Tierärztliche Hochschule Hannover
In-vitro- und Ex-vivo-Untersuchungen augenschädigender
Wirkungen von Arzneistoffen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Elisabeth Wiegand
Oschatz
Hannover 2017
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
1. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
2. Gutachter: Prof. Dr. Ary Boevé
Tag der mündlichen Prüfung: 06.11.2017
Die vorliegende Arbeit wurde von Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit gefördert.
Meiner Familie
in Liebe und Dankbarkeit
1 Inhaltsverzeichnis
1 INHALTSVERZEICHNIS 5
2 EINLEITUNG 7
3 LITERATUR 7
3.1 Anatomie des Auges 7
3.1.1 Aufbau der Retina 8
3.1.2 Die Blut-Augen-Schranke 9
3.1.3 Die Blut-Retina-Schranke 10
3.2 Zelllinien für Untersuchungen an retinalem Pigmentepithel und Retina 12
3.2.1 Zelllinie ARPE-19 12
3.2.2 Zelllinie R28 13
3.3 Arzneistoffe 13
3.3.1 Fluorchinolone 13
3.3.1.1 Enrofloxacin 14
3.3.1.2 Ciprofloxacin 15
3.3.1.3 Danofloxacin 16
3.3.1.4 Marbofloxacin 17
3.3.2 Spinosad 18
3.3.3 Milbemycinoxim 19
3.3.4 Ivermectin 20
3.3.5 Ciclosporin 21
3.3.6 Betamethason 22
3.3.7 Ketoprofen 23
3.3.8 Chlorpromazin 24
3.4 UV- Schädigung von Zellen 24
4 MATERIALIEN UND METHODEN 25
4.1 Materialien und Geräte 25
4.1.1 Verwendete Materialien und Geräte 25
4.1.2 Chemikalien und Substanzen 28
4.1.3 Puffer und weitere Lösungen 30
4.1.3.1 Puffermedium für Transportversuche 30
4.1.3.2 Verwendete Substrate für Transportversuche 30
4.1.3.3 Zellkulturmedien 31
4.1.3.3.1 Wachstumsmedium für R28 (DMEM+) 31
4.1.3.3.2 Wachstumsmedium für ARPE-19 31
4.1.3.3.3 CMF-EDTA 31
4.1.3.3.4 PBS 32
4.1.3.3.5 Stammlösungen für die Zellkultur 32
4.1.3.3.6 Herstellung der Verdünnungsreihen für die Zellkultur 33
4.1.3.3.7 Zelllinen 33
4.1.3.3.8 UV- Lampe 33
4.1.3.1 HPLC- Eluent 33
4.2 Methoden 34
4.2.1 Ussingkammer 34
4.2.1.1 Aufbau der Ussingkammer 34
4.2.1.2 Präparation des retinalen Pigmentepithels aus Rinderaugen 35
4.2.1.3 Versuchsablauf 36
4.2.2 Zellkultur 37
4.2.2.1 R28-Zelllinie 37
4.2.2.2 ARPE-19-Zelllinie 39
4.2.2.3 Zytotoxikologische Untersuchungen 39
4.2.2.3.1 Zytotoxizität der Arzneistoffe (Ansatz 1) 40
4.2.2.3.2 Zytotoxizität der Arzneistoffe und der Einfluss von UV-Licht (Ansatz 2-4) 40 4.2.2.3.3 Zytotoxizität vorbestrahlter Fluorchinolone (Ansatz 5) 41
4.2.2.3.4 Präinkubationsversuch (Ansatz 6) 42
4.2.2.3.5 MTS-Vitalitätstest 42
4.2.3 Nachweis von Ciprofloxacin mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) 43
4.2.3.1 Kalibrationsreihe 43
4.2.3.2 Analytik 43
5 ERGEBNISSE 45
5.1 Ergebnisse der zytotoxikologischen Untersuchungen an R28- und ARPE-19-Zellen 45
5.1.1 Ciprofloxacin 45
5.1.2 Danofloxacin 49
5.1.3 Enrofloxacin 53
5.1.4 Marbofloxacin 57
5.1.5 Spinosad 61
5.1.6 Milbemycinoxim 65
5.1.7 Ivermectin 69
5.1.8 Betamethason 73
5.1.9 Ketoprofen 77
5.1.10 Chlorpromazin 81
5.1.11 Ciclosporin 85
5.2 Ergebnisse aus der Ussingkammer 89
6 DISKUSSION 91
6.1 Methodik 91
6.2 Fluorchinolone 94
6.3 Spinosad, Milbemycinoxim und Ivermectin 97
7 ZUSAMMENFASSUNG 101
8 SUMMARY 103
9 LITERATURVERZEICHNIS 105
10 DANKSAGUNG 114
7
2 Einleitung
In der vorliegenden Arbeit sollten, auf Basis von in der Literatur und in Pharmakovigilanzmeldungen beschriebenen Fällen, augenschädigende Wirkungen von Arzneistoffen untersucht werden.
Anstoß dazu gaben vom Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit berichtete Pharmakovigilanzfälle in den USA in Bezug auf Erblindung, besonders bei Hunden und Katzen nach oraler Anwendung des Arzneistoffes Spinosad. Es wurde berichtet, dass sich 2,45 % der unerwünschten Arzneimittelwirkungen dieses Stoffes auf Veränderungen am Auge bezogen, auch wenn hier nicht nur das gestörte Sehvermögen berücksichtigt wurde (DTBl_05_2016_Fokus Antiparasitika.pdf, 2016.; Dunn et al., 2011).
Ziel war es, In-vitro-Modelle zu entwickeln, an denen die retinale Toxizität untersucht werden kann. Hierzu wurden besonders Zellkulturmodelle berücksichtigt. Da die Augen unserer Haustiere dem UV-Licht unserer Umgebung ausgesetzt sind, wurde dessen Wirkung hierbei berücksichtigt.
Einige Arzneistoffe sind bekannt für ihre Interaktionen mit Transportern. Deren Auswirkungen sollten in einem Ex-vivo-Modell untersucht werden.
3 Literatur
3.1 Anatomie des Auges
Der Augapfel, Bulbus oculi, liegt zusammen mit seinen Muskeln, Gefäßen, Nerven, Drüsen und dem intraorbitalen Fettgewebe in der Orbita. Der von drei Häuten umgebene Hohlraum ist mit wässrigen, teilweise gallertigen lichtbrechenden Medien gefüllt. Im Verhältnis zur Körpergröße besitzt die Katze den größten Bulbus (Böhme, 2004).
Die äußere Augenhaut wird in zwei Abschnitte gegliedert. Die proximale, undurchsichtige und gefäßarme, weiße Augenhaut (Sclera), die ca. 4/5 der
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Bulbusoberfläche einnimmt stellt den ersten Abschnitt dar und die durchsichtige, derb- elastische Hornhaut (Cornea), die den zweiten Abschnitt darstellt.
Die mittlere Augenhaut, besteht aus einer von zahlreichen Gefäßen, Pigmentzellen, elastischen Fasern und Nerven durchsetzten, locker strukturierten Bindegewebshaut.
Gegliedert wird sie in die Aderhaut, den Ziliarkörper und die Iris. Die Aderhaut (Choroidea) ist ein dünnes, braunschwarz gefärbtes Häutchen, welches den Augenhintergrund überzieht. Durch die Lamina suprachoroidea steht sie mit der Sclera in loser Verbindung. Die massivste Schicht der Choroidea ist die Lamina vasculosa.
Dichte Blutgefäßgeflechte sind hier in ein von Pigmentzellen durchsetztes, lamelläres Bindegewebsgerüst eingebaut. Zwischen Lamina vasculosa und innerer Augenhaut liegen noch das als Lamina choroidocapillaris bezeichnete dichte Kapillarnetz und eine aus Basalmembran und elastischen Fasern bestehende Lamina vitrea (Böhme 2004).
Die innere Augenhaut (Netzhaut, Retina) kleidet die innere Oberfläche des Augapfels vom Pupillenrand der Iris bis zum Austritt des Sehnervens vollständig aus. Sie gliedert sich in eine lichtempfindliche Pars optica retinae und eine lichtunempfindliche Pars caeca retinae. Die Pars caeca retinae bildet mit einer doppelten Epithellage die Oberfläche des Ziliarkörpers und der Iris. Die Pars optica retinae kleidet von der Ora serata bis zum Discus nervi optici den gesamten Augenhintergrund aus (Böhme 2004).
3.1.1 Aufbau der Retina
Die Retina besteht aus zwei Blättern, mit teilweise mehreren Schichten. Diese Blätter werden als das Innen- und Außenblatt der Retina bezeichnet.
Das Außenblatt der Retina (Pigmentblatt) wird aus einschichtigem, plattem bis niedrig kubischem Pigmentepithel gebildet. Die Zellen schieben je nach Belichtungsintensität mehr oder weniger lange, pigmenthaltige Cytoplasmafortsätze zwischen die Stäbchen und Zapfen des Innenblatts vor.
Das Innenblatt der Retina (Stratum nervosum) ist ein spezifisch umgebauter Teil der embryonalen Hirnwand mit einem mehrschichtigen Aufbau. Die Photorezeptoren sind dem Licht abgewandt und liegen in Richtung des retinalen Pigmentepithels. In entgegengesetzter Richtung (Richtung Glaskörper) schließen sich an jeden Rezeptor
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zwei Neuronen, eingebettet in ein Stützgerüst aus modifizierten Neurogliazellen an (Böhme 2004).
