Erreger-Wirts-Interaktionen in der Dickdarmschleimhaut von Schweinen mit experimentell induzierter Schweinedysenterie

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Erreger-Wirts-Interaktionen in der Dickdarmschleimhaut von Schweinen mit experimentell induzierter

Schweinedysenterie

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

Dr. med. vet.

vorgelegt von Ulrike Heise Hannover 2013

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Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. E. Liebler-Tenorio Institut für molekulare Pathogenese Friedrich-Loeffler-Institut

1. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. E. Liebler-Tenorio 2. Gutachter: Prof. Dr. M. Wendt

Tag der mündlichen Prüfung: 16.05.2013

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Meiner Familie

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INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ... 15

2 LITERATURÜBERSICHT ... 18

2.1 Die Schweinedysenterie ... 18

Bedeutung... 18

2.1.1 Erreger der Schweinedysenterie: Brachyspira hyodysenteriae ... 18

2.1.2 Krankheitsbild der Schweinedysenterie ... 22

2.1.3 Pathogenese der Schweinedysenterie ... 24

2.1.4 Immunität ... 24

2.1.5 Ausscheidung und Übertragung von B. hyodysenteriae ... 27

2.1.6 Diagnostik der Schweinedysenterie ... 27

2.1.7 Therapie und Bekämpfung der Schweinedysenterie ... 28

2.1.8 Experimentelle Tiermodelle für die Schweinedysenterie ... 28

2.1.9 2.2 Morphologie des Dickdarms ... 30

Anatomischer Aufbau ... 30

2.2.1 Histologischer Aufbau der Wand des Dickdarms ... 31

2.2.2 2.3 Schleimhaut-assoziiertes Lymphgewebe im Dickdarm des Schweines ... 32

Lymphoglanduläre Komplexe (LGK) ... 33

2.3.1 Follikelassoziiertes Epithel (FAE) ... 33

2.3.2 Effektorzellen in der Lamina propria ... 34

2.3.3 Intraepitheliale Lymphozyten (IEL)... 35

2.3.4 2.4 Entzündungs- und Immunzellen des Schweines ... 36

„Cluster of Differentiation“ (CD) System des Schweines ... 36

2.4.1 Charakteristika der in der vorliegenden Untersuchung……… 2.4.2 verwendeten Differenzierungsantigene ... 38

Granulozyten ... 41

2.4.3 Makrophagen ... 42

2.4.4 Dendritische Zellen ... 43 2.4.5

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INHALTSVERZEICHNIS

CD4⁺T-Lymphozyten ... 45

2.4.6 Regulatorische- T-Lymphozyten (Tregs) ... 46

2.4.7 CD8⁺ T-Lymphozyten ... 47

2.4.8 CD4⁺CD8⁺ T-Lymphozyten ... 48

2.4.9 γδ⁺ T-Lymphozyten ... 49

2.4.10 NK-Zellen... 50

2.4.11 IgA⁺ Plasmazellen ... 51

2.4.12 3 MATERIAL UND METHODEN ... 53

3.1 Untersuchungsmaterial ... 53

3.1.1 Infektionsmodell Schweinedysenterie... 53

3.1.2 Auswahl der Gewebeproben für die ... immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen... 56

3.1.2.1 Gewebeproben von Kontrolltieren... 56

3.1.2.2 Gewebeproben von Tieren mit experimentell……… induzierter Schweinedysenterie ... 57

3.2 Theoretischer Hintergrund der immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen ... 60

3.2.1 Immunfluoreszenzmarkierung ... 60

3.2.2 Physikalischer Hintergrund des Fluoreszenzphänomens ... 61

3.2.3 Das Fluoreszenzmikroskop ... 62

3.2.4 Fluoreszenzfilter ... 64

3.2.5 Fluoreszenzfarbstoffe - Fluorochrome ... 66

3.3 Durchführung der histologischen Färbung sowie der APAAP- und der Immunfluoreszenzmarkierungen ... 67

3.3.1 Herstellung der Gefrierschnitte ... 67

3.3.2 Hämalaun-Eosin (HE) Übersichtsfärbung der Gefrierschnitte ... 67

3.3.3 Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase (APAAP) – Methode ... 68

(7)

INHALTSVERZEICHNIS

3.3.4 Durchführung der Einzelimmunfluoreszenzmarkierungen ... 72

3.3.5 Primärantikörper und Sekundärantikörper zur Durchführung………. der Mehrfachimmunfluoreszenzmarkierungen ... 76

3.3.6 Durchführung der Mehrfachimmunfluoreszenzmarkierungen ... 78

3.3.6.1 Darstellung der MHCII⁺, CD16⁺ Zellen sowie B. hyodysenteriae 78 3.3.6.2 Reaktion zur Darstellung der Makrophagen und B. hyodysenteriae . ... 80

3.3.6.3 Reaktion zur Darstellung von IgA⁺ Plasmazellen und………... B. hyodysenteriae ... 80

3.3.6.4 Reaktion zur Darstellung von CD4⁺- und CD8⁺T-Lymphozyten…... und B. hyodysenteriae ... 81

3.3.6.5 Darstellung der CD8⁺ intraepithelialen T-Lymphozyten ... 82

3.4 Auswertung ... 83

3.4.1 Hardware und Software für die digitalen Fotoaufnahmen der Darmschleimhaut ... 83

3.4.2 Einstellungen für die digitale Fotografie ... 84

3.4.3 Auswahl der Messfelder und fotografische Dokumentation ... 84

3.4.4 Auswertung der intraepithelialen CD8⁺ T-Lymphozyten (IEL) ... 85

3.4.5 Pixel basierte Analyse der digitalen Immunfluoreszenzfotos zur Auswertung der Menge der Granulozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, T-Lymphozyten und Plasmazellen in der Darmschleimhaut ... 86

3.4.6 Reproduzierbarkeit der Grenzwertsetzung ... 88

3.4.7 Ermittlung der Kolokalisationen ... 88

3.4.8 Unterscheidung tatsächlicher Kolokalisation und zufälliger………... Überlagerung ... 90

3.4.9 Statistische Auswertung ... 91

4 ERGEBNISSE ... 94

4.1 Etablierung der Doppel- und Dreifachimmunfluoreszenzmarkierungen ... 94

(8)

INHALTSVERZEICHNIS

4.1.1 Ergebnisse der Darstellung der Immunzellen im Dickdarm………

mit der APAAP Methode ... 94

4.1.1.1 Verteilung der MHCII⁺ exprimierenden Zellen ... 94

4.1.1.2 Verteilung der CD16 exprimierenden Zellen ... 95

4.1.1.3 Verteilung der markierten Endothelzellen ... 96

4.1.1.4 Verteilung der CD4⁺ T-Lymphozyten ... 96

4.1.1.5 Verteilung der CD8⁺ T-Lymphozyten ... 97

4.1.1.6 Verteilung der IgA⁺ Plasmazellen ... 97

4.1.2 Validierung der Auswertung ... 98

4.2 Menge und Verteilung der Immunzellen in der Schleimhaut von Zäkum, proximalem Kolon, Ansa centralis und Colon descendens bei klinisch gesunden Schweinen ... 99

4.2.1 Granulozyten ... 99

4.2.2 Dendritische Zellen ... 104

4.2.7 Intraepitheliale CD8⁺ T-Lymphozyten ... 123

4.2.8 IgA⁺ Plasmazellen ... 127

4.3 Immunzellen in der veränderten Darmschleimhaut des proximalen Kolons bei Tieren mit experimentell induzierter Schweinedysenterie während der akuten Krankheitsphase ... 131

4.3.1 Granulozyten (MHCII^-CD16⁺) ... 132

4.3.1.1 Menge und Verteilung ... 132

4.3.1.2 Vergleich der prozentualen Flächenanteile ... 136

4.3.2 Dendritische Zellen (MHCII⁺CD16⁺) ... 137

(9)

INHALTSVERZEICHNIS

4.3.2.2 Kolokalisationsuntersuchungen der MHCII- und CD16- Epitope

auf den dendritischen Zellen ... 140

4.3.5.2 Vergleich der prozentualen Flächenanteile. ... 159

4.3.6.2 Kolokalisationsuntersuchungen der CD4- und CD8 Epitope………. auf den Lymphozyten ... 164

4.3.7 Intraepitheliale CD8⁺ T-Lymphozyten ... 165

4.3.7.1 Verteilung ... 165

4.3.7.2 Vergleich der Anzahl der intraepithelialen ... CD8⁺ T- Lymphozyten ... 165

4.3.8 IgA⁺Plasmazellen ... 168

4.3.8.1 Menge undVerteilung ... 168

5 DISKUSSION ... 176

6 ZUSAMMENFASSUNG ... 190

7 SUMMARY ... 193

(10)

INHALTSVERZEICHNIS

8 LITERATURVERZEICHNIS ... 195 9 ANHANG ... 223

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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abb. Abbildung

