Aufarbeitung von humanem Blut

Mit dem Ziel, Methoden und verwendete Materialien für eine klinische Anwendung zu etablieren, wurden Patienten- und Spenderblut bzw. -leukapheresen unter GMP-Bedingungen aufgearbeitet. Die verschiedenen Methoden wurden dabei auf ihre Eignung getestet, Monozyten möglichst in einem geschlossenen System sowie in hoher Anzahl zu gewinnen.

2.2.2.1 Gewinnung von peripheren mononukleären Blutleukozyten (PBMNL)

Die Gradientenzentrifugation ermöglicht es, Zellen aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte voneinander zu trennen (BοYUM,1964).Lymphoprep ist die Lösung, welche bei der Dichtegradientenzentrifugation benutzt wird. Sie setzt sich aus Methylzellulose (Ficoll) und Natrium-Metrizoat zusammen. Natrium-Metrizoat ist ein Stoff mit hoher Dichte und stellt das eigentliche Trennmedium dar. Durch die Methylzellulose aggregieren die Erythrozyten, wodurch sich ihre Sedimentationsgeschwindigkeit erhöht und sie das Trennmedium passieren. Nach der Dichtegradientenzentrifugation sind die Granulozyten in der untersten Schicht des Pellets zu finden, darüber liegen die aggregierten Erythrozyten und das Trennmedium. Die folgende Schicht wird durch die

Interphase gebildet, sie enthält die zu isolierenden PBMNL. Plasma bildet die oberste Phase des Gradienten.

2.2.2.1.1 Präparation von Vollblut

Zur Blutentnahme wurden 9,5 ml-Monovetten, die K⁺/EDTA als Antikoagulans enthielten, verwendet. Bei Patienten und Spendern wurden 100–200 ml Vollblut entnommen. Vollblut sollte nach der Entnahme sofort verarbeitet werden, da so die Ausbeute an PBMNL erhöht und die Anzahl der toten Zellen gesenkt werden kann. Bei Lagerung von mehreren Stunden empfiehlt es sich, das Blut bei Raumtemperatur auf einer Wippe zu lagern.

In sechs 50 ml-Zentifugenröhrchen wurden je 12,5 ml Lymphoprep vorgelegt. Das Voll-blut (100 ml) wurde in eine sterile Glasflasche überführt und 1:2 mit PBS (RT) verdünnt. Je 12,5 ml Trennmedium wurden mit 25–35 ml des verdünnten Blutes über-schichtet. Die Dichtegradientenzentrifugation erfolgte bei 800 x g, 20 min, ohne Bremse. Von nun an wurde mit 4°C kaltem PBS und vorgekühlten Gefäßen gearbeitet, um ein Adhärieren der Monozyten zu verhindern und eine maximale Ausbeute an peripheren mononukleären Blutleukozyten (PBMNL) zu erzielen. Die Interphase wurde bei allen sechs Röhrchen abgenommen und in vier weiteren Zentrifugenröhrchen gesam-melt. Diese wurden dann mit PBS aufgefüllt und gewaschen (800 x g, 10 min, 4°C ohne Bremse). Die sich im Überstand befindenden Thrombozyten wurden abgesaugt, das Pellet in 50 ml PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert (360 x g, 10 min, 4°C, ohne Bremse). Dieser Waschschritt wurde so oft wiederholt (ab jetzt mit Bremse), bis der Überstand klar war und sich im Pellet nach mikroskopischer Kontrolle keine Thrombo-zyten mehr befanden. Kontaminierende ThromboThrombo-zyten und deren Metabolite können sowohl stimulierende (NAJAR ET AL.,1990;PETERS ET AL.,1990)als auch inhibierende (RUEDA ET AL., 1989) Effekte auf Monozyten haben. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in einem Röhrchen vereinigt, in 50 ml PBS aufgenommen und in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Aus 100 ml Vollblut konnten 1x10⁷ bis 1,5x10⁸ PBMNL gewonnen werden. Der Monozytenanteil in dieser PBMNL-Präparation entsprach ca. 10–30 %. Die Zellzahl gewonnener PBMNL war stark abhängig von dem Leukozytenstatus des Patienten bzw. Spenders.