Die Photorezeptoren sind lichtempfindliche Sinneszellen. Die Oberfläche wird durch die Membrana limitans externa, einer Kette von Zellkontakten gebildet und von Fortsätzen überragt, die das charakteristische Tubulussystem einer Zilie besitzen, aber in Form schmaler Stäbchen und claviformer Zapfen ausgebildet sind. Diese Schicht der Stäbchen und Zapfen wird als Stratum neuroepitheliale bezeichnet. Die Stäbchenzellen vermitteln vor allem Helligkeitsunterschiede und sind somit Träger des Dämmerungssehens. Die Zapfenzellen dienen hingegen dem Form- und Farbsehen.
Katzen haben nur ein sehr geringes Farbsehvermögen. Die kurzen basalen Fortsätze der Photorezeptoren treten mit den Dendriten bipolarer Nervenzellen in synaptische Verbindung und verflechten sich so zur äußeren retikulären Schicht. Diese bipolaren Nervenzellen bilden die innere Körnerschicht und das erste Neuron. Ihre Axone verzweigen sich in der inneren retikulären Schicht und treten dabei in synaptischen Kontakt mit dem Opticusganglion. Das zweite Neuron wird von größeren und kleineren multipolaren Nervenzellen gebildet, deren Dendriten schon aus der inneren retikulären Schicht hervorgehen. Ihre Axone formieren sich zur Optikusfaserschicht und laufen aus dem Bereich der Pars optica retinae zum Discus nervi optici um dort als Faserbündel, den Sehnerv bildend zum Gehirn zu ziehen. Die Nervenfaserbündel durchtreten die Area cribrosa sclerae und weisen hier erstmals Markscheiden auf, während die Nervenfasern vorher marklos sind. Dadurch erscheint das Innenblatt der Retina im lebenden Auge als durchsichtige, häufig rötlich schimmernde Membran, die sich aber nach dem Tot schnell eintrübt (Böhme 2004).
3.1.2 Die Blut-Augen-Schranke
Schnaudigel erbrachte 1913 den ersten Nachweis der Blut-Augen-Schranke, indem er die klassischen Untersuchungen an Kaninchen von Goldman, denen dieser Trypanblau intravenös oder subdural verabreichte und die zur Entdeckung der Blut- Hirn-Schranke führten, erneut durchführte (Goldmann, 1913). Schnaudigel stellte fest, dass „Der Sehnerv [...], wie die Netzhaut, ganz farblos [ist], desgleichen Linse und Glaskörper“. Auch die Augen verfärbten sich also im Gegensatz zu allen anderen
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Organen nicht tiefblau, sondern konnten ihre natürliche Färbung nach intravenöser Applikation von Trypanblau erhalten (Schnaudigel, 1913).
Inzwischen ist klar, dass die Blut-Augen-Schranke aus zwei Anteilen besteht. Sie wird zum einen von der Blut-Kammerwasser-Schranke und zum anderen von der Blut- Retina-Schranke gebildet (Rodriguez-Peralta, 1968). In der vorliegenden Arbeit steht die Blut-Retina-Schranke im Vordergrund.
3.1.3 Die Blut-Retina-Schranke
Die Blut-Retina-Schranke, im Weiteren mit BRB (blood-retinal-barrier) abgekürzt, spielt eine entscheidende Rolle bei vielen Erkrankungen, die mit gestörtem Sehvermögen oder Blindheit einhergehen und ist damit von besonderem Interesse (Mullen and LaVail, 1976; Qaum et al., 2001; Vinores et al., 1999). Sie besteht aus zwei Anteilen, zum einen als äußere Blut-Retina-Schranke aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE) und zum anderen als innere Blut-Retina-Schranke aus dem Endothel der retinalen Gefäße. An beiden kann ein aktiver Transport auch gegen hohe Konzentrationsgradienten von der Retinaseite zur Blutseite stattfinden (Cunha-Vaz and Maurice, 1967).
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Abbildung 1 Schematischer Aufbau der Retina, mit retinalem Pigmentepithel (“retina_schema2.jpg (430×355),” 2017)
In der Blut-Retina-Schranke sind eine Vielzahl von Transportern nachweisbar, welche die Anflutung von Stoffen ins Auge maßgeblich beeinflussen (Mannermaa et al., 2006).
Zu diesen Transportern zählen P-Glykoprotein (Sinha et al., 2005), Brcp/ABCG2 (Breast cancer resistance protein) (Vlaming et al., 2009), SLC6A8 (natrium- und chloridabhängiger Kreatinin Transporter 1) (Tomi and Hosoya, 2004), CRT (Kreatinin Transporter) (Nakashima et al., 2004), GLUT1 (Glukosetransporter 1) (Takata et al., 1992), Oatp2 und 14 (Organo-Anionen-Transporter 2 und 14) (Tomi and Hosoya, 2004), LAT1 oder auch SLC7A5 (large neutral amino acid transporter) (Hosoya et al., 2005), SLC7A11 (Cystin/Glutamat Transporter), Transporter der MCT-Familie (Monocarboxylat Transporter) (Mannermaa et al., 2006), SLC6A6 oder auch TauT (Taurintransporter) (Tomi et al., 2008), CNT1 und CNT2 (Concentrative nucleotide transporter 1,2) und ENT1 und ENT2 (equilibrative nucleotide transporter 1,2) (Nagase et al., 2006).
Diese Transporter können eine Vielzahl von Polymorphismen aufweisen. Der bekannteste in Bezug auf Hunde und Katzen ist wohl der rassespezifische Polymorphismus von P-Glykoprotein bei Collies, der beispielsweise eine massive Überempfindlichkeit und Neurotoxizität gegenüber dem Anthelminthikum Ivermectin
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verursacht (Mealey et al., 2001). Viele Arzneistoffe werden von P-Glykoprotein aktiv aus den Zellen des retinalen Pigmentepithels ausgeschleust und somit wird die Retina vor diesen Substanzen geschützt. Ist dieser Transporter nun durch einen Polymorphismus nicht voll funktionsfähig, kann es zu einem Angleich von Arzneistoffkonzentrationen im Blutplasma und den Konzentrationen an der Retina kommen. Dadurch wirken bei betroffenen Tieren möglicherweise Arzneistoffe, die innerhalb ihrer Dosierungsempfehlung angewandt bei gesunden Tieren keinerlei Schäden verursachen, toxisch. Auch bei Katzen konnte ein solcher Polymorphismus am ABCB1-Gen, welches P-Glykoprotein codiert, nachgewiesen werden. Hier wurden 14 Mutationen nachgewiesen, die auch mit unerwünschten Arzneimittelreaktionen (auch Ivermectin) in Verbindung gebracht werden konnten (Mealey and Burke, 2015).
Es wurde bereits nachgewiesen, dass zudem Mutationen von ABCG2 bei der Katze vorliegen können. ABCG2 dient als Transporter diverser funktionell und strukturell unterschiedlicher Arzneistoffe, die bei gestörter Funktion des Transporters an der Retina anfluten können. Sie können die molekulargenetische Grundlage für eine durch Fluorchinolone induzierte Degeneration der Retina der Katze bilden (Mealey, 2012;
Ramirez et al., 2011).
Da In-vivo-Untersuchungen sich als schwierig herausgestellt haben, wurden für die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zu potentiellen Schädigungen an retinalem Pigmentepithel und Retina durch Arzneistoffe besonders Zelllinien als praktikable Lösung genutzt.
3.2 Zelllinien für Untersuchungen an retinalem Pigmentepithel und Retina
3.2.1 Zelllinie ARPE-19
Als Modell für das retinale Pigmentepithel diente die humane Zelllinie ARPE-19. Diese Zelllinie hat sich spontan, durch selektives Trypsinisieren, aus Zellen des retinalen Pigmentepithels eines 19-jährig verunglückten Mannes gebildet. Die Zellen bilden stabile, adhärente Einzelzellschichten, welche eine morphologische und funktionelle Polarität ausbilden. Die für das retinale Pigmentepithel spezifischen Antigenmarker
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CRALBP und RPE-65 sind exprimiert. Die Zellen haben einen diploiden Chromosomensatz (ARPE-19 ATCC ® CRL-2302TM Homo sapiens eye; retinal pigmente, 2017; DUNN et al., 1996).
3.2.2 Zelllinie R28
Die Zelllinie R28 wurde als Modell für die Zellen der Retina genutzt. Die Zellen wurden aus 6 Tage alten Ratten gewonnen und dann mit dem 12S-E1A-Gen des Adenovirus immortalisiert. Es handelte sich um retinale Vorläuferzellen, die sowohl gliale, als auch neuronale Zellmarker ausprägen (Seigel, 2014). Zur Untersuchung der In-vitro- Zytotoxizität an der Retina wurden sie bereits in mehreren Studien eingesetzt (Adamus et al., 1997; Luthra et al., 2006; Narayanan et al., 2006).
3.3 Arzneistoffe
Die nachfolgend kurz beschriebenen Arzneistoffe wurden aufgrund verschiedener Daten ausgewählt und dienen als Beispielsubstanzen, auch zur Validierung der entwickelten Methoden. Um zu einer schädlichen Wirkung an der Retina beizutragen können sie entweder selbst direkt schädlich auf sie wirken oder die Transportvorgänge an der BRB beeinflussen. Letzteres ist vor allem bei Arzneistoffkombinationen zu beachten.
