Wie effizient phagozytieren unreife und reife MoDC lipidische Proteine einer Mammakarzinomzelllinie?

Dendritische Zellen sind in der Lage unterschiedliche Endozytosemechanismen zur Aufnahme von Antigenen zu benutzen. In Abhängigkeit von den Eigenschaften des Antigens, der Aufnahmekapazität und des Aufnahmeweges können funktionell unter-schiedliche Aktivierungssignale in den dendritischen Zellen induziert werden.

Im Hinblick darauf stellte sich die Frage, ob unterschiedliche Zellkompartimente, wie Membranproteine oder intrazelluläre Proteine von nekrotischen Tumorzellen, mit gleicher Effizienz aufgenommen werden und zu einer MoDC-Aktivierung führen können. Daher wurde eine Proteinaufreinigung mittels Triton X-114 und anschließender Markierung der löslichen und lipidischen Proteine mit FITC aus dem Zell-Lysat der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 durchgeführt (siehe 2.2.6.1 und 2.2.6.3). Monozyten wurden aus Leukapheraten und Elutriaten von gesunden Spendern (Normalspender aus der Blutbank der Universität Göttingen) isoliert und 6 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF für die Generierung von unreifen MoDC kultiviert. Reife MoDC wurden für 2 weitere Tage unter den gleichen Kulturbedingun-gen und zusätzlich mit dem „Jonuleit-Mix“ (IL-6, IL-1β, TNF-α und PGE₂ (siehe 2.2.2.4)) ab Tag 6 kultiviert. Die Zellen wurden für die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen in 24 Napf Lumoxplatten kultiviert und nach 6 bzw. 8 Tagen wurde zu den unreifen bzw. reifen MoDC für 2 Stunden 10µg/ml FITC-markiertes Protein der Membranfraktion gegeben. Eine Azidkontrolle, eine Kontrolle mit FITC-Farbstoff allein

und unmarkierte Zellen zum Vergleich wurden ebenfalls mitgeführt. Nach der zwei-stündigen Phagozytose wurden alle Ansätze im Fluoreszenzmikroskop begutachtet und die Aufnahme des Proteins wurde im Durchflusszytometer quantifiziert (siehe 2.2.7.1 und 2.2.7.2). Für die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen mit Oberflächenantigen-färbung wurden die Zellen in 24-Napf-Lumoxplatten auf Objektträgern kultiviert, der Phagozytose-assay durchgeführt und anschließend gefärbt.

MoDC ohne Protein der Membranfraktion MoDC mit Protein der Membranfraktion iMoDC iMoDC + Azidkontrolle

mMoDC mMoDc + Azidkontrolle iMoDC mit FITC-Farbstoff ohne Protein

∆% FITC positive Zellen

MoDC ohne Protein der Membranfraktion MoDC mit Protein der Membranfraktion iMoDC iMoDC + Azidkontrolle

mMoDC mMoDc + Azidkontrolle iMoDC mit FITC-Farbstoff ohne Protein

∆% FITC positive Zellen

Abbildung 25: Phagozytose von FITC-markiertem Protein der Membranfraktion der Zelllinie MCF-7 durch unreife und reife MoDC bei n=3 Spendern. Der Anteil FITC-markierter Zellen wurde bei unreifen und reifen MoDC von n=3 Spendern nach zweistündiger Inkubation mit FITC-markiertem Protein der Membranfraktion im Durchflusszytometer bestimmt. Sowohl bei den unreifen als auch bei den reifen MoDC wurden jeweils eine Azidkontrolle, eine FITC-Farbstoffkontrolle und unmarkierte Zellen als Kontrolle mitbestimmt. Die Werte sind im Mittel + SD dargestellt.

Die lipipdischen Proteine der Tumorzelllinie MCF-7 wurden von 74,67 % der unreifen MoDC der Spender (n=3) phagozytiert. Im Vergleich zur Aufnahme von Zymosan (siehe Abbildung 23) und löslichen Proteinen (siehe Abbildung 32) der Zelllinie wurden Proteine der Membranfraktion von weniger unreifen MoDC phagozytiert. 30,13 % der reifen MoDC nahmen die FITC-markierten Proteine der Membranfraktion auf. In den

Phagozytose konnte sowohl bei unreifen als auch bei reifen MoDC mit Azid verhindert

iMoDC ohne Protein der Membranfraktion iMoDC mit Protein der Membranfraktion mMoDC ohne Protein der Membranfraktion mMoDC mit Protein der Membranfraktion

91,67

iMoDC ohne Protein der Membranfraktion iMoDC mit Protein der Membranfraktion mMoDC ohne Protein der Membranfraktion mMoDC mit Protein der Membranfraktion

Abbildung 26: Expression der Oberflächenantigene bei den unreifen und reifen MoDC der n=3 Spendern vor und nach der Phagozytose des FITC-markiertem Protein der Membranfraktion. Die Expression der charakteristischen Oberflächenantigene wurde jeweils bei den n=3 Spendern von den unreifen und reifen MoDC mit und ohne Phagozytose des Proteins der Membranfraktion durchflusszytometrisch analysiert. Dafür wurden die Zellen vor und nach der Phagozytose mit Antikörpern, welche an das Tandemkonjugat PE-Cy5 gekoppelt waren, gefärbt (siehe 2.2.7.1). Die Prozentzahl positiver Zellen ist im Mittel + SD dargestellt.

