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Aus der Klinik für Hals-, Nasen, Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover
Direktor: Professor Professor h.c. Dr. med. Thomas Lenarz
Untersuchungen zum neuroprotektiven Effekt von Artemin auf Spiralganglienzellen in vivo
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Ines Buhr
aus Kiel
Hannover, 2012
2 Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 13.12.2012
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. Thomas Lenarz
Referent: Prof. Dr. rer. nat. Peter Claus Korreferent: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Martin Ptok
Tag der mündlichen Prüfung: 13.12.2012
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Carsten Framme, MBA Prof. Dr. med. Makoto Nakamura Prof. Dr. med. Susanne Petri
3 Die vorliegende Dissertation wurde von März 2008 bis Juli 2011 unter der Betreung von Dr.
med. Athanasia Warnecke und Dr. med. vet. Verena Scheper und unter der Leitung von Professor Dr. med. Timo Stöver in der Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover (Leiter: Professor Professor h. c. Dr. med. Thomas Lenarz) angefertigt.
Publikationen:
WARNECKE, A., SCHEPER, V., BUHR, I., WENZEL, G., WISSEL, K., PAASCHE, G., BERKINGALI, N., JØRGENSEN, J. R., LENARZ, T und STÖVER, T. (2010):
Artemin improves survival of spiral ganglion neurons in vivo and in vitro.
NeuroReport 21:517–521.
Poster:
SCHEPER, V., WARNECKE, A., BUHR, I., JÖRGENSEN, J. R., LENARZ, T. und STÖVER, T.:
Spiralganglienzellerhalt durch in vivo Applikation von Artemin.
(Poster, 80. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-Ohren- Heilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie, 16.-20. Mai 2009 in Rostock).
Gefördert durch die Europäische Union im Rahmen des „3g-Nanotechnology based targeted drug delivery using the inner ear as a model target organ“ - Projektes „NanoEar“
(Projektnummer NMP4-CT-2006-026556-2).
Inhaltsverzeichnis
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 6
1.1 Einleitung, Zielsetzung ... 6
1.2 Anatomie des Ohrs; Physiologie des Hörens ... 8
1.3 Pathophysiologie der Schallleitung und Schallempfindung ... 14
1.4 Wachstumsfaktoren ... 16
1.4.1 Die Familie der Neurotrophine ... 17
1.4.2 Die GDNF-Familie ... 19
1.4.2.1 GDNF ... 20
1.4.2.2 ARTN ... 21
1.4.2.3 Neurturin ... 22
1.4.2.4 Persephin ... 22
1.4.3 Die Rezeptoren der GDNF-Familie ... 23
1.5 Zielsetzung ... 26
2 Material und Methoden ... 27
2.1 Material ... 27
2.1.1 Versuchstiere ... 27
2.1.2 Tierhaltung ... 27
2.1.3 Versuchsgruppen ... 27
2.1.3.1 AP-Gruppe ... 28
2.1.3.2 BDNF-Gruppe ... 28
2.1.3.3 ARTN-Gruppe ... 28
2.1.3.4 Normal hörende Gruppe ... 28
2.1.4 Pharmaka. ... 28
2.1.5 Chemikalien zur Anwendung während der Operationen ... 29
2.1.6 Technische Geräte mit Anwendung am Tier ... 29
2.1.7 Das Schlauch-Mikropumpensystem ... 29
2.1.8 Reagenzien, Laborbedarf und Geräte ... 30
2.2 Methoden ... 30
2.2.1 Messung der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale (AABR) ... 32
2.2.2 Ertaubung von Meerschweinchen ... 34
2.2.3 Schlauch- und Pumpen-Implantation ... 35
2.2.4 Pumpenwechsel ... 37
Inhaltsverzeichnis
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2.2.5 Gewinnung und Aufarbeitung der Cochlea ... 37
2.2.5.1 Transkardiale Perfusion. ... 37
2.2.5.2 Pumpentest ... 37
2.2.5.3 Felsenbeinentnahme und Gewinnung der Cochlea ... 38
2.2.5.4 Aufbereitung der Cochlea für die lichrmikroskopische Untersuchung ... 38
2.2.5.5 Schneiden und Färben der Cochlea ... 39
2.2.6 Lichtmikroskopische Auswertung ... 39
3 Ergebnisse ... 43
3. Ergebnisse der in vivo Experimente ... 43
3.1 Ertaubung - elektrophysiologische Ergebnisse ... 43
3.2 Ertaubung - histologische Ergebnisse an Corti-Organ und Basilarmembran ... 45
3.3 Quantitative Analyse der Spiralganglienzellen ... 46
4 Diskussion ... 58
5 Zusammenfassung ... 74
6 Literaturverzeichnis ... 76
7 Anhang ... 88
7.1 Lösungen ... 88
7.2 Laborbedarf, Operationsbesteck und Verbrauchsmaterialien ... 89
7.3 Geräte ... 91
7.4 Herstellen von Lösungen ... 93
7.5 Abkürzungsverzeichnis ... 94
8 Lebenslauf ... 96
9 Erklärung ... 97
10 Danksagung... 98
Einleitung
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1 Einleitung
1.1 Einleitung, Zielsetzung
Die Beeinträchtigung des Hörvermögens durch eine hochgradige bis hin zur Taubheit reichende Schallempfindungsschwerhörigkeit, ist in Deutschland und in anderen industrialisierten Nationen ein weitverbreiteter Krankheitskomplex. Die Prävalenz eines bilateralen kongenitalen Hörverlustes von 40 dB und mehr liegt in der Bundesrepublik Deutschland bei ca. 100 - 300 Erkrankten pro 100.000 Einwohner. Dies entspricht bei einer jährlichen Geburtenzahl von 800.000 Geburten etwa 800 – 2400 betroffene Neugeborene pro Jahr (Leitlinien der deutschen Gesellschaft für Phoniatrie und Pädaudiologie). Der Deutsche Schwerhörigenbund e.V. berichtet 2005 von 16 Millionen hörgeschädigten Erwachsenen.
Grundlage dieser Statistik ist eine Hörschädigung mit einer Hörminderung ab 25 dB. Mit einem Anteil von etwa 19,7 % der deutschen Bevölkerung stellen die Hörgeschädigten einen relevanten Anteil der Menschen mit Behinderungen dar. Der Anteil hochgradig schwerhöriger Menschen, definitionsgemäß mit einer Hörminderung von über 70 dB, beträgt jedoch nur etwa 0,5 % der Bevölkerung.
Die Behandlung taub geborener und ertaubter Patienten ist in den letzten Jahren durch die Einführung künstlicher elektronischer Innenohrprothesen, den sogenannten Cochlea- Implantaten (CI), revolutioniert worden. Inzwischen stellt die CI-Versorgung die weitläufig anerkannte Routinebehandlung insbesondere taub geborener Kinder dar. Allerdings gibt es nach wie vor große interindividuelle Unterschiede hinsichtlich des Erfolgs, der mit einem CI erreicht werden kann.