2.2.2.1.2 Präparation von Leukapheresezellen

Neben PBMNL aus Vollblut wurden auch Zellen aus der Apherese verwendet. Das Apheresesystem (COBE Spectra^TM, Gambro BCT, Martinsried) dient zur Trennung und Sammlung der Blutkomponenten von Spendern und Patienten. Das System verwendet eine Zentrifugalmethode, um Vollblut in seine Hauptbestandteile aufzutrennen. Das Vollblut wurde einem Spender oder Patienten entnommen, mit ACD-A antikoaguliert, über ein Einmalset in den Trennkanal in eine sich drehende Zentrifuge gepumpt und dort in seine Bestandteile aufgetrennt. Durch dieses Verfahren wird die Komponente mit der höchsten Dichte (Erythrozyten) an der äußeren Kanalwand angereichert, der Leukozytenfilm liegt in der Mitte, und das thrombozytenreiche Plasma (mit der geringsten Dichte) bildet die innere Schicht. Über einen Auslassschlauch im Kanal wurden die weißen Blutkörperchen abgesammelt und die restlichen Blutkomponenten über einen separaten Auslass dem Spender / Patienten zurückgeleitet. Es findet dadurch eine extreme Anreicherung von Leukozyten auf ein Gesamtvolumen von ca. 100 ml Leukapherat statt.

Durch die starke Zellkonzentration wurden die Leukapheresezellen (bei einem Volumen von 100 ml) mindestens 1:3 mit PBS verdünnt und auf zwölf Gradienten mit 12,5 ml Lymphoprep geschichtet. Die restliche Aufarbeitung erfolgte wie unter 2.2.2.1.1. Pro 100 ml Leukapheresevolumen konnten bei Spendern 4–10x10⁹ PBMNL und bei Patienten 0,5–7x10⁹ PBMNL gewonnen werden.

2.2.2.2 Gewinnung von Monozyten durch Adhärenz

Monozyten können im Gegensatz zu Lymphozyten an unphysiologischen Oberflächen adhärieren. Diese Eigenschaft macht man sich zunutze, wenn es um die Trennung der Zellen geht. So wird der Prozess der Adhärenz durch Anwesenheit von Serum- bzw.

Plasmaproteinen sowie Wärme, Ca²⁺ und hydrophoben Plastikoberflächen der Kultur-gefäße unterstützt, während Kälte und EDTA ihr entgegen wirken.

Kulturmedium: RPMI 1640 + 5 % (v/v) autologes Serum

Aufgereinigte PBMNL (siehe 2.2.2.1.1 und 2.2.2.1.2) wurden in serumhaltigem Medium auf eine Zellzahl von 0,5-1 x 10⁷/ ml eingestellt. Diese wurden dann je nach Gesamtzellzahl und Ansatzgröße auf TC-Zellkulturschalen mit 5 ml der Suspension auf 21,5 cm², 10 ml Zellsuspension auf 56,7 cm² und 20 ml Zellsuspension auf 145 cm² Schalengröße ausplattiert. Die ausplattierten PBMNL wurden für 30–60 min bei 37°C in einem CO2-Brutschrank inkubiert. Nach mikroskopischer Kontrolle der Adhärenz wurden die nicht adhärenten T- und B-Lymphozyten sowie NK-Zellen mit warmen PBS abgespült. Wurden die autologen Lymphozyten für weitere Tests benötigt, so wurde der Überstand in 50 ml Röhrchen gesammelt (siehe 2.2.2.6). Dieser Waschschritt wurde wiederholt, bis die mikroskopische Kontrolle zufrieden stellend war und die Lymphozyten weitgehend abgespült waren. Die Monozyten wurden im Anschluss in Kultur genommen (Zellkulturansatz siehe 2.2.2.4).

