Mit dieser Arbeit sollten im Wesentlichen zwei Fragestellungen bearbeitet werden. Zum einen wurde der neuroprotektive Einfluss von Rolipram auf Spiralganglienzellen überprüft. Zum anderen wurde dieser Phosphodiesterase-Hemmer in Lipidnanokapseln inkorporiert, um die Eignung dieses neuartigen Drug-Delivery-Systems zur Arzneimittelapplikation im Innenohr zu untersuchen. Rolipram wurde zunächst auf seine neuroprotektiven Eigenschaften gegenüber in vitro angezüchteten Spiralganglienzellen bewertet. Nach der Evaluierung der optimalen Konzentration sollte dieser Effekt im Tiermodell mittels ertaubter Meerschweinchen reproduziert werden. Hierbei wurde der Effekt Rolipram beladener Lipidnanokaspeln (LNC FITC ROLIPRAM) mit der Wirkung von alleinig verabreichtem
Rolipram verglichen um einen eventuellen Vorteil des Arzneimitteltransports über dieses neuartige Drug-Delivery-System zu bewerten.
Die Zellkulturversuche zeigten für Rolipram in allen verwendeten Konzentrationen (1:50= 1:100 = 0,19 µg/ml, 1:200 = 0,095 µg/ml, 1:300 = 0,063 µg/ml) nur einen tendenziell protektiven Effekt auf das Spiralganglienzellüberleben, während sich in der 1:100 Verdünnung der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination (LNC FITC ROLIPRAM, 0,19 µg/ml Rolipram) eine deutlich gesteigerte Spiralganglienzelldichte zeigte. Ebenso konnte für den unbeladenen Nanopartikel (LNC FITC) ein signifikant gesteigertes Spiralganglienzellüberleben gezeigt werden, wobei wahrscheinlich der Bestandteil Polyethylenglykol (LAVERTY et al. 2004) für diesen Effekt verantwortlich ist. Auch der Einfluss des Roliprams scheint in der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination einen wesentlichen Einfluss auf die Spiralganglienzellprotektion zu haben. Da sich durch die direkte Rolipramapplikation kein gesteigertes Zellüberleben nachweisen ließ, kann vermutet werden, dass ein durch den Nanopartikel verbesserter Transport des Arzneimittels in die Zelle erreicht wurde.
Die im Tierversuch ermittelten Spiralganglienzelldichten konnten die Ergebnisse des Zellkulturversuchs nicht reproduzieren. Die applizierten Testsubstanzen werden durch die in der Scala tympani vorhandene Perilymphe um einen weiteren Faktor verdünnt, wodurch die in den Zellversuchen beobachteten Effekte nicht erreicht werden konnten. Das Volumen der Scala tympani ist zwar bekannt, doch handelt es sich hierbei um kein statisches System sondern um einen mit dem Liquorraum verbundenen Bereich, wobei sogar Substanzen zur kontralateralen Seite diffundieren können (STÖVER et al. 1999). Hierdurch ist eine vorherige Kalkulation der letztlich wirkenden Konzentration erschwert. Eine höher dosierte Applikation birgt dabei die Risiken von zytotoxischen Effekten. Nach einer basalen Applikation der Testsubstanzen besteht die Annahme, dass eine vergleichsweise hohe Konzentration von den Zellen dieses Abschnitts aufgenommen wird, bevor sich die Nanopartikellösung in dem Lumen der Scala tympani zur gewünschten Konzentration verdünnt hätte. Dennoch wäre die Untersuchung der Applikation höherer Konzentrationen ein denkbarer Ansatz, um den positiven Effekt der Zellkulturversuche im Tiermodell zu reproduzieren.
Ein weiterer Zellkulturversuch zeigte unter der Verwendung von dendritischen Zellen eine vergleichsweise geringe Freisetzung des Roliprams aus den Nanopartikeln. Auch diese
Beobachtung lässt eine höher dosierte Applikation im Tiermodell sinnvoll erscheinen, um die geringe Freisetzung zu kompensieren.
Die Ergebnisse belegen, dass eine Modifikation der Nanopartikel hinsichtlich der Freisetzung ihres Ladungsgutes anzustreben ist. Eine weitere Optimierung durch die Steigerung der Ladungsmenge wäre ebenfalls vorteilhaft. Dadurch könnte eine höhere Konzentration von Arzneimitteln transportiert werden, um gleichzeitig toxische Effekte der Partikel zu minimieren. Letztlich soll über eine Modifikation der Nanopartikeloberfläche mittels spezieller Liganden eine Gewebespezifität erreicht werden, die einen Wirkstofftransport zu dem jeweiligen zu therapierenden Zelltyp ermöglichen soll.