3.3.1 Fluorchinolone
Fluorchinolone sind häufig in der Kleintiermedizin angewendete Antibiotika. Sie wurden in der Literatur häufiger im Zusammenhang mit verschiedenen Problemen im Bereich der Retina und umliegenden Geweben erwähnt und untersucht. So erhöhen sie beim Menschen die Wahrscheinlichkeit von Netzhautablösungen gegenüber Menschen, die keine Fluorchinolone einnehmen, auch wenn die absolute Anzahl der Fälle eher gering ist (Etminan et al., 2012). Bei der Katze wurde in einer retrospektiven Studie ein Zusammenhang zwischen parenteraler Gabe eines Fluorchinolons (Enrofloxacin) und diffuser retinaler Degeneration nachgewiesen. Weitere Studien kamen zu ähnlichen Ergebnissen (Gelatt et al., 2001; Wiebe and Hamilton, 2002). Ein
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phototoxisches Potential wurde für Fluorchinolone ebenfalls nachgewiesen (Umezawa et al., 1997). Dieses zeigte sich beispielsweise an der Retina von Albinomäusen (Shimoda et al., 1993). Bei einer 10-fachen Überdosierung wurde eine Retinatoxizität bei gesunden Katzen sehr deutlich gezeigt (Ford et al., 2007). In den eigenen Experimenten wurden mehrere Vertreter dieser Gruppe untersucht und vergleichend betrachtet.
3.3.1.1 Enrofloxacin
Enrofloxacinpräparate sind in der Veterinärmedizin in Deutschland weit verbreitet.
Aktuell gibt es 69 Präparate auf dem Markt (VETIDATA, 2017), mit angegebenen Dosierungsempfehlungen von 5 mg/kg Körpergewicht einmal täglich (Potschka et al., 2014).
Im Rahmen der Pharmakovigilanz sind unerwünschte Arzneimittelwirkungen im Bereich der Augen nach Behandlungen mit Enrofloxacin aufgetreten. Dazu gehören auch Retinadegeneration und Verlust des Sehvermögens (MISSION, 2001). In einer retrospektiven Studie wurden 17 Katzen identifiziert, die während einer Enrofloxacinbehandlung Mydriasis und akute Blindheit zeigten. Diese Symptome wurden auf eine diffuse retinale Degeneration zurückgeführt (Gelatt et al., 2001).
Weitere Fallberichte zu gestörtem Sehvermögen nach einer Behandlung mit Enrofloxacin wurden bekannt (Abrams-Ogg et al., 2002; Crispin et al., 2002). Die Firma Bayer reagierte auf diese Fallmeldungen und gab an, dass diese unerwünschten Arzneimittelwirkungen bei 0,001 % der Katzen auftritt. Die Dosierungsempfehlung wurde von ehemals 5-20 mg/kg Körpergewicht auf 5 mg/kg Körpergewicht angepasst (Wiebe and Hamilton, 2002; Wilson, 2002). Um diese Fälle zu untersuchen und den Zusammenhang zu verifizieren, wurden in einer weiteren Studie 24 Katzen deutlich überdosiert mit 50 mg/kg Körpergewicht Enrofloxacin oral behandelt. Funduskopische Veränderungen wurden bereits an Tag 3 festgestellt, vaskuläre Dämpfung an Tag 2-5 und generalisierte tapetale Hyperreflexie zwischen Tag 5 und 7. Generalisierte Degenerationserscheinungen und ein eingeschränktes Sehvermögen wurden bereits nach 3 Tagen nachgewiesen (Ford et al., 2007). Als Risikofaktoren werden häufig
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tägliche Dosis, Behandlungsdauer und Gesamtdosis angegeben (Abrams-Ogg et al., 2002; Ford et al., 2007; Gelatt et al., 2001; Wiebe and Hamilton, 2002).
Um die Ergebnisse der vorliegenden Studie einordnen zu können, sind die Plasmaspiegel von Enrofloxacin, die am retinalen Pigmentepithel und bei Fehlfunktionen der BRB auch an der Retina vorliegen, von entscheidender Bedeutung.
Entsprechend der Dosierungsempfehlung wurden 12 Hunde über 5 Tage oral in einer Cross-over-Studie behandelt. Die maximale Plasmakonzentration betrug 1,6 µg/ml (Frazier et al., 2000). An 34 Hunden wurden in einer weiteren Cross-over-Studie die maximalen Plasmakonzentrationen von Enrofloxacin nach einmaliger oraler Gabe von 5 mg/kg Körpergewicht gemessen. Dabei wurden bis zu 1,4 µg/ml nachgewiesen (Heinen, 2002).
Zudem wurde die Penetration von Enrofloxacin ins Kammerwasser untersucht. Dazu wurden 24 Hunde mit 7,5 mg/kg Körpergewicht subkutan behandelt und im Anschluss zu verschiedenen Zeitpunkten Kammerwasser entnommen. Die Konzentration von 0,22 µg/ml wurde im Kammerwasser nicht überschritten (KRASTEV et al., 2011).
3.3.1.2 Ciprofloxacin
Ein vor allem in der Humanmedizin wichtiges Fluorchinolonderivat ist Ciprofloxacin (Wise et al., 1983, Andrews et al. 1983). Da Ciprofloxacin der Hauptmetabolit von Enrofloxacin ist, welches mehrfach in Verbindung mit retinaler Toxizität beschrieben wurde (siehe 3.3.1.1) und in einer Studie nach Gabe von Enrofloxacin relevante Ciprofloxacinkonzentrationen im Blut bei Hunden nachgewiesen werden konnten, spielt dieser Stoff möglicher Weise auch eine Rolle bei Effekten, die nach Enrofloxacingaben beobachtet wurden (Küng et al., 1993).
In der Literatur wurden Behandlungsdosierungen von 5-15 mg/kg Körpergewicht alle 12 h oral bei Katzen und Hunden empfohlen (Plumb 2008, Emmerich, 2010). Eine Behandlung von 6 Katzen mit 10 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden erbrachte maximale Plasmakonzentrationen von Ciprofloxacin von durchschnittlich 1,04 µm/ml (Albarellos et al., 2004). Wurden Hunden drei Einzeldosen von 10 mg/kg oder 20 mg/kg Körpergewicht oral verabreicht, konnten höhere Plasmaspiegel gemessen werden. Bei der innerhalb der Dosisempfehlung liegenden Menge von 10 mg/kg
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Körpergewicht, wurden im Plasma 1,55 µg/ml nachgewiesen. Bei einer Überdosierung von 20 mg/kg Körpergewicht wurden Plasmaspiegel von maximal 3,08 µg/ml gemessen (Abadia et al., 1995).
In anderen Studien wurden Hunde mit Enrofloxacin behandelt und die durch Metabolismus entstandene Ciprofloxacinplasmakonzentration gemessen. In einer Cross-over-Studie wurden 4 Hunde mit 5 mg/kg Körpergewicht Enrofloxacin per os und intravenös behandelt. Es konnten bis zu 0,2 µg/ml Ciprofloxacin im Plasma der Hunde nachwiesen werden (Küng et al., 1993). Frazier et al. (2000) behandelten die Hunde ausschließlich einmal täglich oral, aber mit der gleichen Konzentration über 5 Tage und konnten im Plasma maximal 0,36 µg/ml nach 97,5 und 98 Stunden nachweisen.
Bei 40 Menschen wurde 17,5 und 5,5 Stunden vor ihrer Kataraktoperation Ciprofloxacin verabreicht. Während der Operation wurden dann Proben aus Kammerwasser, Glaskörper und subretinaler Flüssigkeit untersucht. In der subretinalen Flüssigkeit konnten im Durchschnitt 0,71 µg/ml gemessen werden (Lesk et al., 1993).
3.3.1.3 Danofloxacin
Danofloxacin könnte eine mögliche Alternative in der Therapie mit Fluorchinolonen bei Hund und Katze zu Enrofloxacin darstellen, da für Danofloxacin keine Hinweise zu unerwünschten Arzneimittelwirkungen in Verbindung mit gestörtem Sehvermögen vorliegen. Daher sollte es in der vorliegenden Arbeit vergleichend betrachtet werden.
Aktuell sind in Deutschland zwei Präparate mit Danofloxacin für Tiere zugelassen, jedoch nur für Rinder und Schweine (VETIDATA, 2017). Daher gibt es auch keine spezifischen Dosierungsempfehlungen oder Plasmawerte für Hund und Katze.
Die maximalen Blutplasmakonzentrationen lagen in einer Studie mit 8 ruminierenden Kälbern, die zuvor 1,25 mg/kg Danofloxacin subkutan verabreicht bekamen bei 0,23 µg/ml (McKellar et al., 1999).
17 3.3.1.4 Marbofloxacin
Um weitere Alternativen in der Therapie von Hunden und Katzen mit Fluorchinolonen zu vergleichen, wurde Marbofloxacin in der vorliegenden Arbeit untersucht.
In der Veterinärmedizin ist Marbofloxacin ein weit verbreitetes Antibiotikum. Es sind aktuell 44 Produkte im deutschen Handel (VETIDATA, 2017).
Die Dosierungsempfehlungen reichen von 2 mg/kg Körpergewicht per os (Potschka et al., 2014) bis zu einer Empfehlung von maximal 5,5 mg/kg Körpergewicht per os (Plumb, 2005) für Hunde und Katzen.
Zu Marbofloxacin gibt es lediglich einen Fallbericht, in dem diskutiert wurde, ob bei einem Hund eine versehentliche, massive Überdosierung von 1050 mg Marbofloxacin über drei Tage zu der aktuen Blinheit führte (Akin et al., 2016). In anderen Studien wird sogar hervorgehoben, dass Marbofloxacin die unerwünschten Arzneimittelwirkungen anderer Fluorchinolone nicht teilt (Ishak et al., 2008).
