Methoden für die In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen

4.2.1.1 Übersicht der In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen

Im Vorfeld der In-vivo-Versuche wurden die benutzten Nanopartikel zunächst in vitro getestet, um die optimale Konzentration der verwendeten Nanopartikel zu ermitteln und mögliche toxische Effekte auf die im Tiermodell relevanten Zelltypen auszuschließen. Hierzu wurden Spiralganglienzellen von neonatalen Sprague-Dawley-Ratten kultiviert und mit unterschiedlichen Konzentrationen der Nanopartikel inkubiert. Insgesamt wurden vier unterschiedliche Gruppen getestet. Bei diesen Gruppen handelte es sich um:

- mit FITC fluoreszenzmarkierte Lipidnanokapseln (LNC FITC)

- mit FITC markierte Lipidnanokapseln in welchen Rolipram (LNC FITC ROLIRPAM) inkorporiert war

- verdünntes Rolipram, welches in den zu den arzneimittelkombinierten Nanokapseln entsprechenden Konzentrationen verwendet wurde

- brain derived neurotrophic factor (BDNF) in der Konzentration von 50 ng/ml als Positivkontrolle

Diese Gruppen wurden jeweils in vier verschiedenen Konzentrationen im Sinne einer Verdünnungsreihe der Stammlösungen (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln 45 mg/ml; 19 µg/ml Rolipram) mit Panserin (10.2), von 1:50, 1:100, 1:200 und 1:300 verwendet. Eine Ausnahme bildet die mit BDNF behandelte Gruppe. Hier wurden die Zellen nur mit der Konzentration von 50 ng/ml behandelt, da sich diese Konzentration als besonders protektiv auf das Überleben von Spiralganglienzellen in vitro erwiesen hat (LEFEBVRE et al.

1994; HEGARTY et al. 1997) und in diesem Versuch als Positivkontrolle diente. Insgesamt erfolgten fünf Wiederholungen der Versuche, wobei die Auszählungen der Zellanzahlen, sowie die Ausmessungen der Neuritenlängen und Somadurchmesser gemittelt und miteinander verglichen wurden (Tab. 2).

Tab. 2: Übersicht über die in-vitro-Versuche mit kultivierte Spiralganglienzellen. Es werden die ver-wendeten Konzentrationen und die Anzahl der behandelten Kavitäten der Versuchsgruppen LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BDNF dargestellt.

Versuchsgruppe Konzentration

4.2.1.2 Versuch zur Bewertung des Einflusses der Nanopartikel-Komponenten auf das Überleben von vereinzelt angezüchteten Spiralganglienzellen

Da im ersten Zellkulturversuch ein positiver Effekt der Nanopartikel ohne Rolipram (LNC FITC) auf das Überleben der kultivierten Spiralganglienzellen zu erkennen war, wurde ein zusätzlicher Versuch durchgeführt, um einen etwaigen Einfluss des Fluoreszenzmarkers FITC auf die Vitalität der Spiralganglienzellen zu evaluieren. Die Fragestellung war hierbei, ob der Nanopartikel alleine oder das an ihm gebundene FITC den protektiven Einfluss ausübt.

Auch für diesen Versuch wurden Spiralganglienzellen aus neonatalen Sprague-Dawley-Ratten gewonnen und kultiviert. Folglich wurden drei Gruppen gebildet:

- mit FITC fluoreszenzmarkierte Lipidnanokapseln (LNC FITC) - Lipidnanokapseln ohne Fluoreszenzmarker (LNC BLANK)

- brain derived neurotrophic factor (BDNF) in der Konzentration von 50 ng/ml als Positivkontrolle

Die Versuche wurden dreimal wiederholt. Je Gruppe wurden drei unterschiedliche Konzentrationen getestet. Es wurde eine Verdünnung der Stammlösungen mit Panserin (10.2) von 1:100, 1:200 und 1:300 durchgeführt (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln 45 mg/ml). BDNF wurde wiederum nur in der Konzentration von 50 ng/ml als Positivkontrolle mitgeführt. Eine Übersicht der Gruppen wird in Tabelle 3 gegeben.

Tab. 3: Übersicht über die in-vitro-Versuche mit kultivierten Spiralganglienzellen. Es werden die verwendeten Konzentrationen und die Anzahl der behandelten Kavitäten der Versuchsgruppen LNC FITC, LNC BLANK und BDNF dargestellt.