Diese Arbeit liefert wertvolle Grundlageninformationen, die zur Optimierung dieses viel versprechenden Drug-Carrier-Sytems beitragen können. Weiterhin ist durch das verwendete Arzneimittel Rolipram neben neuroprotektiven Eigenschaften auch ein positiver Effekt hinsichtlich eines postoperativ einsetzenden Bindegewebswachstums zu erwarten. Hierdurch könnte bei Cochlea-Implantaten die Interaktion zwischen Nerven und Elektrode effizienter genutzt werden. Letztlich sind neben der kombinierten Therapie mit Cochlea-Implantaten nicht nur Einsatzgebiete im Innenohr denkbar. Auch in anderen Organsystemen könnten die Vorteile von Nanopartikeln verstärkt genutzt werden. So soll ein gezielter Transport der Arzneimittel erreicht werden, wobei das Ladungsgut solange geschützt ist, bis es die Zielzellen erreicht hat und damit zu einer erheblichen Reduktion von Nebenwirkungen führen kann.
7 Zusammenfassung
Hartwig Meyer (2011):
„Untersuchungen zum biologischen Effekt von Rolipram sowie in Lipidnanokapseln eingeschlossenem Rolipram auf Spiralganglienzellen und dendritische Zellen in vitro und Spiralganglienzellen in vivo“
Sensorineuraler Hörverlust stellt ein weit verbreitetes Krankheitsbild in den industrialisierten Nationen dar. Mittlerweile ist es möglich, betroffenen Patienten mittels eines Cochlea-Implantates ein erneutes Hörempfinden zu verschaffen, was Ihnen die sprachliche Kommunikation mit der Umwelt ermöglicht und ihnen neben einer verbesserten gesellschaftlichen Integration eine wesentlich gesteigerte Lebensqualität bietet. Neben dem Schutz neuronaler Spiralganglienzellen ist ein möglichst enger Nerv-Elektrodenkontakt anzustreben um die funktionelle Effizienz der Cochlea-Implantate und damit den Grad des Therapieerfolges zu erhöhen.
In dieser Arbeit wurde der Phosphodiesterase-Hemmer Rolipram auf seine spiralganglienzellprotektiven Eigenschaften getestet. Des Weiteren wurde der Einfluss dieses Arzneimittels auf die Spiralganglienzellen über die Applikation mittels eines neuartigen Drug-Delivery-Systems untersucht. Hierfür wurde das Rolipram in Lipidnanokapseln inkorporiert, was einen optimierten Transport in die Zelle ermöglichen sollte. Zunächst wurden Zellkulturversuche mit vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen 3-5 Tage alter Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Unter Einfluss der Testsubstanzen wurden diese Zellen für 48 Stunden kultiviert und anschließend über eine immunozytochemische Markierung quantitativ bewertet. Hintergrund dieses Versuchs war neben der Beurteilung der durch Rolipram und der Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination erreichten Spiralganglien-zellprotektivität die Ermittlung einer optimalen Wirkstoffkonzentration für die anschließend durchgeführten In-vivo-Versuche. Alle Testsubstanzen wurden in den Verdünnungen 1:50, 1:100, 1:200 und 1:300 der Stammlösung (Lipidnanokapseln 45 mg /ml; 19 µg/ml Rolipram) im Hinblick auf das Spiralganglienzellüberleben untersucht. Die ermittelten Ergebnisse
belegten kein signifikant erhöhtes Spiralganglienzellüberleben für das alleinig applizierte Rolipram. Die Kombination mit den Nanopartikeln zeigte hingegen einen stark positiven Effekt auf die Überlebensrate der kultivierten Spiralganglienzellen in der Verdünnung 1:100, welche auch in den anschließenden Tierversuchen verwendet wurde. Auch die unbeladenen Nanopartikel führten in der 1:100 Verdünnung zu einer gesteigerten Spiralganglienzelldichte, was auf die neuroprotektiven Eigenschaften des Partikelbestandteils Polyethylenglykol zurückgeführt werden kann. Der Vergleich zwischen diesen beiden Gruppen lässt darüber hinaus einen Einfluss des im Nanopartikel inkorporierten Roliprams erkennen, da im Vergleich die Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination ein signifikant höheres Zellüberleben aufzeigte.