In der bereits mehrfach zitierten Studie von Frazier et al. (2000), die die Pharmakokinetik verschiedener Fluorchinolone beim Hund vergleicht, wurden 12 Hunden an 5 aufeinander folgenden Tagen 2,75 mg/kg Körpergewicht oral verabreicht.
Das führte zu einem maximalen Plasmaspiegel von 2,29 µg/ml. In einer anderen Studie wurden Katzen täglich mit 2 mg/kg Marbofloxacin behandelt. Die erste Gabe gefolgte intravenös, alle weiteren per os. Als maximale Plasmaspiegel im stady-state wurden 1,97 µg/ml gemessen (Albarellos et al., 2005).
Um die maximalen Konzentrationen von Marbofloxacin im Kammerwasser zu untersuchen, haben Regnier et al. (2003) 63 Hunden intravenös mit 2 mg/kg Körpergewicht behandelt und bei den darauffolgenden Kataraktoperationen Kammerwasserproben entnommen. Die Zeit zwischen der Applikation des Arzneistoffes und der jeweiligen Operation wurde variabel gewählt. Maximale Konzentrationen von Marbofloxacin im Kammerwasser waren 3,5 Stunden nach intravenöser Verabreichung nachweisbar und betrugen im Durchschnitt 0,41 µg/ml Kammerwasser (Regnier et al., 2003).
18 3.3.2 Spinosad
Das Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit berichtete von vermehrten Pharmakovigilanzfällen, vorrangig in den USA, bezüglich gestörtem Sehvermögen im Anschluss an die orale Anwendung des Arzneistoffes Spinosad.
Veränderungen am Auge machten 2,45 % der unerwünschten Arzneimittelwirkungen dieses Stoffes aus, auch wenn hier nicht ausschließlich das gestörte Sehvermögen berücksichtigt wurde (DTBl_05_2016_Fokus Antiparasitika.pdf, 2016; Dunn et al., 2011). Da nachgewiesen werden konnte, dass Spinosad ein potenter Inhibitor des caninen P-Glykoproteins ist (Schrickx, 2014), ist bestätigt, dass Spinosad die Funktion der BRB direkt beeinflusst. An der Blut-Hirn-Schranke, welche der BRB sehr ähnlich ist, wurden bereits Effekte bei einer gemeinsamen Verabreichung mit Ivermectin gezeigt (Dunn et al., 2011). Weitere Effekte bei gemeinsamer Medikation mit Substraten von P-Glykoprotein können daher erwartet werden.
Spinosad ist ein Wirkstoff, der den Antiparasitika zuzuordnen ist. Nach einmaliger oraler Gabe ist die Wirkung von Spinosad für einen Monat effektiv (Snyder et al., 2007).
Zudem wird innerhalb von vier Stunden nach der Gabe des Arzneistoffes die gesamte Flohpopulation zu 100 % abgetötet (Blagburn et al., 2010). Diese schnelle Wirkung hält auch über vier Wochen bei erneutem Flohbefall an (Franc and Bouhsira, 2009).
Auch Flohlarven und Eier werden über 30 Tage sicher abgetötet (Blagburn et al., 2010). Die beiden Hauptkomponenten von Spinosad sind die von Saccharopolyspora spinosa durch Fermentation produzierten Spinosyne A und D, die etwa in einem Verhältnis von 5:1 vorliegen (Kirst et al., 2002). Spinosyne binden primär an nicotinerge Acetylcholinrezeptoren (nAChRs), die sich von anderen Angriffspunkten von Insektiziden unterscheiden und somit die Neurotransmission stören.
Sekundäreffekte gibt es außerdem bei GABA-vermittelter Neurotransmission, was die tödliche Wirkung der Spinosyne auf Flöhe noch potenziert (Sparks et al., 2001). In einer Studie an Collies mit defektem P-Glykoprotein konnten in Kombination mit Milbemycinoxim keinerlei Anzeichen von Avermectin-Milbemycin-Toxikosen beobachtet werden (Sherman et al., 2010). Diese massiven Vorteile gegenüber anderen Antiparasitika führten zu einem häufigen Einsatz in der Kleintiermedizin.
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Spinosad ist in Deutschland aktuell nur noch als Monopräparat in acht verschiedenen Dosierungen für Hund und Katze zugelassen. Ein weiteres Medikament, ein Kombinationspräparat mit Milbemycinoxim für Hunde in 5 verschiedenen Dosierungen ist aktuell zwar zugelassen, aber nicht im deutschen Handel erhältlich (VETIDATA, 2017).
Als Dosierungsempfehlung werden 45-70 mg/kg Körpergewicht für Hunde und 50-75 mg/kg Körpergewicht für Katzen zur oralen Verabreichung alle 4 Wochen empfohlen (Richter und Ungemach, 2014).
Um die Effekte an der BRB beurteilen zu können und mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit zu vergleichen, sind die Plasmaspiegel der Arzneistoffe relevant.
In einer Studie mit 24 Hunden wurde die Pharmakokinetik von Spinosad und der Einfluss von einer kombinierten oralen Verabreichung von Spinosad und Milbemycinoxim untersucht. Dazu wurden jeweils vier weiblichen und vier männlichen Hunden zwischen 62 und 78 mg/kg Körpergewicht Spinosad dreimal, im Abstand von einem Monat, verabreicht. Die maximalen Plasmakonzentrationen von Spinosyn A lagen bei den weiblichen Hunden bei 7,0 µg/ml und bei den männlichen bei 4,7 µg/ml.
Außerdem wurden drei weibliche und fünf männliche Hunde zusätzlich mit 0,5-1 mg/kg Körpergewicht Milbemycinoxim oral behandelt. Die maximalen Plasmakonzentrationen lagen im Durchschnitt bei den weiblichen Tieren bei 7,3 µg/ml und bei den Männlichen bei 4,5 µg/ml Spynosyn A (Holmstrom et al., 2012).
3.3.3 Milbemycinoxim
Da zu Beginn der eigenen Untersuchungen ein Kombinationspräparat aus Spinosad und Milbemycinoxim noch im deutschen Handel verfügbar war (siehe 3.3.2) und einige Studien zeigten, dass beide Stoffe interagieren (Holmstrom et al., 2012; Lespine et al., 2009), wurde Milbemycinoxim ein Bestandteil der Untersuchungen.
Milbemycinoxim gehört der Familie der Milbemycine an, die der Gruppe der Makrolide angehört. Es wird mittels Fermentation durch Streptomyces hygroscopicus subspecies aureolacrimosus produziert (Takiguchi et al., 1980). Bereits 1992 galt Milbemycinoxim als sehr effektives Mittel zur Herzwurmprophylaxe bei Hund und Katze (Lee and Terada, 1992).
20
Heute sind 24 verschiedene Präparate in Deutschland für Hunde und Katzen im Handel. Außerdem gibt es zugelassene, aber nicht im Handel verfügbare Kombinationsprodukte mit Spinosad oder Praziquantel (VETIDATA, 2017).
Die empfohlene Dosierung für Hunde liegt bei 0,5 mg/kg Körpergewicht und für Katzen bei 2 mg/kg Körpergewicht. Diese Dosis ist monatlich oral zu verabreichen (Richter und Ungemach, 2014).
Milbemycinoxim hat eine schwache Affinität zu P-Glykoprotein (Lespine et al., 2009).
Der ABCB1-1delta Genotyp, der eine eingeschränkte Funktion von P-Glykoprotein zur Folge hat, ist bei Hunden assoziiert mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen nach Milbemycinoximbehandlung (Barbet et al., 2009; Wj et al., 1991). Eine moderate Wirkung an der BRB steht zur Diskussion.
In der beschriebenen Studie von Holstrom et al. (2012) wurde auch die Pharmakokinetik von Milbemycinoxim und der Einfluss einer Komedikamentation mit Spinosad untersucht. Dazu wurden jeweils vier weibliche und vier männliche Hunde mit jeweils 0,5- 1 mg/kg Körpergewicht mit Milbemycinoxim dreimal im Abstand von vier Wochen oral behandelt. Die maximalen Plasmakonzentrationen lagen bei weiblichen Tieren bei 0,43 µg/ml und bei männlichen Tieren bei 0,28 µg/ml im Durchschnitt. Wurde den Tieren zusätzlich eine Dosis von 60-90 mg/kg Körpergewicht Spinosad gegeben, so lagen die maximalen Plasmakonzentrationen von Milbemycinoxim im Durchschnitt bei 0,72 µg/ml bei den weiblichen Tieren und bei 0,4 µg/ml bei den männlichen Tieren (Holmstrom et al., 2012).
3.3.4 Ivermectin
Ivermectin ist sowohl Substrat als auch Inhibitor von P-Glykoprotein (Didier and Loor, 1996). Damit ist es für einen Vergleich mit Spinosad sehr gut geeignet. Ist dieser Transporter aufgrund einer Deletion im ABCB1 Gen funktionell eingeschränkt, penetriert Ivermectin die Blut-Hirn-Schranke und löst schwere unerwünschte Arzneimittelwirkungen aus (Mealey et al., 2001; PULLIAM, 1985). Die Komedikation von Spinosad und Ivermectin ruft ähnliche Symptome auch bei Tieren ohne Mutation im ABCB1-Gen hervor (Dunn et al., 2011). Ähnliches kann an der BRB erwartet werden. Ein Fallbericht über zwei Hunde und ein weiterer über eine Hündin
21
unterstrichen diese Hypothese (Epstein and Hollingsworth, 2013; Kenny et al., 2008).
