5.1.1 Einfluss von L(C FITC, L(C FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BD(F auf die Überlebensrate vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Zur Untersuchung eines spiralganglienzellprotektiven Effekts wurden zunächst aus neonatalen Sprague-Dawley-Ratten gewonnene Spiralganglienzellen vereinzelt und kultiviert.
Dem Kulturmedium wurden die zu untersuchenden Testsubstanzen zugefügt. Hierbei handelte es sich um LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM und Rolipram, welche in vier unterschiedlichen Verdünnungen (1:50, 1:100, 1:200, 1:300) der Stammlösung (45 mg/ml Lipidnanokapseln; 19 µg/ml Rolipram) getestet wurden. BDNF hingegen diente als Positivkontrolle und wurde in einer Konzentration von 50 ng/ml verwendet, welche als besonders protektiv gilt (LEFEBVRE et al. 1994; HEGARTY et al. 1997). Das Medium der jeweiligen Einsaatkontrollansätze sowie der Negativkontrolle blieb unbehandelt.
Pro Well wurden 15 x 104 Zellen eingesät. Der nach einer Kulturdauer von 4 Stunden fixierte Einsaatkontrollansatz wies im Mittel einen Wert von 229,6 ± 18,1 (Mittelwert ± Standardabweichung; n=12) eingesäten Spiralganglienzellen auf und lieferte den Bezugswert (100 %) für die nach 48 Stunden fixierten Zellen der Negativkontrollgruppe sowie der mit den Testsubstanzen behandelten Gruppen (4.2.1.6).
Nach 48 Stunden Kulturdauer zeigten in der Negativkontrollgruppe (n=12) 10,7 ± 4,2 % der ursprünglich eingesäten Spiralganglienzellen eine Neuritenaussprossung, welche den Somadurchmesser der Zelle um das dreifache oder mehr übertraf. Diese Zellen galten als vital und dienten als Bezugsgröße zur Beurteilung der Effekte der Testsubstanzen (Abb. 10).
Die Verwendung der LNC FITC-Nanopartikel wies in der Verdünnung 1:50 kein erhöhtes Spiralganglienzellüberleben im Vergleich zur Kontrolle auf (10,3 ± 8,2 %; n=20), wohingegen die 1:100 Verdünnung mit einem Wert von 24,4 ± 8,8 % (n=20) ein höchst signifikant (p < 0,001) erhöhtes Überleben bewirkte. Auch in der Verdünnung von 1:200 zur Stammlösung zeigten die unbeladenen Nanopartikel noch einen hoch signifikant erhöhten
Wert (p < 0,01; 20,7 ± 7,6 %; n=20), welcher in der 1:300 Verdünnung nicht mehr zu erkennen war (17,9 ± 6,8 %; n=20).
Tendenziell konnte für die mit Rolipram beladenen LNCs ein ähnliches Bild gezeigt werden.
In der Verdünnung von 1:50 (16,2 ± 10,2 %; n=20) erbrachte der Zusatz der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination keine veränderte Überlebensrate der Spiralganglienzellen verglichen mit der Negativkontrolle, wobei die 1:100 Verdünnung mit dem Maximalwert dieser Gruppe von 32,6 ± 9,7 % (n=20) einen statistisch höchstsignifikanten Unterschied zur Negativkontrollgruppe erreichte (p < 0,001). Aber auch die 1:200 und die 1:300 Verdünnung bewirkten in dieser Gruppe ein erhöhtes Spiralganglienzellüberleben (23,4 ± 7,2 %; n=20;
p < 0,01 respektive 20,0 ± 6,4 %; n=20; p < 0,05). Innerhalb dieser Versuchsgruppe zeigte die 1:100 Verdünnung gegenüber der 1:200 Verdünnung ein hoch signifikant gesteigertes Spiral-ganglienzellüberleben (p < 0,01).
Ein ebenfalls hoch signifikanter Unterschied bestand zwischen den Werten der 1:100 Konzentrationen der LNCs und der mit Rolipram beladenen LNCs, wobei sich bei der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination ein hoch signifikant höheres Überleben zeigte (p < 0,01).
Rolipram hingegen bewirkte in den verwendeten Konzentrationen ein sehr homogenes Bild und erbrachte mit durchschnittlichen Werten von 15,7 ± 4,5 % (n=20 pro Konzentration) ein tendenzielles aber kein signifikant erhöhtes Überleben gegenüber den Zellen der Negativkontrolle.