CI stimulieren direkt Spiralganglienzellen (SGZ), so dass akustische Signale über den N.
cochlearis an das Gehirn übertragen werden können. Eine Erklärung für die oben genannte Variabilität des Erfolges einer CI-Operation könnte in der Anzahl der für eine elektrische Stimulation zur Verfügung stehenden SGZ liegen. Ihre Anzahl wird dementsprechend in der Literatur als eines der kritischen Elemente für den Erfolg einer CI-Versorgung angesehen (Incesulu und Nadol 1998). Weiterhin konnte Spoendlin 1984 zeigen, dass bei einsetzender Taubheit zuerst die Haarzellen absterben und nachfolgend die peripheren Fortsätze (Dendriten) des Hörnervs degenerieren. Die Degeneration der Dendriten stellt damit vermutlich den Auslöser für den nachgeschalteten Untergang der SGZ (Zellkörper des Hörnervs) dar. Wäre es möglich, die Anzahl der SGZ auf einem hohen Niveau zu erhalten oder die Degeneration der Dendriten zu reduzieren, könnte vermutlich die Effektivität der CI
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8 wesentlich zur Protektion des Hörnervs beitragen können. Für GDNF konnten Scheper et al.
2009 dieses in Tierexperimenten an ertaubten Meerschweinchen belegen. Für die Wirkung von ARTN auf das auditorische System gibt es bislang keine Studien. Innerhalb unserer Abteilung wurde der neurotrophe Effekt von ARTN auf kultivierte SGZ gezeigt (Warnecke et al. 2010). Innerhalb der gleichen Studie haben wir den Effekt von ARTN auf SGZ ertaubter Meerschweinchen untersucht. Dieser in vivo-Teil bildet die Grundlage der vorliegenden Dissertation.
Zum Vergleich des Ausmaßes der Neuroprotektion wurde je eine Gruppe von Meerschweinchen ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren (Negativkontrolle) und eine Gruppe behandelt mit einem etablierten Wachstumsfaktor (BDNF) untersucht. Zur Applikation von ARTN in das Innenohr bietet sich die Verwendung von Schlauch-Mikropumpensystemen zur gesteuerten Dosierung an.
Der Vergleich der neuroprotektiven Effekte von ARTN und BDNF könnte eine Aussage darüber zulassen, welcher der beiden Faktoren, vor allem auch im Hinblick auf eine humane Applikation, geeigneter für weitergehende Untersuchungen erscheint.
1.2 Anatomie des Ohrs; Physiologie des Hörens
Der Hör- und Gleichgewichtsapparat lässt sich in einen peripheren Anteil bestehend aus äußerem Ohr, Mittelohr, Innenohr und 8. Hirnnerven, sowie in einen zentralen Anteil bestehend aus Hörbahn, Vestibularbahn und zentralen Teil des N. facialis unterteilen (Boenninghaus und Lenarz 2007).
Das äußere Ohr (Auris externa) umfasst die Ohrmuschel (Auricula) und den äußeren Gehörgang (Meatus acusticus externus) mit äußerem knorpeligen und innerem knöchernen Anteil. Ähnlich einem Trichter, dient das äußere Ohr der Bündelung und der Weiterleitung des Schalls. Für das Richtungshören hat es eine zentrale Bedeutung.
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Abb. 1.: Übersicht über äußeres, mittleres und inneres Ohr; Quelle: „Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde für Studierende der Medizin“, Boenninghaus und Lenarz 2007.
Das Trommelfell (Membrana tympani) trennt den äußeren Gehörgang vom Mittelohr. Das Mittelohr umfasst die Paukenhöhle (Cavum tympani) und die darin liegenden Gehörknöchelchen (Ossicula auditoria), sowie Ohrtrompete (Tuba auditiva) und die pneumatischen Räume. Zwischen dem großen unteren Teil, der Pars tensa und dem kleineren oberen Pars flaccida des Trommelfells zeichnet sich der kurze Fortsatz des Hammers (Malleus) ab (Boenninghaus und Lenarz 2007).
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Abb. 2: Schnitt durch die Paukenhöhle; Quelle: „Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde für Studierende der Medizin“, Boenninghaus und Lenarz 2001.
Gerät das Trommelfell durch eine Schallwelle in Schwingung, überträgt sich diese, ausgehend vom Hammerfortsatz über die nachgeschalteten Gehörknöchelchen Amboss (Incus) und Steigbügel (Stapes) auf das ovale Fenster. Diese ossikuläre Schallleitung bewirkt durch die Hebelwirkung der Gehörknöchelchen und die Flächenverkleinerung vom Trommelfell auf das ovale Fenster eine Schallverstärkung (Schalldrucktransformation). Diese ist notwendig, um den Schall von einem lufthaltigen in einen flüssigkeitshaltigen Raum zu übertragen (Probst et al. 2004). Durch die Binnenohrmuskeln, den Musculus tensor tympani und den Musculus stapedius, kann die Schallübertragung bei hohem Schalldruck reduziert werden.
Das Innenohr liegt im Labyrinth der Felsenbeinpyramide des Os temporale und umfasst das Hörorgan (Schnecke, Cochlea) und das Gleichgewichtsorgan (Bogengänge, Ductus semicirculares). Das knöcherne Labyrinth ist mit Perilymphe gefüllt und umgibt das häutige endolymphhaltige Labyrinth. Über den Ductus perilymphaticus an der basalen Schneckenwindung steht der perilymphatische Raum mit dem Subarachnoidalraum in Verbindung.
Die knöcherne Schnecke windet sich spiralförmig zweieinhalbmal um eine Achse, den Modiolus, der Nerven und Gefäße enthält. Von der Achse ragt die Lamina spiralis ossea ins
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11 Innere des Schneckengangs und unterteilt ihn in eine obere Etage (Scala vestibuli) und eine untere Etage (Scala tympani). An der Schneckenspitze (Helicotrema) stehen beide Scalen miteinander in Verbindung. Die Scala tympani endet zum Mittelohr hin am runden Fenster.
Die Scala vestibuli mündet ins Vestibulum, abschließend mit dem ovalen Fenster. Zwischen den Scalen liegt lateral in der Cochlea die endolymphhaltige häutige Schnecke (Ductus cochlearis). Oberhalb wird der Ductus cochlearis durch die Reissner-Membran begrenzt.
Außen befindet sich das Ligamentum spirale mit der Stria vascularis, die die kaliumreiche Endolymphe sezerniert. Die untere Wand wird durch die zwischen Lamina spiralis ossea und Ligamentum spirale liegende Basilarmembran mit aufsitzendem Corti-Organ gebildet. Das Corti-Organ, bedeckt von der Tektorialmembran (Membrana tectoria), besteht aus Stützzellen (inneren und äußeren Pfeilerzellen, Deiters-Zellen, Hensen-Zellen und Claudius-Zellen), zwischengelagerten perilymphhaltigen Tunnelräumen und einer Reihe inneren, sowie drei Reihen äußeren Haarzellen.