Auch bei anderen Tierarten gibt es Fallberichte zu plötzlicher Blindheit nach Ivermectinanwendung (Plummer et al., 2006; Swor et al., 2009).
Ivermectin ist ein makrozyklisches Lacton, welches von Streptomyces avermitilis produziert wird (Campbell et al., 1983). Es ist eins der am meisten genutzten und am weitesten verbreiteten Breitspektumantiparasitika gegen Endo- und Ektoparasiten, vor allem Nematoden und Arthropoden (Geary, 2005; Omura, 2008).
In Deutschland sind für die Veterinärmedizin aktuell 35 Produkte, vor allem für Rinder, Pferde und Schweine, zugelassen. Für Hunde und Katzen sind keine systemisch zu verabreichenden Medikamente zugelassen. Im Kleintierbereich ist lediglich ein Ohrgel für Katzen im Handel verfügbar (VETIDATA, 2017).
Die Dosierungsempfehlungen für Hunde liegt bei 0,2 mg/kg Körpergewicht per os einmalig bei Befall mit Eucoleus boehmi oder bei parasitären Lungenerkrankungen (Plumb, 2005). Bei Katzen werden entweder 0,4 mg/kg Körpergewicht zu Behandlung von Aelurostrongylus abstrusus, oder 24 µg/kg Körpergewicht alle vier Wochen zur Herzwurmprophylaxe empfohlen (Plumb, 2005).
Um die Pharmakokinetik von Ivermectin bei Hunden zu untersuchen, wurden in einer Studie jeweils fünf Hündinnen 200 µg/kg Körpergewicht entweder oral oder subkutan verabreicht und die Blutplasmaspiegel ab einer Stunde nach der Behandlung untersucht. Der maximale Plasmaspiegel nach oraler Gabe betrug im Durchschnitt 116,8 ng/ml, wohingegen er nach subkutaner Gabe im Durchschnitt 66,8 ng/ml betrug (Gokbulut et al., 2006). Nach einmaliger subsubkutaner Gabe von 200 µg/kg Körpergewicht an Katzen, wurden maximale durchschnittliche Plasmawerte von 16,75 ng/ml gemessen (Chittrakarn et al., 2009).
3.3.5 Ciclosporin
Ciclosporin ist ein weiterer Inhibitor von P-Glykoprotein und kann für erhöhte Konzentrationen von Substraten des P-Glykoproteins im Gehirn sorgen (Schmitt et al., 2006).
Ciclosporin wurde zuerst als Immunsuppressivum bei der Transplantation von Organen eingesetzt (Cohen et al., 1984; Sl et al., 1983). Aber auch bei Psoriasis (Ellis
22
et al., 1986) und atopischer Dermatitis bei Hunden (Olivry et al., 2002) konnten Erfolge erzielt werden.
Auf dem deutschen, veterinärmedizinischen Markt sind aktuell acht Präparate mit dem aktiven Bestandteil Ciclosporin für Hunde und Katzen zugelassen (VETIDATA, 2017).
Die Dosierungsempfehlungen liegen bei 5 mg/kg Körpergewicht beim Hund per os bei atopischer Dermatitis und bis 10 mg/kg Körpergewicht bei schweren Autoimmunerkrankungen. Außerdem wird zur Behandlung am Auge bei Keratoconjunctivitis sicca auch eine Augensalbe mit Ciclosporin empfohlen (Hamann et al., 2014). Bei Katzen gibt es eine Richtdosis von 7 mg/kg Körpergewicht bei chronischer allergischer Dermatitis (Hamann et al., 2014) und Empfehlungen bis zu 10 mg/kg Körpergewicht per os zu verabreichen gegen felines Asthma (Plumb, 2005).
Da Ciclosporin effektiv zur Behandlung von Uveitis intravitreal appliziert wurde (Jaffe et al., 1998; Nussenblatt et al., 1991) ist es Ziel dieser Arbeit, die Wirkung auf Retina und retinales Pigmentepithel unter dem Einfluss von UV-Licht zu untersuchen.
3.3.6 Betamethason
Es sind nur sehr wenige Hinweise auf unerwünschte Arzneimittelwirkungen am Auge dokumentiert. Bei Schafen konnte bei wiederholter Behandlung mit Betamethason während der Trächtigkeit eine verspätete Retinareifung der Feten beobachtet werden (Quinlivan et al., 2000). Außerdem konnten bei Kaninchen innerhalb von 24 Stunden nach intravitrealer Applikation massive Schäden an Retina und Linse nachgewiesen werden (Hida et al., 1986).
Betamethason wird zur Behandlung verschiedener Augenerkrankungen genutzt und wie im Beispiel feliner Uveitis sogar direkt ins Auge appliziert wird (Okabe et al., 2003;
Powell and Lappin, 2001; Sakai et al., 2006).
Im deutschen, veterinärmedizinischem Handel sind aktuell vier Präparate zu erhalten.
Drei dieser Präparate sind zur topischen Anwendung am Hund, eins als Injektionslösung zusätzlich auch für Pferde zugelassen (VETIDATA, 2017).
Die Dosierungsempfehlungen für Hund und Katze liegen bei 0,7-1 mg/kg Körpergewicht, alle 24-48 Stunden. Die einzelnen Dosen können oral, subkutan, intravenös oder auch intramuskulär verabreicht werden (Emmerich, 2010).
23
Unerwünschte oculäre Arzneimittelwirkungen von topisch angewendeten Glukokortikoiden umfassen auch Mydriasis und verschwommene Sicht (Becker, 1964).
Betamethason wird teilweise mit empfohlenen Konzentrationen von 0,75 mg/Auge bei der Katze direkt intravitreal appliziert (Powell and Lappin, 2001) oder durch Implantate direkt freigesetzt, hier wurden Konzentrationen von 1 µg/g Retina-Choreoid gemessen (Okabe et al., 2003).
3.3.7 Ketoprofen
Viele Studien wurden über die phototoxischen Effekte von Ketoprofen bereits durchgeführt (Bagheri et al., 2000; Boscá et al., 1995; Liu et al., 2007; Marguery et al., 1998). Da an der Retina Ketoprofen und UV-Licht potentiell interagieren können, wird dieser Arzneistoff im Rahmen dieser Arbeit als erste Positivkontrolle untersucht.
Außerdem inhibiert Ketoprofen an der Blut-Hirn-Schranke von Ratten den Glut1- Transporter bei der Aufnahme von Glukose und ist - gekoppelt an Glukose - in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden (Gynther et al., 2009), dies könnte analog für die BRB gelten.
Ketoprofen gehört in die Gruppe der schwachen Analgetika. Es inhibiert sowohl Cyclooxygenase 2, als auch Cyclooxygenase 1 (Landoni et al., 1995; Landoni and Lees, 1996).
Aktuell werden auf dem deutschen Markt in der Veterinärmedizin 18 Produkte mit Ketoprofen vertrieben, die für Schweine, Pferde und Rinder zugelassen sind. Für Kleintiere sind im Handel keine Produkte verfügbar (VETIDATA, 2017).
Die Dosierungsempfehlungen umfassen 1 mg/kg Körpergewicht per os, und 1-2 mg/kg Körpergewicht intravenös, intramuskulär oder subkutan bei Hunden und Katzen, insbesondere bei postoperativen Schmerzen (Plumb, 2005).
Nach oraler Gabe von 1 mg/kg Körpergewicht Ketoprofen konnten bei Hunden maximale Plamaspiegel von 2 µg/ml nachgewiesen werden (Montoya et al., 2004).
24 3.3.8 Chlorpromazin
Die unerwünschten Wirkungen von Chlorpromazin am Auge, besonders bei längerer und hoch dosierter Behandlung mit Chlorpromazin, sind auch bei Hunden gut bekannt.
Es handelt sich zumeist um Schäden der Cornea, die oft reversibel sind, und Schäden der Linse (Lal et al., 1993; Legros et al., 1971; Tousimis and Barron, 1970).
Chlorpromazin wirkt phototoxisch (Hull et al., 1982; Kochevar, 1981; Ljunggren and Möller, 1977). An bovinen Zellkulturen von retinalem Pigmentepithel konnten phototoxische Effekte von Chlorpromazin bereits nachgewiesen werden (Persad et al., 1988). Daher dient Chlorpromazin in der vorliegenden Arbeit unter anderem als Positivkontrolle bei der Untersuchung des Einflusses des UV-Lichts auf die unterschiedlichen Stoffe. Auch in der OECD Guideline für die Untersuchung von Chemikalien auf Phototoxizität wird Chlorpromazin als Positivkontrolle empfohlen (Test Guideline 432: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test - oecdtg432-508.pdf, 2004).
Chlorpromazin wurde ab 1952 als Neuroleptikum in der Humanmedizin verwendet (Charpentier et al., 1952, Laborit et al., 1952). In der Veterinärmedizin wurde es seit 1954 als Antiemetikum für Hunde erfolgreich eingesetzt, während es bei Katzen keine zufriedenstellende Wirkung zeigte (Brand et al., 1954).
In der Veterinärmedizin in Deutschland ist aktuell kein Arzneimittel verfügbar, dessen aktiver Bestandteil Chlorpromazin ist. Chlorpromazin ist wegen seiner Phototoxizität beim Nutztier verboten (VETIDATA, 2017).
3.4 UV- Schädigung von Zellen
In der vorliegenden Arbeit wurde neben der direkten zytotoxischen Wirkung auch die Phototoxizität der Arzneistoffe untersucht. In Säugetierzellen lösen UV-induzierte Mutationen DNA-Läsionen aus, die zu Reparatur oder zum Zelltod führen können (Tornaletti and Pfeifer, 1996).
