Methoden für die In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen

4.2.2.1 Die Generierung und Kultivierung dendritischer Zellen

Die Generierung dendritischer Zellen erfolgte durch die Gewinnung von Stammzellen aus dem Knochenmark des Femurs von BALB/c Mäusen. Hierbei wurde nach dem in der Literatur beschrieben Protokoll von LUTZ et al. (1999) verfahren.

Zunächst wurden die verwendeten Tiere durch zervikale Dislokation getötet. Danach erfolgte die Entnahme des Femurs, welcher im Anschluss für 5 Minuten in 70%igem Ethanol desinfiziert und anschließend in sterile PBS-Lösung (10.2) überführt wurde.

Mittels eines Skalpells wurden die Epiphysen des Femurs abgesetzt, um die Stammzellen mithilfe einer Spritze und 5 ml PBS aus dem Knochen zu spülen. Durch vorsichtiges hin und herschaben mit der Kanüle in der Markhöhle wurde die Gewinnung von möglichst vielen Zellen sichergestellt, welche in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen (10.4) aufgefangen wurden.

Um die Zellen zu vereinzeln, wurde die gewonnene Suspension mit einer Pipette einige Male auf und ab pipettiert, um anschließend bei 300 g für 10 Minuten und 4 °C zentrifugiert zu werden. Der entstehende Überstand wurde verworfen und das Zellpellet im Anschluss mit 5 ml Roswell Park Memorial Institute-Medium (RPMI, 10.2) Medium resuspendiert. Um die Anzahl der gewonnen Zellen zu bestimmen, wurden 100 µl der Zellsuspension in ein Eppendorffgefäß überführt und mit 100 µl Schwintzer-Lyse (10.2) für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Hierdurch kommt es zur Lyse der in der Suspension ebenfalls vorhandenen Erythrozyten. Zur Auszählung der vitalen Zellen wurden aus dieser Lösung wiederum 50 µl entnommen um in 100 µl Trypanblau (10.2) überführt zu werden. Durch das Trypanblau können tote Zellen visualisiert werden, indem der Farbstoff aufgrund einer verstärkten Permeabilität der Zellmembran abgestorbener Zellen ins Zytoplasma aufgenommen wird und die Zelle folglich blau anfärbt. Positiv angefärbte Zellen wurden nicht ausgezählt. Im Anschluss wurden 10 µl des Trypanblau-Zellgemischs auf eine Neubauerkammer aufgetragen und die vorhandenen Zellen in vier Feldern der Kammer unter einem Mikroskop (10.6) ausgezählt. Die daraus resultierende Gesamtzellzahl wurde mit der Formel: Anzahl der ausgezählten Zellen x 2 x 3 x 10.000/4, errechnet. Die Faktoren 2 und 3 ergeben sich durch die Verdünnung mit Schwintzer-Lyse und dem Trypanblau wobei das Ergebnis durch die Anzahl der vier ausgezählten Felder geteilt wird.

Zu Beginn des Zellansatzes zur Reifung der dendritischen Zellen, wurde eine Zellzahl von 3 x 10⁶ Zellen in eine Petrischale mit 10 ml sterilem DC-Medium (10.1) eingesät. Die Zellen wurden insgesamt 10 Tage im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. An Tag 3 erfolgte eine Zugabe von 10 ml frischem, sterilem DC-Medium mit 20 ng/ml granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Am 6. sowie 8. Tag erfolgte ein teilweiser Mediumwechsel, wobei 10 ml aus der Kultur entnommen wurden und die darin enthaltenen

Zellen bei 300 g und 4 °C für 10 Minuten herunterzentrifugiert wurden. Der Überstand des alten Mediums wurde verworfen, wobei die Zellen mit 10 ml frischem Medium resuspendiert wurden. Im Anschluss wurden die Zellen wieder in die Petrischale überführt. Des Weiteren wurde auch an diesen Tagen 20 ng/ml GM-CSF hinzugefügt.

