4.1.1 Reagenzien, Laborbedarf, Verbrauchsmaterialien, Pharmaka und Geräte
Die verwendeten Lösungen, Reagenzien (10.2), Pharmaka (10.3), Geräte (10.6) und eine Auflistung des verwendeten Laborbedarfs, sowie der benötigten Verbrauchsmaterialien (10.4), finden sich im Anhang in Tabellenform wieder. In diesem Kapitel wird ebenfalls die Herstellung von einzelnen Lösungen und Medien besprochen (10.1).
4.1.2 Herstellung der Lipidnanokapseln
Alle in dieser Arbeit verwendeten Nanopartikel (Lipidnanokapseln, LNC) wurden in den
„Laboratoires d’Ingénierie de la Vectorisation Particulaire“ der Universität Angers in Frankreich hergestellt.
Die Herstellung der Lipidnanokapseln basiert auf der neuartigen Methode der Phaseninversion (phase inversion temperature method, PIT-Methode) bei welcher eine Öl-in-Wasser Emulsion durch wiederholte Erwärmung und Abkühlung in eine Öl-in-Wasser-in-Öl Emulsion umgekehrt wird (HEURTAULT et al. 2002; BEDUNEAU et al. 2006).
Bei den Lipidnanokapseln handelt es sich um Nanopartikel bestehend aus einem flüssigen Kern, welcher von einer Schicht aus oberflächenaktiven Substanzen umgeben ist (Abb 3. A).
Die zur Herstellung benötigte ölige Phase bestand aus dem Caprin- und Caprylsäure-Triglyzerid Labrafac® WL 1349 (Gattefossé S.A., Saint-Priest, Frankreich), während die wässrige Phase aus mit Natriumchlorid angereichertem, steril gefilterten Wasser bestand. Des Weiteren war das Hinzufügen von zwei Tensiden nötig, dem Lipoïd® S75-3 (Lipoïd GmbH, Ludwigshafen, Deutschland), einem aus Sojabohnen gewonnenem Lecithin und dem Solutol® HS 15 (BASF, Ludwigshafen, Deutschland), einem aus Polyethylenglycol bestehenden, künstlich hergestellten Tensid. Um Lipidnanokapseln mit dem gewünschten Durchmesser von etwa 50 nm herzustellen, wurden die Komponenten in den folgenden Mengen verarbeitet:
1,028 g Labrafac®, 0,075 g Lipoïd®, 0,846 g Solutol®, 0,089 g NaCl und 2,962 g steril gefiltertes Wasser.
Um zunächst eine Öl-in-Wasser Emulsion zu erhalten, wurden alle Komponenten vermengt und auf einem Magnetrührer bei Raumtemperatur und 200 rounds per minute (rpm) vermischt. Unter kontinuierlicher Erwärmung bei einer steigenden Temperatur von 4 °C pro Minute, wurde bei etwa 70 °C ein kurzes Intervall der Transparenz beobachtet, wonach die vollständige Phasenumkehr bei einer Temperatur von etwa 85 °C erreicht wurde.
Anschließend wurden drei Temperaturzyklen nahe der Phasenumkehr, alternierend von 60 bis 85 °C, wiederholt, um eine stabile Wasser-in-Öl Emulsion zu erhalten. Die vorliegende Mischung wurde daraufhin mit 12,5 ml Wasser im Verhältnis 1:2,5 verdünnt, wobei das Wasser zudem auf 2 °C herabgekühlt war um die Reaktionsprozesse zu stoppen und somit die Herstellung der LNC zu vollenden.
Eine anschließende Modifikation der Oberfläche wurde im Vorfeld der Fluoreszenzmarkierung der Nanopartikel vorgenommen. 1,75 ml LNC (1017 Nanopartikel/ml) wurden für 90 Minuten bei einer Temperatur von 60 °C mit 1,25 ml wässriger Lösung (15 mg/ml) von 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Amino(Polyethylene-Glycol)2000] (DSPE-PEG2000-amino) (Alabaster, USA) inkubiert. Die Suspension wurde alle 15 Minuten aufgeschüttelt und am Ende in einem Eisbad für 1 Minute abgeschreckt.