Phototoxizität ist definiert als toxische Reaktion einer Substanz, die entweder durch UV-Licht ausgelöst oder verstärkt (niedrigere Konzentrationen wirken toxisch) wird (Test Guideline 432: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test - oecdtg432-508.pdf, 2004).
Das gemeinsame Merkmal der phototoxischen Substanzen ist ihre Fähigkeit, Lichtenergie im Sonnenlichtbereich zu absorbieren. Nach dem ersten Gesetz der
25
Photochemie (Grotthus-Draper Gesetz), erfordert die Photoreaktion eine ausreichende Absorption von Lichtquanten, die die Stoffe in einen angeregten Zustand versetzen können, in dem sie dann phototoxisch wirken (Test Guideline 432: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test - oecdtg432-508.pdf, 2004).
Die phototoxische Wirkung von Substanzen kann außerdem durch die vermehrte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies ausgelöst werden. Diese schädigen dann die DNA der Zelle. Diese Form der Phototoxizität wurde für Fluorchinolone nachgewiesen (Umezawa et al., 1997).
Eine weitere Form der Phototoxizität ist die Entstehung von sogenannten Photoprodukten durch die UV-Bestrahlung. Die zu testende Substanz wird dabei zu einer oder mehreren anderen Substanzen, den Photoprodukten, umgebaut. Diese können dann einen zytotoxischen Effekt bei geringeren Konzentrationen haben. Auch diese Form der Phototoxizität ist für einige Fluorchinolone bekannt (Burhenne et al., 1997).
In der vorliegenden Arbeit wurden die zytotoxisch und phototoxisch wirkenden Grenzkonzentrationen der Arzneistoffe bestimmt. Der Einfluss der Arzneistoffe auf die Transporter des retinalen Pigmentepithels kann zu höheren Arzneistoffkonzentrationen an der Retina führen, welche dann möglicher Weise oberhalb der ermittelten zytotoxischen Grenzkonzentrationen liegen könnten. Daher sollte auch dieser Einfluss untersucht werden.
4 Materialien und Methoden
4.1 Materialien und Geräte
4.1.1 Verwendete Materialien und Geräte
Ag/AgCl-Bezugselektroden Mettler Toledo Prozessanalytik GmbH, Gießen
Multi-Well-Kulturplatten (6-,48-, 96-Well) Greiner, Frickenhausen Costar Stripetten 15/25ml Corning, NY
Einmalkanülen Braun Melsungen AG, Melsungen
26
Feinwaage Sartorius 2002 MP1, Sartorius,
Göttingen
Falcon (15ml, 50ml) Greiner, Frickenhausen
Filtergewebe aus Polyamid, 210µm A.Hartenstein Laborbedarf für die Forschung, Würzburg
Glasgefäße mit Schraubdeckel VWR International GmbH, Darmstadt
Glasvial, 1,1ml Macherey-Nagel GmbH & Co. KG,
Düren
Kryogefäße Greiner, Frickenhausen
Kühlzentrifuge Centrifuge 5804R, Eppendorf,
Hamburg
Kulturflaschen (75cm2) Greiner, Frickenhausen
Magnetrührer Magnetomix, Colora, Lorch
Mikroskop Axiovert 25, Zeiss, Jena
Neubauer-Zählkammer Neubauer, VWR, Mannheim
NOBAGLOVE®-Latex NOBA Verbandsmittel Danz GmbH &
Untersuchungshandschuh Co KG, Wetter
NOBAGLOVE®-Nitril NOBA Verbandsmittel Danz GmbH &
Untersuchungshandschuh Co KG, Wetter
Parafilm „M“ American Can Company, Baltimore
USA
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Säule CC 250/4 NUCLEODUR Macherey-Nagel GmbH & Co KG,
100-5 C18ec, 25 cm Düren
Säule LiChroCART® 250-4 Merck, Darmstadt LiChrospher®100 RP-18 (5 μm)
Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
Stripette Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
27
pH-Meter PH 320 WTW Wissenschaftlich- Technische
Werkstätten GmbH, Weilheim
Photometer Microplatereader MRX, Dynatech,
Denkendorf Pipettierhilfe Accu-jet®pro Brand, Wertheim
Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
Spritzen BD Discardit II, Fraga, Spanien
Sterilbank Heraeus Lamin Air, Jürgens, Bremen
Sterilbank MSC-Advantages Thermo Scientific, Waltham, USA
Sterilfilter Minisart, Sartorius, Göttingen
Strom-Spannungsgenerator Dipl.-Ing. Mussler, Aachen
Ussigkammern und –apparatur Eigenbau Physiologisches Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover, Hannover
Wasserbad WNB, Memmert, Schwabach
Akkupipettierhilfe accu-jet®pro Brand GmbH + Co. KG, Wertheim
Autoklav Schlumbohm Medizin-Labor-
Technologie GmbH, Hamburg Beckman Coulter, System Gold Beckmann, München
508 Autosampler 126 Solvent Module
Detektor Shimadzu RF-535, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan Fluorescence HPLC Monitor
Feinwaage ALS I20-4 Kern & Sohn GmbH, Balingen
Säulenofen SpH 99 Spark Holland, Emmen, Niederlande UV Detektor System Gold Beckmann, München
166 Detector
Voltage/Current Clamps Dipl.-Ing. Mussler, Aachen
28 4.1.2 Chemikalien und Substanzen
Aceton Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
Acetonitril UHPLC AppliChem, Darmstadt
Betamethason Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
CellTiter 96 AQueous One Solution Promega, Mannheim Cell Proliferation Assay Kit (MTS-Test)
Ciclosporin Arzneimittelwerk Dresden, Dresden
Ciprofloxacin Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
Citronensäuremonohydrat Merck, Darmstadt
Danofloxacin Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
Dinatriumhydrogenphostphatheptahydrat Sigma- Aldrich Chemie GmbH, München
DMEM D5523 incomplete Sigma-Aldrich Chemie GmbH München
Dimethylsulfoxid Merck, Darmstadt
EDTA Biochrome, Berlin
Enrofloxacin Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
Entellan Merck, Darmstadt
Fetales Kälberserum superior Biochrome, Berlin
Gentamycin sulfat AppliChem GmbH, Darmstadt
Glucose Merck, Darmstadt
Ivermectin Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
Kaliumdihydrogenphosphat Sigma- Aldrich Chemie GmbH, München
Kaliumchlorid Merck, Darmstadt
Kalziumchlorid dihydrat Merck, Darmstadt
L- Glutamin Thermo Fisher Scientific Inc,
Darmstadt
29
Magnesiumchlorid hexahydrat Merck, Darmstadt
Mannit Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
Marbofloxacin Vetoquinol, Ravensburg
MEM non- essential amino acids (11140-019) Thermo Fisher Scientific Inc, Darmstadt
MEM vitamins (11120-029) Thermo Fisher Scientific Inc, Darmstadt
Milbemycinoxim Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
Natriumbicarbonat Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
Natriumhydrogencarbonat Sigma- Aldrich Chemie GmbH, München
Natriumhydrogenphosphat dihydrat Merck, Darmstadt Natriumhydrogenphosphat hydrat Merck, Darmstadt
Natriumchlorit Merck, Darmstadt
Penicillin-Streptomycin Biochrome, Berlin
Salzsäure Merck, Darmstadt
Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat VWR International GmbH, Darmstadt
Spinosad Sigma- Aldrich Chemie GmbH,
München
Stickstoff, flüssig Wesphalen AG, Münster
Tris-Natrium-Citrat-Dihydrat Merck, Darmstadt
Trypan-Blau Sigma, Steinheim
Trypsin Biochrome, Berlin
30 4.1.3 Puffer und weitere Lösungen
4.1.3.1 Puffermedium für Transportversuche
Bei dem im weiteren Verlauf als „Ussingpuffer“ bezeichnetem Puffer für die Transportversuche handelte es sich um eine Krebs-Henseleit-Lösung mit Glucose.
Natriumchlorid 6,64 g/l
Kaliumchlorid 0,40 g/l
Kalziumchlorid dihydrat 0,18 g/l Magnesiumchlorid hexahydrat 2,44 g/l
Salzsäure 0,2 mM
Natriumhydrogenphosphat hydrat 0,08 g/l Natriumhydrogenphosphat dihydrat 0,43 g/l Natriumhydrogencarbonat 1,76 g/l
Glukose 1,80 g/l
Mannit 3,60 g/l
Unbegast und kalt hat der Puffer einen pH-Wert von 7,7. Im Versuch hat er bei einer Temperatur von 37°C und mit Carbogen begast einen pH-Wert von 7,4.
4.1.3.2 Verwendete Substrate für Transportversuche
Da einige der beschriebenen Stoffe für ihre Wirkung auf spezifische Transporter an der BRB bekannt sind, soll mit Hilfe der Ussingkammer deren Wirkung auf den Transport von Ciprofloxacin durch die BRB untersucht werden. Im Fokus stehen hier vor allem Spinosad und Ivermectin, potente Inhibitoren von P-Glykoprotein (Didier and Loor, 1996; Schrickx, 2014), und Milbemycinoxim, welches wie beschrieben in Kombination mit Spinosad verabreicht wird. Als Substrat für P-Glykoprotein wird Ciprofloxacin in einer Konzentration von 5 µmol/ml genutzt (Bankstahl et al., 2012) um die Einflüsse darzustellen.
