Antigenpräsentation der MoDC von Mammakarzinompatientinnen und Induktion einer spezifischen Immunantwort

In diesem Abschnitt soll die T-Zell-stimulatorische Kapazität von Mammakarzinom-zelllinien und autologen Tumorzell-Lysaten sowie deren Induktion einer Antitumor-Immunantwort diskutiert werden. Neben spezifischen, definierten Tumorpeptiden oder genetisch transfizierten Tumorzellen ist die komplette Tumorzelle eine Quelle von Tumorantigenen. Der Vorteil des gesamten Tumorzellrepertoires ist, dass alle im Tumor vorhandenen Antigene für das Pulsen der dendritischen Zellen zur Verfügung stehen und physiologische Prozesse aus dem vorhandenen Tumor auf die in vitro-Situation übertragen werden können. Weitere Vorteile dieser Methode sind, dass keine

bei Patienten erforderlich sind. Für das Peptidpulsen stehen lediglich MHC-Kl I-restringierte Peptide zur Verfügung, an MHC-Kl II-Peptide sind nur wenige charak-terisiert und problematisch bei der Anwendung, da es zu viele unterschiedliche MHC-Kl-II-Typen gibt (THUMANN ET AL., 2003). Ein weiteres Argument für die Verwendung von Tumorzell-Lysaten ist die mögliche Präsentation von Antigenen über MHC-Kl I oder MHC-Kl II. Apoptotische Tumorzell-Lysate induzieren eine cross-Präsentation auf CD8⁺-T-Zellen, während nekrotische Tumorzell-Lysate eine potente Stimulation von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen induzieren (SAUTER ET AL.,2000).Für eine effektive Anti-Tumor-Immunantwort sind CD4⁺-T-Helferzellen von ganz entscheidender Bedeutung (TOES ET AL., 1999). Die Verwendung von Tumorzell-Lysaten ist allerdings limitiert durch das begrenzt vorhandene Material. Andererseits besteht die Möglichkeit, dass bei vorhandenen Metastasen diese andere Antigene exprimieren als der Primärtumor.

Die verwendeten nekrotischen Tumorzell-Lysate der Mammakarzinomzelllinien (1 MoDC:2 SK-BR3; 1 MoDC:8 MCF-7) und den autologen Tumorzellpräparationen (3 von 4 Patientinnen bei 1 MoDC:4 TZ; Patientin TZ1 bei 1 MoDC:2 TZ) zeigten bei unterschiedlichen Verhältnissen Tumorzell-Lysat zu MoDC mit zum Teil großen Standardabweichungen die jeweils stärkste T-Zellstimulationskapazität (siehe Abbildung 34 und Abbildung 36). Dies weist darauf hin, dass sowohl innerhalb der Zelllinien als auch innerhalb der autologen Tumorzellpräparationen unterschiedliche T-Zell-stimulatorische Antigene vorhanden waren. In der Literatur finden sich ebenfalls verschiedene Dosisangaben zum Pulsen der dendritischen Zellen mit Tumorzell-Lysaten. In einem Mausmodell wurden die dendritischen Zellen in einem Verhältnis von 1:3 mit Fibrosarkomzellen einer Zelllinie gepulst (FIELDS ET AL., 1998). Die höchste Beladung dendritischer Zellen mit lysierten Tumorzellen einer Melanomzelllinie konnte in einem Verhältnis von 1:5 durchgeführt werden, ohne größere Verluste an dendritischen Zellen in Kauf zu nehmen. Bei höheren Konzentrationen kam es zu einer Readhärenz der dendritischen Zellen an den Plastikoberflächen der Kulturgefäße und somit zu einer schlechteren Ausbeute der dendritischen Zellen (THUMANN ET AL.,2003).

Dieses Phänomen konnte bei den hier durchgeführten Experimenten ebenfalls beobachtet werden. Wir deuten dies als Induktion von MФ-Eigenschaften durch die

Masse des Materials. Hohe Tumorantigenkonzentrationen in Form von Lysaten führen zur Apoptose von dendritischen Zellen. Somit ist die Konzentration des Tumorzell-Lysates ein kritischer und entscheidender Punkt (POSPISILOVA ET AL., 2002). Letztlich bedeuten diese Ergebnisse, dass die Konzentration für jeden Tumor eines jeden Patienten auf die beste T-Zell-stimulatorische Kapazität getestet werden müsste, diese aber nicht das Verhältnis von 1:4 aus den oben genannten Gründen überschreiten sollte.