Die Zugabe von BDNF in der Konzentration 50 ng/ml (n=30) diente als Positivkontrolle und zeigte im Vergleich zur Negativkontrollgruppe ein deutlich signifikant erhöhtes Spiralganglienzellüberleben von 45,7 ± 12,6 % (p < 0,001). Auch im Vergleich zu allen anderen Gruppen zeigte BDNF den signifikant höchsten Wert (p < 0,001).
LNC FITC 1:50 ursprünglich eingesäten SGZ [229,6 ± 18,1 Zellen (Mittelwert ± Standardabweichung; n=12)]. Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 5 unabhängigen Experimenten (n=20 pro Konzentration je Gruppe, Kontrolle: n=12, BDNF: n=30). Die Signifikanzen sind im Vergleich zur Kontrollgruppe über den Säulen dargestellt, während Vergleiche unter den Gruppen mittels Klammern dargestellt sind (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).
5.1.2 Einfluss von L(C FITC, L(C FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BD(F auf das (euritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Nach 48 Stunden Kultivierungsdauer wurde neben der prozentualen Überlebensrate der Spiralganglienzellen auch das Neuritenauswachsverhalten der Zellen analysiert. In der Negativkontrolle zeigten die Zellen ein mittleres Auswachsverhalten von 420,1 ± 181,5 µm (Mittelwert ± Standardabweichung; n=60). Dieser Wert galt als Bezugsgröße um die Effekte der Versuchskonditionen in ein gesteigertes sowie verringertes Auswachsverhalten einzuteilen.
Das Auswachsverhalten der Neuriten unter Einwirkung der LNC FITC Nanopartikel in einer Verdünnung von 1:50 zur Stammlösung (45 mg/ml Lipidnanokapseln) zeigte mit einem Wert von 265,6 ± 159,4 µm (n=100) eine höchst signifikante Verringerung der Neuritenlängen im Vergleich zur Negativkontrollgruppe (p < 0,001). In den Verdünnungen von 1:100 und 1:200 wurde hingegen kein signifikanter Unterschied zur Negativkontrollgruppe deutlich (474,2 ± 185,4; n=100 respektive 500,1 ± 193,6 µm; n=100). So zeigten die mit der 1:300 Verdünnung behandelten Zellen aber ein signifikant verlängertes Neuritenwachstum verglichen zur Negativkontrollgruppe (p < 0,05; 519,1 ± 205,4 µm).
Die LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe wies analog zu den unbeladenen Nanopartikeln ein signifikant verringertes Neuritenauswachsverhalten in der Verdünnung von 1:50 auf (349,3 ± 178,3 µm; p < 0,05, n=100). Mit der 1:100 sowie die 1:200 Verdünnung dieser Gruppe konnten bei den behandelten Zellen signifikant verlängerte Neuriten im Vergleich zu den Zellen der Negativkontrolle erreicht werden (547,6 ± 164,1 µm bzw. 536,8 ± 201,1 µm;
p < 0,01 und n=100 je Gruppe). Diese Konzentration 1:100 zeigte im Vergleich zu allen Konzentrationen der mit Rolipram behandelten Zellen eine signifikant erhöhte Neuritenlänge (p < 0,05). Die 1:300 Verdünnung hingegen wies keinen signifikanten Unterschied zur Kontrolle auf (512 ± 197,9 µm; n=100). Der Vergleich zwischen den mit Rolipram beladenen Partikeln sowie den unbeladenen Partikeln in der Verdünnung 1:50, konnte für die Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination hoch signifikant längere Neuritenlängen zeigen (p < 0,01). Die Gegenüberstellung der restlichen Verdünnungen ergab untereinander keine signifikanten Unterschiede.
Rolipram zeigte in allen Verdünnungen ein sehr homogenes Bild und wies lediglich eine tendenziell verlängerte Neuritenlänge auf, welche aber in keinem Fall eine Signifikanz zur Kontrollgruppe bot (1:50 = 462,7 ± 196,4 µm; 1:100 = 455,9 ± 177,4 µm; 1:200 = 464,9 ± 185,9 µm; 1:300 = 460,6 ± 190,4; n=100 je Gruppe).
Auch die mit BDNF 50 ng/ml behandelten Zellen zeigten diese Tendenz, wiesen aber ebenfalls keinen statistisch signifikanten Unterschied auf. (475 ± 151,2 µm; n=130).