Versuchsgruppe Konzentration

4.2.1.3 Beschichtung der 96-Multiwellplatten zur Kultivierung von Spiralganglienzellen

Zur Kultivierung von Spiralganglienzellen wurden die in 96-Multiwell-Kulturplatten (10.4) vorhandenen Kavitäten mit Poly-D/L-Ornithin (10.2) und Laminin (10.2) beschichtet. Diese Behandlung gewährleistete eine bessere Adhäsion der Spiralganglienzellen am Boden des Wells und verhinderte somit eine Ablösung der Zellen durch spätere Spül- und Färbevorgänge.

Zunächst wurde aus zuvor angelegten und bei -20°C gelagerten Aliquots die benötigte Menge D/L-Ornithin entnommen und eine Lösung mit der Konzentration von 0,1 mg/ml Poly-D/L-Ornithin in phosphate buffered saline (PBS, 10.2) hergestellt. Von dieser Lösung wurden im ersten Schritt des Beschichtens 100 µl in die einzelnen Vertiefungen pipettiert. Im Anschluss erfolgte eine Inkubationszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur.

Vor Ablauf dieser Stunde wurde die Lamininlösung vorbereitet, wobei hier entsprechend der Lösung des Poly-D/L-Ornithins verfahren wird. Die Konzentration beträgt im Falle des Laminins 0,01 mg/ml in PBS. Die Poly-D/L-Ornithin Lösung wird nun vorsichtig vom Rand des Wells beginnend abgesaugt, wobei auch in den folgenden Schritten darauf geachtet wird, dass der Boden der jeweiligen Vertiefung nicht austrocknet. Hiernach schließt sich ein Waschvorgang mit 100 µl PBS pro Well an, wobei anschließend je Vertiefung 100 µl Lamininlösung eingebracht wurde.

Die folgende Inkubationszeit beträgt wiederum 60 Minuten, wobei die Wellplatte im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit gelagert wurde.

Abschließend wurde die Lamininlösung vorsichtig entfernt und ein letzter Spülschritt mit 100 µl PBS pro Well schloss sich an. Bis zur Verwendung konnte die beschichtete Platte 5 Tage bei 4 °C gelagert werden.

4.2.1.4 Gewinnung der Spiralganglienzellen

Zur Gewinnung der Spiralganglienzellen wurden 3-5 Tage alte Sprague-Dawley-Ratten zunächst durch einen Scherenschlag dekapitiert. Anschließend wurden die Unterkieferäste mit einer geraden chirurgischen Schere (10.5) von rostral nach caudal entfernt. Vom Schädel wurde im nächsten Schritt die Haut entfernt wonach, beginnend vom Hinterhauptsloch, die Schädeldecke und die Schädelbasis durch zwei Scherenschnitte eröffnet wurde. Auf Höhe der Verbindungslinie der caudalen Augenwinkel erfolgte anschließend ein Transversalschnitt, wodurch die zwei caudalen Anteile des Schädels vom rostralen Anteil separiert wurden. Die zügige Überführung der beiden Schädelhälften in eiskalte phosphate buffered saline (PBS, 10.2) erfolgte nach der Entnahme der Gehirnanteile.

Die weiteren Dissektionsschritte wurden unter einem Auflichtstereomikroskop (10.6) mithilfe von Uhrmacherpinzetten (10.5) durchgeführt. Hierbei erfolgte zunächst eine präparatorische Darstellung des Felsenbeines, wonach die Cochleakapsel eröffnet wurde. Anschließend konnten die Anteile der häutigen Schnecke entnommen und in eine neue Petrischale mit eiskaltem PBS überführt werden. Vom Modiolus wurden nun das Cortische Organ und die Stria vascularis entwunden. Letztlich erfolgte die Trennung des Spiralganglions vom

Modiolus, welches sofort in eisgekühltes Hank´s balanced salt solution (HBSS, 10.2) überführt wurde. In Abbildung 4 werden einzelne Präparationsschritte bildlich dargestellt.

Für einen Versuchsansatz von 15 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung auf einer 96-Multikulturplatte (10.4), wurden etwa 18-20 Tiere benötigt, was der Präparation von 36-40 Spiralgangliensträngen entspricht. Mit den gewonnenen Zellen konnten 60 Vertiefungen belegt werden.