AC Ansa centralis

AMCA Aminomethylcoumarinazetat

APAAP Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-

Phosphatase

Aqua dest. Aqua destillata

Aqua bidest. Aqua bidestillata

B. hyodysenteriae Brachyspira hyodysenteriae

BM-DC Bone marrow-derived dendritic cells/ aus dem

Knochenmark stammende dendritische Zellen

BP Bandpassfilter

BS Beamsplitter

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CD Cluster of Differentiation

Cec Zäkum

Corez. Corezeptor

DAPI 4`,6-Diamin-2-phenylindol

DC dendritische Zellen

d.h. das heißt

diphth. diphteroid

DNS Desoxyribonukleinsäure

DPBS Dulbecco`s Phosphat gepufferte Salzlösung

dpi Tage nach der Inokulation

exp. experimentell

g Gramm

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FAE Follikel assoziiertes Epithel

FITC Fluorescein-Isothiocyanat

GM-CSF Granulozyten- Makrophagen- Kolonie

stimulierender Faktor

HE Hämatoxylin-Eosin

IEL intraepitheliale Lymphozyten

Inokul. Inokulation

ICE Ileozäkaleingang

IFN Inteferon

IL Interleukin

i.m. intramuskulär

ind. induziert

IZ Inkubationszeit

klin. klinisch

l Liter

LGK lymphoglandulärer Komplex

LPS Lipopolysaccharid

LOS Lipooligosaccharid

m Meter

mAk monoklonale Antikörper

Mbp Megabasenpaare

mg Milligramm

MHC Major histocompatibility complex/

Haupthistokompatibilitätskomplex

min Minute

ml Milliliter

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mm Millimeter

Mo-DC monocyte derived dendritic cells/ von Monozyten

abstammende dendritische Zellen

MW Molekulargewicht

NK-Zellen natürliche Killerzellen

NSP Nicht-Stärke-Polysaccharide

NBF neutral gepuffertes Formalin

Nl./Nll. Nodus lymphaticus/ Nodi lymphatici

PBS Phosphat gepufferte Salzlösung

PC proximales Kolon

PCR Polymerase-Kettenreaktion

pi post inoculation, nach der Inokulation

RNA Ribonukleinsäure

ROI Region of Interest

rpm rounds per minute

RS resistente Stärke

s.c. subkutan

SD Schweinedysenterie

sek Sekunden

spp. Spezies

SWC Swine Workshop Cluster

Tab. Tabelle

TCR T-Zellrezeptor

Th-Zellen T-Helfer Zellen

TLR Toll-Like-Rezeptor

TNF Tumornekrosefaktor

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TRITC Tetramethylrhodamin Isothiocyanat

Tween-TBS Tween-Tris gepufferte Salzlösung

WBE Wachstumsbildende Einheiten

z.B. zum Beispiel

µl Mikroliter

µm Mikrometer

° C Grad Celsius

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15 EINLEITUNG

1 EINLEITUNG

Die Schweinedysenterie (SD) zählt in Ländern mit intensiver Schweinehaltung zu den wichtigsten infektiösen Durchfallerkrankungen beim Schwein (HAMPSON et al. 2006;

RITZMANN et al. 2009). Die Untersuchung von Kot- und Tupferproben von Schweinen mit Durchfallsymptomatik aus verschiedenen Betrieben in Deutschland auf B. hyodysenteriae ergab Nachweisraten von 21% bis 28% und zeigte damit, dass auch hierzulande die Schweinedysenterie noch weit verbreitet ist (WENDT et al. 2006; NATHUES et al. 2007;

RITZMANN et al. 2009; REINER et al. 2011).SD tritt vor allem bei Läuferschweinen und jungen Mastschweinen auf und verursacht Dysenterie, Gewichtsverlust und gelegentliche Todesfälle (GLOCK u. HARRIS 1972). Die Morbidität liegt bei 90% und die Mortalität kann bis zu 30% betragen. Die finanziellen Verluste der Landwirte sind hauptsächlich durch verminderte Gewichtszunahmen, verlängerte Mastdauer und hohe Behandlungskosten der Tiere bedingt (HAMPSON et al. 2006).

Bei der SD handelt es sich um eine Faktorenkrankheit (HAMPSON et al. 2006). Als Infektionserreger spielt Brachyspira (B.) hyodysenteriae, ein spiraliger, beweglicher und gramnegativer Spirochäte eine Rolle. Der Infektionsweg ist fäko-oral. Die alleinige Infektion mit B. hyodysenteriae reicht nicht immer aus, um die Erkrankung zu erzeugen. Auch ungünstige Haltungsbedingungen, mangelnde Hygiene, bestimmte Futtermittel, aber auch gleichzeitige Infektionen mit anderen Durchfallerregern oder Erkrankungen anderer Organsysteme, wie Atemwegserkrankungen, sind für die klinische Manifestation der Erkrankung wichtig (HERBST et al. 2004).

Bislang können erkrankte Schweine nur mit Antibiotika behandelt, Haltungs- und Hygienebedingungen optimiert und betroffene Bestände warm oder kalt saniert werden (SCHULZE-HORSEL u. STUHLDREIER 2012). Die Behandlung von Schweinen mit Antibiotika ist nicht unproblematisch, da zunehmend Resistenzen auftreten (DUINHOF et al.

2008). Außerdem wird der Einsatz von Antibiotika bei Tieren, die der Lebensmittelgewinnung dienen, immer kritischer diskutiert (ULLRICH et al. 2012). Als

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EINLEITUNG 16

Alternative zur antibiotischen Therapie wäre eine Impfprophylaxe wünschenswert.

Kenntnisse über die durch eine Infektion mit B. hyodysenteriae ausgelösten systemischen, aber auch lokalen Immunreaktionen sind vor allem vor dem Hintergrund, dass die Erkrankung spontan abheilen kann (LEE et al., 1976, OLSON u. RODABAUGH 1978, SATTLER 2010), wichtig für die Entwicklung wirksamer Impfstoffe. Bisher wurden überwiegend die systemischen Reaktionen auf Infektion oder parenteral verabreichte Vakzinen untersucht (WATERS et al. 1999a; HONTECILLAS u. BASSAGANYA-RIERA 2003; JONASSON et al. 2004; JONASSON et al. 2006). Es liegen nur wenige Befunde zur lokalen Immunantwort in der Dickdarmschleimhaut des Schweines vor (WATERS et al. 1999b; HONTECILLAS et al. 2005; JACOBSON et al. 2007). Mit der vorliegenden Untersuchung sollten zum einen die Methoden zur Darstellung von Entzündungs- und Immunzellen in der Dickdarmschleimhaut des Schweines etabliert werden. Zum anderen sollten Anzahl und Verteilung von Entzündungs- und Immunzellen in verschiedenen Abschnitten des Dickdarms bei Kontrolltieren ermittelt werden. Schließlich wurde bei einer begrenzten Anzahl von Schweinen in der frühen Phase der SD untersucht, wie sich Anzahl und Verteilung der Entzündungs- und Immunzellen verändern und ob es zu Kolokalisationen zwischen bestimmten Zellen und B. hyodysenteriae kommt.

Im Einzelnen sollten folgende Ziele in der Dissertation bearbeitet werden:

o Etablierung der Methodik zur Darstellung von Entzündungs- und Immunzellen in der Dickdarmschleimhaut mit Mehrfachimmunfluoreszenzmarkierungen und Pixel- basierter Auswertung der markierten Zellen

o Ermittlung der Menge und Verteilung der neutrophilen Granulozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, CD4⁺T-Lymphozyten, CD8⁺T-Lymphozyten, CD4⁺CD8⁺T- Lymphozyten und IgA⁺ Plasmazellen in der Schleimhaut an repräsentativen Lokalisationen (Zäkum, proximales Kolon, Ansa centralis, Kolon descendens) entlang der Dickdarmschleimhaut von Kontrolltieren. Hierbei wurde die Verteilung im basalen und apikalen Bereich der Schleimhaut verglichen, um zu überprüfen, ob eine den Zotten und Krypten des Dünndarms analoge, differenzierte Verteilung vorliegt.

o Menge und Verteilung der entsprechenden Entzündungs- und Immunzellen bei Schweinen mit experimentell induzierter Schweinedysenterie in der frühen Phase der

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17 EINLEITUNG

SD mit diphtheroider Kolitis. Untersuchung der Kolokalisationen des Erregers B.

hyodysenteriae mit den Entzündungs- und Immunzellen.

Die Ergebnisse sollen die Grundlage bilden für vergleichende Untersuchungen von Schweinen in verschiedenen Stadien der SD und nach Infektion mit unterschiedlich virulenten Isolaten von B. hyodysenteriae.