2.2.2.3 Gewinnung von Monozyten durch Elutriation

Neben der Monozytengewinnung durch Adhärenz aus Vollblut und Leukapheresen wurden Monozyten durch Elutriation gewonnen. Das Elutra^TM (Gambro BCT, Martinsried) Zellseparationssystem ist ein semi-automatisches, zentrifugenbasiertes Gerät, welches in der Lage ist, über Zentrifugalkraft und einem gegenläufigen Mediumfluss die Zellen aus Leukapheresen je nach Größe und Dichte in mehrere Fraktionen zu separieren. Während der Elutriation wirkt der Mediumfluss in einer Separationskammer im Widerstand zu der durch die Zentrifugalkraft induzierten Sedimentation von Zellen. Letztlich werden die Zellen dabei primär nach Größe und sekundär nach Dichte separiert und in der Kammer aufgereiht. Durch eine Erhöhung des Mediumflusses in der Kammer, bei gleich bleibender Zentrifugengeschwindigkeit, werden die Zellen vom Zellbett der Kammer getrennt und in verschiedene Fraktions-sammelbeutel geleitet. Das Elutra^TM Zellseparationssystem ist ein geschlossenes System und ermöglicht somit die Isolierung von großen Mengen an Monozyten bei Patienten und Spendern für eine klinische Anwendung (ADAMSON ET AL. 2004; BERGER ET AL. 2005).

Medium: Hanks + 1 % (v/v) HSA

Percoll Dichte 1,068 g/ml: 52,94 ml Percoll + 47,06 ml PBS

In die Elutra^TM wurde ein Einmalschlauchset eingelegt, bestehend aus Separations-kammer, Schläuchen und Beuteln. Der Leukapheresebeutel des Spenders / Patienten wurde mit diesem verbunden und die Probe in die Separationskammer eingeladen. Im Anschluss wurde ein semi-automatisches Monozyten-Anreicherungsprotokoll gestartet.

Für dieses Protokoll wurde vorher noch das Leukapheresevolumen, die Konzentration an Leukozyten und Erythrozyten ermittelt. Die fünf Fraktionen wurden über die folgenden Flussraten und Zentrifugationsgeschwindigkeiten separiert:

Fraktion Flussrate (ml/min)

Zentrifugen-geschwindigkeit

(rpm)

Volumen (ml)

1 37 2400 900

2 97,5 2400 975

3 103,4 2400 975

4 103,9 2400 975

5 103,9 2400 250

Tabelle 2: Flussraten, Zentrifugationsgeschwindigkeiten und Volumina der Fraktionen 1–5 während der Elutriation.

In Fraktion 1 befanden sich danach Plasma, Thrombozyten und Erythrozytentrümmer, in Fraktion 2 Erythrozyten und Lymphozyten. Die Fraktionen 3 und 4 waren Wasch-fraktionen, welche noch restliche Lymphozyten enthielten. In Fraktion 5 befand sich nach der Elutriation eine reine Monozytenpopulation. Eine Granulozytenabreicherung fand bereits durch ein spezielles Sammelverfahren während der Leukapherese statt. Bei Patienten mit bestimmten Vortherapien konnten weder durch das Sammelverfahren in der Leukapherese, noch durch die Elutriation die Granulozyten komplett von den Monozyten getrennt werden. War die Fraktion 5 mit mehr als 20 % Granulozyten kontaminiert, wurde im Anschluss an die Elutriation die Fraktion 5 auf 10

zentrifugation vorgenommen. Aus einem 100 ml Leukapherat konnten durch die Elutriation bei Spendern und bei Patienten 0,2 – 2x10⁹ Monozyten gewonnen werden.

2.2.2.4 Kulturbedingung von Monozyten und deren Ausdifferenzierung zu unreifen und reifen dendritischen Zellen

Monozyten des peripheren Blutes dienen als Ausgangsmaterial zur Differenzierung humaner dendritischer Zellen in vitro. Peters und Mitarbeiter zeigten, dass durch die Zugabe der Zytokine GM-CSF, IL-4 und IFN-γ bei Monozyten die Differenzierung zu monocyte-derived dendritic cells (MoDC) induziert wird (PETERS ET AL., 1991;

KRÄMER, 1993; XU ET AL., 1995; PEISER, 1998), welche einen unreifen Phänotyp aufweisen. Durch die Zugabe von TNF-α und / oder anderen Reifungssignalen kann eine Differenzierung der unreifen dendritischen Zellen in reife dendritische Zellen induziert werden (SALLUSTO UND LANZAVECCHIA,1994;ZHOU UND TEDDER,1996).

