Aufarbeitung und Kultivierung von Tumoren

Bei längerer Kulturdauer bilden die meisten Tumoren durch den Selektionsdruck Subzelllinien, die mit der Ausgangszelllinie bezüglich des Karyotyps und der Wachstumseigenschaften nicht mehr identisch sein müssen (PETERS UND BAUMGARTEN

1990). Die Arbeit mit frischen Tumorzellpräparationen oder Kurzzeit-Primärkulturen von isolierten Tumorzellen umgeht die Transformation der Tumorzellen.

Um vergleichende Untersuchungen zwischen schon bewährten Permanentlinien und frisch isoliertem Patientenmaterial durchzuführen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Primärtumoren, Metastasen und Pleuraergüsse von Mammakarzinompatientinnen aufgearbeitet. Diese Präparationen wurden zytopathologisch begutachtet, um sicher zustellen, dass es sich bei den isolierten Tumorzellen um Zellen des Originaltumors handelte.

2.2.3.1 Mechanische Aufarbeitung von Tumoren

Die mechanische Isolierung von Tumorzellen stellt die am häufigsten verwendete Methode dar. Im Gegensatz zur enzymatischen Aufarbeitung besteht hier nicht die Gefahr des Verlustes der antigenen Eigenschaften der Tumorzellen. So können vitale isolierte Einzelzellen sofort für eine weitere Expansion genutzt werden, eine durchfluss-zytometrische Analyse der Oberflächenmarker auf Tumorzellen kann durchgeführt oder die Zellen können für weitere Verwendungszwecke vital eingefroren werden.

Transport- bzw. Aufarbeitungsmedium: RPMI 1640 + 2,5 µg/ml Amphotericin B + 10 µg/ml Ampicillin + 50 µg/ml Gentamycin + 20 µg/ml Metronidazol

55 % iges (v/v) Percoll (Dichte: 1.07 g/ml)

steriles Zell-Gewebedissoziations Kit: autoklavierbare Siebhalterung + 60-Mesh- und 80- Mesh-Siebe + Glaspistill + Pinzette; Sigma-Aldrich Chemie, Deisenhofen

Einmalskalpelle; Aeskulap AG, Tuttlingen

Operativ gewonnenes Tumormaterial wurde in einem sterilen, gekühlten (4–8°C) Trans-portbehälter, der mit dem Transportmedium gefüllt war, transportiert. Das Material wurde in eine Petrischale mit vorgelegtem Aufarbeitungsmedium überführt. Mittels eines Skalpells erfolgte die Fragmentierung des Tumorgewebes in möglichst kleine Stücke. Eventuell vorhandenes Fettgewebe wurde entfernt. Nach Überführung der fragmentierten Tumorstücke in ein 60-Mesh-Sieb wurden die Gewebestücke mit einem Glaspistill weiter zerkleinert, indem sie durch das Sieb gepresst wurden. Diese Prozedur wurde so lange wiederholt bis sich kaum noch vollständiges Gewebe im Sieb befand.

Ein zweites autoklavierbares 80-Mesh-Sieb wurde in eine dritte Petrischale gestellt. Das 60-Mesh-Sieb wurde aus der zweiten Schale entfernt und das Medium aus der zweiten Schale mit den Einzelzellen und kleineren Gewebsverbänden wurde durch das 80-Mesh-Sieb mit dem Glaspistill gegeben. Dadurch konnte eine vollständige Einzelzell-suspension hergestellt werden.

Durch die makroskopische Betrachtung des Gewebes vor der Aufarbeitung und eine mikroskopische Beurteilung der vorliegenden Zellsuspension wurde entschieden, ob im Anschluss eine Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll durchgeführt wurde. War das

Gewebe stark vaskularisiert oder befanden sich in der Einzelzellsuspension sehr viele Erythrozyten, wurde die Einzelzellsuspension im Aufarbeitungsmedium auf zwei Gradienten mit je 12,5 ml Percoll gegeben und bei 800 x g für 20 min ohne Bremse zentrifugiert. Mit diesem Schritt wurden Erythrozyten, Granulozyten und Zelltrümmer entfernt. Erfolgte kein Gradient, wurden die Einzelzellen aus der Petrischale in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und das Röhrchen mit PBS aufgefüllt. Die Zellen wurden sowohl mit als auch ohne Gradient dreimal in PBS gewaschen (360 x g, 10 min, 4°C, 1 x ohne; 2 x mit Bremse), um verbliebe Fettreste auszuwaschen. Anschließend wurden die Zellen mit einer Lebend-Totfärbung mittels Trypanblau (siehe 2.2.1.3) gezählt. Von der Zellsuspension wurde ein Ausstrich auf einem Objektträger angefertigt.