Abb. 3: Ductus cochlearis mit Corti-Organ; Quelle: „Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde für Studierende der Medizin“, Boenninghaus und Lenarz 2007.
Die durch den Schall ausgelösten Bewegungen des Steigbügels am ovalen Fenster führen zu einer Volumenverschiebung der dahinter liegenden Perilymphe in der Scala vestibuli. Die
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12 Volumenverschiebung bewirkt eine Auslenkung des Ductus cochlearis und der Basilarmembran. Diese Auslenkung wird in Form einer Wanderwelle in unterschiedlicher Geschwindigkeit und Reichweite in Richtung Helicotrema fortgeleitet. Die Wellenlänge wird entlang der Scala vestibuli immer kürzer, die Amplitude bis zu einem Maximum jedoch immer größer. Je länger die Schallwellenlänge ist, also je tiefer die Frequenz, desto weiter wandert die Wanderwelle und desto später erreicht sie ihr Amplitudenmaximum. So hat jede Frequenz einen bestimmten Ort auf der Basilarmembran, wo sie abgebildet wird. Es entsteht somit eine räumliche Trennung nach Frequenzen (Dispersion, Frequenz-Orts- Transformation). Die Auslenkung der Basilarmembran bewirkt eine relative Verschiebung der Tektorialmembran, wodurch vor allem im Bereich des Amplitudenmaximums eine Ausscherung der Stereozilien der Haarzellen ausgelöst wird. Dadurch kommt es zum Kaliumioneneinstrom aus der Endolymphe in die Haarzelle und zur Membrandepolarisation, die einen Kalziumioneneinstrom aus der Corti-Lymphe bewirkt. Dies führt zur Entleerung der Transmittervesikel in den synaptischen Spalt und zum Aufbau eines postsynaptischen Generatorpotentials zur Weiterleitung im Nerven.
Abb. 4: Darstellung der Reizübertragung: Durch Auslenkung der Stereozilien wird ein Kaliumeinstrom in die innere Haarzelle getriggert, es kommt zur Depolarisation mit Kalziumeinstrom und nachfolgender Transmitterausschüttung in den synaptischen Spalt, wodurch die Übertragung des Aktionspotentials auf die Hörnervenfaser erfolgt. Quelle: „Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde für Studierende der Medizin“, Boenninghaus und Lenarz 2007.
Für diese Reizweiterleitung sind die inneren Haarzellen zuständig. Die äußeren Haarzellen dienen als cochleaere Verstärker, indem sie durch Kontraktion ihrer Aktinfilamente während
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14 1.3 Pathophysiologie der Schallleitung und Schallempfindung
Wenn akustische Reize nur noch abgeschwächt oder gar nicht mehr wahrgenommen werden können, spricht man von Schwerhörigkeit oder Gehörlosigkeit bzw. Taubheit. Es wird zwischen Schallleitungs- und Schallempfindungsschwerhörigkeit unterschieden.
Schallleitungsstörungen sind bedingt durch eine verminderte Schallübertragung im äußeren Ohr oder Mittelohr. Verantwortlich dafür können ein Ohrenschmalzpfropf (Cerumen), ein Fremdkörper im Gehörgang, eine Entzündung des Gehörgangs, ein Tubenverschluss, ein Mittelohrerguss, eine traumatische Verwerfung der Gehörknöchelchen, eine Otosklerose oder eine chronische Mittelohrentzündungen sein. Schallempfindungsschwerhörigkeit kann viele verschiedene Ursachen haben. Sie kann kongenital (angeboren) sein, entweder als hereditäre (erbliche) Form oder pränatale (vorgeburtliche) Form, ausgelöst z. B. durch Röteln- Embryopathie, konnatale Lues oder andere Erkrankungen der Mutter. Perinatal (während der Geburt) kann es z.B. durch Traumen oder Rhesus-Inkompatibilität mit Kernikterus zu einer Schädigung kommen. Postnatal (nach der Geburt) entstandene Taubheit kann durch eine Labyrinthitis oder Meningitis, sowie weitere Infektionskrankheiten hervorgerufen werden.
Schallempfindungsstörungen beruhen häufig auf einem Schaden in der Cochlea, können aber auch durch eine Störung des Hörnervs oder der zentralen Hörbahn bedingt sein.
Innenohrschäden gehen meist mit dem Untergang der inneren und/oder äußeren Haarzellen einher. Ursachen hierfür können Infektionen, Sauerstoffmangel, Durchblutungsstörungen, Altersdegeneration, ototoxische Substanzen wie Medikamente und Chemikalien, akutes oder chronisches Schalltrauma, Schädeltraumen, Tumoren, die Meniere’sche Erkrankung oder ein Hörsturz sein (Probst et al. 2004). Behandlungsmöglichkeiten der Schallleitungsstörungen und unvollständigen Schallempfindungsstörungen bieten Hörgeräte, die mit Hilfe von Mikrophonen über den äußeren Gehörgang, den Schädelknochen oder direkt über die Gehörknöchelchen ein verstärktes Signal an das Hörsystem übermitteln. Somit soll der durch die Schwerhörigkeit ausgelöste Hörverlust weitgehend ausgeglichen werden.
Bei ausgeprägter Innenohrfunktionsstörung infolge stark verminderter oder fehlender Haarzellen kann bei bestehender Funktionalität der fortleitenden Nerven eine elektronische Hörprothese, das Cochlea-Implantat (CI), eingesetzt werden. Das CI besteht, wie in Abb. 6 dargestellt, aus einem extern getragenen Mikrophon und einem Audioprozessor zur Umwandlung des Schalls in elektrische Impulse. Eine intracochleaere Elektrodenanlage dient zur Aufnahme und Weiterleitung der elektrischen Impulse an die einzelnen Elektroden auf
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15 dem Elektrodenträger. Die Reichweite der Elektroden in die Scala tympani variieren, so dass unterschiedliche Bereiche der Basilarmembran mit den jeweiligen Ganglienzellen stimuliert werden können (tonotope Reizung), um eine physiologische Frequenz-Orts-Transformation nachzuahmen. Die Reizrate spiegelt die zeitliche Struktur der verarbeiteten akustischen Information wider (Boenninghaus und Lenarz 2007). Die physiologischen Haarzellen decken im Vergleich zum CI ein wesentlich größeres Frequenzspektrum im Bereich von 16 bis 20000 Hz ab (Boenninghaus und Lenarz 2007), während das CI nur das Wahrnehmen von Frequenzen im Sprachbereich, zwischen 250 und 6800 Hz, ermöglicht.
Abb. 6: Beispielhafte Darstellung der Lage und der Bestandteile eines Cochlea-Implantats. 1:
Mikrophon; 2: Sprachprozessor; 3: Übertragungskabel; 4: Übertragungsspule; 5: Implantatempfänger;
6: Elektrode; 7: N. cochlearis (Quelle: Fa. Cochlear).
