Etablierung der Doppel- und Dreifachimmunfluoreszenzmarkierungen

4.1.1 Ergebnisse der Darstellung der Immunzellen im Dickdarm mit der APAAP

Methode Vor Durchführung der Einzel- und anschließenden Mehrfachimmunfluoreszenzmarkierungen

wurden die in der Mehrfachimmunfluoreszenzmarkierung verwendeten Primärantikörper mit der Alkalischen-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (APAAP) im Zäkum, proximalen Kolon, der Ansa centralis und des Colon descendens der klinisch gesunden Schweine und im proximalen Kolon der Tiere mit experimentell induzierter Schweinedysenterie eingesetzt. Hierdurch konnten die Verteilung und die Morphologie der Zellen im Gewebe besser beurteilt werden. Diese Vorkenntnisse erleichterten die Einschätzung und Beurteilung der fluorochrom-markierten Zellen.

Weiterhin wurden die Epitope CD8α und CD8β in konsekutiven Schnitten markiert, um Anzahl und Verteilung der CD8⁺ T-Lymphozyten mit den entsprechenden Epitopen in der Kolonschleimhaut zu vergleichen. Schließlich wurden auch die Endothelzellen mit MIL11 (anti-porzine Endothelzellen, Isotyp: IgE) dargestellt.

4.1.1.1 Verteilung der MHCII⁺ exprimierenden Zellen

Mit dem Antikörper MSA3 ließ sich das Epitop MHCII auf einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen darstellen. In der Mukosa aller vier untersuchten Dickdarmlokalisationen wurden Makrophagen, Lymphozyten, dendritische Zellen und Endothelzellen markiert. Epithelzellen und Granulozyten blieben ohne Markierung.

Unter dem Oberflächenepithel waren Gruppen von MHCII⁺ Zellen zu finden. Dies erschwerte die Abgrenzung einzelner Zellen. Zum Teil lagen die Zellen eng nebeneinander und waren in mehreren Reihen angeordnet. Teilweise stellten sich einzelne Zellen in diesem Bereich als besonders rund und groß dar.

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Im apikalen Anteil der Schleimhaut, in dem relativ viel Lamina propria zwischen den Epithelanschnitten vorhanden war, lagen die markierten Zellen diffus verteilt. In der Lamina propria ließen sich Zellen mit der Morphologie von dendritischen Zellen, die zum Teil Zellausläufer entlang der Basalmembran der Krypten hatten, und einzeln liegende Zellen mit der Morphologie von Makrophagen, die häufig in direkter Nähe von Zellen mit der Morphologie von Lymphozyten zu finden waren, unterscheiden. Letztere waren relativ klein und besaßen einen großen Zellkern und einen schmalen Zytoplasmasaum.

Im basalen Anteil der Schleimhaut war die Lamina propria schmaler und die markierten Zellen lagen einzeln zwischen den Krypten. Dabei stellten sich Makrophagen, Lymphozyten und dendritische Zellen dar.

Weiterhin wurden die Endothelzellen der Kapillaren in der Lamina propria dargestellt. Die länglichen Anschnitte der Kapillaren waren besonders markant in breiteren Bereichen der Lamina propria im apikalen Anteil der Schleimhaut. Einzelne Anschnitte ließen sich auch in den schmaleren Anteilen der Lamina propria im basalen Anteil der Schleimhaut darstellen.

Zahlreiche MHCII⁺ Zellfragmente konnten nicht eindeutig einer Zellart zugeordnet werden.

Bei den Tieren mit experimentell induzierter Schweinedysenterie war die Lamina propria im basalen Anteil und vor allem im apikalen Anteil der Schleimhaut schmaler als bei den Kontrolltieren. Es waren daher weniger MHCII⁺ Zellen in der schmalen Lamina propria des proximalen Kolons zu finden als bei den Kontrolltieren. In der basalen und apikalen Lamina propria war eine erhöhte Anzahl an Kapillarendothelanschnitten im Vergleich zu den Kontrolltieren vorhanden. Diese waren vor allem im basalen Anteil der Schleimhaut häufig länglich angeschnitten. Einzelne MHCII⁺ Zellen lagen in direkter Nähe zu den Kapillarendothelien. Im apikalen Anteil der Lamina propria unter dem sich ablösenden Oberflächenepithel waren multifokale Gruppen MHCII⁺ Zellen zu finden, ebenso in den Fibrinmassen im Darmlumen.

