Antigenaufnahme der MoDC von Mammakarzinompatientinnen

Antigenpräsentierende Zellen sind in der Lage, unterschiedliche Endozytosemechanismen zur Aufnahme von Antigenen zu benutzen. Dies ist zum einen abhängig von der Art des Antigens und der Antigenaufnahmekapazität und zum anderen führen die verschiedenen Aufnahmerouten zu funktionell unterschiedlichen Konsequen-zen. Durch Phagozytose werden große Partikel oder Zellen >1 µm im Durchmesser aufgenommen. Monozyten und unreife dendritische Zellen phagozytieren mit einer hohen Kapazität apoptotische Zellen, Bakterien, Partikel oder Liposomen (TROMBETTA UND MELLMAN,2005).Unreife MoDC sind ebenfalls in der Lage, apoptotische Zellen zu phagozytieren. Die exogene Aufnahme von apoptotischen Zellen führt bei MoDC zu einer vermehrten cross-Präsentation von exogenen Antigenen auf MHC-KL I und einer damit verbundenen Entwicklung von zytotoxischen T-Zellen (ALBERT ET AL., 1998) sowie zu Selbsttoleranz (STEINMAN ET AL., 2000). Dendritische Zellen phagozytieren

benachbarten lebenden Zellen auf und präsentieren diese ebenfalls über cross-Präsen-tation auf MHC-Kl I (HARSHYNE ET AL, 2001; JOLY UND HUDRISIER, 2003). MoDC besitzen eine hohe Endozytoseaktivität bei der Aufnahme von löslichen Antigenen durch Makropinozytose und der Rezeptor-vermittelten Endozytose (BANCHEREAU UND

STEINMAN,1998). Sowohl die Phagozytose als auch die Makropinozytose werden durch die Reifung von dendritischen Zellen herunterreguliert, dagegen hat die Reifung von DC nur einen geringen Effekt auf die Rezeptor-vermittelte Aufnahme von Antigenen (GARRETT ET AL.,2000).

In den folgenden Abschnitten wird die Phagozytosekapazität von unreifen und reifen MoDC von Mammakarzinompatientinnen diskutiert. Des Weiteren wird die Phago-zytose und PinoPhago-zytose von Membran- und löslichen Proteinen aus nekrotischem Tumorzell-Lysat der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 im Hinblick auf die Induktion einer Reifung der dendritischen Zellen betrachtet.

Die Funktion der Antigenaufnahme durch Phagozytose war bei fast allen unreifen MoDC (82,21 %) der Mammakarzinompatientinnen vorhanden (siehe Abbildung 23).

Kein Unterschied zwischen der Phagozytosekapazität von unreifen MoDC von Mammakarzinompatientinnen und denen von gesunden Spendern wurde von GERVAIS ET AL., (2005) beschrieben. Durch die Kultivierung von unreifen MoDC mit einem Cocktail aus IL-6, IL-1β, TNF-α und PGE2 ab Tag 5 kommt es zu einer kompletten Reifung der dendritischen Zellen (JONULEIT ET AL.,1997).Die Phagozytoseaktivität der reifen MoDC von den Patientinnen war durch den „Jonuleit-Mix“ bis auf 29,55 % der Zellen im Mittel herunterreguliert. Wie bereits zuvor schon erwähnt konnten GARRETT ET AL., (2000) zeigen, dass durch die Reifung der dendritischen Zellen sowohl die Makropinozytose als auch die Phagozytose reduziert wird. Durch die Reifungssignale CD40-Ligand und IFN-α/TNF-α konnte bei dendritischen Zellen aus CD34+

Vorläuferzellen von gesunden Spendern eine reduzierte Phagozytosekapazität auf 34 % mit CD40-Ligand und auf 31 % mit IFN-α/TNF-α der Zellen festgestellt werden (CHEN ET AL.,2001). KIAMA ET AL.,(2001) wiesen nach, dass die Reduktion der Phagozytose mit zunehmender Reifung auch auf die in vivo-Situation zu übertragen ist. Diese Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass Alveolarmakrophagen die höchste Phagozytose-kapazität im Vergleich zu den peripheren Monozyten besitzen, dass Monozyten eine

höhere Phagozytosekapazität als unreife DC und diese wiederum als reife DC besitzen.