Das Vorhandensein und die Funktionalität der SGZ ist Voraussetzung für eine effiziente Behandlung mit einem CI (Gantz et al. 1993). Da sich die Haarzellen der Cochlea aber unter physiologischen Bedingungen nicht regenerieren, kommt es bei einer Schädigung zu einem irreversiblen Verlust. Sekundär folgt dem Haarzellverlust eine ebenfalls irreversible Degeneration der SGZ und deren Neuriten (Takeno et al. 1998; Spoendlin 1984). Gründe für die Degeneration der SGZ sind unter anderem die durch den Haarzellverlust bedingte fehlende Produktion von neurotrophen Faktoren wie z. B. GDNF, BDNF und Neurotrophin, die von den SGZ zum Überleben benötigt werden. Zudem fällt mit herabgesetzter Transmitterfreisetzung aus den inneren Haarzellen die zur Membranaktivität und Ausbildung
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16 von Aktionspontentialen führende stimulierende Wirkung auf die SGZ weg. Fehlt der trophische Effekt, der einerseits durch die Aktivierung der SGZ und andererseits durch die neurotrophen Faktoren generiert wird, so kommt es zur Degeneration und zum Absterben der SGZ. Allerdings haben tierexperimentelle molekularbiologische Studien gezeigt, dass nach Ertaubung die endogene Produktion der neurotrophen Faktoren GDNF und ARTN ansteigt (Wissel et al. 2006). Womöglich handelt es sich hierbei um einen endogenen protektiven Mechanismus nach Verabreichung von Ototoxika. Dieser reicht allerdings nicht aus, um die SGZ vor Degeneration und Absterben zu bewahren. Voraussetzung für das Funktionieren des CI ist das Vorhandensein der SGZ zur direkten Stimulation. Deshalb beinhaltet der Hauptansatz der Innenohrforschung den Erhalt der SGZ zur Optimierung des Hörens. Dies kann möglicherweise durch eine externe Applikationen von neurotrophen Faktoren erreicht werden.
1.4 Wachstumsfaktoren
Wachstumsfaktoren sind Botenstoffe, die Informationen zwischen Zellen übertragen. Das können beispielsweise Zytokine (Interleukine, Lymphokine oder Monokine), Proteine wie NGF (nerve growth factor), FGF (fibroblast growth factor) oder TGF (transforming growth factor), oder auch hormonähnliche Stoffe sein. Mittlerweile kennt man eine Vielzahl verschiedener Wachstumsfaktoren, für die es einen oder mehrere spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzellen gibt. Durch die Interaktion mit dem Rezeptor erzeugt der Wachstumsfaktor im Zellinneren ein Signal und vermittelt es auf den Zellkern. Dieses Signal kann sowohl inhibitorisch zur Abschaltung von Genen führen, als auch stimulierend eine Aktivierung bewirken. So kann ein Wachstumsfaktor direkt oder auch indirekt durch Wechselwirkungen Einfluss auf Zellteilung und Wachstum, Differenzierung, Überleben, Apoptose, Bewegung und andere spezielle Funktionen der Zellen nehmen.
Eine Familie der Wachstumsfaktoren sind Neurotrophine. In den frühen 1950er Jahren begann die Erforschung der Neurotrophine mit der Entdeckung von NGF. Rita Levi- Montalcini machte erstmals die Beobachtung, dass zielgerichtetes Neuritenwachstum in dorsalen Rückenmarkswurzeln von Hühnerembryonen durch benachbarte Mäusesarkomzellen induziert werden konnte (Levi-Montalcini und Hamburger 1951; Cohen et al. 1954). In den folgenden Untersuchungen entdeckte sie ein humorales Protein, das aus den Sarkomzellen zu stammen schien. Es war offensichtlich in der Lage, das Wachstum und die Differenzierung von Nervenzellen zu stimulieren. Sie nannte es NGF. Die weitreichende Bedeutung dieser
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17 Entdeckung und ihrer Erforschung wurde 1986 durch die Verleihung des Nobelpreises an Levi-Montalcini und ihren Kollegen Stanley Cohen honoriert.
Neurotrophine sind basische Proteine mit einer Größe von 13 kDa, die von peripheren und zentralen Neuronenpopulationen zur Differenzierung, zum Funktionserhalt und zum Überleben benötigt werden. Die Neurotrophine lassen sich in Gruppen unterteilen, die strukturell eng miteinander verwandt sind.
1.4.1 Die Familie der Neurotrophine
Zu der Gruppe miteinander verwandter Zytokine gehört brain-derived neurotrophic factor (BDNF), NGF, Neurotrophin-3, -4 und -5 (NT-3, NT-4, NT-5). Das durch BDNF induzierte Signal wird über den TrkB-Rezeptor vermittelt, der auch in cochleaeren Neuronen nachgewiesen werden konnte (Ylikoski et al. 1993). Er wird sowohl auf SGZ hörender, als auch ertaubter Tiere exprimiert (Gillespie et al. 2004). Im zentralen Nervensystem ist BDNF in der Lage, während der Entwicklung die Reifung von Synapsen zu modulieren, deren Anzahl zu steigern und die morphologische Komplexität von Axonen und Dendriten zu beeinflussen (Hu et al. 2005). Außerdem steigert die beschriebene Signaltransduktion die Myelin-Protein-Expression im peripheren Nervensystem. Nach Verletzung peripherer Nerven kann durch exogene Applikation von BDNF ein direkter Effekt auf Regeneration und Myelinisierung erzielt werden (Notterpek 2003). Eine Langzeitexpression von BDNF führt scheinbar zur Formationsbeschleunigung bzw. Zunahme der Myelinschichtdicke im adulten und sich entwickelnden Organismus (Tolwani et al. 2004). BDNF wird auch im auditorisch sensorischem Epithel während der Entwicklung exprimiert (Pirvola et al. 1992).
BDNF wurde erstmals 1982 beschrieben (Barde et al. 1982). 1989 gelang bereits eine Klonierung und die heterologe Expression (Leibrock et al. 1989). Miller et al. 1997 und Ruan et al. 1999 demonstrierten nach Verabreichung von BDNF ins Innenohr über osmotische Pumpen ein verbessertes Haarzell- und SGZ-Überleben nach Kanamycin-induzierter Innenohrschädigung im Vergleich zu einer Kontrollgruppe. Dieser Erfolg konnte auch noch nach verzögerter Verabreichung von BDNF nach Aminoglykosid-induziertem Hörverlust in Meerschweinchen erreicht werden (Gillespie und Shepherd 2005, Yamagata et al. 2004).