Danach wurden die Nanopartikel mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszein-5-isothiocyanate (FITC, Sigma-Aldrich Frankreich) markiert, um die Lokalisation der Partikel in Zellen und Geweben nachvollziehen zu können (Abb. 3. B.). Hierfür wurden 1 ml FITC mit einer Konzentration von 2 mg/ml auf 2,95 ml LNC Suspension gegeben, wobei der pH-Wert langsam durch tropfenweise Zugabe von Na3PO4 auf 9 erhöht wurde. Unter Lichtabschluss wurde die Mischung in einem Wasserbad für 45 Minuten bei 37 °C inkubiert um abschließend die Reaktion, durch Überführung in ein Eisbad für 3 Minuten, zu beenden. Bei den in den Zellversuchen verwendeten Nanopartikeln ohne Fluoreszenzmarkierung entfiel dieser Schritt der Herstellung.
Um das Arzneimittel Rolipram in die Partikel aufzunehmen, wurde der Phosphodiesterase-Hemmer vor den drei Temperaturzyklen in einer Konzentration von 1 mg/ml Labrafac® hinzugefügt (Abb. 3. B.), wobei dieser Schritt bei den Nanopartikeln ohne Rolipram entfiel.
4.1.3 Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit Spiralganglienzellen
Für die zu Beginn der vorliegenden Arbeit durchgeführten Zellkulturexperimente wurden neonatale Sprague-Dawley-Ratten (eigene Zucht) beiderlei Geschlechts verwendet. Insgesamt fanden in dieser Studie 138 Tiere im Alter von 3-5 Tagen Verwendung.
Durch die den In-vivo-Experimenten vorangegangenen Zellkulturexperimente wurde der Einfluss des biologischen Effekts von Rolipram sowie der Nanopartikel auf das Überleben der Spiralganglienzellen untersucht, um die Studien am Tier auf ein Minimum zu reduzieren. So konnte durch die Zellversuche im Rahmen dieser Arbeit diejenige Konzentration der Nanopartikellösung ermittelt werden, welche ein optimales Überleben der Spiralganglienzellen in vitro zeigte. Die daraus ermittelte Konzentration wurde anschließend im Tiermodell untersucht.
Die Verwendung der Tiere zu wissenschaftlichen Zwecken (Tierschutzgesetz, §4) wurde dem zuständigen Amt gemeldet (Veterinäramt Hannover). Die Tierhaltung und Zucht wurde unter
A B C
Labrafac®
Mixture of Lipoïd® and Solutol® DSPE-PEG2000-amino
FITC Rolipram
Abb. 3: (A) Lipidnanokapsel; (B) Lipidnanokapsel mit FITC markiert; (C) Lipidnanokapsel mit FITC markiert und inkorporiertem Rolipram.
spezifisch pathogen-freien Bedingungen in den Räumlichkeiten des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover unter identischen Bedingungen für alle Tiere durchgeführt.
Die Haltung der Muttertiere erfolgte in Zweiergruppen in Typ 3 Makrolon®-Käfigen (Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Holland). Bei einer Raumtemperatur von 20-24 °C und 50-60 % relativer Luftfeuchtigkeit wurde der Tagesrhythmus der Tiere durch einen täglichen Hell/Dunkel-Zyklus von 12 Stunden reguliert. Die Versorgung der Tiere erfolgte durch ein Trockenpelletfutter (Altromin-1324®, Altromin GmbH, Lage) und Trinkwasser ad libitum, wobei die Tiere auf einer Standardeinstreu gehalten wurden.
Zur Gewinnung der Spiralganglienzellen wurden die Jungtiere 1-2 h vor der Verwendung von den Muttertieren separiert.
4.1.4. Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit dendritischen Zellen
Zur Generierung der dendritischen Zellen wurden Stammzellen aus dem femoralen Knochenmark von BALB/c Mäusen gewonnen. Die Versuche sollten neben der zytokinproduktionshemmenden Wirkung des Roliprams auch einen Aufschluss über die Freisetzung des Arzneimittels aus der Nanopartikel-Rolipram-Kombination geben.
Für die Gewinnung von Stammzellen aus dem femoralen Knochenmark der BALB/c Mäuse erfolgte eine Anzeige zur Organentnahme für das Anlegen von Zellkulturen beim Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES Oldenburg). Insgesamt wurden drei Tiere für die Durchführung der Experimente verwendet.
Hierbei handelte es sich um weibliche BALB/c Mäuse mit einem Gewicht von ca. 20 g. Die Tiere wurden in der Tierhaltung des Instituts der Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in Kleingruppen von 5-6 Tieren auf einer Standardeinstreu gehalten, wobei der Tagesrhythmus durch einen Hell/Dunkel-Zyklus von 12 Stunden reguliert wurde. Zur Versorgung wurde den Tieren eine Altromin-Standarddiät (Altromin-1324®, Altromin GmbH, Lage) sowie Wasser zur freien Verfügung gestellt.