In Abbildung 11 ist das Neuritenauswachsverhalten aller Versuchsgruppen graphisch dargestellt. In Abbildung 12 wird in einer lichtmikroskopischen Aufnahme beispielhaft das Neuritenauswachsverhalten aller Versuchsgruppen in der Verdünnung von 1:100 gezeigt.
BDNF wurde in einer Konzentration von 50 ng/ml verwendet, während die Negativkontrolle Rolipram sowie BDNF auf das Neuritenauswachsverhalten von SGZ nach 48 Stunden Kulturdauer.
Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 5 unabhängigen Experimenten (n=100 vermessene Neuritenlängen pro Konzentration je Gruppe, Kontrolle: n=60, BDNF: n=130). Die Signifikanzen im Vergleich zur Kontrollgruppe sind über den Säulen dargestellt, während Vergleiche unter den Gruppen mittels Klammern dargestellt sind (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **;
p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).
Abb. 12: Mikroskopische Darstellung des Neuritenauswachsverhaltens (Pfeile) vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen nach 48 Stunden unter Einfluss von folgenden Faktoren: Bild 1: LNC FITC 1:100;
Bild 2: LNC FITC ROLIPRAM 1:100; Bild 3: LNC BLANK 1:100; Bild 4: ROLIPRAM 1:100; Bild 5:
unbehandelte Negativkontrolle; Bild 6: BDNF 50 ng/ml. Stammlösung der Nanopartikel: 45 mg/ml LNC, 19 µg/ml Rolipram.
1 2
3 4
5 6
5.1.3 Einfluss von L(C FITC, L(C FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BD(F auf den Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Neben der Evaluierung der prozentualen Überlebensrate der Spiralganglienzellen sowie ihrem Neuritenauswachsverhalten wurde auch der Durchmesser der Zellkörper unter Zugabe der Testsubstanzen ermittelt und miteinander verglichen. Der mittlere Somadurchmesser der Negativkontrolle betrug 14,5 ± 2,6 µm (Mittelwert ± Standardabweichung, n=60). Nur die mit den LNC FITC-Nanopartikeln in einer Konzentration von 1:50 zur Stammlösung (45 mg/ml Lipidnanokapseln) behandelten Zellen zeigten einen hoch signifikant geringeren Somadurchmesser von 12,8 ± 1,9 µm (p < 0,01). Alle anderen Werte lieferten keine statistisch signifikanten Differenzen verglichen mit dem mittleren Zelldurchmesser der Negativ-kontrolle. Zur Vollständigkeit seien die ermittelten Werte tabellarisch dargestellt (Tab. 5)
Tab. 5: Ergebnisse der ermittelten Spiralganglienzelldurchmesser (Mittelwert ± Standardabweichung) nach 48-stündiger Kultivierung unter LNC FITC-, LNC FITC ROLIPRAM-, Rolipram- sowie BDNF-Einfluss in unterschiedlichen Verdünnungen.
Gruppe Mittelwert des Somadurchmessers
[µm]
Standardabweichung Anzahl der vermessenen Somae
Negativkontrollgruppe 14,5 2,6 60
LNC FITC 1:50 12,8 1,9 100
LNC FITC 1:100 13,2 2,2 100
LNC FITC 1:200 13,3 2,2 100
LNC FITC 1:300 14,0 3,2 100
LNC FITC ROLIPRAM 1:50 13,3 2,1 100
LNC FITC ROLIPRAM 1:100 14,0 2,6 100
LNC FITC ROLIPRAM 1:200 13,7 2,8 100
LNC FITC ROLIPRAM 1:300 14,1 3,0 100
Rolipram 1:50 14,4 2,6 100
Rolipram 1:100 14,7 2,9 100
Rolipram 1:200 14,6 3,0 100
Rolipram 1:300 14,6 3,0 100
BDNF 50 ng/ml 14,8 2,7 130
5.1.4 Einfluss von L(C FITC, L(C BLA(K und BD(F auf die Überlebensrate vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Da die Ergebnisse des ersten Zellversuches einen positiven Effekt der Nanopartikel ohne Rolipram auf das Überleben der Spiralganglienzellen zeigten, wurde ein zweiter Zellversuch durchgeführt, um die Effekte des Fluoreszenzmarkers FITC und der Lipidnanokapseln (LNC) als solches auf das Überleben der Spiralganglienzellen zu evaluieren. Hierbei wurde der Einfluss von mit FITC markierten Lipidnanokapseln (LNC FITC) und unmarkierten LNCs (LNC BLANK) auf das Überleben von kultivierten Spiralganglienzellen untersucht. Hierfür erfolgte der Zusatz von LNC FITC Nanopartikeln, welche in drei verschiedenen Verdünnungen der Stammlösung (1:100, 1:200, 1:300 Verdünnung der Stammlösung von 45 mg/ml Lipidnanokapseln) auf die Zellen gegeben wurden. Mit der LNC BLANK-Gruppe wurde analog verfahren. Des Weiteren wurden die Zellen mit BDNF 50 ng/ml behandelt, welche als Positivkontrolle dienten. Das Medium der Einsaatkontrollansätze und der Negativkontrolle blieb unbehandelt.
