In diesem Versuch wurde der Einfluss der jeweiligen Testsubstanzen auf die TNF-α-Sekretion der dendritischen Zellen evaluiert. Hierbei wurden die dendritischen Zellen mit Rolipram (ROLIPRAM), in fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln inkorporiertem Rolipram (LNC FITC ROLIPRAM), fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln (LNC FITC) sowie nicht markierten Lipidnanokapseln (LNC BLANK) behandelt. Pro Gruppe wurden vier Konzentrationen angewendet (0,01 µM; 0,1 µM; 1 µM; 10 µM). Eine Stunde nach der
Inkubation mit den Testsubstanzen erfolgte die Anregung und Reifung der Zellen zur TNF-α-Produktion durch die Zugabe von Lipopolysacchariden (LPS).
5.2.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die T(F-α-Sekretion
Die Inkubation mit Dimethylsulfoxid (DMSO; > 0,01 Vol %; Vehikelkontrolle) führte zu keiner TNF-α-Sekretion. Die Gegenüberstellung zu der in der Positivkontrolle (Zellen ausschließlich mit Lipopolysacchariden behandelt) ermittelten TNF-α-Konzentration von 338,18 ± 41,82 pg/ml TNF-α (Mittelwert und Standardabweichung; n=12) zeigte besonders in den mit Rolipram inkubierten Zellen eine signifikante Inhibition dieses Zytokins. Alle gemessenen Werte erwiesen sich gegenüber der Positivkontrolle als signifikant erniedrigt (p < 0,001; Abb.15). Hierbei zeigte der Vergleich innerhalb der Gruppe einen deutlichen Abwärtstrend je stärker die eingesetzte Konzentration des Arzneimittels war. So bewirkte die Zugabe von 0,1 µM Rolipram bereits eine signifikant verringerte TNF-α-Produktion im Vergleich zu den mit 0,01 µM behandelten Zellen (211,23 ± 56,78 pg/ml TNF-α, n=12 gegen 244,23 ± 47,42 pg/ml TNF-α, n=12; p < 0,05; Abb. 16). Des Weiteren zeigten die mit 1 µM (123,74 ± 30,27 pg/ml TNF-α; n=12) und 10 µM (100,71 ± 46,24 pg/ml TNF-α; n=12) Rolipram behandelten Zellen im Vergleich zu den beiden niedrigeren Rolipramkonzentrationen eine weitere, in diesem Fall höchst signifikant (p < 0,001) verminderte TNF-α-Produktion.
Die Lipidnanokapsel-Rolipram-Kombination hingegen (LNC FITC ROLIPRAM) hatte in den Konzentrationen 0,01 µM und 0,1 µM keinen Effekt auf die TNF-α-Sekretion (326,09 ± 72,52 pg/ml TNF-α; n=12 bzw. 290,20 ± 45,74 pg/ml TNF-α; n=12). Jedoch zeig-ten sich in der Konzentration von 1 µM sowie 10 µM signifikant verringerte TNF-α-Werte.
(p < 0,01; 245,07 ± 42,22 pg/ml TNF-α; n=12 bzw. p < 0,001; 105,20 ± 90,51 pg/ml TNF-α;
n=12 ). Innerhalb der verschiedenen Konzentrationen wurde zwischen den mit 0,01 µM und 0,1 µM LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen kein signifikanter Unterschied in der TNF-α-Produktion festgestellt, wobei sich aber zwischen 0,01 µM respektive 0,1 µM und 1 µM ein hoch signifikant (p < 0,01) erniedrigter TNF-α-Wert für die mit 1 µM LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen ergab. Die für die 10 µM Konzentration ermittelten Werte
wiesen gegenüber allen anderen LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen einen höchst signifikant verringerten TNF-α-Wert auf (p < 0,001). Im mikroskopischen Bild zeigten die Zellen jedoch zellmorphologische Abweichungen im Gegensatz zu den Zellen der anderen Konzentrationen, wobei deutliche Granulationen im Zellinneren zu erkennen waren.
Weiterhin zeigten sich Kristallbildungen.
Bei den mit unbeladenen und unmarkierten Nanopartikeln (LNC BLANK) behandelten Zellen konnte in den Konzentrationen 0,01 µM (305,56 ± 40,74 pg/ml TNF-α; n=12) und 0,1 µM (308,59 ± 45,67 pg/ml TNF-α; n=12) keine zur Positivkontrolle verringerte TNF-α-Sekretion detektiert werden. Nur die mit 1 µM (283,11 ± 23,01 pg/ml TNF-α; n=12) Nanopartikel-lösung behandelten Zellen zeigten einen signifikant inhibierten Wert (p < 0,05). Auch in dieser Nanopartikelgruppe zeigte sich das für die LNC FITC ROLIRPAM beschriebene Bild in der Konzentration von 10 µM (98,11 ± 81,29 pg/ml TNF-α; n=12, p< 0,001). Innerhalb der Gruppe fanden sich höchst signifikante Unterschiede (p < 0,001) nur zu der TNF-α-Konzentration der mit 10 µM LNC BLANK-Lösung behandelten Zellen (Abb.16).