Auch nach Hörminderung durch Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A-Exposition konnte durch direkte BDNF-Applikation ins Innenohr ein protektiver Effekt erzielt werden (Maeta und Anniko 2003). Andere in vivo Studien zeigten nach Ertaubung ebenfalls ein ähnlich
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18 verbessertes SGZ-Überleben nach Implantation osmotischer Pumpen zur intracochleaeren BDNF-Verabreichung (Shinohara et al. 2002; Yamagata et al. 2004). Bei zusätzlich erfolgter elektrischer Stimulation wurde sogar im Vergleich zu der Gruppe mit alleiniger BDNF- Zufuhr, eine nochmals signifikant erhöhte Dichte der überlebenden SGZ bestimmt (Shepherd et al. 2005). Neurotrophin-3 (NT-3) beeinflusst die Proliferation sympathischer Neuroblasten in der späten Entwicklung über den TrkC-Rezeptor (Wyatt et al. 1997). Auch im auditorisch sensorischen Epithel ist NT-3 in der Entwicklung (Pirvola et al. 1992, Pirvola et al. 1994) und in inneren Haarzellen adulter Ratten (Ylikoski et al. 1993) vorhanden. Der korrespondierende Rezeptor TrkC konnte ebenfalls in den cochlearen Neuronen nachgewiesen werden. Mäuse ohne NT-3 oder dem Rezeptor TrkC zeigten eine deutliche Reduktion der SGZ in der basalen Windung der Cochlea (Fritzsch et al. 1997). NT-3 konnte in vitro ein Neuritenwachstum in Kulturen mit explantierten cochleaeren Neuronen hervorrufen (Pirvola et al. 1994). Außerdem konnte eine Behandlung mit NT-3 eine Degeneration der Hörnervenzellen während fortschreitender Ertaubung verlangsamen bzw. rückgängig machen (Richardson et al. 2004).
Wie schon erwähnt, binden die Wachstumsfaktoren der Neurotrophin-Familie mit hoher Affinität an einen der drei Tyrosinkinase-Rezeptoren (TrkA, TrkB, TrkC), wobei auch Kreuzreaktivitäten vorkommen (Huang und Reichardt 2001). Außerdem binden alle mit geringer Affinität an einen weiteren Zelloberflächenrezeptor, an den p75NT-Rezeptor, der zur Familie der Tumor Nekrose Faktoren-Rezeptoren gehört (Abb. 7).
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Abb. 7: Hochaffine Bindung der Neurotrophine NGF (nerve growth factor), BDNF (brain-derived neurotrophic factor), NT (Neurotrophin) -3, -4 und -5 an den jeweiligen Tyrosin-Kinase-Rezeptor (TrkA, B, C). Niedrigaffine Bindung aller Neurotrophine an den Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor p75 (Abb. aus Kramer 2007 nach Waartiovarra 1998).
1.4.2. Die glial cell line-derived neurotrophic factors (GDNF)-Familie
Große Bedeutung erlangten die Mitglieder der Transforming Growth Factor-β- (TGF-β) Superfamilie, die mit weit über 50 Mitgliedern die größte und bedeutendste Gruppe unter den neurotrophen Faktoren darstellt (Böttner et al. 2000). Neben bekannten Mitgliedern wie Aktivinen, bone morphogenetic proteins (BMPs) und Inhibinen gehört auch die GDNF- Familie zu der TGF-β-Superfamilie, sie weist aber nur eine 20 %-ige Homologie zu ihr auf (Saarma und Sariola 1999). Die Angehörigen dieser GDNF-Familie setzen sich aus den neurotrophen Faktoren GDNF (Lin et al. 1993), Neurturin (NRTN) (Kotzbauer et al. 1996), Persephin (PSPN) (Milbrandt et al. 1998) und ARTN (Baloh et al. 1998) zusammen. Durch ihre effiziente neurotrophe Wirkung sind sie für die Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen von besonderem Interesse.
Die GFL (GDNF family ligands) sind für die angemessene Entwicklung von enterischen, sympathischen, parasympathischen, sensorischen und motorischen Neuronen unerlässlich.
Neben dem Begünstigen des Überlebens und der Differenzierung von Neuronen können Neurotrophine auch Einfluss auf das Neuritenwachstum nehmen. Alle Mitglieder der GDNF- Familie und ihre Rezeptoren konnten im Innenohr in unterschiedlichen Konzentrationen nachgewiesen werden (Stöver et al. 2000).
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20 1.4.2.1 GDNF
GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) ist während der Entwicklung in verschiedenen Geweben des peripheren und zentralen Nervensystems und einiger anderer Organsysteme, wie z. B. in der Niere und in den Harnwegen, weitverbreitet und fördert das Überleben, die Differenzierung und die Regeneration der Neurone (Hendersson et al. 1994;
Saarma und Sariola 1999). Beispielsweise weisen neonatale Mäuse ohne GDNF oder GFRα3 einen 30 %-igen Verlust von Neuronen des Ganglion cervicale superior bei der Geburt auf (Moore et al. 1996; Nishino et al. 1999). Ebenso fand man eine signifikant reduzierte Anzahl von sensorischen Neuronen (Thompson et al. 1998) und Defizite in der Entwicklung des enterischen Systems und der Niere bei GDNF-/- Mäusen (Moore et al. 1996; Pichel et al.
1996).
Die neuroprotektiven Eigenschaften von GDNF wurden erstmals an embryonalen dopaminergen Neuronen im ventralen Mittelhirn aufgezeigt (Lin et al. 1993). Da GDNF den Dopaminumsatz steigert und an dopaminnergen Neuronen nach Schädigung eine Neuroprotektion und Neuritenaussprossung bewirkt, fand es Anwendung in der Behandlung von an Morbus Parkinson erkrankten Mäusen (Henderson et al. 1994; Beck et al. 1995).
Ferner wirkt GDNF protektiv nach ischämisch bedingter Zellschädigung (Tokumine et al.
2003) und konnte durch externe Applikation eine verletzungsbedingte neuronale Degeneration verhindern. Nach Axotomie verhinderte GDNF eine Atrophie spinaler Motoneurone und verbesserte deren Überleben (Bär et al. 1998). GDNF wird ebenfalls im Hörorgan in neonatalen äußeren und adulten inneren Haarzellen exprimiert (Ylikoski et al.