Der fixierte Ausstrich wurde zur zytologischen Begutachtung an die Pathologie in Bonn übersand. Da in Tumoren auch andere Zellen, z. B. Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL), vorkommen, war für weitere Analysen und Verwendungszwecke der genaue Tumorzellanteil von Bedeutung. Dieser wurde von dem Pathologischen Institut der Universität Bonn mitgeteilt. Die so aufgearbeiteten Zellen wurden eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C bzw. -152°C gelagert.

2.2.3.2 Enzymatische Aufarbeitung von Tumoren

Metastasen lassen sich mit Hilfe der mechanischen Aufarbeitungsmethode ohne weiteres in Einzelzellsuspension bringen. Bei primären Mammakarzinomen sind die einzelnen Zellen oftmals fest im umliegenden Stroma verankert, was das mechanische Zerkleinern erschwert bzw. unmöglich macht. Ebenso befinden sich in Mamma-karzinomen häufig Mikrokalzifikationen, welche eine mechanische Aufarbeitung eben-falls erschweren. In diesen Fällen werden Proteasen verwendet, die das Stützgewebe des Tumors angreifen und so eine Vereinzelung der Tumorzellen fördern.

Eine Standardmethode besteht darin, die Zellen zunächst soweit wie möglich mechanisch aufzuarbeiten um die Zellsuspension im Anschluss in 0,005 %iger (v/v) Kollagenase / Dispase (Boehringer, Mannheim) für 30 Minuten zu inkubieren. Diese Methode wurde nur für experimentelle Fragestellungen verwendet, da für die Anwen-dung am Patienten eine enzymatische Aufarbeitung nicht erlaubt ist.

2.2.3.3 Isolierung von Tumorzellen aus Pleura- bzw. Aszitesergüssen

Bei Karzinomerkrankungen können seröse Körperflüssigkeiten aus der Pleura oder der Peritonealhöhle metastatische Absiedlungen mit enthaltenen Tumorzellen enthalten.

Auch sind in diesen Ergüssen häufig Entzündungszellen wie Lymphozyten und Makro-phagen zu finden. Diese Ergüsse werden aus diagnostischen und therapeutischen Gründen unter sterilen Bedingungen punktiert und in sterile Sekretbeutel aufgenommen.

Für den Transport wurden die Aspirate gekühlt bei 4–8°C gelagert. Sie wurden in 50 ml-Zentrifugenröhrchen gefüllt und bei 360 x g, 10 min, 4°C, mit Bremse zentri-fugiert. Der serumhaltige Überstand wurde abgenommen und aufbewahrt. Je nach Erythrozytengehalt des abzentrifugierten Pellets wurde eine Dichtegradienten-zentrifugation mit Percoll durchgeführt (siehe 2.2.3.1). Die Zellen wurden danach mit PBS gewaschen (360 x g, 10 min, 4°C, mit Bremse), gezählt und entweder im serumhaltigen Überstand eingefroren oder in Kultur genommen. Tumorzellen konnten aus Punktaten am vitalsten und schnellsten isoliert werden.

2.2.3.4 Kultivierung von Tumorzellen

Die Kultivierung von Tumorzellen aus Primärtumoren von Mammakarzinomen war aufgrund der Aufarbeitungsprobleme (siehe 2.2.3.2) sehr schwierig bzw. nicht möglich.

So konnten z.B. stromale Fibroblasten epitheliale Zellen in einer Zellkultur überwachsen, was zu Problemen beim Ansatz der Primärkulturen führte. Die Isolierung vitaler Tumorzellen aus Metastasen und Ergüssen war hingegen wesentlich einfacher und erfolgreicher. Insbesondere Tumorzellen aus Ergüssen konnten leicht in Kultur genommen werden und vermehrten sich dort schnell.