Abb. 4: Darstellung einzelner Präparationsschritte zur Gewinnung des Spiralganglions. Bild 1 zeigt die eröffnete Schädelkapsel einer 4 Tage alten Sprague-Dawley-Ratte. Bild 2 veranschaulicht die Präparation und Entnahme der Cochlea. In Bild 3 ist die häutige Schnecke dargestellt. Nach der Entfernung von Stria vascularis und Cortischem Organ zeigt Bild 4 das aus dem Modiolus herausgetrennte Spiralganglion.

4.2.1.5 Die Vereinzelung der Spiralganglienzellen

Zunächst wurde für die Kultivierung und Vereinzelung der Spiralganglienzellen supplementiertes, serumfreies Zellkulturmedium hergestellt. Die Herstellung wurde nach dem im Anhang (10.1) aufgeführtem Schema vollzogen und entsprach in ihrer Zusammensetzung den Protokollen von LEFEBVRE et al. (1991) und ALETSEE et al. (2000). Die so gefertigte Lösung konnte bis zur Verwendung sieben Tage im Kühlschrank bei 4 °C gelagert werden.

Bevor mit der eigentlichen Vereinzelung begonnen werden konnte, wurden die Überstände aus den zuvor beschichteten 96-well Platten (10.4) verworfen und pro Vertiefung mit 100 µl serumfreiem Spiralganglienzellkulturmedium gewaschen. Die Multiwell-Kulturplatte wurde im Anschluss unter dem Laborabzug (10.6) gelagert, sodass das die Platte vor der Einsaat der Spiralganglienzellen Raumtemperatur erreichen konnte, um ein möglichst schonendes Einsäen der Zellen zu gewährleisten.

Die Separierung der Spiralganglienzellen erfolgte in einen enzymatischen sowie mechanischen Schritt der Vereinzelung. Bei der Vorgehensweise wurde nach in der Literatur anerkannten Protokollen verfahren (LEFEBVRE et al. 1991; HEGARTY et al. 1997).

Bevor mit der enzymatischen Vereinzelung der nach obigem Schema (4.2.1.4) präparierten Spiralganglienzellstränge begonnen werden konnte, wurden die hierfür benötigten 2 ml Verdaulösung [Hank’s balanced salt solution (HBSS) inklusive 0,1 % Trypsin, 0,1 % DNase I und 0,01 % Kollagenase, 10.2] sowie das anschließend verwendete FBS (200 µl) bei 37 °C und 5 % CO₂ für mindestens 30 Minuten im Brutschrank (10.6) inkubiert. Die in eisgekühltem HBSS vorliegenden Spiralganglienzellstränge wurden zunächst mittels Pipettierhilfe (10.6) vom Überstand befreit. Sofern sich noch einige Stränge frei in der Lösung befanden und sich noch kein vollständiger Bodensatz gebildet hatte, wurden die Zellstränge für etwa 20 Sekunden bei 6000-7000 rounds per minute (rpm) zentrifugiert (10.6).

Anschließend erfolgte die Zugabe von 2 ml erwärmter Verdaulösung mit einer nachfolgenden Inkubationszeit von 20 min bei 37 °C und 5 % CO2. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Verdaulösung so vollständig wie möglich entfernt und durch sofortige Zugabe von 200 µl erwärmten FBS konnte die enzymatische Vereinzelung der Zellen gestoppt werden. Im nächsten Schritt wurden die Zellen noch dreimalig mit je einem Milliliter serumfreien Spiralganglienzellmedium gespült, wonach sich die mechanische Verdauung angeschlossen

hat. Hierfür wurden die Zellen mittels einer 1000 µl Pipettierhilfe (10.6) und einem entsprechenden Pipettenaufsatz (10.4) etwa 100 Mal auf- und abpipettiert, wobei sehr vorsichtig verfahren werden musste um durch die entstehende Schaumbildung keine Zellen zu verlieren. Anschließend wurde mit einer 200 µl Pipettierhilfe (10.6) und entsprechendem Aufsatz (10.4) in gleicher Weise verfahren wodurch eine Suspension mit einzelnen Zellen entstand um die für die Einsaat der Spiralganglienzellen benötigte Zellzahl bestimmen zu können.