Die optimale Kultivierungsdauer wird für aus dem Knochenmark gewonnene dendritische Zellen mit etwa 8 Tagen angegeben (INABA et al. 1992). Bei einer längeren Kultivierung von über 10 Tagen nehmen die Reinheit und die Ausbeute der Zellen wieder ab.

4.2.2.2 Übersicht der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen

In diesem Versuchsaufbau sollte der Einfluss von Rolipram, sowie von in Lipidnanokapseln inkorporiertem Rolipram auf die TNF-α-Produktion dendritischer Zellen untersucht werden.

So wurden die kultivierten Zellen am Tag neun des Versuchs mit den jeweiligen Testsubstanzen behandelt. Eine Stunde später erfolgte die Zugabe von 0,5 µg/ml LPS (Lipopolysacchariden; 10.2), was zur Reifung und Aktivierung der dendritischen Zellen führt.

Durch die Anregung der Zellen mit LPS kommt es zur Produktion des Zytokins TNF-α. Die Stärke der Hemmung der Zytokinproduktion durch die verwendeten Versuchssubstanzen wurde durch die Bestimmung der TNF-α-Konzentration ermittelt (4.2.2.3). Je geringer die TNF-α-Produktion, desto höher die Effizienz der hemmenden Wirkung der Substanz. Um ein Ausbleiben der TNF-α-Produktion durch eine verminderte Vitalität der Zellen durch eine mögliche Toxizität der eingesetzten Substanzen auszuschließen wurde ein CellTiter 96^® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay am Ende des Versuchs (Tag 10) durchgeführt (4.2.2.4). Hierfür wurde die gesamte Mikrotiter-Wellplatte zunächst für 10 min bei 1000 g (g = Erdschwerebeschleunigung) und 4 °C zentrifugiert, um die Abnahme eines zellfreien Überstandes zu gewährleisten. Bis zur Auswertung wurden die Überstände bei -80 °C eingefroren.

Dieser Versuch sollte neben der Wirkung des Roliprams auch eine Aussage über die Effizienz der Nanopartikel-Rolipram-Kombination liefern. Des Weiteren können auch Rückschlüsse auf den Einfluss des Roliprams auf entzündungsbedingte Prozesse gezogen werden, da TNF-α

hierbei eine Schlüsselrolle spielt und die Hemmung dieses Zytokins zu einer Abschwächung der Symptome führt.

Sechs Gruppen wurden gebildet und in drei Versuchsansätzen wiederholt, wobei die Ergebnisse zusammengefasst und statistisch ausgewertet wurden. Die verwendeten Konzentrationen wurden in Anlehnung an HEYSTEK et al. (2003) gewählt.

- Zu dem ersten Zellkulturansatz (Versuchsgruppe ROLIRPAM) wurden vier unterschiedliche Verdünnungen von Rolipram hinzugegeben (10 µmol, 1 µmol, 0,1 µmol, 0,01 µmol).

- Der zweiten Gruppe wurde die Nanopartikel-Rolipram Kombination (LNC FITC ROLIPRAM) hinzugegeben, wobei die Konzentrationen des Roliprams analog zur ersten Gruppe gewählt wurden (10 µmol, 1 µmol, 0,1 µmol, 0,01 µmol).

- Die dritte Gruppe (LNC FITC) wurde mit unbeladenen Nanopartikeln behandelt, wobei diese den Fluoreszenzmarker FITC an ihrer Oberfläche gekoppelt hatten.

Die Partikelanzahlen entsprechen in den unterschiedlichen Konzentrationen den Werten der zweiten Gruppe.

- Als Kontrollgruppe wurde ein unbeladener, sowie unmarkierter Partikel gewählt (LNC BLANK), um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Die Konzentrationen entsprechen ebenfalls den Werten der Gruppe 1.