Mit zunehmendem Grad der dendritischen Zelldifferenzierung wird die Phagozytose reduziert und die Prozesse der Antigenpräsentation rücken verstärkt in den Vordergrund.

Durch die Phagozytose von bestimmten Materialien kann eine Reifung induziert werden und somit dann zu einer verstärkten T-Zellstimulation durch diese reifen DC führen.

Zymosan bindet an den TLR-2 und induziert die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen in Immunzellen (SATO ET AL.,2003).Bei den hier vorliegenden Ergebnissen konnte eine Reifung der unreifen Patienten-MoDC durch die gesteigerte Expression von CD83 nach Zymosanphagozytose gezeigt werden (siehe Abbildung 24). Auch andere Arbeitsgruppen konnten nachweisen, dass die Phagozytose von Zymosan durch Monozyten zu einer Differenzierung der Monozyten zu intermediären dendritischen Zelle führt (ROSENZWAJG ET AL., 2002). Diese dendritischen Zellen besitzen einen Phänotyp zwischen unreifen und reifen DC. Nicht alle phagozytierten Materialien verursachen eine Reifung. TOROSANTUCCI ET AL., (2004) wiesen nach, dass Candida albicans keine dendritische Zelldifferenzierung bei humanen Monozyten induzierte.

Ebenso wurde durch die Phagozytose von PLGA (poly lactide co glycolide)-Partikeln keine Reifung bei unreifen MoDC hervorgerufen (WAECKERLE-MEN ET AL.,2004).

Im Folgenden soll die Aufnahme von Membran- und löslichen Proteinen von nekrotischen Tumorzellen hinsichtlich der Aufnahmekapazität und der Induktion einer Reifung von MoDC diskutiert werden.

Bei der Verwendung von kompletten Tumorzellpräparationen zum Pulsen der dendritischen Zellen spielt die Art des Zelltodes der Tumorzellen eine entscheidende Rolle. Für die Antigenbeladung der dendritischen Zellen werden nekrotische Tumor-zellen, in Form von Tumorzell-Lysaten, und apoptotische TumorTumor-zellen, durch osmotischen Schock oder UV-B-Bestrahlung induziert, verwendet. Exogene Antigene werden in dendritischen Zellen nicht ausschließlich über MHC-Kl II präsentiert, über einen so genannten cross-Präsentations-pathway können exogen aufgenommene Anti-gene auch auf MHC-Kl I präsentiert werden (CARBONE ET AL.,1990). SAUTER ET AL., (2000) zeigten, dass nekrotische Tumorzellen zu einer Reifung der dendritischen Zellen mit einer gesteigerten CD83-Expression führen. Diese DC waren potente Stimulatoren

+ +

dass die Aufnahme von apoptotischen Tumorzellen zu einer cross-Präsentation auf MHC-Kl I führt. In einer früheren Arbeit wiesen sie bereits nach, dass die Aufnahme von apoptotischen Zellen eine über alphavbeta 5 Integrin und CD36-Rezeptor-vermittelte Aufnahme ist und diese zu der cross-Präsentation führt (ALBERT ET AL., 1998). In neueren Untersuchungen zeigten DALGAARD ET AL., (2005), dass auch nekrotische Zellen über eine CD36-vermittelte Rezeptoraufnahme von peripheren Blut-DC aufgenommen werden.