Monozyten, die durch Adhärenz aus Vollblut oder Leukapheresen (siehe 2.2.2.1.1 und 2.2.2.1.2) bzw. aus Leukapheresen und Elutriation (siehe 2.2.2.3) gewonnen wurden, wurden zu unreifen MoDC (immature MoDC; iMoDC) oder zu reifen MoDC (mature MoDC; mMoDC) (JONULEIT ET AL., 1997; VERDIJK ET AL., 1999) mit folgenden Kulturbedingungen ausdifferenziert:

Kulturansätze für unreife MoDC:

1. RPMI 1640 + 2,5 % (v/v) autologes Serum + 300 U/ml IL-4 + 300 U/ml GM-CSF + / - 150 U/ml INF γ

2. RPMI 1640 + 2,5 % (v/v) autologes Serum + 500 U/ml IL-4 + 800 U/ml GM-CSF

Kulturansätze für reife MoDC :

1. RPMI 1640 + 2,5 % (v/v) autologes Serum + 500 U/ml IL-4 + 800 U/ml GM-CSF + 100 ng/ml IL-6 + 10 ng/ml IL-1β + 10 ng/ml TNF-α + 1 µg/ml PGE₂ 2. RPMI 1640 + 2,5 % (v/v) autologes Serum + 500 U/ml IL-4 + 800 U/ml

GM-CSF + 10 µg/ml Poly I:C + 500 U/ml IFN-α

2.2.2.5 Gewinnung von Plasma und Serum

Der flüssige Bestandteil des Blutes wird als Plasma bezeichnet. Serum ist fibrinogen-freies Plasma und wird den Medien zur Kultivierung von Zellen zugesetzt. Plasma wird zum Beschichten von Objektträgern und Zellkulturschalen benutzt, damit auf diesen Oberflächen Monozyten und andere Zellen leichter haften.

Zur Vermeidung von Fremdstimulation bzw. im Hinblick auf die klinische Applikation wurde ausschließlich im autologen System gearbeitet.

a) Plasmagewinnung:

Vollblut wurde in 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 1600 x g, 10 min, RT, ohne Bremse zentrifugiert. Der dabei entstandene Plasmaüberstand wurde abgenommen und zur Beschichtung der Kulturgefäße genutzt. Das verbliebene Zellpellet konnte zur PBMNL-Aufarbeitung (siehe 2.2.2.1.1) weiter verwendet werden.

Ebenso konnte Plasma im Verlauf einer Leukapherese gewonnen werden. Über einen weiteren Auslasskanal wurde die innere Schicht abgesammelt (siehe 2.2.2.1.2). Bei der Verwendung von Plasma ist zu beachten, dass in einer Plasmafraktion auch immer Thrombozyten enthalten sind und stets die Gefahr der Kontamination der Kultur mit Thrombozyten besteht.

b) Serumgewinnung:

Zur Serumgewinnung wurden jedem Spender / Patienten 40–100 ml Blut in Serummonovetten, die mit Defibrinisierungskügelchen beschickt waren, entnommen.

Die Monovetten blieben bis zum vollständigen Ablauf der Gerinnung bei RT stehen und wurden dann bei 1600 x g, 10 min, RT, ohne Bremse zentrifugiert. Der Überstand konnte nun als Serum gewonnen werden. In Abhängigkeit zur Frage-stellung wurden die Komplementproteine des Serums durch eine halbstündige Inkubation bei 56°C inaktiviert.

2.2.2.6 Gewinnung von Lymphozyten durch Adhärenztechnik

Die durch Adhärenztechnik isolierten Lymphozyten stellen eine Mischpopulation aus ca. 80 % T- und 15 % B-Zellen dar. Diese ist zudem geringfügig mit bis zu 15 % NK-Zellen und 0,1–1 % dendritischen NK-Zellen kontaminiert.