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LITERATURÜBERSICHT 18

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Die Schweinedysenterie

Bedeutung 2.1.1

Es handelt sich bei der Schweinedysenterie um eine für die Schweineproduktion wirtschaftlich bedeutsame Durchfallerkrankung, die besonders in Betrieben mit intensiver Schweinehaltung auftritt (POHLENZ et al. 1983). Die Erkrankung betrifft hauptsächlich Absetzferkel und junge Mastschweine (HAMPSON et al. 2006a). Die Verluste sind durch verminderte Mastzunahmen, Kosten für Behandlungen, prophylaktische Maßnahmen sowie einzelne Todesfälle bedingt (POHLENZ et al. 1983). Die erste Beschreibung der Erkrankung erfolgte bereits 1921 in den USA (WHITING et al. 1921). Es dauerte jedoch bis 1971, bis dem Krankheitsbild mit B. hyodysenteriae ein Erreger zugeordnet werden konnte (TAYLOR u. ALEXANDER 1971). Die Schweinedysenterie hat bis heute ihre Bedeutung für die Schweinemast behalten. Untersuchungen zur Verbreitung des Erregers der Schweinedysenterie, B. hyodysenteriae, in Schweinebetrieben Norddeutschlands zeigten, dass 17,9% der Kotproben von durchfallerkrankten Tieren und 27,1% der Betriebe mit an Durchfall erkrankten Schweinen positiv für B. hyodysenteriae waren (HERBST et al. 2004).

Der Untersuchungszeitraum erstreckte sich über ein Jahr und der Nachweis des Erregers erfolgte mittels PCR direkt aus den Kotproben. Bei einer anderen Studie wurden Kot- und Darmproben aus Schweinebeständen mit Durchfallproblemen aus dem norddeutschen und süddeutschen Raum kulturell auf B. hyodysenteriae untersucht. B. hyodysenteriae konnte in Proben von 21,1% der untersuchten Schweinebestände angezüchtet werden (WENDT et al.

2006).

Erreger der Schweinedysenterie: Brachyspira hyodysenteriae 2.1.2

Taxonomie. Die Einordnung des Erregers erfolgte zuerst in die Gattung Treponema (HARRIS et al. 1972). Anschließend in die Gattung Serpula, die durch eine Doppelbenennung in Serpulina umbenannt wurde (PASTER u. DEWHIRST 2000). Aktuell wird B. hyodysenteriae in die Klasse der Spirochäten und die Ordnung der Spirochaetales

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19 LITERATURÜBERSICHT

eingeordnet. Die Ordnung ist in drei Familien eingeteilt: Leptospiraceae, Spirochaetaceae und Brachyspiraceae. In der Familie der Brachyspiraceae sind zahlreiche Brachyspira-Arten zu finden. Die bekanntesten sind B. hyodysenteriae, B. pilosicoli, B. murdochii, B. innocens und B. intermedia (PASTER u. DEWHIRST 2000). Innerhalb der Art B. hyodysenteriae gibt es verschiedene Serotypen, die sich durch die Lipooligosaccharide in der Zellwand unterscheiden.

Morphologie. B. hyodysenteriae ist ein gramnegatives, spiraliges, motiles, anaerobes Bakterium. Es zeigt eine geringe Sauerstofftoleranz und wächst stark hämolysierend auf Blutagar. Die Länge liegt zwischen 6 bis 9 µm und der Durchmesser zwischen 320 bis 380 nm (AMTSBERG u. MERKT 1986; SATTLER 2010). Periplasmatische Endoflagellen winden sich von beiden Enden des Bakteriums um den Bakterienleib (CHARON et al. 1992).

Das gesamte Bakterium ist in eine lockere Bakterienwand eingeschlossen (HAMPSON et al.

2006a). Da im Folgenden wiederholt auf Bestandteile der Bakterienwand Bezug genommen wird, ist in Abb. 1 der Aufbau der Zellwand gramnegativer Bakterien schematisch dargestellt.

Kultur. B. hyodysenteriae wächst langsam auf bluthaltigem festem Nährboden (z.B.

Trypticase-Soja-Agar mit 5% Schaf- oder Kälberblut) bei einer Temperatur von 38°C–39°C.

Dem Nährboden werden verschiedene Antibiotika (Spiramycin, Vancomyzin, Colistin, Spectinomycin, Rifampicin) zugesetzt, um die Begleitflora zu unterdrücken. Die Kolonien sind von zartem, transparentem Aussehen und umgeben von einer Zone vollständiger beta- Hämolyse (OCHIAI et al. 1997; HERBST 2008). Bei Versand des Probenmaterials muss die geringe Sauerstofftoleranz des Erregers berücksichtigt werden, um falsch negative Ergebnisse zu vermeiden (WALDMANN et al. 2000).

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Abb. 1: Aufbau der Zellwand gramnegativer Bakterien (modifiziert nach SAVAGE u.

FLETSCHER (1985)).

Molekularbiologische Eigenschaften. Das Genom von B. hyodysenteriae hat eine Größe von etwa 3,2 Mbp (Stamm B78T) bzw. 3,0 Mbp (Stamm WA1) (WANCHANTHUEK et al.

2010). Ein Großteil der Gene von B. hyodysenteriae ist in den Transport und die metabolischen Funktionen involviert (HAMPSON u. AHMED 2009). Das Genom von B.

pilosicoli ist ungefähr 2,5 Mpb und das von B. murdochii ungefähr 3,18 Mbp groß. Ihnen gemeinsam ist, dass die Genome aus einem einzelnen zirkulären Chromosom bestehen (WANCHANTHUEK et al. 2010). Mit dem wachsenden Interesse an der Genomsequenzierung, Proteomanalyse und Impfstoffentwicklung für Brachyspira spp. nimmt die Anzahl der klassifizierten Gene für Membran- und Lipoproteine stetig zu. Über die biologische Bedeutung der Membran- und Lipoproteine ist bisher wenig bekannt (HOLDEN et al. 2006). Da die Nomenklatur der Membran- und Lipoproteine und der assoziierten Gene sich unabhängig voneinander entwickelt hatten, bestand die Notwendigkeit einer einheitlichen Nomenklatur. In der neuen Nomenklatur werden die Gene und Proteine zunächst nach der Brachyspira Spezies benannt. Für B. hyodysenteriae wird die Abkürzung „bh“, für B.

pilosicoli „bp“ verwendet. Es schließt sich ein Kürzel an, aus dem hervorgeht, ob es sich um Membran- oder Lipoproteine handelt. Membranproteine werden mit „mp“, Lipoproteine mit

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„lp“ abgekürzt. Schließlich wird für die eindeutige Identifizierung noch die Molekularmasse des Proteins angegeben (HAMPSON et al. 2006b).

Hierdurch ergibt sich beispielsweise für das Gen smpA (auch bezeichnet als bmpA) von B.

hyodysenteriae, das für ein 16 kDa Lipoprotein, als SmpA (THOMAS u. SELLWOOD 1993) oder BmpA (LEE et al. 2000) bezeichnet, codiert, die neue Bezeichnung bhlp16 für das Gen und Bhlp16 für das Lipoprotein (HAMPSON et al. 2006b). In der Tab. 1 sind Beispiele für die alten und die neuen Bezeichnungen nach HAMPSON und Mitarbeiter (2006) angegeben.

Tab. 1: Alte und neue Nomenklatur der Gene und Proteine der Brachyspiren

alte Bezeichnung Gen

alte Bezeichnung Protein

neue Bezeichnung Gen

neue Bezeichnung Protein

Referenz

smpA oder bmpA SmpA oder BmpA

bhlp16 Bhlp16

(THOMAS u.

SELLWOOD 1993;

LEE et al. 2000)

bmpB oder blpA BmpB oder BlpA bhlp29,7 Bhlp29,7

(LEE et al. 2000;

CULLEN et al.

2003)

vspA-H VspA-H bhmp39a,bhmp39b

– bhmp39h

Bhmp39a, Bhmp39b – Bhmp39h

(GABE et al. 1998;

MCCAMAN et al.

1999, 2003)

mglB MglB bplp35 Bplp35

(ZHANG et al.

2000)

bmpC BmpC bplp23 Bplp23 (TROTT et al. 2004)

Virulenz. B. hyodysenteriae verfügt über verschiedene Virulenzfaktoren, die die Kolonisation des Dickdarms erleichtern.

Der Erreger zeigt eine hohe Beweglichkeit im intestinalen Mukus, bedingt durch die periplasmatischen Flagellen (CANALE-PAROLA 1978). Die Beweglichkeit wird durch

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Glykoproteine im Mukus, wie L-Serin und L-Fucose, verstärkt (MILNER u. SELLWOOD 1994; LUX et al. 2000).

Einige Stämme sind trotz des anaeroben Wachstums geringgradig tolerant gegenüber dem Vorhandensein von Sauerstoff. Dadurch wird das Überleben in der Umwelt bis zur Aufnahme in den Verdauungstrakt und die Besiedelung des Dickdarms begünstigt (HERBST 2008).

Die Entstehung der Läsionen im Dickdarm wird vor allem auf die Hämolysine und Lipooligosaccharide zurückgeführt. Das Hämolysin soll eine große Rolle bei der Zerstörung des Oberflächenepithels spielen. Die zytotoxische Wirkung konnte in vitro und in vivo gezeigt werden (LYSONS et al. 1991). Das Lipooligosaccharid (LOS) ist ein Endotoxin aus der Zellwand von B. hyodysenteriae, das sich im chemischen Aufbau von den Lipopolysacchariden (LPS) der Zellwand anderer gramnegativer Erreger unterscheidet (HALTER u. JOENS 1988). Die Applikation von LOS in den Dickdarm eines für LPS empfänglichen Mäusestammes verursachte dort Dysenterie-ähnliche Läsionen, während ein gegen LPS resistenter Mäusestamm trotz des Vorhandenseins von B. hyodysenteriae keine Läsionen entwickelte (NUESSEN et al. 1983).

