DC über die Expression von ICAM-1 geführt. Zellen in der S-Phase wurden durch den Einbau von BrdU, das eine Stunde vor der Organentnahme i.v. injiziert wurde, nachgewiesen. Zellen im Zellzyklus wurden hingegen durch das Zellzyklus-assoziierte Zellkernantigen Ki-67 (Antikörper Mib5) identifiziert. Es wurde ausgewertet, welcher prozentuale Anteil der injizierten T-Lymphozyten, die einen Kontakt zu DC aufweisen, sich in der S-Phase oder im Zellzyklus befindet. Bei der Auswertung wurde zusätzlich unterschieden, ob sich die injizierten Zellen im inneren (Mitte) oder äußeren Bereich (Peripherie) der PALS befanden. Angegeben sind die Werte von Einzeltieren aus jeweils n=2-10 unabhängigen Versuchen. Die Signifikanz (**, p<0,02) wurde mit dem Wilcoxon-Test für nicht parametrische Tests ermittelt. Für 24h (BrdU) ließ sich aufgrund der geringen Anzahl der Versuche keine Signifikanz ermitteln.