4.1.5 Versuchstiere und Tierhaltung für die In-vivo-Experimente
Für die den Zellkulturversuchen nachfolgenden In-vivo-Experimente wurden weibliche, Dunkin-Hartley-Meerschweinchen vom Züchter Charles-River verwendet. Das Ausgangsgewicht betrug 330-460 g. Für die Durchführung der Studie wurden 32 Tiere verwendet. Das Tierversuchsvorhaben wurde beim Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) unter der Nummer 33.9-42502-04-07/1266 angemeldet und genehmigt.
Die Haltung, sowie alle Eingriffe am Tier, erfolgten in den Räumlichkeiten des CrossBIT-Gebäudes, Feodor-Lynen-Straße 31 in 30625 Hannover. Zu Versuchsbeginn wurde die Hörschwelle der Versuchstiere mittels akustisch evozierter Hirnstammpotentiale ermittelt. In die Studie wurden nur Tiere aufgenommen, deren Hörstatus der physiologischen Norm entsprach (KANO u. STARR 1987; MITCHELL et al. 1997).
Nachfolgend wurden die Tiere systemisch ertaubt und sieben Tage später einer erneuten Messung der Hirnstammpotentiale zur Verifizierung des Ertaubungserfolges unterzogen.
Anschließend wurden die zu untersuchenden Substanzen intracochleär appliziert.
Die Tierhaltung wurde entsprechend der EU-Richtlinie 86/609/EWG unter identischen Bedingungen durchgeführt. Die Tiere wurden in Gruppen zu je 4 Individuen in Typ 3 Makrolon®-Käfigen (Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Holland) auf einer Standard-Einstreu (Weichholzfaser) gehalten. Ihr Tagesrhythmus wurde durch einen Hell/Dunkel-Zyklus von 12 Stunden reguliert. Die Raumtemperatur wurde konstant in einem Bereich von 20-24 °C gehalten wobei die Luftfeuchtigkeit einen Wert von 50-60 % aufwies. Zur Versorgung erhielten die Tiere Trinkwasser und Heu ad libitum, wobei ihnen zusätzlich ein Trockenpelletfutter (ssniff MS-2, ssniff Spezialdiäten GmBH, Soest) angeboten wurde.
4.1.6 Versuchsgruppen
Die folgende Tabelle (Tab.1) gibt einen Überblick über die Einteilung der Versuchstiergruppen. Es wurde eine Gruppengröße von je acht Tieren gewählt. Alle Versuchstiere wurden am ersten Tag der Studie systemisch ertaubt, wobei zuvor die
Hörschwelle mittels acoustically evoked auditory brainstem response (aABR)-Messung bestimmt wurde. In die Studie wurden nur normalhörende Tiere einbezogen. Am siebten Tag der Studie wurde die Ertaubung mittels wiederholter aABR-Messung bestätigt. Die Studie umfasst den Vergleich von vier Gruppen, wobei den Tieren der ersten Gruppe eine Woche nach der Ertaubung per Cochleostomie 5 µl Lipidnanokapsellösung mit inkorporiertem Rolipram in einer Verdünnung mit phospate buffered saline (PBS) von 1:100 in die Scala tympani der linken Cochlea injiziert wurde (Konzentration der Stammlösung:
Lipidnanokapseln 45 mg/ml; 19 µg/ml Rolipram). Die Tiere der zweiten Gruppe wurden in gleicher Weise auf der linken Seite mit einer Injektion von 5 µl Lipidnanokapsellösung in einer Verdünnung von 1:100 behandelt (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln 45 mg/ml). Bei der dritten Versuchsgruppe wurden 5 µl Rolipramlösung in der zu Gruppe 1 entsprechenden Konzentration injiziert wobei die letzte Gruppe eine Injektion von 5 µl PBS in die Scala tympani beider Cochleae erhielt. Bei den Gruppen 1-3 wurden in die Scala tympani der rechten Cochlea je 5 µl PBS als Kontrolle injiziert. Die Perfusion wurde bei allen Gruppen nach wiederholter aABR-Messung am Tag 21 vorgenommen.
Tab. 1: Darstellung des zeitlichen Verlaufs sowie der vorgenommenen Eingriffe während der in-vivo-Versuche. PBS = phosphate buffered saline, aABR = acoustically evoked auditory brainstem response
Tiergruppe Tag 0 Tag 7 Tag 21