1998). Stöver et al. 2001 konnten außerdem auf Proteinebene mittels Immunfloreszenz- Nachweis belegen, dass GDNF auch in SGZ vorhanden ist. Im Vergleich zu dem Kontrollgewebe der Substantia nigra wurde im Modiolus anhand von semiquantitativer RT- PCR (Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion) eine höhere Expressionsrate der GDNF-mRNA nachgewiesen. Nach Ertaubung war die GDNF-Konzentration in den Colliculi inferiores verglichen mit normal hörenden Ratten nur leicht erniedrigt. Die Genexpression von dem korrespondierenden Rezeptor GFRα2 und Ret war jedoch leicht erhöht, ebenso wie Neurturin, was ebenfalls eine hohe Affinität zum GFRα2-Rezeptor hat (Wissel et al. 2006). In den SGZ konnte jedoch eine erheblich erhöhte Konzentration der mRNA aller Faktoren der GDNF-Familie, außer der von Neurturin, und ihrer Rezeptoren nach der Ertaubung festgestellt werden (Wissel et al. 2006). Besonders bei ARTN und GDNF sowie den dazugehörigen Rezeptoren war die Erhöhung ausgeprägt. Es kommt zu einer Verlust-
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21 induzierten Hochregulation der endogene ARTN- und GDNF-Expression, die den zellulären Schutzmechanismus der Zelle unmittelbar nach Ertaubung triggert. Da diese intrinsische Expression den Nerven nicht über längere Zeit erhalten kann, ist es nötig, extrinsisch neurotrophe Faktoren zuzuführen (Wissel et al. 2006). Eine lokale Applikation von GDNF steigert das Überleben der Hörnervenzellen nach Ertaubung (Altschuler et al. 1999; Ylikoski et al. 1998; Miller et al. 1997; Yamagata et al. 2004). GDNF kann auch in der Cochlea als protektiv wirksamer Schutz gegen Medikamenten- und Lärm-induzierte Schäden durch Haarzellverlust fungieren (Yagi et al. 2000).
1.4.2.2 Artemin
Artemin (ARTN), auch als Neublastin und Enovin bekannt, konnte im Gehirn (in der Hypophyse), in den dorsalen Wurzeln im Rückenmark, im Ganglion Trigeminale, in Schwann-Zellen, in der Plazenta, der Trachea, der Niere, der Lunge und den Muskelzellen der Gefäße nachgewiesen werden (Baloh et al. 1998; Enomoto et al. 2001; Honma et al. 2002).
ARTN ist ein entscheidender neurotropher Faktor für die Entwicklung des sympathischen Nervensystems. In Mäusen ohne ARTN ist die zweite rostrale Wanderung der sympathischen Vorläuferzellen gestört (Nishino et al. 1999) und es kommt zu Zellteilungs- und Innervationsstörungen in weiter kaudal gelegenen sympathischen Ganglien. Es wird vermutet, dass ARTN als chemischer Lockstoff für sympathische Vorläuferzellen und Nervenfasern in Mäusen fungiert (Honma et al. 2002). ARTN unterstützt das Überleben von dopaminergen Neuronen im ventralen Mittelhirn (Baloh et al. 1998). Es fördert ferner in sympathischen Neuronen die Proliferation von Vorläuferzellen, regt die mitotische Zellteilung neuer Neuronen in Kultur an und verbessert das Neuritenwachstum in vitro (Baloh et al. 1998;
Enomoto et al. 1998; Andres et al. 2001). Es hat sich gezeigt, dass ARTN eine Rolle in der Nozizeption spielt und für die systemische Behandlung neuropathischer Schmerzen genutzt werden kann (Gardell et al. 2003).
Nach Nervenverletzungen, die eine Veränderungen der Genexpression, Morphologie und funktionellen Fähigkeiten der Zellen hervorrufen (Hokfelt et al. 1994), lässt sich durch eine Behandlung mit ARTN eine Vielzahl dieser Veränderungen in den Nervenfasern wieder beheben (Bennett et al. 2000). So zeigte sich bei Ratten nach einer über 2 Wochen intermittierenden sytemischen ARTN-Applikation nach Verletzung des Hinterstrangs eine über sechs Monate andauernde vollständige Regeneration der nozizeptiven und sensomotorischen Funktionen (Wang et al. 2008).
Einleitung
22 ARTN ist außerdem durch seine chemotaktische Reizwirkung auf sympathische Neurone für das Neuronenwachstum in direkter Nachbarschaft zu Blutgefäßen von Bedeutung (Enomoto et al. 2001).
Im Innenohr ist ARTN in hohen Konzentrationen im sensorineuralen Epithelium der lateralen Wand und in geringeren Konzentrationen im neuralen Gewebe im Modiolus vertreten (Stöver et al. 2000). Nach Ertaubung lässt sich ein Anstieg der Transkriptionsaktivität von ARTN im Hörnerven nachweisen (Wissel et al. 2006).
In vitro zeigte ARTN sowohl allein verabreicht als auch in Kombination mit BDNF in den experimentellen Untersuchungen einen neuroprotektiven Effekt auf die SGZ. Zu einem Kulturmedium mit vereinzelten, eingesäten SGZ neonataler Ratten wurden die jeweiligen Wachstumsfaktoren hinzugefügt. Resultierend zeigte sich, verglichen mit den unbehandelten Kulturen, eine signifikant gesteigerte Überlebensrate der SGZ nach Zugabe von ARTN.
Außerdem erzielte ARTN eine statistisch gleichermaßen neuroprotektive Wirkung auf die SGZ wie BDNF. Auch die Kombination von ARTN und BDNF bewirkte ein gesteigertes Überleben der Zellen. Vor allem aber beeinflusste eine kombinierte Gabe beider Faktoren, im Gegensatz zur Einzelfaktorzufuhr, die Aussprossung der Neuriten positiv.
1.4.2.3 Neurturin
Neurturin spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Neuronen und unterstützt das Überleben parasympathischer, sensorischer und enterischer Neurone (Kotzbauer et al. 1996;
Milbrandt et al. 1998). Bei Mäusen ohne Neurturin und GFRα2 ist der Plexus myentericus unterentwickelt und die parasympathische Innervation der Glandula submandibularis und der Glandula lacrimalis ist deutlich herabgesetzt (Heuckerodt et al. 1999).
1.4.2.4 Persephin
Persephin weist neurotrophe Funktionen bezüglich der dopaminergen Neuronen im Mesencephalon und der Motoneuronen auf, außerdem hat es einen Effekt auf die Nierenentwicklung (Baloh et al. 1998). Persephin konnte ebenfalls im N. cochlearis nachgewiesen werden (Stöver et al. 2000). Es zeigt allerdings keine Wirkung auf periphere sympathische, sensorische und enterische Neurone (Milbrandt et al. 1998).
Einleitung
23 1.4.3 Die Rezeptoren der GDNF-Familie
Die vier verschiedenen Liganden der GDNF-Familie, GDNF, ARTN, Persephin und Neurturin übermitteln ihre Signale über einen Komplex aus Ret (Receptor Tyrosinkinase) und einem Mitglied der GFRα-Rezeptoren-Familie, Glycosylphosphatidylinositol verankerte Zelloberflächenproteine. GFR-Proteine können aber auch in löslicher Form vorkommen.
GFRα ist für die Bindung des Liganden zuständig. Durch diese Wechselbeziehung wird die Aktivität der intrazellulären Tyrosinkinase Ret getriggert (Airaksinen et al. 1999). Die GFRα- Rezeptoren haben zysteinreiche Sequenzen, die unterschiedliche extrazelluläre Domänen kennzeichnen (D1, D2 und D3). Es lassen sich vier GFRα-Rezeptoren differenzieren (Baloh et al. 1998). GFRα1 bindet vorwiegend GDNF, GFRα2 vorwiegend Neurturin, GFRα3 bevorzugt ARTN und GFRα4 bindet überwiegend Persephin (Airaksinen et al. 1999).