Zuerst wurden PBMNL nach 2.2.2.1.1 bzw. 2.2.2.1.2 aufgearbeitet. Die suspendierten Zellen wurden nach 30–60 min Adhärenz der Monozyten abgespült, gesammelt, gewaschen (300 x g, 10 min, 4°C, mit Bremse) und nach der Zellzahlbestimmung entweder bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert oder in Aliquots (0,2–2x10⁸ Zellen) eingefroren. Bei einer Leukapherese konnten 1–1,6x10⁹ und aus 50 ml Vollblut 2–4x10⁷ Lymphozyten gewonnen werden.

2.2.2.7 Pan T-Zellisolierung durch MACS (Magnetic cell sorting)

Dabei werden T-Zellen durch die Depletion von Zellen isoliert. Die nicht-T-Zellen werden zuerst mit einem Cocktail aus Biotin-konjugierten monoklonalen-Antikörpern markiert. Dieser Cocktail besteht aus folgenden monoklonalen-Anti-körpern: α-CD14 (bindet Monozyten), α-CD16 (bindet Makrophagen und neutrophile Zellen), α-CD19 (bindet B-Zellen), α-CD36 (bindet Thrombozyten), α-CD56 (bindet NK-Zellen), α-CD123 (bindet Knochenmarksstammzellen, Granulozyten und Mega-karyozyten) und Glycophorin A (bindet Erythrozyten). Mit einem Sekundärantikörper, Anti-Biotin konjugiert mit MicroBeads, werden die primär markierten nicht-T-Zellen sekundär magnetisch gekoppelt. Die markierten Zellen werden durch eine MACS-Säule, welche im Magnetfeld eines MACS-Separators befindet, geleitet. Alle magnetisch markierten Zellen bleiben in der Säule, während die unmarkierten T-Zellen die Säule passieren (negative Selektion).

MACS Puffer: PBS + 0,5 % (v/v) autologes HuS + 2 mM EDTA

Die durch die Adhärenz gewonnenen Lymphozyten (siehe 2.2.2.6) wurden gezählt und der Überstand vollständig vom Zellpellet entfernt. Das Pellet wurde in 40 µl MACS-Puffer pro 10⁷ Gesamtzellen resuspendiert. 10 µl des Biotin-Antikörper-Cocktails wurden ebenfalls pro 10⁷ Gesamtzellen hinzugegeben, danach wurden die Zellen

resuspendiert und für 10 min bei 4–8°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde auf die Zellen 30 µl MACS-Puffer und 20 µl Anti-Biotin MicroBeads auf 10⁷ Gesamtzellenzahl gegeben und für weitere 15 min bei 4-8°C inkubiert. Im Anschluss erfolgte das Waschen der Zellen durch die Zugabe des 10-20 fachen Färbevolumens an MACS Puffer und die Zentrifugation der Zellen bei 300 x g, 10 min, 4°C, mit Bremse. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 500 µl MACS-Puffer pro 10⁸ Gesamt-zellen resuspendiert. Die magnetische Separation erfolgte in MS- (für bis zu 2x10⁸ Gesamtzellen) oder in LS- (für bis zu 2 x 10⁹ Gesamtzellen) Säulen, diese wurden in das magnetische Feld des MACS-Separators gespannt und dreimal mit MACS-Puffer gewaschen (MS mit 500 µl und LS mit 3 ml). Nach dem Waschen wurde die Wasch-fraktion unterhalb der Säule verworfen, ein neues Röhrchen bereitgestellt und die gefärbte Zellpopulation auf die Säule gegeben. Die Negativfraktion (angereicherte T-Zellen) passierten die Säule, die Positivfraktion (nicht-T-T-Zellen) verblieb in der Säule.

Die isolierten T-Zellen wurden einmal gewaschen und gezählt, dann wurde ein Aliquot zum Zweck der durchflusszytometrischen Analyse entnommen. Diese Probe wurde mit α-CD3-PE gefärbt um die Reinheit der Population zu messen (siehe 2.2.5). Die so isolierten T-Zellen wurden im Anschluss für funktionelle assays weiter verwendet.