Insgesamt war im Vergleich zu der durch das Tetanustoxoid induzierten T-Zellproliferation eine schwächere T-Zell-stimulatorische Kapazität sowohl durch die Mammakarzinomzelllinien als auch durch die autologen Tumorzell-Lysate zu verzeichnen. Dieses kann zum einen an einer sehr starken Sekundärantwort, welche durch das Tetanustoxoid induziert wurde, liegen oder an einer schwach immunogenen Stimulation durch die autologen Tumorzell-Lysate. Ein Grund für die schwache T-Zellproliferation könnte wie bereits zuvor erwähnt die Art des Zelltodes der Tumorzellen bei der Stimulation der T-Zellen sein. Autologe Lysate aus Blasten einer akuten lymphatischen Leukämie stimulierten geringere Mengen an T-Zellen als apoptotische Zellen der allogenen Jurkat-Zelllinie. Die nekrotischen Blastenlysate waren in der Lage, eine Reifung der DC und eine T_H1-Immunantwort zu induzieren (POSPISILOVA ET AL., 2002). GALEA-LAURI ET AL., (2004) konnten zeigen, dass dendritische Zellen, welche mit Tumorzellen fusioniert wurden, und dendritische Zellen gepulst mit apoptotischen Tumorzellen zu einer höheren T-Zellstimulation führten als Tumorzell-gepulste DC. Die hier vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass Lysat-gepulste dendritische Zellen eine nur schwache TH1-Immunantwort mit der Tendenz zu einer T_H2-Immunantwort durch die Produktion von IL-6 induzierten. Die Ergebnisse von Galea-Lauri werden durch die in dieser Arbeit erhobenen Daten bestätigt. Die Mammakarzinomzelllinie SK-BR3 induzierte eine sehr schwache T_H1-Antwort, während die MCF-7 sogar eine TH2-Antwort, wenn auch ebenfalls mit nur sehr schwacher IL-6-Produktion, induzierte. Ein Grund könnte die schwache Antigenität der Mammakarzinomzelllinien sein, denn eine ebenfalls getestete Melanomzelllinie (FM 3-13) induzierte zwar eine mäßige T-Zellproliferation, aber die T-Zellen produzierten höhere Mengen IL-6, IFN-γ und TNF-α. Weiterhin sei darauf hingewiesen,

T-Zellen stattfand. Die autologen Tumorzell-Lysate bestätigen die bereits zuvor diskutierten Ergebnisse. Nur bei einer von 4 Patientinnen konnte eine nur sehr geringe Produktion des T_H1-Zytokins IFN-γ gemessen werden. Ansonsten konnte lediglich eine schwache TH2-Antwort festgestellt werden. MoDC der Spender und der Patientinnen waren grundsätzlich in der Lage, eine T_H1-Antwort zu induzieren, wie mit den Tetanustoxoid-gepulsten MoDC gezeigt werden konnte (siehe Abbildung 19). Insgesamt konnte durch das nekrotische Tumorzell-Lysat von Mammakarzinomen eine nur sehr schwache Immunantwort hervorgerufen werden. Offensichtlich scheint die dendritische Zelle bei der Bereitstellung eines schwach immunogenen antigenen Repertoires ein zusätzliches Signal zu benötigen. Dieses zusätzliche Signal, auch danger Signal genannt, kann bereits durch die Verwendung von apoptotischen Tumorzellen - dies sind Zellen, welche durch ein internes Zerstörungsprogramm einen Abbau der Kern-DNA erfahren haben - zur Verfügung gestellt werden. RAD ET AL., (2003) konnten zeigen, dass apoptotische Tumorzellen, bei welchen zuvor durch die Behandlung mit Chemotherapeutika Apoptose induziert wurde, eine höhere T-Zellstimulation und IL-12-Produktion bewirkten als nekrotische Tumorzellen. Der programmierte Zelltod und der daraus resultierende DNA-Schaden bei apoptotischen Zellen ist wahrscheinlich das entscheidende danger-Signal für die dendritischen Zellen, was zu einer effektiveren T_H1-Immunantwort führt. Diese Ergebnisse können durch Studien belegt werden, laut denen Chemotherapien in Kombination mit dendritischen Zellen besser wirken (YU ET AL.,2004). SONG UND LEVY,(2005)zeigten im Mausmodell, dass die alleinige Gabe von dendritischen Zellen intratumoral keinen Effekt und die Anwendung einer Chemo-therapie nur eine transiente Tumorregression induzierte, während die intratumorale Injektion der dendritischen Zellen nach erfolgter Chemotherapie zu einer lang anhaltenden Tumorregression führte.

Da aus den bereits oben genannten Gründen eine Herstellung apoptotischer Zellen aus primären Tumorzellpräparationen sehr schwierig war, wurde sich im Kontext dieser Arbeit für die klassischen danger-Signale entschieden.