Die LNC FITC-Gruppe zeigte ein ähnliches Bild, wobei in den Konzentrationen von 0,01 µM (303,84 ± 32,76 pg/ml TNF-α; n=12), 0,1 µM (293,52 ± 28,25 pg/ml TNF-α; n=12) und 1 µM LNC FITC (311,48 ± 33,57 pg/ml TNF-α; n=12) kein Unterschied zur Positivkontrolle evident wurde (Abb. 15). Die höchst signifikante Verringerung der TNF-α-Konzentration in der mit LNC FITC in der Konzentration von 10 µM behandelten Zellgruppe wiederholte die in den anderen Nanopartikelgruppen ermittelte Charakteristik der zellmorphologischen Veränderungen und der Kristallbildungen (p < 0,001, 146,90 ± 7,64 pg/ml TNF-α; n=12).
Innerhalb der Gruppe waren wiederum höchst signifikante Unterschiede (p < 0,001) nur zur 10 µM Konzentration zu verzeichnen (Abb.17).
ROLIPRAM 0,01 µM ROLIPRAM 0,1 µM ROLIPRAM 1 µM ROLIPRAM 10 µM LNC FITC ROLIPRAM 0,01 µM LNC FITC ROLIPRAM 0,1 µM LNC FITC ROLIPRAM 1 µM LNC FITC ROLIPRAM 10 µM LNC BLANK 0,01 µM LNC BLANK 0,1 µM LNC BLANK 1 µM LNC BLANK 10 µM LNC FITC 0,01 µM LNC FITC 0,1 µM LNC FITC 1 µM LNC FITC 10 µM Vehikel (DMSO) LPS 0
100 200 300 400
******
*** ***
** *
***
*** *** ***
Versuchsgruppe
Konzentration TNF -αααα [pg/ml]
Abb. 15: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM, LNC BLANK und LNC FITC in verschiedenen Konzentrationen und anschließender Stimulation mit LPS. Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12 Wells pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen sind im Vergleich zur Kontrollgruppe über den Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***).
ROLIPRAM 0,01 µM ROLIPRAM 0,1 µM
ROLIPRAM 1 µM ROLIPRAM 10 µM
LNC FITC ROLIPRAM 0,01 µM LNC FITC ROLIPRAM 0,1 µM
LNC FITC ROLIPRAM 1 µM LNC FITC ROLIPRAM 10 µM 0
100 200 300 400
*
*** **
*** *** ***
**
Versuchsgruppe
Konzentration TNF -αααα [pg/ml]
Abb. 16: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von ROLIPRAM und LNC FITC ROLIPRAM in verschiedenen Konzentrationen und anschließender Stimulation mit LPS. Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12 Wells pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen innerhalb einer Versuchsgruppe sind über den Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***).
LNC BLANK 0,01 µM
LNC BLANK 0,1 µM
LNC BLANK 1 µM
LNC BLANK 10 µM
LNC FITC 0,01 µM
LNC FITC 0,1 µM
LNC FITC 1 µM
LNC FITC 10 µM 0
100 200 300
400 *** *** *** *** *** ***
Versuchsgruppe
Konzentration TNF-αααα [pg/ml]
Abb. 17: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von LNC BLANK und LNC FITC in verschiedenen Konzentrationen und anschließender Stimulation mit LPS. Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12 Wells pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen innerhalb einer Versuchsgruppe sind über den Säulen
dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***).
5.2.2 Einfluss der Testsubstanzen in der Konzentration von 1 µM auf die T(F-α- Sekretion
In der zu den dendritischen Zellen gegebenen Konzentration von 1 µM zeigte sich die geringste TNF-α-Sekretion in der mit Rolipram behandelten Zellgruppe. Die über Rolipram ausgeübte Hemmung der Zytokinsekretion war gegenüber allen anderen Gruppen höchst signifikant erhöht (p < 0,001). Weiterhin zeigt die Nanopartikel-Rolipram-Kombination (LNC FITC ROLIPRAM) eine hoch signifikant stärkere TNF-α-Hemmung gegenüber der LNC
BLANK-Gruppe (p < 0,01), wobei gegenüber der LNC FITC-Gruppe sogar ein höchst signifikanter Unterschied zu erkennen war (p < 0,001). Ein weiterer signifikanter Unterschied war zwischen den ermittelten Werten der LNC BLANK- und LNC FITC-Gruppe vorhanden, wobei die TNF-α-Konzentration der mit LNC BLANK behandelten Zellen geringer war (p < 0,05; Abb.18).
ROLIPR AM 1µM
LNC FITC ROLIPR AM 1µM
LNC BLANK 1µM LN
C FITC 1µM 0
100 200 300
400 ** ***
*
***
***
***
Versuchsgruppe
Konzentration TNF- α α α α [pg/ml]
Abb. 18: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM, LNC BLANK und LNC FITC in der Konzentration von 1 µM und anschließender Stimulation mit LPS.
Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12 Wells pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen zwischen den Versuchsgruppen sind über den Säulen mit Klammern dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0.01 = **; p < 0.001 = ***).
5.2.3 Ergebnisse der Vitalitätstestsbestimmung der dendritischen Zellen
Die mit 10 µM Nanopartikel-Lösung (LNC FITC Rolipram, LNC BLANK und LNC FITC) behandelten Zellen zeigten zellmorphologische Veränderungen mit Granulierung des Zytoplasmas im mikroskopischen Bild, weiterhin waren Kristallbildungen zu erkennen.
Trotz hoher Werte der photometrischen Auswertung bei LNC FITC ROLIPRAM 10 µM und LNC FITC 10 µM (10.7) wurde in der visuellen Betrachtung keine Umfärbung des gelblichen Methyltetrazoliums zu dem violetten Formazonfarbstoff festgestellt.
Die Ergebnisse der anderen Gruppen zeigten eine Umfärbung von gelb zu violett, was sich in den hohen Werten der ermittelten optischen Dichten widerspiegelte (10.7).