Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase (APAAP) –

Die APAAP-Methode ist eine Enzym-anti-Enzymkomplex-Methode. Sie zählt zu den empfindlichsten immunhistologischen Methoden, da durch den Einsatz stabiler Immunkomplexe die natürliche Affinität von Antikörpern gegenüber ihrem Antigen genutzt wird. Die Benennung der Immunkomplexmethoden erfolgt nach dem jeweils verwendeten Enzym. Bei der APAAP-Methode erfolgte die Benennung nach dem Enzym Alkalische Phosphatase. Die Alkalische Phosphatase katalysiert die hydrolytische Spaltung von Estern der Orthophosphorsäure mit Alkoholen oder Phenolen bei stark alkalischem pH-Optimum und ist an der Zellmembran lokalisiert. Typische Lokalisationen sind in den Nieren der Bürstensaum der proximalen Tubuli und der Bürstensaum im Dünndarm. Ein APAAP-Komplex ist aus jeweils zwei Molekülen alkalischer Phosphatase und einem dagegen gerichteten Antikörper aufgebaut.

Im ersten Reaktionsschritt wird bei den Immunkomplexmethoden ein unkonjugierter Primärantikörper verwendet, der an das Antigen im Gewebe bindet. Im zweiten Reaktionsschritt wird ein unkonjugierter Sekundärantikörper aufgetragen, dieser ist gegen das Fc-Fragment des Primärantikörpers gerichtet. Der Sekundärantikörper muss im Überschuss vorliegen, damit eine Bindung an den Fab-Arm des Primärantikörpers gewährleistet ist und der andere Fab-Arm noch zur Anlagerung für den Antikörper aus dem Enzym-Immunkomplex zur Verfügung steht. Im dritten Reaktionsschritt werden lösliche Enzym-anti-Enzymkomplexe hinzugegeben. Der Antikörper des Enzym-Immunkomplexes muss aus derselben Spezies stammen wie der Primärantikörper. Somit wird die Funktion des Sekundärantikörpers als Brückenantikörper gewährleistet und dieser kann Primärantikörper und den Enzym-Immunkomplex miteinander verbinden. Der Abschluss der Reaktion findet mit einer Substrat-Chromogen-Reaktion statt.

11 eigene Herstellung; siehe Anhang

12 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Seelze-Hannover, Deutschland

69 MATERIAL UND METHODEN

Durchführung

Die Gefrierschnitte wurden aus dem Tiefkühlschrank genommen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Nach etwa der Hälfte der Trocknungszeit wurde der Gewebebereich auf dem Objektträger mit einem Fettstift¹³ umrandet. Die Fixierung der Schnittpräparate erfolgte nach der Trocknungszeit für 90 Sekunden in einer bei 4°C frisch angesetzten Aceton-Methanol-Lösung. Die Lösung wurde in einem Verhältnis von 1:2 angesetzt. Anschließend wurden die Schnitte in Tween-TBS¹⁴ gespült (3 x 5 Minuten), um die Fixierungsmittelreste zu entfernen.

Zur Vermeidung einer unspezifischen Hintergrundfärbung durch die Anlagerung des Primärantikörpers an elektrisch geladene Kollagen- und Bindegewebselemente wurde vor Zugabe des Primärantikörpers eine neutrale Proteinlösung aufgetragen. Bei dem sogenannten Blockserum handelte es sich um inaktiviertes Serum derselben Spezies aus dem der Sekundärantikörper stammte. Die Schnitte wurden mit je 50 µl hitzeinaktiviertem Kaninchenserum für 20 Minuten in einer 1:10 Verdünnung mit Tween-TBS¹⁵ bei Raumtemperatur in feuchten Kammern¹⁶ inkubiert. Nach dem Ablauf der Inkubationszeit wurde das Blockserum vorsichtig dekantiert. Im nächsten Reaktionsschritt erfolgte die Inkubation der Schnitte mit jeweils 50 µl des jeweiligen Primärantikörpers, verdünnt in 12,5%igem bovinen Serumalbumin¹⁷ verdünnt in DPBS¹⁸. Die Konzentration der Primärantikörper ist in Tab. 6 angegeben. Diese Inkubation und alle weiteren erfolgten in feuchten Kammern. Die Primärantikörper wurden für 60 Minuten auf den Schnitten bei Raumtemperatur belassen. Die Antikörperlösung wurde nach Ablauf der Inkubationszeit mit Tween-TBS aus einer Pipette und drei weiteren Spülschritten in Tween-TBS (3x5 Minuten) abgespült. Im nächsten Schritt wurde ein Anti-Maus-Ig- Antikörper aus dem Kaninchen¹⁹ in einer Verdünnung von 1:50 PBS und Schweinenormalserum auf die Schnitte aufgetragen. Die

13 PAP-Pen/DAKO Pen, Fa. Dako, Hamburg, Deutschland

14 eigene Herstellung, siehe Anhang

15 eigene Herstellung, siehe Anhang

16 Fa. Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland

17 eigene Herstellung, siehe Anhang

18 eigene Herstellung, siehe Anhang

19 Fa.Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, UK vertrieben durch Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig, Deutschland

MATERIAL UND METHODEN 70

Inkubation des Antikörpergemisches erfolgte bei Raumtemperatur für 30 Minuten in feuchten Kammern.