4.2.1.6 Einsaat der Spiralganglienzellen

Um die für den Versuch benötigte Zellanzahl von 1,5 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung bestimmen zu können, wurde zunächst die Gesamtzellzahl der zuvor verdauten Zellen bestimmt. Hierfür entnahm man dem vorliegenden Milliliter Zellsuspension 10 µl und überführte diese in ein 0,5 ml Eppendorffgefäß (10.4). Aus Gründen der optimierten Visualisierung sowie zur Identifizierung von bereits letalen Zellen wurden noch 10 µl Trypanblau (10.2) hinzugefügt.

Das Trypanblau-Zellgemisch wurde zur besseren Homogenisierung noch einige Male auf- und abpipettiert um anschließend je 7 µl auf beide Seiten einer Neubauer-Zählkammer (10.6) einzubringen. Die acht Felder der Zählkammer wurden unter einem Aufsichtmikroskop (10.6) einzeln ausgezählt und gemittelt, wobei der Mittelwert mit 2 x 10⁴ multipliziert (Faktor 2 ergibt sich durch das Hinzufügen des Trypanblaus) die Gesamtzellzahl in dem hergestellten Milliliter Zellsuspension ergab. Fielen während der Zählung größere Zellcluster auf, so wurde die Zellsuspension erneut mechanisch vereinzelt, da neben der nicht durchzuführenden Zählung auch die spätere Auswertung der Spiralganglienzellanzahl zu nicht tolerablen Abweichungen geführt hätte.

Anhand der Gesamtzellzahl wurde die Zellsuspension mit der entsprechenden Menge serumfreien Spiralganglienzellmedium verdünnt, um eine Konzentration von 1,5 x 10⁴ Zellen pro 50 µl zu erreichen. Diese wurden nach Verwerfen des serumfreien Spiralganglienzellkulturmediums in die Vertiefungen der Multikulturwellplatte eingebracht.

Weitere 50 µl wurden in je nach Versuchsansatz entsprechenden Anteilen Medium und Nanopartikel- oder Arzneimittellösungen aufgefüllt um ein Gesamtvolumen von 100 µl pro

Well zu erreichen. In jedem Versuch wurden neben den unterschiedlich konzentrierten Nanopartikel- und Arzneimittelgruppen auch mindestens zwei Kontroll- und zwei Einsaatansätze mitgeführt. Die Einsaatkontrolle wurde bereits nach vier Stunden fixiert, wodurch sich in der späteren Auswertung die relative Überlebensrate der Spiralganglienzellen aller Gruppen ermitteln ließ. Hierfür wurden die immunozytochemisch angefärbten Spiralganglienzellen der Einsaatkontrolle ausgezählt. Der Mittelwert der pro Versuchsansatz mitgeführten Einsaatkontrollansätze galt als Bezugsgröße (100 %) und wurde mit den Anzahlen der als vital geltenden Spiralganglienzellen der mit den Testsubstanzen behandelten Versuchsansätze sowie der Negativkontrolle ins Verhältnis gesetzt (5.1.1). Die Kontrollgruppe wurde nur mit serumfreiem Spiralganglienzellkulturmedium angesetzt, wobei keine weiteren Zusätze hinzugegeben wurden um den Effekt auf die Überlebensrate der Spiralganglienzellen der Nanopartikel und des Arzneimittels zu verifizieren. Versuchs- und Kontrollgruppen wurden nach 48 Stunden Inkubationszeit im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2

und 95 % Humidität fixiert.

4.2.1.7 Fixation der Spiralganglienzellen

Zur Fixierung der Spiralganglienzellen wurde zunächst das serumfreie Spiralganglienzellmedium entfernt wobei die Flüssigkeit vorsichtig vom Rand her abgesaugt wurde, um die am Boden adhärenten Zellen nicht zu beschädigen oder gar zu entfernen.

Hierbei wurde auch darauf geachtet, dass der Boden nicht vollständig austrocknen durfte, bevor der nächste Schritt erfolgte. Anschließend wurde die Fixierlösung, welche zu gleichen Teilen aus Methanol und Aceton (10.2) besteht, hinzugefügt. Pro Well wurden 100 µl verwendet, welche für 10 Minuten bei Raumtemperatur einwirken mussten. Nach dreimaligen Spülvorgängen mit je 150 µl PBS (10.2) wird im letzten Durchgang die Lösung in der Kavität belassen und die Versuchsplatte von außen mit Parafilm abgedicht. So konnte die abgedichtete Platte bei 4 °C bis zur immunozytochemischen Anfärbung gelagert werden. Die Weiterverarbeitung sollte innerhalb der darauffolgenden 2 Monate abgeschlossen sein.