Beispielsweise bindet ein GDNF-Dimer zwei GFRα1-Moleküle, dieser Komplex dimerisiert zwei Moleküle Ret und führt zur Transphosphorylierung ihrer Tyrosinkinase-Domänen (Maroldt et al. 2005). ARTN bindet ebenfalls zwei Moleküle seines korrespondierenden Rezeptors GFRα3 (Wang et al. 2006). Durch diese Aktivierung werden mehrere intrazelluläre Signalkaskaden induziert und regulieren die Zellvitalität, Differenzierung, Proliferation, Migration, Chemotaxis, Neuriten-Aussprossung und -Verzweigung und synaptische Plastizität im zentralen und peripheren Nervensystem sowie in nicht-neuronalen Organen (Enomoto et al. 2001; Sariola und Saarma 2003).
GFRα1 bindet GDNF mit 10000-fach höherer Affinität als ARTN. Zwischen ARTN und GFRα1 besteht nur eine schwache bis keine funktionelle Kreuzreaktivität (Carmillo et al.
2005). Der Phänotyp ARTN-defizienter Mäuse ähnelt sehr dem GFRα3 defizienten, was eine geringe Ausweichmöglichkeit für die Signalvermittlung in der Entwicklung bestätigt (Carmillo, et al. 2005). Wenn GFRα1 in Mäusen nicht vorhanden ist, kommt es zu Entwicklungsstörungen der Niere, des enterischen Nervensystems, der motorischen und sensorischen Neuronen und zu einer kurzen Überlebensdauer der Tiere.
Der bevorzugte Rezeptor für ARTN ist GFRα3, sein Auftreten ist hauptsächlich auf sich entwickelnde und adulte periphere Nerven beschränkt (Carmillo, et al. 2005). In 34 % der Zellen in adulten dorsalen Rückenmarkswurzeln konnte der GFRα3-Rezeptor auf der Oberfläche nachgewiesen werden. Nach Nervenverletzungen der C-Fasern konnte man einen Anstieg der GFRα3-Rezeptoren und RET beobachten (Bennett et al. 2000). Ebenso konnte man im Hörnerven ertaubter Tiere einen Anstieg der GFRα1, GFRα2, GFRα3 und Ret mRNA
Einleitung
24 beobachten (Wissel et al. 2006). Der Rezeptor (GFRα4) für Persephin wird im Innenohr nicht exprimiert.
In der neuralen Region der Cochlea, dem Modiolus, ist der GFRα3-Rezeptor (im Vergleich zur Substantia nigra) in hohen Konzentrationen exprimiert, obwohl sich die ARTN Konzentrationen eher in geringeren Bereichen bewegen (Stöver et al. 2000).
Einleitung
25
Abb. 8: Darstellung der verschiedenen Signalwege der homodimeren GDNF Family-Liganden via RET: GDNF (grün), NRTN (rot), ARTN (blau) und PSPN (gelb) binden mit hoher Affinität an ihre GPI- verankerten GFRα-Rezeptoren, führen durch die darauffolgende Anheftung an die transmembranäre Ret-Tyrosin-Kinase zu deren Homodimerisierung, Autophosporylierung und aktivieren dadurch weitere intrazelluläre Signalkaskaden. Durchgezogene Linien zeigen die bevorzugten funktionellen Bindungen an: GDNF bindet an GFRα1, NRTN an GFRα2, ARTN an GFRα3 und PSPN an GFRα4, während gestrichelte Linien mögliche Interaktionen in vivo aufzeigen. Dem nicht humanen GFRα4 fehlt die N- terminale kugelförmige Domäne. Für GDNF existieren noch weitere Signalwege über einen schon bestehenden GFRα1-Ret-Komplex und Ret-unabhängig via transmembranäre Neural Cell Adhesion Molecule (Abb. aus Kramer 2007 nach Saarma 2000). ARTN = Artemin; GFRα = GDNF-Family Receptor-α; GPI = Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol; NRTN = Neurturin; PSPN = Persephin.
Einleitung
26 1.5 Zielsetzung
Nach Ertaubung konnte eine Hochregulierung der Expression von GDNF, ARTN und ihrer entsprechenden Rezeptoren im Hörnerven beobachtet werden (Wissel et al. 2006). Eine neuroprotektive Wirkung von GDNF in ertaubten Meerschweinchen konnte bereits nachgewiesen werden (Scheper et al. 2009). In vitro bewirkte auch ARTN ein tendenziell erhöhtes Neuritenwachstum und ein gesteigertes Überleben von SGZ neonataler Ratten (Warnecke et al. 2010). Ein möglicher neuroprotektiver Effekt einer ARTN-Behandlung auf die SGZ ertaubter Meerschweinchen soll im Rahmen der vorliegenden Arbeit in vivo untersucht werden. Um die neuroprotektive Effektivität von ARTN zu beurteilen, wird parallel auch eine Gruppe ertaubter Meerschweinchen mit einem etablierten Wachstumsfaktor, BDNF, behandelt.
Material und Methoden
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2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Versuchstiere
Als Versuchstiere wurden Meerschweinchen gewählt, da für diese Spezies standardisierte operative Zugänge zum Innenohr bestehen und sich die anatomischen Dimensionen als günstig für mikrochirurgische Eingriffe erwiesen haben. Zudem existieren für diese Tierart etablierte Methoden zur systemischen Ertaubung. Für die Untersuchungen wurden Meerschweinchen beiderlei Geschlechts des BFA-Stammes mit einem Anfangsgewicht von ca. 250 g bis 450 g verwendet. Die Tiere stammen aus der Zucht der Charles River WIGA GmbH, Sulzfeld. Die Verwendung der Tiere zu wissenschaftlichen Zwecken wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt (Tierversuchsantrag 08/1497, 07/1389). Die Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz und mit der Richtlinie 86/609/EWG des Rates der europäischen Gemeinschaft zum Schutz der für experimentelle Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt.
Durch die Ableitung akustisch evozierter Hirnstammpotentiale am Versuchstag 0 wurde der Hörstatus der Tiere ermittelt. Alle Tiere waren normal hörend und wurden in den weiteren Versuch aufgenommen.
2.1.2 Tierhaltung
Die Haltung der Meerschweinchen erfolgte in den Räumlichkeiten des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover und entsprach der EG-Richtlinie für die Haltung von Versuchstieren der Länder der Europäischen Union. Die Lebensbedingungen waren für alle Versuchstiere identisch. Die Tiere wurden in Dreiergruppen in Typ 4 Makrolon®-Käfigen (7.3) auf einer Standardeinstreu bei Raumtemperatur und 55 ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit bei einem täglichen hell/dunkel-Zyklus von jeweilig 12 Stunden gehalten. Sie erhielten ein Trockenpelletfutter (7.2) sowie Heu und Trinkwasser ad libitum.