Bislang konnte in vivo nicht nachgewiesen werden, ob der Stamm B204 am Oberflächenepithel der Darmschleimhaut adhäriert. Es konnte jedoch in vitro eine Adhäsion von B. hyodysenteriae an humane Zelllinien und Schweinezelllinien sowie Schweineepithelzellen gezeigt werden (KNOOP et al. 1979; WILCOCK u. OLANDER 1979b; BOWDEN et al. 1989). Die Adhäsion gelang nur mit lebenden und beweglichen Bakterien.

Am Eindringen des Erregers in das Gewebe und dessen Zerstörung könnten 15 Proteasen beteiligt sein (BELLGARD et. al 2009).

Krankheitsbild der Schweinedysenterie 2.1.3

Klinische Befunde. Die Inkubationszeit variiert zwischen 2 Tagen bis 3 Monaten; sie liegt im Mittel zwischen 10-14 Tagen (AMTSBERG u. MERKT 1986). Die Durchfallsymptomatik stellt den Hauptbefund dar. Beginnend mit einer breiigen Konsistenz und Grauverfärbung des

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Kotes sind im weiteren Verlauf Schleimbeimengungen, Blutbeimengungen und Fibrinfetzen im Kot zu finden (POHLENZ et al. 1983). Die Rektaltemperatur erkrankter Tiere erhöht sich auf 40,0°C bis 40,5°C (HEINRITZI 2002). Die meisten Tiere erholen sich nach einer Woche.

Tiere, die länger krank sind, zeigen ein schlechtes Allgemeinbefinden, dehydrieren und können bei länger unbehandelter Erkrankung eine Azidose und Hyperkaliämie entwickeln und verenden (HARRIS u. LYSONS 1992).

Makroskopische Befunde. Läsionen sind ausschließlich auf den Dickdarm beschränkt. Das Dickdarmkonvolut ist hyperämisch und ödematös (GLOCK u. HARRIS 1972). Die Kolonlymphknoten können geschwollen sein und klare Flüssigkeit kann in der Bauchhöhle gefunden werden (HUGHES et al. 1975; HARRIS u. LYSONS 1992). In der Dickdarmschleimhaut ist der Übergang zu verändertem Gewebe abrupt (HARRIS u.

LYSONS 1992). Im Darmlumen und teils fest mit der Oberfläche der Dickdarmschleimhaut verbunden befindet sich muko-fibrino-hämorrhagisches Exsudat (HUGHES et al. 1975). Die Schleimhautveränderungen können sich bis hin zu einer nekrotisierenden Typhlokolitis entwickeln (GLOCK et al. 1974). Läsionen der Schleimhaut sind auch bei klinisch gesunden Tieren vorhanden. Bei diesen finden sich umschriebene, gerötete Areale auf der mit Mukus bedeckten Dickdarmschleimhaut (HAMPSON et al. 2006a).

Histologische Befunde. Auch die histologischen Befunde sind auf die Dickdarmschleimhaut beschränkt. Sie sind durch eine fibrinöse Entzündung der Darmschleimhaut mit Erosionen charakterisiert (OLSON 1974; HUGHES et al. 1975; ALBASSAM et al. 1985). Im Darmlumen und in die Schleimhaut reichend befindet sich ein Exsudat, bestehend aus Schleim, Fibrin, Erythrozyten, Zelltrümmern und Bakterien (HUGHES et al. 1975). Die Krypten sind verlängert und die Becherzellen hyperplastisch (POHLENZ et al. 1983;

JACOBSON et al. 2007). B. hyodysenteriae kann vor allem in den Exsudatmassen im Lumen, oberflächlich am Epithel, in den Krypten und in der Lamina propria gefunden werden (HUGHES et al. 1975; WILCOCK u. OLANDER 1979a). Der Erreger kann auch bei intaktem Epithel in der Lamina propria nachgewiesen werden (GLOCK u. HARRIS 1972). In der Lamina propria und diffus im Gewebe ist eine Lymphozyteninfiltration beschrieben (WILCOCK u. OLANDER 1979a). Unter dem veränderten Epithel sind vor allem neutrophile Granulozyten zu beobachten (HUGHES et al. 1975).

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Pathogenese der Schweinedysenterie 2.1.4

Im Dickdarm gesunder, erwachsener Schweine sind als Mikroorganismen hauptsächlich grampositive Bakterien zu finden (ROBINSON et al. 1981). Eine Verschiebung dieser Mikroflora zu gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise Bacteroides vulgatus, Selenomonas spp., Fusobacterium necrophorum, Clostridium spp. und Listeria denitrificans (WHIPP et al. 1979; JOENS et al. 1981), begünstigt die Ansiedlung von B. hyodysenteriae (ROBINSON et al. 1984). Die Zusammensetzung der Mikroflora im Dickdarm wird maßgeblich durch die Fütterung beeinflusst. Eine große Rolle spielt dabei der Gehalt an Nicht-Stärke-Polysacchariden und resistenter Stärke, wie z.B. Soja, im Futter (DURMIC et al.

1998). Gelangen diese Substrate in den Dickdarm, so fördern sie das Wachstum der gramnegativen Mikroflora (DURMIC et al. 1998; DURMIC et al. 2000).

Nach Aufnahme von B. hyodysenteriae über infizierten Kot (HEINRITZI 2006) kann der Erreger durch seine Chemotaxis für Muzine, seine geringe Sauerstofftoleranz und seine Beweglichkeit die Kolonschleimhaut besiedeln (HERBST 2008). Der Erreger dringt aktiv in die Becherzellen ein, worauf diese vermehrt Schleim produzieren (POHLENZ et al. 1983).

Das Oberflächenepithel wird durch die Produktion des Endotoxins LOS und des Hämolysins zerstört (HAMPSON et al. 2006a). Dies führt zu einer lokalen Entzündungsreaktion mit Ödem, Hämorrhagien und Leukozyteninfiltration. Der Erreger lässt sich dann auch in der Lamina propria finden. Die Mitoserate im basalen Kryptbereich erhöht sich, um die defekte Schleimhaut zu erneuern (POHLENZ et al. 1983). An der zerstörten Oberfläche kommt es durch Störung des NaCl-Transports zur Malabsorption und zu einem Verlust an Proteinen und extrazellulärer Flüssigkeit. Dies wiederum verstärkt die Durchfallsymptomatik (HARRIS u.

LYSONS 1992; MOESER u. BLIKSLAGER 2007).

Immunität 2.1.5

Die Infektion mit Brachyspira hyodysenteriae löst eine Immunantwort bei infizierten Schweinen aus. Hierdurch kann es zur Immunität gegen den Erreger kommen. Schweine, die an SD erkrankten, waren nach ihrer Genesung bis zu 4 Monaten vor einer erneuten Infektion mit B. hyodysenteriae desselben Serotyps geschützt (OLSON 1974). Ein unvollständiger Schutz wurde gegen B. hyodysenteriae anderen Serotyps beschrieben (NUESSEN u. JOENS

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1982, PARIZEK et al. 1985). Eine weitere Untersuchung betont, dass ein Schutz vor Re- infektion auch bei homologem Challenge trotz Entwicklung von Serumantikörpern nur bei etwa 40% der Schweine bestand (REES et al. 1989). Die Autoren interpretierten den Antikörpertiter als Hinweis auf einen Erregerkontakt, aber nicht auf Protektion. Eine protektive Immunität entwickelt sich besser bei Tieren, die während der Erkrankung nicht antibiotisch behandelt werden, sondern einen unbeeinflussten Krankheitsverlauf haben und spontan genesen (LEE et al. 1976; OLSON u. RODABAUGH 1978). Dies spricht dafür, dass ein intensiver und ausreichend langer Kontakt zwischen Erreger und Wirt notwendig ist, um eine Immunantwort zu initiieren.

Von verschiedenen Arbeitsgruppen wurden systemische und lokale Immunreaktionen auf B.

hyodysenteriae als Grundlage der Immunität untersucht. Hierbei ergaben sich teils widersprüchliche Befunde.

Systemische Reaktionen. Bereits bei frühen experimentellen Infektionsversuchen wurde beschrieben, dass sich 2-4 Wochen nach der Inokulation mit B. hyodysenteriae Antikörpertiter im Serum entwickelten und bis zu 8 Wochen bei wieder genesenen Tieren nachweisbar waren (JOENS et al. 1979). Während der klinischen Phase stiegen IgG-, IgA- und IgM-Antikörper im Serum an und IgA im Darminhalt des Dickdarms (ELAZHARY et al.

1973; REES et al. 1989). Serumantiköper vom IgA-Typ sind hinweisend auf eine kürzliche Infektion, Serumantikörper vom IgG/IgM-Typ auf eine länger zurückliegende Infektion (REES et al. 1989). Der Antikörpertiter im Serum war bei Behandlung der Erkrankung mit Antibiotika niedriger (LEE et al. 1976; OLSON u. RODABAUGH 1978).