4.2.1.8 Markierung der vereinzelten Spiralganglienzellen über die immunozytochemische ABC-Methode

Da man durch die Präparation und Vereinzelung des Spiralganglionzellstrangs eine Mischkultur aus Spiralganglienzellen, Bindegewebszellen sowie Gliazellen erhält, ist es notwendig, die kultivierten Spiralganglienzellen nach der Fixierung zu markieren. Dadurch war es möglich, die Zielzellen sicher zu identifizieren, weiterhin wurde eine genaue Vermessung der Dendriten und Somadurchmesser ermöglicht.

In der vorliegenden Arbeit erfolgte die spezifische Anfärbung der Spiralganglienzellen durch die Avidin-Biotin-Complex-(ABC-)Methode. Hierbei handelt es sich um eine Immunperoxidase-Methode, bei der ein biotinylierter Sekundärantikörper an einem gegenüber dem Zielantigen sensitiven Primärantikörper bindet (HSU et al. 1981). Der Mechanismus dieser Methode beruht auf dem Vorhandensein von vier Bindungsstellen für das wasserlösliche Vitamin Biotin am Molekül des Glykoproteins Avidin, wobei drei Bindungsstellen durch ein biotinyliertes Markerenzym besetzt werden. Bei diesem Markerenzym handelt es sich um eine Peroxidase. Die verbleibende Bindungsstelle wird zur Bindung eines biotinylierten Sekundärantikörpers verwendet, wobei dieser an einen gegen Spiralganglienzellantigene gerichteten Primärantikörper bindet. Anschließend wird durch die Zugabe des Chromogens Diaminobenzidin (DAB) eine Enzym-Substrat-Reaktion herbeigeführt, welche letztlich zu einer farbigen Markierung der Spiralganglienzellen führt.

Für die selektive Anfärbung der Spiralganglienzellen wurde neben den einzelnen Bestandteilen des „Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit, Mouse IgG“ (10.2) und „Peroxidase Substrate Kit DAB“ (10.2), sterilisierte PBS (10.2) sowie der als Primärantikörper dienende

„ANF-AK (Neurofilament 200 kD, NCL-NF200)“-Antikörper (10.2) verwendet. Die Arbeitsabfolge entsprach hierbei dem Schema von in der Literatur publizierten Protokollen (DAZERT et al. 1998; ALETSEE et al. 2000).

Vor dem Beginn der einzelnen Färbeschritte stellt man eine 1,5%ige Pferdenormalserum-lösung her, wobei für einen Versuchsumfang von 50 Wells einer 96-Multiwellplatte zu 13 ml PBS 3 Tropfen Pferdeserum aus dem Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit hinzugegeben wurden. Anschließend wurden für die Herstellung der Antikörperlösung 1 in 6 ml Pferdenormalserumlösung 13 µl ANF-Antikörper hinzugegeben, was einer Konzentration von

1:500 entspricht. Die Antikörperlösung 2 wurde durch die Zugabe von 30 µl Biotin-Ak aus dem Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit in 6 ml Pferdenormalserumlösung hergestellt. Die Endkonzentration entspricht in diesem Fall einer Verdünnung von 1:200.

Nach Fertigstellung dieser Lösungen wurden die Zellen aus dem Brutschrank entnommen.

Das überstehende PBS wurde vorsichtig vom Rand her entfernt, woraufhin 100 µl der Antikörperlösung 1 in jede Vertiefung gebracht wurden und eine Inkubationszeit von einer Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank erfolgte. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Überstand verworfen und es folgte ein Spülvorgang mit 150 µl PBS pro Vertiefung. Anschließend wurde eine Inkubationszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 µl Antikörperlösung 2 pro Kavität durchgeführt. Während dieser Zeit wurde die ABC-Lösung hergestellt, wozu 7,5 ml PBS mit jeweils drei Tropfen der Reagenzien A und B aus dem Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit versetzt wurden. Die Lösung sollte dabei etwa 30 Minuten vor der Verwendung hergestellt werden.