Zusätzlich wurde ein Zellkulturversuch mit dendritischen Zellen (DC), welche nach einer Aktivierung mit Lipopolysacchariden TNF-α produzieren, durchgeführt. Die Hemmung der Zytokinproduktion ließ Rückschlüsse auf die Freisetzung des zu testenden Arzneimittels zu.
So konnte eine Aussage über die Freisetzung und die Effektivität der Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination im Vergleich zu dem direkt applizierten Rolipram getroffen werden. Darüber hinaus geben diese Versuche Auskunft auf die entzündungshemmenden Eigenschaften des Roliprams, da dendritische Zellen eine Schlüsselrolle im Entzündungsgeschehen einnehmen. Für diese Versuchsreihe wurden DC aus dem Knochenmark von BALB/c-Mäusen gewonnen und nach einer neuntägigen Kultivierung mit den Testsubstanzen behandelt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde erfolgte die Zugabe von Lipopolysacchariden, worüber die Zellen zur Maturation und TNF-α-Sekretion angeregt wurden. Die nach 24 Stunden per ELISA ermittelten Ergebnisse belegen eine konzentrationsabhängige Hemmung der Zytokinproduktion für das direkt applizierte Rolipram (1 µM), was auf einen entzündungshemmenden Effekt schließen lässt und Vorteile gegenüber dem Auftreten fremdkörperbedingter Bindegewebsbildung im Zusammenhang mit Cochlea-Implantaten bietet. Die Nanopartikel-Rolipram-Kombination bewirkte ebenfalls eine signifikant gehemmte Zytokinproduktion in der Konzentration von 1 µM, wobei diese im Vergleich zum direkt applizierten Rolipram aber wesentlich schwächer war. Diese Beobachtungen lassen auf eine, wenn auch geringe, Freisetzung des Roliprams aus den Nanopartikeln schließen, da die Applikation von purem Rolipram in den gleichen Konzentrationen eine stärkere TNF-α-Hemmung erzielte.
Für die In-vivo-Studien wurden unpigmentiere Meerschweinchen des Typs Dunkin Hartley verwendet. In die Studie wurden nur Tiere einbezogen, welche ein physiologisch normales Hörvermögen zeigten, welches am Tag null der Versuche durch eine aABR-Messung verifiziert wurde. Am gleichen Tag erfolgte die systemische Ertaubung der Tiere mit einer kombinierten Gabe von Kanamycin und Furosemid, welche durch eine wiederholte aABR-Messung an Tag sieben kontrolliert wurde. Die Testsubstanzen wurden im Anschluss über eine Cochleostomie zu je 5 µl in die Scala tympani der jeweils linken Ohren eingebracht, wohingegen rechtsseitig, zur Kontrolle, nur PBS injiziert wurde. Nach zwei weiteren Wochen wurden die Cochleae gewonnen. Durch die histologische Aufarbeitung konnte der Einfluss der Testsubstanzen auf die ermittelten Spiralganglienzelldichten ausgewertet werden. Hierbei wurden die im Zellversuch ermittelten Ergebnisse nicht reproduziert, da die Ergebnisse keinen spiralgangliezellprotektiven Effekt erkennen ließen. Als Hauptursache hierfür wird eine zu geringe Konzentration der Testsubstanzen angenommen. Durch die in der Cochlea vorhandenen Flüssigkeitsvolumina kommt es zu einer Verdünnung der injizierten Testsubstanz, welche im Voraus nur schwer kalkulierbar ist.
Zusammenfassend zeigten die In-vitro-Studien vielversprechende Ergebnisse. Diese könnten möglicherweise durch eine Modifikation der Tierversuche auch in vivo erfolgreich reproduziert werden. So wäre die Durchführung von tierexperimentellen Studien unter der Verwendung von höheren Konzentrationen oder kontinuierlichen Applikationsformen, wie osmotischen Pumpen, denkbar.
Die mit dieser Arbeit gewonnenen Grundlageninformationen liefern wertvolle Anhaltspunkte für eine weitere Optimierung dieses viel versprechenden Drug-Delivery-Sytems. So wäre neben einer verbesserten Freisetzung auch eine höhere Transportkapazität wünschenswert.
Letztlich soll durch die Modifikation der Partikeloberfläche eine Gewebespezifität erreicht werden, wodurch ein gezielter Einsatz der in den Nanopartikeln inkorporierten Substanzen bewirkt werden könnte.