MATZINGER, 1994 und GALLUCCI UND MATZINGER, 2001 prägten den Begriff danger-Signal als ein Zeichen für Immunzellen, über Inflammation die Anwesenheit von Gefahr zu vermitteln. Eines dieser Muster, diese Gefahr zu vermitteln, sind die so genannten

PAMPs mit ihren Rezeptoren, den PRRs. Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Mitglieder dieser PRRs. Eine Aktivierung der TLR über TLR-Liganden führt bei aktivierten dendritischen Zellen zu einer effektiven T_H1-Immunantwort, während inflammatorische Zytokine allein auf dendritischen Zellen zwar die klonale Expansion von CD4⁺-T-Zellen unterstützen, aber keine TH1/TH2-Immunantwort fördern (SPÖRRI UND REIS E SOUSA, 2005). Aus diesen Gründen wurde entschieden, über verschiedene TLR-Liganden und nicht über einzelne inflammatorische Zytokine (wie z. B. im „Jonuleit-Mix“) die über das Tumorzell-Lysat aktivierten dendritischen Zellen mit einem zusätzlichen dritten Signal zu stimulieren, um so eine effektive T_H1-Immunantwort zu induzieren.

Die hier verwendeten TLR-Liganden BCG, welches an den TLR2 bindet, und Poly I:C (dsRNA), welches an den TLR3 bindet, induzierten mit und ohne Tumorzell-Lysat einer Mammakarzinomzelllinie eine TH1-Immunantwort mit hohen Mengen IFN-γ und TNF-α sowie dem T_H2-Zytokin IL-6. IL-6 wird bei einer TLR-Aktivierung gebildet, um die reagierenden T-Zellen bei einer überschießenden TH1-Immunantwort zu regulieren (PASARE UND MEDZHITOV, 2003). Poly I:C induzierte dabei die effektivste T_H1-Immunantwort, während BCG und das Recall-Antigen PPD eine schwächere T_H1-Antwort hervorriefen (siehe Abbildung 38). BCG induzierte ebenfalls eine TH2-Antwort über die Produktion von IL-10. Die Arbeitsgruppe ATKINS ET AL.,(2003) konnte gleichzeitige IL-12- und IL-10-Produktion nach BCG-Stimulation nachweisen, dagegen induzierten LPS und CpG eine reine TH1-Immunantwort. Das Tumorzell-Lysat unterstützte die TH1-Antwort nicht zusätzlich, die TH1-Antwort, induziert durch das Poly I:C und das Lysat, war schwächer als ohne Lysat. Dies könnte mit einer Überaktivierung der T-Zellen in Richtung T_H1-Antwort zusammenhängen, denn ohne ein zusätzliches Antigen (Lysat) wurde das T_H1-supprimierende Zytokin IL-10 gebildet.

Durch die Aktivierung der dendritischen Zellen mit dem Lysat und Poly I:C konnte die IL-10-Produktion reduziert werden. Zwischen der TH1- und TH2-Immunantwort finden immer gegenseitig regulierende Mechanismen statt, um so eine überschießende Reaktion in die eine oder andere Richtung zu verhindern. TH1- und TH2-assoziierte Zytokine regulieren sich gegenseitig, IFN-γ inhibiert TH2-Zytokine und IL-4 und IL-10 inhibieren TH1-Zytokine (MOSMANN,1991;FIORENTINO ET AL.,1991).

Eine T-Zellantwort kann somit durch die Aktivierung der dendritischen Zellen mit einem Tumorzell-Lysat und dsRNA als danger-Signal wesentlich verstärkt werden. Die Ergebnisse von BAI ET AL.,(2002)zeigen ebenfalls, dass durch ein zusätzliches danger-Signal die Immunogenität des Tumors erhöht wird. Sie erzielten eine verstärkte memory-T-Zellantwort durch MCF-7-Lysat-gepulste dendritische Zellen wobei das Lysat der Zelllinie zuvor mit Newcastle disease virus (NDV) versetzt wurde.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass schwach immunogene Antigene, wie autologe Tumorzell-Lysate, durch die zusätzliche Aktivierung über TLR-Liganden auf dendritischen Zellen zu einer wesentlichen Verstärkung der T_H1-Immunantwort führen können. Dabei stellte sich in dieser Arbeit die dsRNA (Poly I:C) als der potenteste Aktivator für eine effiziente TH1-Immunantwort heraus. Somit steht für eine Antitumor-Immuntherapie eine sichere und potente dendritische Zellvakzine zur Verfügung, mit dem Potential eine verstärkte Immunreaktion gegen den Tumor zu erzeugen.