Nach einem weiteren Spülschritt mit jeweils 150 µl PBS wurden anschließend pro Vertiefung 100 µl ABC Lösung hinzugegeben und für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

In der Zwischenzeit erfolgte die Herstellung des DAB-Substrats aus den Reagenzien des Peroxidase Substrate Kits DAB. Hierzu wurden 7,5 ml Aqua bidest (10.2) mit 3 Tropfen Puffer-Stammlösung, 6 Tropfen DAB-Stammlösung sowie 3 Tropfen Wasserstoffperoxid vermischt. Das DAB-Substrat wurde letztlich nach einem wie oben beschriebenen Spülschritt in einer Menge von 100 µl pro Well hinzugegeben, wobei dieser Färbevorgang nach einer Dauer von 12 Minuten durch die Hinzugabe von 300 µl PBS pro Kavität gestoppt wurde.

Nach Verwerfen des Überstandes erfolgte ein weiterer Spülvorgang mit jeweils 150 µl PBS, wobei zur abschließenden Lagerung bei 4 °C 150 µl PBS pro Well hinzugegeben wurden, was ein Austrocknen der fixierten und gefärbten Zellen verhindert. Bis zur Auswertung war eine Lagerung der Zellen durch Abdichten mit Parafilm bei 4 °C bis zu zwei Monate möglich.

4.2.1.9 Vermessung der Spiralganglienzellen und statistische Auswertung der Spiralganglienzellversuche

Zur Auswertung der Versuche wurden mittels eines inversen binokularen Mikroskops (10.6) und einer charged-coupled-device-(CCD)-Kamera (10.6) sowie dem angeschlossenem rechnergestützten Bildbearbeitungssystem cellP (Olympus Soft Imaging Solutions, Münster;

10.6) drei Parameter der überlebenden und zuvor immunozytochemisch angefärbten Spiralganglienzellen ermittelt. Zunächst erfolgte die Bestimmung der Zellanzahl von vitalen Spiralganglienzellen. Als vital wurden Zellen definiert, deren Neuritenaussprossungen mindestens die dreifache Länge des Somadurchmessers aufgewiesen haben (MARZELLA et al. 1999). Als zweiter Parameter wurde mittels softwaregestützter Vermessung die Länge der Neuriten bestimmt. Hierbei wurden pro Kavität 5 Gesichtsfelder bestimmt und je Gesichtsfeld diejenige Spiralganglienzelle mit der längsten Neuritenaussprossung vermessen (GILLESPIE et al. 2001). War in dem entsprechenden Gesichtsfeld keine vitale Spiralganglienzelle visualisierbar, so wurde eine Zelle aus einem benachbartem Bereich hinzugezogen. Letztlich erfolgte in entsprechender Weise die Vermessung des Somadurchmessers, wobei die Messung vertikal zur Richtung der Neuritenaussprossung vorgenommen wurde. Weiterhin wurde bei der Erhebung der Parameter auch auf morphologische Abweichungen der Zellen geachtet, welche Aufschluss auf eine Beeinträchtigung durch die Testsubstanzen geben könnten.

Abbildung 5 gibt eine beispielhafte Darstellung der angezüchteten Spiralganglienzellen wieder.

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Softwareprogramm GraphPad Prism^® 4 (10.6).

Zunächst wurden die Daten mittels Kolmogorow-Smirnow-Test auf Normalverteilung geprüft, anschließend wurde eine Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) mit Student-Newman-Keuls-Test durchgeführt.

Die ermittelten Signifikanzniveaus wurden dabei wie folgt definiert:

- p > 0,05 = nicht signifikant unterschiedlich (ns) - p < 0,05 = signifikant unterschiedlich (*) - p < 0,01 = hoch signifikant unterschiedlich (**) - p < 0,001 = höchst signifikant unterschiedlich (***)

Abb. 5: Beispielhafte Darstellung in Zellkultur angezüchteter und immunozytochemisch angefärbter (DAB-Färbung) Spiralganglienzellen. Als vital wurden Zellen bewertet, deren Neuritenausläufer mindestens die dreifache Länge des Somadurchmessers aufweisen konnten. Immunozytochemisch angefärbte Spiralganglienzellen ohne Ausläufer wurden als nicht lebensfähig bewertet (Pfeile).