Tab. 6: Übersicht über die bei der APAAP-Methode verwendeten Primärantikörper mit Angabe der Spezifität, Isotyp, Verdünnung und Herkunft; sowie des verwendeten Sekundärantikörpers mit Angabe der Herkunftsspezies, Spezifität, Isotyp, Verdünnung und Herkunft sowie Angabe des verwendeten Enzymkomplexes mit Verdünnung und Herkunft

Klon Spezifität Verdünnung Herkunft

MSA3 MHCII 1:30 VMRD²⁰

G7 CD16 1:80 Serotec²¹

74-12-4 CD4 1:10 Southern Biotech²²

11-295-33 CD8b 1:2 TiHo Hannover²³

2B2 Granulozyten 1:100 Serotec²⁴

76-2-11 CD8a 1:40 VMRD²⁵

MIL11 Endothelzellen 1:100 Serotec²⁶

K611B4 IgA 1:20 Serotec²⁷

Sekundärantikörper

Herkunftsspezies Spezifität Isotyp Verdünnung Herkunft

Kaninchen anti Maus IgG 1:50

20 Fa.VMRD, Pullman, USA, vertrieben durch Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig, Deutschland

21 Fa. MorphoSys AbD GmbH, AbD Serotec Biotechnologie, Düsseldorf, Deutschland

22 Fa. SouthernBiotech, Birmingham, USA

23 Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Virologie

24 Fa. MorphoSys AbD GmbH, AbD Serotec Biotechnologie, Düsseldorf, Deutschland

25 Fa.VMRD, Pullman, USA, vertrieben durch Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig, Deutschland

26 Fa. MorphoSys AbD GmbH, AbD Serotec Biotechnologie, Düsseldorf, Deutschland

27 Fa. MorphoSys AbD GmbH, AbD Serotec Biotechnologie, Düsseldorf, Deutschland

28 Fa.Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, UK vertrieben durch Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig, Deutschland

29 Fa. DAKO, Hamburg, Deutschland

71 MATERIAL UND METHODEN

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde auch diese Antikörperlösung zuerst mit Tween-TBS aus einer Pipette vorsichtig abgespült, gefolgt von drei weiteren Spülschritten (3x5 Minuten).

Folgend wurde jeweils 50 µl des APAAP-Komplexes³⁰ aus der Maus in einer Verdünnung von 1:50 in Tween-TBS auf die Schnitte aufgetragen. Die Inkubation erfolgte für 30 Minuten in feuchten Kammern bei Raumtemperatur. Nach Ablauf der Inkubationszeit erfolgte wiederum die Spülung mit Tween-TBS (3x5 Minuten). Zur Verstärkung der Reaktion wurden wiederholt der Sekundärantikörper und der APAAP-Komplex, wie beschrieben, aufgetragen.

Die Inkubationszeit wurde in den Verstärkungsschritten auf 20 Minuten begrenzt. Nach der Spülung in Tween-TBS wurden die Schnitte gründlich in Aqua dest. gespült. Schließlich erfolgte die Durchführung der Enzym-Substrat-Reaktion mit der Neufuchsin- Methode.

Hierfür waren folgende Lösungen notwendig:

Lösung 1:

0,53 g 2-Amino-methyl-1,3-propandiol³¹ wurden in 25 ml Aqua dest. gelöst, sodass eine 0,2 M Aminomethylpropandiol-Lösung entstand. Ferner wurden 6,057 g Tris- hydroxymethylaminomethan³² in 1 l Aqua dest. gelöst, sodass man 0,05 M Trispuffer erhielt, dessen pH-Wert auf 9,7 eingestellt wurde. 25 ml der Aminomethylpropandiol-Lösung wurden mit 75 ml Trispuffer und 675 mg Natriumchlorid gemischt und hierin 40 mg Levamisol³³ Neufuchsinlösung entstand. Ferner wurden 40 mg kristallines Natriumnitrit in 1 ml Aqua dest.

30 Fa. DAKO, Hamburg, Deutschland

31 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

32 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

33 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

34 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

35 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

MATERIAL UND METHODEN 72

gelöst, sodass man eine 4 %ige Natriumnitritlösung erhielt. Man mischte 200 µl der 5% igen Neufuchsinlösung mit 500 µl der 4% igen Natriumnitritlösung und ließ sie 60 Sekunden unter Schütteln miteinander mischen.

Die Lösungen 1 und 3 wurden gemischt und anschließend die Lösung 2 hinzugegeben. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1 N Salzsäure auf 8,7 eingestellt und die erhaltene Lösung in Glasküvetten filtriert. Die Schnitte wurden dann für 15-20 Minuten unter Schütteln inkubiert, wobei die Farbintensität mehrfach mikroskopisch kontrolliert wurde. Zur Beendung der Reaktion wurden die Schnitte in Aqua dest. verbracht und noch mindestens zweimal für 5 Minuten in Aqua dest. gespült.

Die Gegenfärbung der Schnittpräparate wurde mit Methylengrün-Lösung³⁷ in Aqua dest. für 10 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden die Schnitte in Aqua dest. gespült, bis überschüssiges Methylengrün entfernt war und mit Glyceringelatine³⁸ eingedeckt.