4.1.1.2 Verteilung der CD16 exprimierenden Zellen

Bei den Kontrolltieren waren die CD16⁺ Zellen gleichmäßig in der gesamten Lamina propria verteilt. Einzelne Zellen konnten nicht differenziert werden. Es zeigten sich keine Unterschiede in der Verteilung zwischen den untersuchten Lokalisationen der Kontrolltiere.

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Bei den Tieren mit experimentell induzierter Schweinedysenterie waren mehr CD16⁺ vorhanden.Vor allem im basalen Anteil der Schleimhaut traten Ansammlungen CD16⁺ Zellen zwischen den Krypten auf. Im apikalen Anteil der Schleimhaut waren CD16⁺ Zellen teils einzeln, teils in kleinen Gruppen zu finden. Direkt unter dem Oberflächenepithel lagen besonders große und rundliche CD16⁺ Zellen nebeneinander angeordnet. In den Fibrinmassen im Darmlumen befanden sich die CD16⁺ Zellen vor allem massenhaft über zerstörtem Oberflächenepithel. Sie unterschieden sich stark in ihrer Form von den CD16⁺ Zellen in der Schleimhaut. Die Markierungen der CD16⁺ Zellen im Fibrin im Darmlumen waren innerhalb eines Tieres unterschiedlich stark ausgeprägt.

4.1.1.3 Verteilung der markierten Endothelzellen

Mit dem monoklonalen Antikörper MIL 11 (anti-porzine Endothelzellen, Isotyp: IgE) wurden die Endothelzellen in der Darmschleimhaut selektiv markiert. Bei den Kontrolltieren stellten sich die Anschnitte der Kapillarendothelzellen in der Lamina propria der drei Kolonlokalisationen und des Zäkums dar. Ihre Form variierte von rund bis länglich.

Anschnitte der Endothelien größerer Gefäße waren nur in der Submukosa lokalisiert. In der Lamina propria der 6 erkrankten Tiere konnten mehr Kapillarendothelanschnitte dargegestellt werden als bei den Kontrolltieren. Ihre Form ähnelte denen der Kontrolltiere. Zusätzlich zu den Anschnitten der Kapillarendothelien konnten auch kleine Gefäßanschnitte in der Lamina propria dargestellt werden. Diese Befunde ergänzten und bestätigten die Befunde der MHCII-Markierung.

4.1.1.4 Verteilung der CD4⁺ T-Lymphozyten

Die CD4⁺ T-Lymphozyten zeigten in den 3 Kolonlokalisationen und im Zäkum der Kontrolltiere eine vergleichbare Verteilung. Die Lage der CD4⁺ T-Lymphozyten war auf die Lamina propria begrenzt. Dort waren sie ungleichmäßig in Gruppen und mitunter auch einzeln angeordnet. Die Zellen stellten sich unregelmäßig rund dar und konnten, wenn sie in Gruppen lagen, häufig nicht voneinander abgegrenzt werden.

Bei den Tieren mit experimentell induzierter SD war die Anzahl der CD4⁺ T-Lymphozyten in der Lamina propria geringer als bei den Kontrolltieren. Sie waren hauptsächlich als Einzelzellen in der Lamina propria zu finden. In den Fibrinmassen im Darmlumen lagen

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schwach markierte CD4⁺ T-Lymphozyten. Diese unterschieden sich hochgradig in ihrer Form von den CD4⁺ T-Lymphozyten in der Lamina propria.

4.1.1.5 Verteilung der CD8⁺ T-Lymphozyten Verteilung der CD8β⁺ T-Lymphozyten

Die CD8β⁺ T-Lymphozyten in der Lamina propria und im intestinalen Epithel zeigten in den 3 Kolonlokalisationen und im Zäkum bei den Kontrolltieren eine ähnliche Verteilung. In der Lamina propria lagen die CD8β⁺ T-Lymphozyten überwiegend einzeln, gleichmäßig verteilt und epithelnah. In mehreren Lokalisationen konnte Zellansammlungen unter dem Epithel beobachtet werden. Im Epithel waren sie zwischen den Epithelzellen der Krypten zu finden.