Neben der humoralen Immunantwort wird durch die Schweinedysenterie auch eine zelluläre Immunantwort stimuliert. Diese wurde einerseits durch durchflusszytometrische Auswertung der Zellen im peripheren Blut, andererseits durch Erfassen der Zytokine gemessen. Bei Schweinen mit experimentell induzierter SD kam es während der akuten Krankheitsphase zu einem Anstieg der Monozyten, der neutrophilen Granulozyten, der CD3⁺ T-Lymphozyten, der CD4⁺CD8⁺ T-Lymphozyten, der CD8⁺ T-Lymphozyten und von IL1β, einem proinflammatorischen Zytokin, sowie zu einer Abnahme der CD21⁺ B-Lymphozyten (JONASSON et al. 2004; JONASSON et al. 2006, KRUSE et al. 2008). Während der

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Genesungsphase blieb die Zahl der neutrophilen Granulozyten weiterhin erhöht und es kam zu einem Anstieg der γδ T-Lymphozyten und IL10, einem antiinflammatorischen Zytokin (JONASSON et al. 2006, KRUSE et al. 2008). WATERS und Mitarbeiter konnten zudem einen Anstieg der CD8αα⁺ T-Lymphozyten zeigen (WATERS et al. 2000).

Bei der Korrelation der Anteile der Lymphozytensubtypen vor der Inokulation mit B.- hyodysenteriae- und dem Auftreten von Krankheitssymptomen konnte gezeigt werden, dass Tiere mit einem höheren Anteil an γδ T-Lymphozyten und niedrigerem Anteil an CD4⁺und CD8⁺T-Lymphozyten empfänglicher für die Erkrankung waren (JONASSON et al. 2004).

Hieraus zogen die Autoren den Schluss, dass CD8⁺T-Lymphozyten und IFNγ besonders wichtige Abwehrmechanismen des Wirtes sind (JONASSON et al. 2004). Andererseits konnte bei Schweinen mit experimentell induzierter SD IFNγ weder während der akuten Erkrankung noch nach der Genesung nachgewiesen werden (KRUSE et al. 2008).

Die systemischen Reaktionen wurden auch nach parenteraler Applikation einer B.- hyodysenteriae-Vakzine untersucht (WATERS et al. 1999, WATERS et al. 2000, HONTECILLAS u. BASSAGANYA-RIERA 2003). Durch die Vakzination kam es zur Bildung von antigenspezifischem IFNγ im peripheren Blut, aber nicht in den Kolonlymphknoten, zu einer Zunahme der CD8αα⁺ T-Lymphozyten und zu einer Abnahme der CD4⁺T-Lymphozyten (WATERS et al. 1999). In einer nachfolgenden Studie wurden die Reaktionen auf Ganzzellbakterine und Präparationen nach Proteinaseverdau in Verbindung mit verschiedenen Adjuvantien untersucht (WATERS et al. 2000). Hierbei konnte bestätigt werden, dass vorwiegend eine CD3⁺ T-Lymphozytenantwort - insbesondere CD8⁺ T- Lymphozyten, CD4⁺CD8⁺ T-Lymphozyten und γδ T-Lymphozyten - und keine B- Lymphozytenantwort induziert wurde (WATERS et al. 2000). Zwischen den verschiedenen Vakzinepräparationen und Adjuvantien gab es keine Unterschiede in der Induktion dieser Reaktionen. Diese Befunde konnten durch die Untersuchung der In- vitro- Stimulierbarkeit der Lymphozyten von vakzinierten Schweinen bestätigt werden: es war eine antigenabhängige CD4⁺T-Lymphozytenantwort und IFNγ- Produktion sowie eine reziproke Regulation zwischen CD4⁺ T-Lymphozyten und γδ T-Lymphozyten nachweisbar (HONTECILLAS u. BASSAGANYA-RIERA 2003).

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Lokale Reaktionen. Da es sich bei B. hyodysenteriae um einen Erreger handelt, dessen Ausbreitung im Wirt auf die Schleimhaut begrenzt bleibt, ist davon auszugehen, dass lokale Reaktionen von besonderer Bedeutung sind.

Die Untersuchung der veränderten Kolonschleimhaut von Schweinen mit SD zeigte, dass es dort zu einer Zunahme der neutrophilen Granulozyten kam (HONTECILLAS et al. 2002, (JACOBSON et al. 2007). Die Anzahl der intraepithelialen CD3⁺und γδ T-Lymphozyten war herabgesetzt (HONTECILLAS et al. 2005, JACOBSON et al. 2007). Die Anzahl der CD3⁺T- Lymphozyten, der γδ T-Lymphozyten und der B-Lymphozyten in der Lamina propria zeigte keine Veränderung (HONTECILLAS et al. 2005, JACOBSON et al. 2007). Es kam jedoch zu multifokalen Anhäufungen von CD4⁺ T-Lymphozyten in der Lamina propria des Kolons (HONTECILLAS et al. 2005).

Durchflusszytometrische Untersuchungen der Ileozäkallymphknoten von 4 Monate alten Schweinen mit experimentell induzierter SD zeigten eine signifikant erhöhte Anzahl von CD4⁺CD8⁺ T-Lymphozyten und eine niedrigere Anzahl von γδ T-Lymphozyten und B- Lymphozyten (LAKOMY et al. 2009). Auch in der Peyerschen Platte im Ileum, einem wichtigen Bestandteil des Darmschleimhautimmunsystems, waren Reaktionen auf die Kolitis, verursacht durch SD, zu finden. So hatten Schweine mit klinischer SD in der Tendenz mehr CD8⁺ T-Lymphozyten als gesunde Tiere (KALECZYC et al. 2010).

Ausscheidung und Übertragung von B. hyodysenteriae 2.1.6

Nach einer Infektion kann B. hyodysenteriae bereits 2 Tage später ausgeschieden werden (JANETSCHKE u. KIELSTEIN 1976; AMTSBERG u. MERKT 1986). Die Ausscheidung erhöht sich mit dem Schweregrad des Durchfalls und kann bis zu 70 Tage nach Abheilen der Läsionen anhalten (HARRIS u. LYSONS 1992). Bei der Übertragung spielen latent infizierte Tiere eine große Rolle, da sie den Erreger unregelmäßig und in geringer Menge ausscheiden (AMTSBERG u. MERKT 1986).

Diagnostik der Schweinedysenterie 2.1.7

Die klinischen Symptome erlauben bei akuter Infektion mit B. hyodysenteriae eine Verdachtsdiagnose. Der Erreger kann mittels Verfahren, wie Phasenkontrast-, Hell- und

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Dunkelfeldmikroskopie in Kotproben direkt nachgewiesen werden (KINYON u. HARRIS 1979; STANTON et al. 1997). Am gebräuchlichsten ist die kulturelle Anzucht aus Kottupfern (siehe 2.1.2). B. hyodysenteriae lässt sich mittels PCR auch direkt im Schweinekot detektieren. Zum Nachweis werden ribosomale RNA-Gene (16S, 23S rRNA; STANTON et al. 1997; BARCELLOS et al. 2000) oder das nox–Gen (ROHDE et al. 2002; AKASE et al.

2009) verwendet. Latent infizierte Tiere und mit Antibiotika behandelte Tiere sind aufgrund der zu geringen oder unregelmäßigen Erregerausscheidung schwierig zu identifizieren (HAMPSON et al. 2006a).

Therapie und Bekämpfung der Schweinedysenterie 2.1.8

In betroffenen Betrieben sollte der Infektionsdruck durch regelmäßige Kotbeseitigung, eine adäquate Reinigung und Desinfektion, Schadnagerbekämpfung und durch Anwendung des Rein–Raus–Prinzips gesenkt werden (WALDMANN 1992; HEINRITZI 2002). Zur Behandlung können Antibiotika eingesetzt werden (RITZMANN et al. 2009). Als wirksam werden Tiamulin, Tylosin, Lincomycin, Tylvalosin und Valnemulin angesehen. Durch die fehlerhafte Anwendung der Antibiotika, wie Unterdosierung, zu kurze Behandlungsdauer oder fehlerhafte Applikation, nimmt die Resistenzentwicklung zu (WALDMANN et al. 2000;

HAMPSON u. THOMSON 2004). Als Alternative zur antibiotischen Therapie wäre eine Impfprophylaxe wünschenswert. Bisherige Impfstoffe führen zu weniger schweren Verläufen sowie einer geringeren Mortalität und Morbidität, verhindern jedoch nicht die Infektion (FERNIE et al. 1983; HAMPSON et al. 1993; DIEGO et al. 1995; LA et al. 2004; SONG et al. 2009)

Experimentelle Tiermodelle für die Schweinedysenterie 2.1.9

Bereits in den 1970ern, bevor bekannt war, welcher Erreger SD hervorruft, wurden Versuche zur Erzeugung der Erkrankung durchgeführt. Dazu wurde Kulturmaterial (HARRIS et al.