- Als Negativkontrolle wurde in einer fünften Gruppe der Effekt des Vehikels, also des Lösungsmittels (DMSO > 0,01 Vol. %) auf die TNF-α-Produktion der dendritischen Zellen untersucht. Die dendritischen Zellen dieser Gruppe (Gruppe VEHIKEL) wurden nicht mit LPS behandelt.

- Die sechste Gruppe diente als Positivkontrolle, wobei die dendritischen Zellen mit keiner weiteren Substanz behandelt, aber mit LPS angeregt wurden (Gruppe LPS).

Als Übersicht zur Gruppenaufteilung sowie zu den verwendeten Konzentrationen soll die untenstehende Tabelle 4 dienen.

Tab. 4: Übersicht der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen zur Beurteilung der TNF-α Produktion nach LPS-induzierter Stimulation und Zugabe von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM, LNC FITC und LNC BLANK

Die Messung des von den dendritischen Zellen produzierten Zytokins TNF-α wurde mittels eines TNF-α-Maus ELISA (10.2, R&D Systems, Minneapolis, USA) nach Herstellerprotokoll durchgeführt. Das Prinzip dieses Tests beruht auf der Bindung von TNF-α an polyklonale Antikörper, welche fest in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte (10.4) gebunden sind. Wird

der Überstand der unterschiedlichen Versuchsansätze nun auf die Platte gegeben, so bindet darin vorhandenes TNF-α an diesen Antikörper. Durch das Hinzufügen eines enzymgekoppelten Antikörpers wurde TNF-α erneut gebunden, woraufhin die Zugabe eines Farbstoffes einen enzyminduzierten Farbumschlag bewirkt. Je mehr TNF-α vorhanden war, desto stärker ist der Farbumschlag, was durch photometrische Auswertung mittels MRX-Reader (10.6) bei 450 nm zwischen den unterschiedlichen Gruppen verglichen werden sollte.

Anhand der ermittelten Werte der Standardreihe wurde eine Kalibrationskurve zur Bestimmung der TNF-α-Konzentration in den mit den Testsubstanzen behandelten Wells errechnet. Die statistische Auswertung wurde über den Vergleich der jeweiligen Konzentrationen der Gruppen untereinander durchgeführt und mittels Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) und Student-Newman-Keuls-Test ausgewertet. Hierfür wurde das Softwareprogramm GraphPad Prism^® 4 (10.6) verwendet.

Die ermittelten Signifikanzniveaus wurden dabei wie folgt definiert:

- p > 0,05 = nicht signifikant unterschiedlich (ns) - p < 0,05 = signifikant unterschiedlich (*) - p < 0,01 = hoch signifikant unterschiedlich (**) - p < 0,001 = höchst signifikant unterschiedlich (***)

4.2.2.4 Vitalitätsbestimmung

Zur Bestimmung der Vitalität der dendritschen Zellen wurde am Ende des Versuchs (Tag 10) ein CellTiter 96^® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay durchgeführt. Zudem wurden die Zellen einer mikroskopischen Kontrolle hinsichtlich morphologischer Abweichungen unterzogen, welche eine tendenzielle Aussage über eine mögliche Beeinflussung durch die Testsubstanzen zulassen könnte. Die Ergebnisse des Vitalitätstests lassen eine Aussage über die Beeinträchtigung der Zellen durch die verwendeten Testsubstanzen zu. So kann eine geringere TNF-α-Produktion nicht nur durch eine Hemmung der Zytokinbildung sondern auch durch ein vermehrtes Degenerieren der in der Zellkultur vorhandenen Zellen bedingt sein.

Die Funktionsweise dieses Assays basiert auf der Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH) oder Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) katalysierten Umsetzung von dem gelblichen Methyltetrazolium zu einem violetten Formazanfarbstoff.

NADPH/NADH befindet sich nur in lebenden Zellen, sodass der Farbumschlag durch photometrische Auswertung bei 490 nm einen Aufschluss auf die Vitalität der Zellen gibt. Die erhaltene Menge des Formazonfarbstoffs ist hierbei direkt proportional zu der Anzahl vitaler Zellen.