In der hier vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich nekrotische Tumorzellen, in Form von Tumorzell-Lysaten, welche durch Einfrieren und Auftauen hergestellt wurden, verwendet. Dies hatte zum Teil pragmatische Gründe. Die meisten Studien mit apoptotischen Tumorzellen wurden mit Zelllinien durchgeführt. Für diese Arbeit wurde mit dem autologen, nativen Tumorgewebe der Patientinnen gearbeitet. Dieses Gewebe wies zum Teil bereits nach der Entnahme aus dem Patienten Nekrosen auf. Durch die mechanische Aufarbeitung des Gewebes waren bereits zu Beginn sehr viele tote Tumorzellen in den Präparationen enthalten. Daher wurde entschieden, mit nekrotischen Tumorzellen zu arbeiten, um einen massiven Verlust an autologen Tumorzellen der Patientinnen zu vermeiden. Bei den hier vorliegenden Daten konnte eine effiziente Aufnahme der FITC-markierten löslichen Proteine des Lysates und der FITC-markierten lipidischen Proteine des Tumorzell-Lysates bei fast allen unreifen MoDC gezeigt werden. Die Phago- und Makropinozytose wurde durch die Reifung der dendritischen Zellen mit dem „Jonuleit-Mix“ inhibiert. Die Aufnahme von Tumorzell-Lysaten durch dendritische Zellen konnte bereits mit FITC-markierten Tumorzell-Lysaten von Neuroblastomen gezeigt werden (ACKERMANN ET AL.,2004).Die Aufnahme von CFSE-markierten allogenen und apoptotischen B-Zellen durch dendritische Zellen wurde in vitro und in der Maus gezeigt (IYODA ET AL.,2002).Ein überraschendes Ergebnis dieser Arbeit war, dass nur die Proteine der Membranfraktion von dem Tumorzell-Lysat der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 eine Reifung der MoDC mit einer gesteigerten Expression von CD83 induzierte, während sich bei den löslichen Proteinen der Zelllinie keine Veränderung der analysierten Oberflächenmarker ergaben (siehe Abbildung 26 und Abbildung 33). Dies bestätigt die von SAUTER ET AL., (2000) bereits erwähnten Ergebnisse, dass nekrotische Tumorzellen zwar eine Reifung induzieren, nach den hier

vorliegenden Ergebnissen können aber nur die lipidischen Proteine der Tumorzell-Lysate diese Reifung induzieren. Dass Membranproteine gegenüber löslichen Proteinen eine übergeordnete Rolle zu spielen scheinen, kann durch die Ergebnisse von IYODA ET AL., (2002) untermauert werden. Diese Arbeitsgruppe fand bei den MHC-Peptid-komplexen überwiegend Membranproteine von toten Zellen, welche zuvor durch dendritische Zellen phagozytiert wurden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sich in Kulturüberständen von nekrotischen Tumorzelllinien Hitzeschockproteine (hsp70 und gp90) im Vergleich zu normalen Primärzellen befinden. Das Hitzeschockprotein 70 induzierte eine Reifung bei dendritischen Zellen (SOMERSAN ET AL., 2001). Somit könnten Hitzeschockproteine in oder auf den Membranen von Tumorzellen einer der Gründe für die Induktion der Reifung bei dendritischen Zellen sein. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die in nekrotischen Tumorzellen enthaltenen Membran-fraktionen eine Reifung der dendritischen Zellen induzieren und somit eine verstärkte T-Zellstimulation hervorrufen könnten. Ebenfalls zu erwähnen ist, dass Membranen lipidische Proteine beinhalten und bereits zuvor dem CD1a, als antigenpräsentierendes Molekül von lipidischen Antigenen, eine entscheidende Bedeutung in der Aktivierung einer effizienten Antitumor-Immunantwort zugewiesen wurde. Ein näherer Zusammen-hang zwischen dem CD1a und der Induktion der Reifung durch lipidische Proteine konnte bisher nicht gefunden werden und ist somit rein hypothetisch zu sehen.

4.3 Antigenpräsentation der MoDC von Mammakarzinompatientinnen und