1972), frisches und zerkleinertes Kolonmaterial (OLSON 1974) oder auch Schleimhautgeschabsel (GLOCK et al. 1974) an Läuferschweine verfüttert. Es folgten Infektionsmodelle, in denen die Schweine auf verschiedenen Wegen mit den Bakterienkulturen inokuliert wurden (WHIPP et al. 1978; OLSON 1981; JACOBSON et al.

2007). Dabei stellte sich heraus, dass die Erzeugung des Krankheitsbildes der SD nicht nur

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von der Art und Verabreichung des Inokulums abhängig ist, sondern noch mehrere Faktoren eine wichtige Rolle spielen (MEYER et al. 1974). Bei gnotobiotischen Schweinen war die Verfütterung von Kulturmaterial von B. hyodysenteriae zur Erzeugung von klinischen Symptomen nicht ausreichend. Wurden sie aber zusätzlich mit gramnegativen Bakterien, wie zum Beispiel Fusobacterium necrophorum oder Bacteroides vulgatus, inokuliert, entwickelten sich die typischen klinischen Symptome und pathologischen Läsionen (MEYER et al. 1975; HARRIS et al. 1978). Nach Auswertung von Literaturdaten und eigenen Untersuchungen stellte Jacobson (2004) eine Liste mit folgenden Haupteinflussfaktoren für eine erfolgreiche Erzeugung des Krankheitsbildes der SD sowie für die Etablierung eines reproduzierbaren experimentellen Modells auf:

• Alter der Tiere (Absetzferkel)

• B. hyodysenteriae Stamm

• Verabreichung des Inokulationsmediums

• Fütterungsregime (Sojaanteil im Futter)

• Verabreichung von Kortikosteroiden und Antaciden

• Unterbringung in Gruppenhaltung

• Gabe anderer Bakterien (E. coli, Fusobacterium spp., Bacteroides vulgatus) Unter der Berücksichtigung dieser Variablen wurden am Friedrich-Loeffler-Institut Standort Jena verschiedene Infektionsversuche zur Etablierung eines reproduzierbaren Infektionsmodells für die Schweinedysenterie durchgeführt (SATTLER 2010). Besonders günstig für die Erzeugung des Krankheitsbildes der SD erwiesen sich folgende Parameter:

• Adaptionszeit von 5–6 Wochen nach dem Absetzen, d.h. 8-9 Wochen alt bei Inokulation

• Gruppenhaltung

• einstreulose Haltung

• Spezialfutter mit hohem Sojaanteil

• mehrfache intragastrale Applikation einer hohen Erregerdosis (100 ml Inokulum, 10⁶-10⁸ WBE 50/ml) bestimmter B.-hyodysenteriae-Stämme.

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2.2 Morphologie des Dickdarms

Anatomischer Aufbau 2.2.1

Das Schwein als omnivores Tier besitzt einen relativ voluminösen Darm, der in seiner Länge dem ca. 15-fachen der Körperlänge entspricht. Die Gesamtlänge des Darmes bei einem ausgewachsenen Tier kann zwischen 20 und 27 Metern (m) liegen, wobei der Dickdarm 3,5 m bis 6 m lang ist (VOLLMERSHAUS u. ROOS 1999). Der anatomische Aufbau des Schweinedarms ist in Abb. 2 schematisch dargestellt.

Abb. 2: Schema des Schweinedarms (aus NICKEL, SCHUMMER, SEIFERLE 2004, S. 124, modifiziert)

Der Dickdarm lässt sich in Zäkum, Kolon und Rektum einteilen. Das blind endende Zäkum ist 30 cm bis 40 cm lang und ähnelt im Aussehen einem stumpf-kegeligen Sack mit drei charakteristischen Bandstreifen oder Tänien. Es handelt sich dabei um eine ventrale, eine laterale und eine mediale Tänie. Zwischen diesen wölbt sich die Darmwand in Form von drei Poschenreihen vor. Das Kolon gliedert sich in drei Abschnitte: Colon ascendens, Colon transversum und Colon descendens. Das Colon ascendens zeigt einen besonderen Aufbau in Form einer stumpfkegeligen Spirale, bestehend aus zentripetalen und zentrifugalen

A: Magen B: Duodenum C: Jejunum D: Ileum E: Zäkum

F1: Colon ascendens Gyri centripetales F2: Colon ascendens

Gyri centrifugales G: Colon transversum H: Colon descendens

I: Rektum

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Windungen. Die Gyri centripetales winden sich 2,5 bis 4,5 mal um das Gekröse. An der Spitze der Spirale sind sie durch die Ansa centralis mit den Gyri centrifugales verbunden, deren ein bis zwei Windungen im Inneren des Kolonkegels liegen und zur Basis zurück laufen. Die letzte zentrifugale Windung geht in ein kurzes Colon transversum über, an welches sich das Colon descendes anschließt. Nahe der Medianen zieht dieses geradlinig, an einem kurzen, fettgewebsreichen Gekröse befestigt, beckenwärts und geht in das Rektum über. Eine deutliche Erweiterung des Rektums in Form der Ampulla recti ist in diesem sehr kurzen Dickdarmabschnitt des Schweines sichtbar (VOLLMERSHAUS u. ROOS 1999) .

Histologischer Aufbau der Wand des Dickdarms 2.2.2

Die Darmwand (Abb. 3) besteht aus Tunica mucosa, Tela submucosa, Tunica muscularis und Tunica serosa (LIEBICH 2004).

Abb. 3: Schema der einzelnen Dickdarmwandschichten (aus BLOOM u. FAWCETT (1962), modifiziert)

Tunica mucosa. Bei der Tunica mucosa handelt es sich um die Schleimhautschicht, die den Dickdarm von innen auskleidet. Sie besteht von innen nach außen aus folgenden Schichten:

Lamina epithelialis, Lamina propria mucosae und Lamina muscularis mucosae. Zum Darmlumen hin befindet sich die Lamina epithelialis, ein einschichtiges hochprismatisches Epithel aus Enterozyten, in welches zahlreiche Becherzellen eingestreut sind. Die hochprismatischen Zellen haben einen ovalen, basisnah liegenden Kern und besitzen luminal einen Mikrovillisaum. Der Lamina epithelialis schließt sich die Lamina propria mucosae an.

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Diese besteht aus lockerem Bindegewebe, kollagenen, elastischen- und retikulären Fasern, Blut- und Lymphgefäßen und Leukozyten. Anschließend folgt die Lamina muscularis mucosae, eine dünne Schicht aus glatten Muskelzellen. Am Anfang des Dickdarms ist sie wesentlich dünner und lässt im Rektum eine Zweiteilung in innere Zirkulär- und äußere Längsschicht erkennen. Sie bildet die Grenze zur Tela submucosa.

Tela submucosa. Sie besteht aus einer breiten Schicht aus lockerem Bindegewebe und schließt große Lymph- und Blutgefäße, Nerven und lymphoglanduläre Komplexe (LGCs) mit ein.

Tunica muscularis. Die Tunica muscularis besteht aus zwei Schichten, einer inneren Zirkulär- (Stratum circulare) und einer äußeren Längsschicht (Stratum longitudinale) aus glatten Muskelzellen. Zwischen den Muskelschichten befinden sich Lymph- und Blutgefäße und Nervengewebe. Die Tunica muscularis ist wichtig für die Darmperistaltik und damit den Transport der Nahrung und die Durchmischung des Futterbreis mit Verdauungsenzymen. Die Tänien entstehen durch die Zusammenraffung der Längsmuskelschicht.

Tunica serosa. Die Tunica serosa besteht aus einer einschichtigen Plattenepithelschicht (Mesothel) sowie der Lamina propria serosae, einer feinfaserigen, dünnen Bindegewebsschicht mit eingelagertem Fettgewebe und elastischen Fasern. Sie ist in der Lage, seröse Flüssigkeiten in die Körperhöhle zu sezernieren sowie Stoffe aus dieser aufzunehmen. Die Tunica serosa ist über die bindegewebige Tela subserosa mit der Tunica muscularis verbunden.

2.3 Schleimhaut-assoziiertes Lymphgewebe im Dickdarm des Schweines

Das schleimhautassoziierte Lymphgewebe im Dickdarm lässt sich in einen afferenten und efferenten Teil gliedern. Der afferente Teil wird von vielen einzelnen Lymphknötchen in der Darmwand, den lymphoglandulären Komplexen, gebildet. Der efferente Teil setzt sich aus Effektorzellen in der Lamina propria (ROTHKOTTER et al. 1991) und Lamina epithelialis (PABST u. ROTHKOTTER 1999) zusammen.

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Lymphoglanduläre Komplexe (LGK) 2.3.1

LGKs sind umschriebene lymphatische Bildungen in der Dickdarmschleimhaut. Im proximalen Kolon sind wenige LGKs vorhanden. Ein gehäuftes Auftreten der LGKs lässt sich bei jüngeren Tieren im mittleren und distalen Kolon beobachten (MORFITT u. POHLENZ 1989). Die Verteilung der LGKs entlang des Dickdarms wird mit zunehmendem Alter der Tiere durch die Ausreifung der Darmproportionen gleichmäßiger. Die Anzahl der LGKs liegt zwischen 1043 und 1499 bei Schweinen bis zum Alter von 13 Wochen (MORFITT u.