Die relevanten Konzentrationen von 20 µmol/ml Spinosad, 5 µmol/ml Milbemycinoxim und 5 µmol/ml Ivermectin wurden dem Ussigpuffer auf der „Blutseite“ eingestellt (siehe 4.2.1).
31 4.1.3.3 Zellkulturmedien
4.1.3.3.1 Wachstumsmedium für R28 (DMEM+) 420 ml DMEM D5523 incomplete
15 ml Natriumbicarbonat (7,5 % Stammlösung) 50 ml Fetales Kälberserum
5 ml MEM non-essential amino acids 5 ml MEM vitamin
5 ml L-Glutamin
0,625 ml Gentamicin (Stammlösung 80 mg/ml)
4.1.3.3.2 Wachstumsmedium für ARPE-19 500 ml DMEM: F12
50 ml Fetales Kälberserum 5 ml Penicilin, Streptomycin
4.1.3.3.3 CMF-EDTA 1. CMF
8,77 g Natriumchlorid
2,28 g Dinatriumhydrogenphosphatheptahydrat 0,20 g Kaliumchlorid
0,20 g Kaliumdihydrogenphosphat 2,18 g Nahydrogencarbonat 900 ml Bidest
pH- Wert 7,4
2. CMF-EDTA für 100ml CMF
1 ml steriles 2 %iges EDTA 1 ml sterile Glucose
125 µl Gentamicin (40 mg/ml) 3. Sterilfiltration
32 4.1.3.3.4 PBS
Natriumchlorid 8,00 g/l
Kaliumchlorid 0,20 g/l
Dinatriumphosphat dihydrat 1,44 g/l Kaliumdihydrogenphosphat 0,20 g/l
Der pH-Wert wurde im Anschluss mittels Natriumhydroxid und Salzsäure auf 7,4 eingestellt.
4.1.3.3.5 Stammlösungen für die Zellkultur
Angesetzt wurden die Stammlösungen und Verdünnungsreihen der Verwendung entsprechen mit den jeweiligen Wachstumsmedien der Zelllinien ARPE-19 und R28.
Für einige Stoffe waren Vorlösungen notwendig, diese erfolgen mit den in Tabelle 1 genannten Lösungsmitteln. Die Endkonzentration der Lösungsmittel in der Stammlösung ist ebenfalls vermerkt. Alle für die Zellkultur angewendeten Lösungen wurden nach Ablauf von maximal einer Woche verworfen.
Arzneistoff Lösungsmittel (Endkonzentration)
Konzentrationsbereich (µmol/ml)
Ciprofloxacin 0,1 N HCl (7 %) 2-2000 µmol
Danofloxacin - 2-2000 µmol
Enrofloxacin - 2-2000 µmol
Marbofloxacin - 2-2000 µmol
Betamethason - 2-2000 µmol
Chlorpromazin Bidest (0,25 %) 2-500 µmol/ml
Ciclosporin DMSO (3 %) 2-200 µmol
Ketoprofen - 2-2000 µmol
Ivermectin DMSO (3 %) 2-200 µmol/ml
Milbemycinoxim DMSO (3 %) 2-200 µmol/ml
Spinosad Aceton (1 %) 2-500 µmol/ml
Tabelle 1 Stammlösungen für die Zellkultur mit Konzentrationen der verwendeten Lösungsmittel
33
4.1.3.3.6 Herstellung der Verdünnungsreihen für die Zellkultur
Aus den unter 4.1.3.3.5 beschriebenen Stammlösungen wurden für die Versuche in der Zellkultur Verdünnungsreihen angefertigt. Die Stammlösung wurde jeweils auf Konzentrationsstufen von 500 µmol/ml, 200 µmol/ml, 50 µmol/ml, 20 µmol/ml, 5 µmol/ml und 2 µmol/ml verdünnt.
4.1.3.3.7 Zelllinen
R28 Retinal Cell Line Kerafast, Boston
ARPE-19 ATTC, Middlesex, UK
4.1.3.3.8 UV- Lampe
In der vorliegenden Arbeit wurde zur UV-Bestrahlung eine Quecksilberdampflampe SOL 500, Seriennummer 9904-0105 (Fa. Dr. Hönle AG, Gräfelfing), die ein Sonnenlichtspektrum simuliert, genutzt. Ihre Intensität, Intensitätsverteilung und die Intensitätsveränderungen im direkten Anschluss an das Einschalten wurden von Dr.
Matthias Lüpke aus dem Fachgebiet Allgemeine Radiologie und Medizinische Physik, der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, untersucht.
Die Messungen erfolgten 10 cm unterhalb des Glasfilters der UV-Lampe, wo die Haltevorrichtung für die Multiwellplatten aus der Zellkultur angebracht waren, auf einer Fläche von etwa 12 x 12 cm.
Die Messungen ergaben, dass die Lampe nach dem Einschalten eine Vorlaufzeit von 5 min benötigt. Für die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurde eine Vorlaufzeit von 20 min eingehalten.
Die Lichtintensität ist im UVA-Bereich mit 8,46 mW/cm² fast achtzigmal größer als im UVB-Bereich mit 0,11 mW/cm².
Die Intensitätsverteilung der gesamten durch die Lampe bestrahlten Fläche weist Abweichungen von bis zu 30 % auf.
4.1.3.1 HPLC- Eluent
Der Eluent setzte sich aus 85 % Citratpuffer und 15 % Acetronitril zusammen. Der Citratpuffer enthält pro Liter 1,8 g Citronensäuremonohydrat und 0,43 g Tri-Natrium Citrat Dihydrat und hat einen pH-Wert von 3,0. Der Eluent wurde vor der Benutzung für 30 min im Ultraschallbad entgast.
34 4.2 Methoden
4.2.1 Ussingkammer
4.2.1.1 Aufbau der Ussingkammer
Zur Ex-vivo-Untersuchung des Einflusses von Arzneistoffen (Inhibitoren) auf den Stofftransport am retinalen Pigmentepithel wurde die Ussingkammer nach Hans Hendriksen Ussing (Koefoed-Johnsen and Ussing, 1958) verwendet (siehe Abbildung 2). Die Ussingkammer besteht aus 2 Kammeranteilen aus Plexiglas, die nur durch das Präparat, in der vorliegenden Arbeit das retinale Pigmentepithel, getrennt sind. Die Kontaktfläche beträgt 0,3 cm2. Die Kammern sind horizontal zueinander angeordnet.
Jede Kammer hat etwa ein Volumen von 500 µl und ist mit einem Lift verbunden, der als Reservoir dient und für das Zirkulieren des Puffers sorgt. Das Puffervolumen wird durch Reservoir und Lift auf 10ml pro Seite aufgestockt. Der Lift besteht aus einem Glasdoppelmantel, welcher kontinuierlich von 37 °C warmem Wasser durchströmt wird, was die Temperatur des Puffers auf 36 °C erhält. Der Puffer wird durch das Gasliftsystem ständig in Bewegung gehalten. Dazu wird Carbogen® (95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid) kontinuierlich zugefügt und steigt im aus der Kammer führenden Puffer auf. Dabei transportiert es diesen Puffer mit nach oben und auf der anderen Seite fließt im Zufluss aus dem Reservoir Puffer nach. Der pH-Wert (7,4) und die jeweils zugesetzten Substrat- und Inhibitorkonzentrationen bleiben so dauerhaft gleich.
Der linke Anteil der Kammer plus zugehörigem Lift sollen in der vorliegenden Arbeit die Blutseite im Körper des Tieres darstellen, während der rechte Kammeranteil mit zugehörigem Lift die der Retina zugewandten Seite entsprechen. Der Flux eines Substrates von der Blut- auf die Retinaseite wurde untersucht.
35
Abbildung 2 Schematischer Aufbau der Ussingkammer mit eingespanntem retinalem Pigmentepithel
4.2.1.2 Präparation des retinalen Pigmentepithels aus Rinderaugen
Für die Untersuchungen in der Ussingkammer zum Stofftransport am retinalen Pigmentepithel wurde selbiges aus Augen von Schlachtrindern gewonnen. Die im Versuch verwendeten Augen wurden vom Schlachthof Hannover bezogen. Direkt nach dem Eintritt des Todes der Schlachtrinder wurden deren Augen entnommen und sofort in eiskalten Ussingpuffer überführt. Über die Schlachtrinder konnten keine weitergehenden Informationen erhoben werden. Der Transport in das Labor des Physiologischen Instituts der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover erfolgte innerhalb von maximal 15 min. Der gesamte Versuch fand im Labor des Physiologischen Instituts und mit der Unterstützung der Mitarbeiter vor Ort statt. Im Labor wurde der die Augen enthaltende Ussingpuffer sofort mit Carbogen® begast.
Die Augen wurden zuerst halbiert, wobei der vordere Augenanteil verworfen wurde und
36
der hintere nach Entfernung des Glaskörpers vorerst zurück in den Ussigpuffer gelegt wurde. Nachdem alle Augen soweit präpariert waren, wurde das retinale Pigmentepithel auf Eis durch das Lösen der Lamina suprachochoridea von der Sclera getrennt, wobei die Retina sich meist selbstständig ablöste, aber nicht aktiv entfernt wurde und daher teilweise erhalten blieb. Unpigmentierte Areale und der Teil des Tapetum lucidums wurden verworfen.
Da das retinale Pigmentepithel nicht allein präparierbar ist, aber das funktionelle Gewebe darstellt, wird die Gesamtheit aus retinalem Pigmentepithel, Choroidea und teilweise der Retina im Weiteren stets als retinales Pigmentepithel bezeichnet.