Bei einer Einsaat von 15 x 104 Zellen pro Kavität konnte bei der Einsaatkontrolle nach einer Kulturdauer von 4 h eine mittlere Spiralganglienzellanzahl von 247,3 ± 59,8 (Mittelwert ± Standardabweichung; n=6) ermittelt werden. Dieser Wert galt als Bezugsgröße (100 %) für die Berechnung der prozentualen Überlebensrate der nach 48 Stunden fixierten Spiralganglienzellen der Negativkontrolle (6,8 ± 4,9 %; n=9) sowie der mit den Testsubstanzen behandelten Gruppen (4.2.1.6).
Im Vergleich zur Negativkontrolle konnten die mit LNC FITC behandelten Spiralganglien-zellen in der Verdünnung von 1:100 eine signifikant erhöhte Zellanzahl aufweisen (22,0 ± 13,8 %; n=9; p < 0,05). Die Werte der 1:200 sowie 1:300 Verdünnung erwiesen sich nicht als signifikant erhöht, zeigten aber die Tendenz zu einer erhöhten Überlebenszahl hinsichtlich der Negativkontrolle (17,4 ± 9,6 %; respektive 12,4 ± 6,8 %; n=9 je Gruppe).
Im Gegensatz dazu bewirkten alle Verdünnungsstufen der LNC BLANK-Versuchsgruppe einen signifikant erhöhten Anstieg von vitalen Spiralganglienzellen. In der 1:100 Verdünnung zeigte sich der höchste Wert mit einem hoch signifikanten Unterschied von p < 0,01 (28,4 ± 8,4 %; MW und STABW; n=9). Bei der 1:200 und der 1:300 Verdünnung war ein
geringerer aber dennoch signifikanter Anstieg des Spiralganglienzellüberlebens zu erkennen (p < 0,05; 23,9 ± 10,9 %; respektive 20,6 ± 9,6 %; n=9 je Gruppe).
Die mit BDNF 50 ng/ml behandelten Zellen zeigten den höchsten Signifikanzwert (p < 0,001;
40,8 ± 16,2 %; n=9), wobei diese Gruppe als Positivkontrolle diente und gegenüber LNC BLANK-Gruppe und der 1:100 Verdünnung der LNC FITC-Gruppe ein signifikant erhöhtes Zellüberleben bewirkte (p < 0,01). Gegenüber den 1:200 und 1:300 Verdünnungen der LNC FITC-Gruppe zeigte BDNF sogar ein höchstsignifikant gesteigertes Überleben der Spiralganglienzellen (p < 0,001). Die im Text erläuterten Ergebnisse sind in Abbildung 13 graphisch dargestellt.
Abb. 13: Effekte der unterschiedlichen Verdünnungen von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf das SGZ-Überleben nach 48 h Kulturdauer in Prozent der ursprünglich eingesäten SGZ [247,3 ± 59,8 SGZ (Mittelwert ± Standardabweichung; n=6 ausgezählte Wells)]. Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 unabhängigen Experimenten (n=9 ausgezählte Wells pro Verdünnung je Gruppe). Die Signifikanzen im Vergleich zur Kontrollgruppe sind über den Säulen dargestellt, während die Vergleiche unter den jeweils entsprechenden Verdünnungen keine signifikanten Unterschiede ergaben (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).