Dabei lagen sie auf der Höhe der Epithelzellkerne. Bei Tieren mit experimentell induzierter SD waren weniger CD8β⁺ T-Lymphozyten sowohl in der Lamina propria als auch intraepithelial lokalisiert. Die Zellen lagen gleichmäßig und einzeln angeordnet.

Verteilung der CD8α⁺ T-Lymphozyten

Bei den Kontrolltieren wurde nur das proximale Kolon zum Vergleich herangezogen. Im proximalen Kolon ähnelte ihre Verteilung der der CD8β⁺ T-Lymphozyten. Es stellten sich mehr CD8α⁺ T-Lymphozyten als CD8β⁺ T-Lymphozyten sowohl in der Lamina propria als auch im Epithel dar. Die Beobachtungen, dass mehr CD8α⁺ T-Lymphozyten als CD8β⁺ T-Lymphozyten markiert wurden, wird durch durchflusszytometrische Untersuchungen bestätigt, die zeigten, dass CD8α auch von γδ T-Zellen und natürlichen Killerzellen exprimiert wird (WATERS et al. 2000). Um ausschließlich CD8⁺ T-Lymphozyten zu erfassen, wurde in den Mehrfachimmunfluoreszenzmarkierungen der monoklonale Antikörper 11-295-33 (anti- porzines CD8β) verwendet.

4.1.1.6 Verteilung der IgA⁺ Plasmazellen

Bei den Kontrolltieren zeigten sich keine Unterschiede in der Verteilung der IgA-markierten Strukturen zwischen den drei Kolonlokalisationen und dem Zäkum. Die Lamina propria enthielt vor allem im basalen Anteil der Schleimhaut zahlreiche Plasmazellen, die häufig nicht einzeln abgrenzbar waren. Im basalen Drittel der Krypten färbte sich das Zytoplasma der Kryptepithelzellen schwach, der Bürstensaum intensiv positiv für IgA. Auch der Schleim

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im Kryptlumen zeigte eine intensive Markierung für IgA. Im apikalen Anteil der Lamina propria waren nur einzelne IgA⁺ Plasmazellen zu finden. Die IgA⁺ Plasmazellen zeigten bei den Tieren mit experimentell induzierter SD eine vergleichbare Verteilung wie bei den Kontrolltieren. Im basalen Anteil der Lamina propria lagen sie in Haufen, sodass einzelne Zellen nicht differenziert werden konnten, im apikalen Anteil waren nur einzelne IgA⁺ Plasmazellen zu finden. In einzelnen Krypten fehlte die Markierung des Zytoplasmas und des Bürstensaums der Epithelzellen für IgA. Die epithelnahen Fibrinmassen im Darmlumen waren positiv für IgA.

4.1.2 Validierung der Auswertung

Um die individuelle untersucherbedingte Variation in der Auswertung möglichst gering zu halten, wurde die Auswertung von einem Untersucher an einem Arbeitsplatz durchgeführt.

Dieser war zur besseren Übersicht über die Fotos mit zwei Bildschirmen ausgestattet. Um die Variation der Grenzwertsetzung zur Detektion der markierten Zellen zu kontrollieren, wurden Testmessungen zu Beginn der Mehrfachimmunfluoreszenzmarkierungen durchgeführt.

Hierfür wurden in einem zeitlichen Abstand 44 repräsentative Fotos der Doppelimmunfluoreszenzmarkierung MHCII und CD16 bei den Kontrolltieren in einem zeitlichen Abstand von mehreren Tagen von demselben Untersucher wiederholt ausgewertet.

Die ermittelten Daten wurden miteinander verglichen. Die statistische Auswertung zeigte keine signifikanten Unterschiede (p-Werte > 0,05) für die ermittelten Flächenanteile der MHCII⁺, der CD16⁺ und MHCII⁺CD16⁺ Zellen zwischen der der 1. und 2.

Wiederholungsmessung (Tab. 18).

Tab. 18: Statistischer Vergleich der Wiederholungsmessungen an repräsentativen Schnitten (p – Werte des statistischen Vergleiches der Flächenanteile)

markierte Epitope 1. Messung

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4.2 Menge und Verteilung der Immunzellen in der Schleimhaut von