Die Präparation wurde auf Eis durchgeführt, wobei das Gewebe dauerhaft mit Ussingpuffer befeuchtet wurde. Geeignetes retinales Pigmentepithel, teilweise inklusive Retina, wurde in im Durchmesser etwa 0,8 cm große Teilstücke geschnitten und auf Netze aufgeschwemmt, die der Stabilisierung des Gewebes dienten. Bei dem Netz handelte es sich um ein Filtergewebe aus Polyamid mit einer Porengroße von 210 µm. Aus jedem Auge wurden durchschnittlich drei Präparate gewonnen, es wurden pro Versuchstag vier Rinderaugen präpariert. Das Gewebe wurde vor Versuchsbeginn visuell auf Löcher und Risse untersucht.
4.2.1.3 Versuchsablauf
Vor Versuchsbeginn wurde eine Kalibrierung des Systems durchgeführt. Dabei wurden Lösungsmittelwiderstand und Potentialdifferenz, ohne eingespanntes Gewebe ermittelt.
Um das retinale Pigmentepithel auf dem Netz in die Kammer zu spannen, wurde es mit selbigem auf Nadeln einer Kammerhälfte aufgespannt. Die zweite Kammerhälfte wurde daraufhin auf die erste aufgebracht, die Kammer in die Gesamtapparatur eingespannt und angeschlossen. So durchströmte der warme zirkulierende Ussingpuffer die Kammer und erwärmte das Gewebe wieder auf 36 °C. Die offene Fläche zwischen den Kammern, die lediglich durch das retinale Pigmentepithel und das Netz getrennt sind, beträgt 0,3 cm2. Die jeweiligen Kammern wurden nach dem Einspannen direkt mit der Voltage-clamp-Steuereinheit verbunden, welche der Messung der elektrischen Gewebeleitfähigkeit (Gt) und des Kurzschlussstromes (Isc)
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diente. Vonder Übergabe der Augen am Schlachthof bis zum Anschließen der ersten Kammer vergingen im Durchschnitt 30 min. Bis zum Anschluss der letzten Kammer dauerte es etwa weitere 20 min.
Sobald drei Kammern eingespannt waren, wurden die elektrochemischen Aufzeichnungen gestartet. Nach Aquibrilierung über 10 min wurde in Minute 10 der jeweils zu testende Inhibitor (Spinosad, Milbemycinoxim, Ivermectin) zugegeben. Um seine mögliche Wirkung an den Transportern des retinalen Pigmentepithels zu entfalten hatte er daraufhin 15 min Zeit. In Minute 25 wurde das Substrat Ciprofloxacin zugegeben und direkt im Anschluss eine erste Probe von 200 µl auf der Retinaseite genommen. Weitere Proben folgten nach 30 min, 60 min, 90 min und 120 min. Nach der Probe in Minute 120 wurden 20 µl 1,85x105 Bq (5 µCi) Tritium-Mannit auf der Blutseite zugegeben. Dieser Stoff wird ausschließlich parazellulär transportiert (Favus and Angeid-Backman, 1984) und dient als Markersubstanz für den parazellulären Flux und zur Detektion von Löchern oder Rissen im retinalen Pigmentepithel. Nach 5 min wurde auf der Blutseite die erste Probe genommen und nach 20 min erneut auf beiden Seiten. Die Radioaktivität wurde daraufhin im Liquid Scintillation Analyser gemessen.
Kammern mit Proben über 1000 DPM (>1 %) auf der Retinaseite wurden von der Auswertung ausgeschlossen.
Der Transport wurde anhand des Substrats quantifiziert, welches von der Bluseite der Kammer auf die Retinaseite übertrat. Zur Auswertung wurden die auf der Retinaseite entnommenen Proben mittels HPLC auf ihren Ciprofloxacingehalt untersucht. Die Werte der Kammern mit Inhibitorzusatz wurden dann ins Verhältnis zu den Werten der Kammern, die nur Ciprofloxacin enthielten, gesetzt.
4.2.2 Zellkultur 4.2.2.1 R28-Zelllinie
Die Zellen wurden in flüssigem Stickstoff, bei -196 °C, in verschiedenen Passagen (40- 47), zu je 1,5 Millionen Zellen pro Portion gelagert. Eine Portion wurde bei ca. 37 °C im Wasserbad aufgetaut, bis nur noch ein winziges Eisklümpchen vorhanden war.
Dann wurde die Flüssigkeit unter der Sterilbank in eine Zellkulturflasche mit 15 ml
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vorgewärmtem Wachstumsmedium überführt und für 4 h im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit schloss sich ein Mediumwechsel an, um die Zellkultur vom Dimethysulfoxid, welches als „Frostschutzmittel“ der Zellen im flüssigen Stickstoff fungierte, zu reinigen. Die Zellen wurden nun über 2 Nächte, mit täglicher Sichtkontrolle inkubiert. Wenn sie zu etwa 75- 90 % konfluent waren, wurden die Zellen passagiert.
Für eine Passage wurde das Medium abgesaugt, die Flasche mit 1 ml CMF-EDTA gespült und die Flüssigkeit wieder abgesaugt. Ein weiterer Milliliter CMF-EDTA wurde in die Flasche gegeben und durchschnittlich etwa 4 min bei 37 °C inkubiert, bevor 1 ml 0,125 %iges Trypsin hinzugefügt wurde. Die Flasche wurde daraufhin zwischen 3 und 4 min erneut bei 37 °C inkubiert, bis sich die Zellen ablösten. Der Ablösevorgang wurde unter einem Phasenkontrastmikroskop kontrolliert. Die Trypsinisierung wurde mit ca. 5 ml Wachstumsmedium abgestoppt und die Zellen in ein steriles Gefäß überführt. Nun wurde die Zellsuspension mit 1000 xg für 10 min zentrifugiert. Das sich über dem Zellpellet befindende Medium wurde abgegossen und das Zellpellet in je nach Größe meist in 5 ml, oder teilweise in 10 ml Wachstumsmedium resuspendiert. Von der suspendierten Flüssigkeit wurden 50 µl entnommen und in 100 µl Trypanblau überführt. Die angefärbten Zellen wurden mittels Neubauer Zählkammer gezählt. Nun wurde eine Zellzahl von 50.000 Zellen pro Milliliter eingestellt und diese Zellsuspension, welche ständig gerührt wurde, zu je 100 µl pro Well in 96-Well-Platten überführt. Es wurden teilweise mehrere Platten derselben Passage angefertigt und mit fortlaufenden Nummern gekennzeichnet. Außerdem wurde mindestens eine neue Zellkulturflasche mit je nach Bedarf mindestens 300.000 Zellen bestückt. Alles wurde bei 37 °C über 24 h inkubiert, bevor ein erneuter Mediumwechsel stattfand. Die 96- Well-Platte wurde nach dem Mediumwechsel noch zwei weitere Nächte inkubiert und dann entsprechend der verschiedenen Versuchsansätze behandelt.
Die erwähnte Flasche wurde nach dem Bestücken für eine bis vier Nächte bei 37 °C inkubiert und bei Erreichen einer Konfluenz von 75-90 % erneut passagiert. Die Passage 60 wurde hierbei für den Versuch nicht überschritten.
Zum Kryokonservieren der Zellen wurde das Zellpellet nach der Zentrifugation in einem 10 % DMSO enthaltendem DMEM+ Medium resuspendiert und die Zelldichte
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auf 1,5 Millionen Zellen pro Milliliter eingestellt. Je 1 ml dieser Suspension wurde in ein Kryogefäß überführt und über Nacht bei -80 °C gelagert. Am darauf folgenden Morgen wurden die Zellen in den flüssigen Stickstoff überführt.
4.2.2.2 ARPE-19-Zelllinie
Die ARPE-19-Zellen wurden in Zellkulturflaschen mit DMEM:F12 kultiviert und beim Erreichen von etwa 75-90 % Konfluenz passagiert. Dazu wurde das Medium abgesaugt und die Flasche mit 5 ml des auf 37 °C erwärmtem PBS gespült. Nach dem Absaugen desselbigen, wurden 2 ml CMF-EDTA auf die Zellen gegeben und etwa 5 min bei 37 °C inkubiert. Dazu wurden dann 2 ml 0,125 %iges Trypsin gegeben, so dass eine Konzentration von ca. 0,0625 % Trypsin in der Flasche erreicht wurde. Eine weitere Inkubation von 5-10 min bei 37 °C folgte. Die Reaktion wurde mit 7-8 ml Kulturmedium nach Sichtkontrolle abgestoppt. Die entstandene Zellsuspension wurde bei 1000 xg für 10 min zentrifugiert und die Zellzahl mittels Neubauerzählkammer bestimmt. Die Aussaat betrug pro Flasche 200.000-1.000.000 Zellen, pro Well in der 96-Wellplatte 15.000 Zellen. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert und alle 2-3 Tage passagiert. Jeder Passage folgte 4-24 h später ein Mediumwechsel. Die 96-Wellplatten wurden bis zum Versuchsbeginn 48 h inkubiert.
Das Kryokonservierungsmedium enthielt zusätzlich zum Wachstumsmedium 5 % DMSO und es wurden Portionen von 1-1,5 Millionen Zellen entsprechend tiefgefroren gelagert.
4.2.2.3 Zytotoxikologische Untersuchungen
Die zytotoxikologischen Untersuchungen wurden mit den Arzneistoffen Ciprofloxacin, Enrofloxacin, Danofloxacin, Marbofloxacin, Spinosad, Milbemycinoxim, Ivermectin, Betamethason, Ketoprofen, Chlorpromazin und Ciclosporin durchgeführt.