POHLENZ 1989). Bei sehr jungen Tieren enthalten die LGKs einen einzelnen Primärfollikel, wohingegen sie bei 13 Wochen alten Tieren aus bis zu 12 Sekundärfollikeln mit Keimzentren bestehen können (MORFITT u. POHLENZ 1989). Zwischen den Lymphfollikeln sind T- Lymphozyten-abhängige Interfollikularzonen zu finden. LGKs sind durch Epithelinvaginationen gekennzeichnet (MANSFIELD u. GAUTHIER 2004), die bis in die Tela submucosa reichen und als Verlängerungen der Schleimhautkrypten anzusehen sind (MORFITT u. POHLENZ 1989).

Follikelassoziiertes Epithel (FAE) 2.3.2

In der Tiefe der LGKs sind Bereiche mit spezialisiertem, follikelassoziiertem Epithel (FAE) vorhanden (LEMKE 1990). Das FAE weist im Vergleich mit dem absorptiven Epithel morphologische Besonderheiten auf, die eine Aufnahme von Antigenen ermöglichen. Nach dem Schluss der Darmbarriere ist über das FAE weiterhin die Aufnahme von Makromolekülen möglich. Auch Infektionserreger können über das FAE in den Körper gelangen (WOLF u. BYE 1984).

Im FAE liegt zwischen den hochprismatischen absorptiven Epithelzellen eine variable Anzahl spezialisierter intestinaler Epithelzellen, die sogenannten M-Zellen („microfold“ oder

„membraneous“ Zellen). Das apikale Zytoplasma der M-Zellen wird durch eine Ansammlung von intraepithelialen Lymphozyten oberhalb des Zellkerns verdrängt, sodass von den M- Zellen nur eine dünne apikale Zytoplasmamembran zu erkennen ist. Dies hat zur Bezeichnung als „membranous“ Zellen geführt (OWEN u. JONES 1974; EGBERTS et al. 1985). M-Zellen besitzen keinen Mikrovillisaum, sondern kurze Mikrofalten (WOLF u. BYE 1984). Es sind zahlreiche intraepitheliale Lymphozyten im FAE vorhanden (ERMAK u. OWEN 1986;

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GEBERT u. HACH 1993). Die Anzahl der Becherzellen ist im Vergleich zum absorptiven Epithel vermindert (O'LEARY u. SWEENEY 1986). Es findet im FAE kein Transport von IgA in das Darmlumen statt (MORFITT u. POHLENZ 1989). Über die M-Zellen erfolgen die Antigenaufnahme sowie der Antigentransport und damit die Initiierung einer Immunantwort in den darunter liegenden lymphatischen Strukturen (PAAR et al. 1992; GEBERT et al.

1996).

Effektorzellen in der Lamina propria 2.3.3

Die Zelltypen, die als Effektorzellen in der Dickdarmschleimhaut des Schweines liegen, sind wenig untersucht. Dagegen gibt es mehrere Studien über den Dünndarm. Die folgenden Befunde stammen daher überwiegend aus dem Dünndarm des Schweines. Die Lamina propria enthält viele Effektorzellen. Hierbei handelt es sich um B-Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen, dendritische Zellen sowie T-Lymphozyten (BROWN u. BOURNE 1976;

MOWAT u. VINEY 1997).

Zum Zeitpunkt der Geburt gibt es in der Lamina propria des Dünndarms des Schweines auch CD2⁺ T-Lymphozyten, die weder CD4 noch CD8 Co-Rezeptoren besitzen und deren Anzahl nach der Geburt rapide bis zum 12. Lebenstag ansteigt (ROTHKOTTER et al. 1991; VEGA- LOPEZ et al. 2001). Die Anzahl der CD4⁺- und CD8⁺ T-Lymphozyten entspricht am 12.

Lebenstag der Anzahl der CD2⁺ T-Lymphozyten (ROTHKOTTER et al. 1994). Der Anteil der CD2⁺CD4^-CD8^- T-Lymphozyten nimmt ab der zweiten Lebenswoche ab. Dagegen nehmen die CD4⁺ T-Lymphozyten beginnend in der ersten Lebenswoche bis zum 40.

Lebenstag um das 150fache zu (ROTHKOTTER et al. 1991). Immunhistologische Untersuchungen des Duodenums, Jejunums, Ileums und Kolons zeigten, dass es sich bei den T-Lymphozyten in der Lamina propria aller Darmlokalisationen, bei 40 Tage alten Schweinen, hauptsächlich um CD4⁺T-Lymphozyten handelt (ROTHKOTTER et al. 1991). In einer anderen Untersuchung wurde mittels Durchflusszytometrie in der Lamina propria des Jejunums ein Verhältnis von 0,7:1 CD4⁺ T- zu CD8⁺ T-Lymphozyten ermittelt (HAVERSON et al. 1999). CD8⁺ T-Lymphozyten erscheinen in einer größeren Anzahl erst im Alter von 5 bis 7 Wochen in der Lamina propria des Dünndarms (VEGA-LOPEZ et al. 1995). In der Lamina propria sind zytotoxisch aktive Lymphozyten hauptsächlich NK-Zellen (ABREU- MARTIN u. TARGAN 1996).

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Dendritische Zellen (DC) in der Lamina propria besitzen lange zytoplasmatische Prozesse, mit deren Hilfe sie auf der Mukosaseite des Darms direkten Zugang zu luminalen Antigenen zu haben scheinen. Diese Prozesse ragen zwischen den Epithelzellen bis in das Darmlumen, sind aber beim gesunden Schwein selten (BIMCZOK et al. 2006). Zwischen dem 2. und 5.

sowie 12. und 20. Lebenstag steigt die Anzahl der CD16⁺MHCII⁺DCs in der Lamina propria des Jejunums sowohl bei konventionell als auch bei unter besonderes hohen Hygienestandards gehaltenen Schweinen stark an (INMAN et al. 2010a). Die Anzahl der DCs war vom 5. bis 20. Lebenstag bei den unter hohen Hygienestandards gehaltenen Schweinen höher als bei den konventionell gehaltenen Tieren. Am 28. Lebenstag zeigten sich keine Unterschiede mehr in der Anzahl der DCs zwischen beiden Gruppen (INMAN et al. 2010a).

Bei 5 Tage alten Tieren konnten nur IgM⁺-Plasmazellen in der Lamina propria des Jejunums und Ileums nachgewiesen werden. Ab dem 12. Lebenstag nahm die Anzahl der IgA⁺- Plasmazellen stark zu (ROTHKOTTER et al. 1991) und stellte ab der 2. Lebenswoche (BIANCHI et al. 1992) bzw. 3. Lebenswoche (PABST u. ROTHKOTTER 1999) den dominierenden Plasmazelltyp in der Lamina propria des Dünndarms dar. Der prozentuale Anteil der IgA⁺-Plasmazellen an den Gesamtzellen in der Lamina propria lag zwischen 15%

im Duodenum und 7% - 8% im Colon ascendens und Colon descendens (DUNCKER et al.

2006). Die Anzahl der Plasmazellen war im Duodenum höher als im Jejunum oder Ileum (PABST u. ROTHKOTTER 1999).

Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) 2.3.4

Intraepitheliale Lymphozyten sind mononukleäre Zellen, die zwischen den Enterozyten des epithelialen Anteils der Darmschleimhaut lokalisiert sind. Sie migrieren aus der Lamina propria in das Epithel (VEGA-LOPEZ et al. 1995). Die Anzahl und die strategische Lokalisation der IEL nahe dem intestinalen Lumen und damit nahe den luminalen Antigenen lässt auf eine wichtige Rolle in der Regulierung der Immunantwort im Darm schließen (PABST 1987; VEGA-LOPEZ et al. 2001). Es konnten bislang zwei Subpopulationen der CD2⁺ intraepithelialen T-Lymphozyten identifiziert werden. Eine Subpopulation hat den Phänotyp CD2⁺CD4^-CD8⁺ (VEGA-LOPEZ et al. 1993) und liegt im Bereich der Basalmembran der Epithelzellen (SOLANO-AGUILAR et al. 2001). Dieses kann auf eine

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zytotoxische und regulatorische Rolle hindeuten (PABST 1987; VEGA-LOPEZ et al. 1995).

Die zweite Subpopulation hat den Phänotyp CD2⁺CD4^-CD8^- und ist apikal im Epithel positioniert (VEGA-LOPEZ et al. 1993). Die IEL stellen eine heterogene Gruppe von Lymphozyten, γδ T-Lymphozyten und NK-Zellen dar. Es konnten im Oberflächenepithel des Jejunums und Ileums keine γδ T-Lymphozyten ermittelt werden (ROTHKOTTER et al.

1999). IELs werden als potente zytotoxische und immunregulatorische Effektorzellen beschrieben (HAYDAY et al. 2001).

Entlang des Darmes vom Duodenum zum Kolon nimmt die Anzahl der im Epithel gelegenen IEL ab (DUNCKER et al. 2006). Ein Anstieg der Anzahl der IEL konnte mit zunehmendem Alter im Jejunum und Ileum bei jungen Schweinen gezeigt werden. So zeigte sich bei Ferkeln ein altersabhängiger Anstieg der IEL vom 12. zum 17. Lebenstag (ROTHKOTTER et al.