5.1.5 Einfluss von L(C FITC, L(C BLA(K sowie BD(F auf das (euritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Neben dem prozentualen Überleben wurde auch in diesem Versuch das Auswachsverhalten der Neuriten bestimmt. So zeigten die Zellen in der unbehandelten Negativkontrollgruppe nach 48 Stunden Kulturdauer eine mittlere Neuritenlänge von 401,8 ± 166,1 µm (Mittelwert ± Standardabweichung; n=45) welche als Bezug für die Evaluierung der Neuritenlängen der mit den Testsubstanzen behandelten Spiralganglienzellen diente.
Die Neuritenlängen aller mit LNC FITC behandelten Gruppen zeigten einen signifikanten Anstieg im Vergleich zur Negativkontrollgruppe. Die Verdünnung 1:100, 1:200 sowie 1:300 (515,8 ± 131,6 µm; 526,0 ± 166,5 µm, respektive 491,4 ± 184,8 µm; n=45 je Gruppe) der Stammlösung (45 mg/ml Lipidnanokapseln), zeigten ein moderat signifikant verlängertes Auswachsverhalten (p < 0,05).
Die mit LNC BLANK behandelten Zellen zeigten ebenfalls alle eine signifikante Erhöhung des Auswachswertes, wobei der höchste Wert in der Verdünnung 1:200 erreicht wurde (595,5 ± 187,4 µm; n=45; p < 0,01). Die Verdünnungen 1:100 und 1:300 wiesen im Vergleich zur Negativkontrolle ein leicht signifikant erhöhtes Neuritenauswachsverhalten auf (p < 0,05;
487,5 ± 143,3 µm, respektive 523,3 ± 188,6 µm, n=45 je Gruppe). Innerhalb dieser Gruppe ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen der 1:100 und 1:200 Verdünnung, wobei die mittleren Neuritenlängen der 1:200 Verdünnung den höheren Wert erreichten (p < 0,05).
Jedoch zeigte der Vergleich der sich entsprechenden Verdünnungen der LNC FITC und LNC BLANK Partikel untereinander keinen statistischen Unterschied.
Auch BDNF konnte in einer Konzentration von 50 ng/ml in diesem Versuch ein signifikant erhöhtes Neuritenwachstum im Vergleich zur Negativkontrolle erzielen (p < 0,01;
541,8 ± 144,9 µm; n=45).
Die Abbildung 14 stellt die ermittelten Ergebnisse der Neuritenlängen graphisch dar.
LN
C FITC 1:100 LN
C FITC 1:200 LN
C FITC 1:300 LN
C BLANK 1:100 LN
C BLANK 1:200 LN
C BLANK 1:300
BDNF 50 ng/ml
Negativkontrolle 0
100 200 300 400 500 600 700
800 ***
* * *
* **
*
*
Versuchsgruppe
SGZ-Neuritenlänge [µm]
Abb. 14: Effekte der unterschiedlichen Konzentrationen von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf das Neuritenauswachsverhalten von SGZ nach 48 Stunden Kulturdauer. Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 unabhängigen Experimenten (n=45 vermessene Neuritenlängen pro Konzentration je Gruppe). Die Signifikanzen sind im Vergleich zur Kontrollgruppe über den Säulen dargestellt, während Vergleiche unter den Gruppen mit Klammern dargestellt sind (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).
5.1.6 Einfluss von L(C, L(C BLA(K sowie BD(F auf den Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Der Vergleich der Somadiameter unter den mit den verschiedenen Testsubstanzen behandelten Gruppen ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede. Die tabellarische Darstellung gibt eine Übersicht über die ermittelten Daten (Tab. 6).
Tab. 6: Ergebnisse der ermittelten Spiralganglienzelldurchmesser (Mittelwert ± Standardabweichung) nach 48-stündiger Kultivierung unter LNC FITC-, LNC BLANK- sowie BDNF-Einfluss in unterschiedlichen Verdünnungen.
Gruppe Mittelwert des Somadurchmessers
[µm]
Standardabweichung Anzahl der vermessenen Soma
Negativkontrolle 14,7 3,2 45
LNC FITC 1:100 14,1 2,2 45
LNC FITC 1:200 13,7 2,2 45
LNC FITC 1:300 13,5 2,8 45
LNC BLANK 1:100 13,5 2,1 45
LNC BLANK 1:200 13,5 2,1 45
LNC BLANK 1:300 13,3 2,0 45
BDNF 50 ng/ml 14,5 2,3 45