Kulturmedium: RPMI 1640 + 10 % (v/v) autologes HuS + 50 µg/ml Gentamycin

Damit sich die Zellen ihr Medium besser konditionieren konnten, wurden sie in kleinen Gewebekulturflaschen (21,5 cm²) ausgesät. Bei aus Ergüssen kultivierten Tumorzellen, wurde dem Kulturmedium statt autologem Humanserum der serumhaltige Zentri-fugationsüberstand als Serumersatz und als Wachstumsfaktor zugesetzt. Waren

Zell-teilungsstadien zu beobachten, so wurde die Mediumfarbe täglich kontrolliert. Bei Verbrauch des Mediums erfolgte ein 50 %iger Mediumwechsel. Bei etwa 75 %iger Konfluenz wurden die Zellen durch die Zugabe von Trypsin / EDTA Lösung abgelöst, einmal mit Kulturmedium gewaschen und zu gleichen Teilen auf zwei 21,5 cm²-Gewebekulturflaschen verteilt. Durch Untersuchungen des Tumormaterials in pathologischen Instituten unter nicht vollständig sterilen Bedingungen oder durch die Dauer der Kulturzeit, mit schwach proliferierenden Zellen, wächst die Gefahr einer Infektion stark an. In Primärkulturen können so leicht Keime heranwachsen. Um eine Kontamination mit Keimen zu verhindern, wurden allen Kulturmedien 2,5 µg/ml Amphotericin B, 10000 U/ml Penizillin und 10000 µl/ml Streptomycin zugesetzt. Bei besonders erhöhter Infektionsgefahr wurden zusätzlich Antibiotika wie Gentamycin, Amphotericin B, Ampicillin und Metronidazol (siehe 2.2.3.1 Aufarbeitungsmedium) verwendet. Waren die Tumorzellpräparation von Fibroblasten kontaminiert, wuchsen diese in der Regel sehr schnell, entzogen dem Medium Nährstoffe und überwucherten die vorhandenen Tumorzellen. Die Tumorzellen wurden in einem zertifizierten, LPS-freien RPMI-Medium ohne FCS kultiviert, um einen unbedenklichen Einsatz der Tumorzellen in autologen dendritischen Zellvakzine zur Behandlung von Mamma-karzinompatientinnen zu gewährleisten.

2.2.3.5 Herstellung eines Tumorzell-Lysates

Für das Pulsen der dendritischen Zellen und deren Antigenaufnahme müssen Tumor-zellen abgetötet und aufgeschlossen werden. Dann können dendritische Zellen sowohl membranständige als auch intrazelluläre Antigene zur Aufnahme bereitgestellt werden.

Es sollte dabei eine Methode verwendet werden, bei der Proteine und Proteinfragmente ihre Ausgangskonfiguration beibehalten und wobei keine Substanzen auftreten, die zelltoxisch auf die dendritischen Zellen wirken könnten. Aufgrund dieser Überlegung kamen keine Detergenzien und Ultraschallzerkleinerungen zum Einsatz.

Die Zellen wurden durch mehrfachen Wechsel zwischen Schockgefrieren und Auftauen abgetötet und aufgeschlossen. Beim Einfrieren wurde kein DMSO zum Einfriermedium

Folge zum Zerplatzen der Zellmembran kam. Die Tumorzellen wurden dafür aus der Kultur genommen oder aufgetaut, gezählt und auf die entsprechend benötigte Zellzahl eingestellt. Es wurden 1–10 x 10⁷ Tumorzellen / ml RPMI 1640 aufgenommen und je 1 ml auf die Kryoröhrchen verteilt. Diese wurden im Anschluss für 15 min in ein Stickstoff-beschicktes Dewargefäß gegeben. Danach wurden die Kryoröhrchen für 15 min bei 37°C aufgetaut. Dieser Vorgang wurde mindestens dreimal wiederholt.

Durch eine mikroskopische Kontrolle über eine Lebend-Totfärbung mit Trypanblau wurde kontrolliert, ob alle Zellen tot bzw. nur noch Zellfragmente zu erkennen waren.

Das Zell-Lysat konnte im Anschluss zum Pulsen der dendritischen Zellen verwendet werden. Dabei wurde auf eine dendritische Zelle das Lysat einer Tumorzelle gegeben.

Für spätere Verwendungszwecke wurde das Lysat bei -152°C gelagert.

2.2.4 Spezifische T-Zellaktivierung mit Tetanustoxoid und Tumorzell-Lysaten