1999). Dagegen war die Anzahl der IEL bei Schweinen im Alter von einem und 4,5 Jahren vergleichbar (ROTHKOTTER et al. 1999). Die Anzahl der CD8⁺ T-Lymphozyten im Epithel war größer als die im dazugehörigen Kompartiment der Lamina propria im Dünndarm (DUNCKER et al. 2006).

2.4 Entzündungs- und Immunzellen des Schweines

Im folgenden Abschnitt werden das System und die Benennung der Differenzierungsantigene auf den Immunzellen beim Schwein sowie die Eigenschaften und das Vorkommen der in der nachfolgenden Untersuchung dargestellten Differenzierungsantigene und der durch diese Differenzierungsantigene dargestellten Zelltypen beschrieben.

„Cluster of Differentiation“ (CD) System des Schweines 2.4.1

Immunzellen können mit ihrer direkten Umwelt und anderen Zellen interagieren. Dazu besitzen sie verschiedene Glykoproteine auf ihrer Zelloberfläche. Die Oberflächenproteine können als Transportproteine und als Rezeptoren für Zytokine, Antikörper und Komplement dienen oder enzymatische Aktivitäten aufweisen (TIZARD 2004b). Diese an der Zelloberfläche lokalisierten Glykoproteine werden auch Differenzierungsantigene (cluster of differentiation antigens, CD Antigene) genannt. Sie sind in einem CD-System klassifiziert, in dem sie eine spezifische Nummer erhalten (SAALMÜLLER 1996). Die Epitope der CD-

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Antigene unterscheiden sich bei verschiedenen Spezies; homologe CD-Antigene werden jedoch unter derselben Nummer geführt. Um den Bezug zu der jeweiligen Spezies hervorzuheben, wird ein Kürzel für die jeweilige Spezies, z. B. „sw“ für Schwein oder „bo“

für Rind, der Bezeichnung CD vorangestellt.

Die erste Veröffentlichung von monoklonalen Antikörpern (mAk), die Epitope auf Schweineleukozyten erkennen, erfolgte im Jahr 1984 (JONJIC u. KOSZINOWSKI 1984;

PESCOVITZ et al. 1984). Zuvor wurden Lymphozyten- und Makrophagenpopulationen aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften identifiziert (SALMON 1979; OUTTERIDGE et al. 1982). Zuerst wurden gegen menschliche CD-Antigene gerichtete monoklonale Antikörper auf ihre Kreuzreaktivität mit Zelloberflächenantigenen porziner Zellen getestet (PESCOVITZ et al. 1984). Diese Versuche waren wenig erfolgreich, da Kreuzreaktivität nur zwischen wenigen CD-Antigenen, wie beispielsweise CD18 und CD44, nachgewiesen werden konnte (LUNNEY et al. 1994). Um die Reaktivität existierender mAks beim Schwein zu überprüfen, wurden im Folgenden drei internationale Workshops abgehalten (LUNNEY et al. 1994;

SAALMÜLLER et al. 1998; HAVERSON et al. 2001). Die Workshops ermöglichten eine Bestandsaufnahme der für den Nachweis der CD-Antigene beim Schwein verfügbaren Antikörper (PIRIOU-GUZYLACK u. SALMON 2008).

In den Veröffentlichungen der Workshops sind grundlegende Informationen über die mAks angegeben: Bezeichnung des Differenzierungsantigens, das erkannt wird, Molekulargewicht (MW) des erkannten Epitops, Name des Hybridoms und Isotyp des mAk. Eine CD-Nummer wird für ein Differenzierungsantigen nur vergeben, wenn es von mindestens zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern erkannt wird und seine Verteilung im Gewebe bekannt ist. Bei den CD-Antigenen werden echte Homologe, bei denen das MW des Antigens beim Schwein gleich dem des humanen Antigens ist, als swCD bezeichnet (LUNNEY et al.

1994). Es wird das Präfix „w“ verwendet, wenn mindestens zwei verschiedene mAks an ein Differenzierungsantigen binden, aber das MW nicht bekannt ist (LUNNEY et al. 1994;

SAALMÜLLER 1996). Die Bezeichnung „Swine Workshop Cluster Number“ (SWCs) wird benutzt, um Differenzierungsantigene des Schweins zu bezeichnen, die mit keinem bekannten humanen oder murinen CD-Antigen übereinstimmen (SAALMÜLLER 1996).

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Charakteristika der in der vorliegenden Untersuchung verwendeten 2.4.2

Differenzierungsantigene

Tab. 2 gibt einen Überblick über die in der Untersuchung verwendeten Differenzierungsantigene und soweit zum Verständnis notwendig, einzelne weitere Differenzierungsantigene des Schweines. Weitere Eigenschaften einzelner CD-Antigene sind im Folgenden zusammengefasst.

swCD4 Antigen

Das porzine CD4 ist ein monomeres Transmembran Glykoprotein, mit einer Molekularmasse von 55 kDa (PESCOVITZ et al. 1984; LUNNEY u. PESCOVITZ 1987; LUNNEY et al.

1994). Der in der vorliegenden Untersuchung verwendete monoklonale Antikörper 74-12-4 markiert porzine CD4⁺T-Helferzellen (PESCOVITZ et al. 1984).

swCD8 Antigen

Das porzine CD8 ist ein dimerisches Protein mit einer Molekularmasse von 30-35 kDa (JONJIC u. KOSZINOWSKI 1984; LUNNEY et al. 1994). Es kann als αα-Homodimer oder αβ-Heterodimer vorliegen. Das CD8 Molekül ist in unterschiedlicher Dichte auf der Zelloberfläche von CD8⁺ T-Lymphozyten exprimiert (SAALMÜLLER et al. 1994a;

ZUCKERMANN et al. 1998). Das CD8 Molekül wird von den meisten Thymozyten exprimiert und zu einem großen Anteil von peripheren T-Lymphozyten im Blut und in lymphoiden Geweben (SAALMÜLLER et al. 1994a). Der Anteil der CD8⁺ T-Lymphozyten zeigt große individuelle Unterschiede (SAALMÜLLER et al. 1987). CD8α ist auch auf γδ T- Lymphozyten und natürlichen Killerzellen zu finden (WATERS et al. 2000). In der vorliegenden Untersuchung wurde der mAk 11-295-33 verwendet, der an CD8β bindet, und nicht der mAk 76-2-11, der an CD8α bindet (JONJIC u. KOSZINOWSKI 1984).

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Tab. 2: Eigenschaften der in der vorliegenden Untersuchung verwendeten Differenzierungsantigene

Differenzierungs- antigene

Expression von s.u. bekannte Funktionen Referenz

CD1 Thymozyten, Langerhanszellen, Subpopulation DCs, periphere

B-Lymphozyten

MHCI ähnliches Molekül, Antigenpräsentation

(LUNNEY u. PESCOVITZ 1987; PESCOVITZ et al.

1990; SALMON et al. 2000)

CD2 T-Lymphozyten, einige B- Lymphozyten, NK-Zellen

Adhäsionsmolekül (SINKORA et al. 1998;

BUTLER et al. 2009;

GERNER et al. 2009)

CD4 T-Helferzellen

Corez. für MHCII, große Bedeutung bei Antigenerkennung

(ZHU u. PAUL 2008)

CD8α T-Lymphozyten mit zytotox.

Fkt., NK-Zellen

Corezeptor für MHCI, Bedeutung bei der Antigenerkennung

(SAALMÜLLER et al.

1994b; YANG u.

PARKHOUSE 1997;

ZUCKERMANN et al.

1998; GERNER et al. 2009) CD8β zytotoxische T-Lymphozyten

CD14

Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, DCs

Rezeptor für LPS und LPS-bindendem Protein

(CARRASCO et al. 2001;

EZQUERRA et al. 2009) CD16 Granulozyten, DCs, NK,

Monozyten

Bestandteil des niedrigaffinen Rezeptors

FcγRIII

(DATO et al. 1992;

HALLORAN et al. 1994a;

HAVERSON et al. 2000;

CARRASCO et al. 2001;

RAYMOND et al. 2006) CD163 Monozyten, Subpopulation

Makrophagen, Gewebe DCs

Rezeptor des Hämoglobin- Haptoglobin Komplexes

(KRISTIANSEN et al. 2001;

HAVERSON et al. 2007;

PIRIOU-GUZYLACK u.

SALMON 2008) MHCII DR B-Lymphozyten, Makrophagen,

DCs, CD4⁺T-Lymphozyten, CD8⁺T-Lymphoyzten

Antigenpräsentation (LUNNEY u. PESCOVITZ 1987; INMAN et al. 2010b)

SWC1 ruhende T-Lymphozyten, Monozyten, Subpopulation Granulozyten

unbekannt (SAALMÜLLER et al.

1994c; MAGYAR et al.

1995; LEITNER et al. 2012)

SWC3a/CD172a Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, Subpopulation

DCs

Signal regulierendes Protein SIRPα

(MAGYAR et al. 1995;

EZQUERRA et al. 2009)