8 Summary
Hartwig Meyer (2011):
“Investigations concerning the biological effect of rolipram and in lipid nanocapsules encapsulated rolipram on spiral ganglion cells and dendritic cells in vitro and spiral ganglion cells in vivo”
Sensorineural hearing loss is a widespread disease in industrialized nations. The treatment of deaf patients with cochlear implants gains a renewed sense of hearing, allowing linguistic communication with the environment, which leads to a better social integration and increases quality of life. For the optimal function of cochlear implants, spiral ganglion cell protection and a close nerve-electrode contact is desirable.
In this study, the phosphodiesterase inhibitor rolipram was tested on its efficiency to protect spiral ganglion cells. Moreover, the effect of this drug was investigated by application of a novel drug-delivery system. For this purpose, rolipram was incorporated in lipidic nano-capsule nanoparticles, which leads to an optimized transport into the cell by releasing the drug only inside.
First, in-vitro-experiments with isolated cultured spiral ganglion cells of 3-5 days old Sprague Dawley rats were performed. Under the influence of the test substances, these cells were cultured for 48 hours and then evaluated quantitatively by a immunocytochemical marker.
Reasons for this experiment were the evaluation of the neuroprotecive properties of rolipram and the drug-nanoparticle combination as well as the determination of an optimal drug concentration for the subsequently performed in-vivo-experiments. For all test substances dilutions of 1:50, 1:100, 1:200 and 1:300 of stock solution (lipid nanocapsules 45 mg / ml, 19 mg / ml rolipram) were examined on the spiral ganglion cell survival. The calculated results showed no significantly increased spiral ganglion cell survival for the pure administered rolipram. The combination with the nanoparticles was found to have a strong positive effect on the survival of cultured spiral ganglion cells in the dilution of 1:100, which was used in subsequent animal experiments. The unloaded nanoparticles in the 1:100 dilution showed an increased spiral ganglion cell survival as well, which may be caused by the neuroprotective
properties of the particle component polyethylene glycol. The comparison between these two groups also reveals an effect of rolipram incorporated in the nanoparticles. Compared with the unloaded nanoparticles the drug-nanoparticle-combination led to a significantly higher cell survival.
In addition, a cell culture experiment with dendritic cells (DC) was performed to evaluate the effectiveness of the TNF-α inhibition of the drug-nanoparticle combination compared to the directly administered rolipram. Furthermore, these experiments give information on the anti-inflammatory properties of rolipram, since dendritic cells play a key role in anti-inflammatory processes. For these experiments bone marrow derived DC of BALB/c mice were treated after a 9-day cultivation with the test substances. Following an incubation period of one hour, DC were stimulated by the addition of lipopolysaccharides to obtain maturation and TNF-α secretion. The following day, ELISA obtained results showed a concentration-dependent inhibition of cytokine production for the directly administered rolipram, suggesting an anti-inflammatory effect, offering advantages over the occurrence of foreign body-related connective tissue growth associated with cochlear implants. The drug-rolipram-combination also showed a significantly inhibited cytokine production at a concentration of 1 µM. But compared to the directly administered rolipram this effect was less pronounced. These observations suggest a reduced release of rolipram from the nanoparticles, hence pure administered rolipram showed higher TNF-α-inhibition in the same concentrations.
For the in-vivo-studies unpigmented Dunkin Hartley guinea pigs were used. In the study, only animals were included, which showed a physiologically normal hearing, which was verified on day 0 of experiments by aABR measurement. On the same day, the animals were systemically deafened with a combined administration of kanamycin and furosemide, which was controlled by repeated aABR measurement on day seven. The test substances were then injected by cochleostomy. A volume of 5 µl was applied in the scala tympani of the left ears, while the right control side was treated PBS. After two more weeks, the cochleae were harvested. The influence of the test substances was evaluated on the determined spiral ganglion cell densities. The experimental results obtained in the in-vitro-studies has not been reproduced, no spiral ganglion cell protection was evident. The reasons for this might be caused by an insufficient concentration of the test substances. Due to the cochlear fluid volumes a further dilution occurs, which is difficult to calculate in advance.
In summary, the in-vitro-studies showed promising results, which could possibly be reproduced by a modification of the animal experiments by using higher concentrations or continuous application forms, e. g. by means of osmotic pumps.
The collected data provides basic information for further optimization of this promising drug-delivery system. In addition to an improved release a higher transport capacity would be desirable. Finally, further modifications of the particle surface should achieve tissue specificity, which leads to a targeted application of the incorporated substances.
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