Vor und nach der Phagozytose von Proteinen der Membranfraktion der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 ergaben sich keine Unterschiede in dem sowohl bei unreifen als auch bei reifen MoDC schwach exprimierten LPS-Rezeptor CD14 und dem stark exprimierten MHC-Kl II-Antigen HLA-DR. Veränderungen in der Expression konnten vor allem bei dem Marker für reife dendritische Zellen CD83 gemessen werden. Sowohl bei den unreifen MoDC von 15,01 % auf 40,01 % und bei reifen MoDC von 65,39 % auf 86,2 % konnte eine gesteigerte Expression des CD83 nach der Phagozytose Proteinen der Membranfraktion festgestellt werden. CD1a wurde auf unreifen MoDC nach der Aufnahme der Proteine nur leicht heraufreguliert und bei den

reifen MoDC induzierte die Phagozytose eine Herunterregulation von CD1a, was ebenfalls ein Hinweis auf eine weitere Ausreifung bzw. Aktivierung der Zellen ist (siehe Abbildung 26). Die Phagozytose von lipidischen Proteinen der Zelllinie MCF-7 induzierte somit eine Reifung bei unreifen MoDC und ist ein weiteres Reifungssignal bei reifen MoDC von Spendern.

a) b)

a) b)

Abbildung 27: 6 Tage alte unreife MoDC mit phagozytiertem FITC-markiertem Proteinen der Membranfraktion der Tumorzelllinie MCF-7. Monozyten von Spendern wurden für 6 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF kultiviert und nach 6 Tagen Kulturdauer wurden die unreifen MoDC für 2 Stunden mit 10 µg/ml FITC-markiertem Protein der Membranfraktion inkubiert. Phasenkontrast- (a) und Fluoreszenzmikroskopische-Aufnahme (b) der MoDC, welche FITC-Proteine der Membranfraktion internalisiert haben.

HLA-DR HLA-ABC

HLA-DR (Phasenkontrast) HLA-ABC

CD80 CD86

a)

b)

c)

d)

e)

f)

HLA-DR HLA-ABC

HLA-DR (Phasenkontrast) HLA-ABC

CD80 CD86

a)

b)

c)

d)

e)

f)

Abbildung 28: 6 Tage alte unreife MoDC mit phagozytierten FITC-markierten Proteinen der Mem-branfraktion der Zelllinie MCF-7 und Oberflächenantigenfärbung funktionell wichtiger Antigene auf unreifen MoDC. Monozyten von Spendern wurden für 6 Tage auf Lumoxplatten mit Objektträgern in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF kultiviert und nach 6 Tagen Kulturdauer wurden die unreifen MoDC für 2 Stunden mit 10 µg/ml FITC-markiertem Protein der

Membranfraktion inkubiert. Nach der Phagozytose wurde der Überstand aus den Näpfen entnommen, die Zellen wurden mit PBS gewaschen und anschließend wurden die Objektträger aus den Näpfen ent-nommen. Die Färbung mit den PE-gekoppelten Antikörpern gegen HLA-DR ((a) Fluoreszenz- und (b) Phasenkontrast-Aufnahme), CD80 ((c) Aufnahme), HLA-ABC((d) und (e) Fluoreszenz-Aufnahmen) sowie CD86 ((f) Fluoreszenz-Aufnahme) erfolgte wie unter 2.2.7.2 beschrieben. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen erfolgten mit einem Breitband-Filter, welcher sowohl FITC als auch PE emitiert.

Wie in den Abbildung 28 a-f an der Grünfluoreszenz zu erkennen ist, hatten alle Zellen das FITC-markierte Protein der Membranfraktion internalisiert und die für die Antigen-präsentation essentiellen Oberflächenantigene waren nach der Phagozytose der lipidischen Proteine deutlich auf den unreifen MoDC exprimiert. Die stärkste Expression konnte bei dem MHC-Kl I-Molekül HLA-ABC und dem costimulatorischen Molekül CD86 beobachtet werden. Ein ebenfalls stark exprimiertes Antigen mit einer starken Rotfluoreszenz war das MHC-Kl II-Molekül HLA-DR. Eine schwächere Rotfluoreszenz war bei dem B7.1-Molekül (CD80) zu sehen. Nach der Phagozytose von Proteinen der Membranfraktion waren die für die im Folgenden beschriebenen wichtigen Moleküle der Antigenprozessierung und -präsentation im hohen Maße auf unreifen MoDC exprimiert.

3.2.3 Pinozytose der Wasser- löslichen Proteine der Tumorzelllinie MCF-7 durch