2.1.3 Versuchsgruppen
Die Gesamtzahl von 30 Versuchstieren setzt sich aus vier Gruppen zusammen, wobei 24 Tiere systemisch ertaubt und fünf Tage später unilateral mit einem Schlauch- Mikropumpensystem versorgt wurden. Weiteren sechs Tieren (Tierversuchsantrag 07/1389) wurden nach Bestätigung der Normalhörigkeit die rechte Cochlea entnommen und als Kontrolle verwendet. Die Benennungen der Gruppen wurden anhand der jeweils angewendeten Intervention bestimmt.
Material und Methoden
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28 2.1.3.1 AP-Gruppe
Durch das Schlauch-Mikropumpensystem wurde AP (artifizielle Perilymphe) in die Cochlea appliziert (n = 8). Zur Zusammensetzung und Herstellung der AP siehe 7.4.1.
2.1.3.2 BDNF-Gruppe
BDNF wurde in einer Konzentration von 50 ng/ml verabreicht (n = 8). Die Bezugsquelle und die Methode der Verdünnung sind unter 7.4.2 dargestellt.
2.1.3.3 ARTN-Gruppe
ARTN wurde ebenfalls in einer Konzentration von 50 ng/ml intracochleaer appliziert (n = 8).
Unter 7.4.3 wird die Aliquotierung beschrieben.
2.1.3.4 Normal hörende Gruppe
Zur Kontrolle haben wir die rechten, unbehandelten Cochleae (n = 6) normal hörender Meerschweinchen verwendet.
2.1.4 Pharmaka
a) Carprofen (50 mg/ml), Rimadyl®, 20 ml; Pfizer GmbH, Karlsruhe
b) Enrofloxacin (25 g/ml), Baytril® 2,5 %, orale Lösung; Bayer, Leverkusen
c) Ethacrynsäure (50 mg), Edecrin®; Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
d) Glycopyrroniumbromid (0,2 mg/ml), Robinul®; Riemser Arzneimittel AG, Greifswald, Insel Riems
e) Kanamycinsulfat (333 mg/ml), Kanamycin Injection, USP®; American Pharmaceutical Partners, Inc., Schaumburg, IL, USA
f) Ketaminhydrochlorid (115,3 mg/ml), Ketamin Gräub®10 %; A. Albrecht GmbH & Co., Aulendorf
g) Lactobacillen (Lactobacillus (L.) fermentum, L. casei, L. plantarum, L. acidophilus, je 60 mg) und Streptococcus faecium (60 mg), Bird Bene-Bac®; A. Albrecht GmbH & Co., Aulendorf
h) isotone Natriumchloridlösung 0,9 %, Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen i) Prilocainhydrochlorid (20 mg/ml), Xylonest® 1n %; AstraZeneca GmbH, Plankstadt j) Ringer-Acetat-Lösung, 500 ml, Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Material und Methoden
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29 k) Thilo-Tears® Gel; Alcon Pharma (Dr. Thilo) GmbH, Freiburg i. Breisgau
l) Xylazin-Hydrochlorid (23,32 mg/ml) und p-Hydroxybenzoesäuremethylester (1 mg/ml) in Natriumchloridlösung, Rompun® 2 %; Bayer Vital GmbH, Leverkusen
2.1.5 Chemikalien zur Verwendung während der Operationen a) Carboxylatzement, Durelon®; ESPE Dental AG, Seefeld
b) Epiglu® Lösung, Meyer-Haake, Wehrheim
2.1.6 Technische Geräte zur Anwendung am Tier
a) AABR-Messeinheit: Die Ableitung der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale (acoustically evoked auditory brainstem response, AABR) erfolgte mit Hilfe des Tucker Davis Technologies System 3® (7.3). Dieses Gerät ist sowohl zur elektrophysiologischen Stimulation als auch zur Ableitung der evozierten Potentiale geeignet. Elektromagnetisch isolierte Hi-Fi-Lautsprecher dienen der akustischen Stimulation. Die Lautsprecher wurden mittels eines Modells des äußeren Gehörganges von Meerschweinchen und eines high fidelity Mikrophons (ACO systems model PS9200) kalibriert.
b) Wärmebett, bestehend aus Wärmeeinheit HICO-Aquatherm 660 und Patientenmatte, Fa.
Hirtz, Köln
c) Stativmikroskop OPMI-6-M, Fa. Carl Zeiss, Jena
d) Kautereinheit: Elektrochirurgiegerät Erbotom T175E, Fa. Erbe, Tübingen; Bipolare Koagulationspinzette, abgewinkelt und dazugehöriges Kabel, Fa. Medicalis, Garbsen e) Haarschneidemaschine ECO-black M, Tondeo Werk GmbH, Solingen
2.1.7 Das Schlauch-Mikropumpensystem
In dieser Studie wurde ein Schlauch-Mikropumpensystem zur chronischen Innenohrapplikation der Testsubstanzen verwendet. Die osmotischen Pumpen (7.3) weisen eine Infusionsrate von 0.5 µl/Stunde für eine Dauer von 14 Tagen auf. Mittels eines als Flow Moderator bezeichneten Verbindungsteils werden die Pumpen am Silikonschlauch befestigt.
Der Applikationsschlauch besteht aus einem ca. 10 cm langen (7.3) mit einem Innendurchmesser (ID) von 0,76 mm und einem Außendurchmesser (AD) von 1,22 mm, in dessen eine Öffnung ein Polyimidschlauch mit 0,12 mm ID und 0,15 mm AD (7.3) inseriert und mit LocTITE 4011® (7.3) befestigt wurde. Das schmale Ende des Schlauches wurde in die
Material und Methoden
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32 2.2.1. Messung akustisch evozierter Hirnstammpotentiale (acoustically evoked
auditory brainstem response (AABR))
Zur Minimierung akustischer Störgeräusche wurden die AABR-Messungen in einer akustisch isolierten Kammer durchgeführt. Alle Geräte in der Kammer waren zur Vermeidung elektrischer Störungen batteriebetrieben. Nadelelektroden wurden s.c. platziert (siehe Abb.
11).
Material und Methoden
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Abb. 12: Zeitskala zur Darstellung des Ablaufs der akustischen Stimulation zur Bestimmung der Hörschwelle. Die durch das TDT-System generierten Strompulse wurden in akustische Signale umgewandelt, die den Tieren in Intervallen von 120 ms jeweils für eine Dauer von 10 ms präsentiert werden.
Frequenzen von 1, 4, 8, 16, 32 und 40 kHz wurden bei hörenden Tieren randomisiert von 0 – 80 dB SPL, bei ertaubten Tieren von 50 – 100 dB SPL in 10 dB Schritten präsentiert. Die generierten neurologischen Signale wurden 20-fach verstärkt und nachfolgend mit einer Rate von 25 kHz und einem analogen high pass filter von 2,2 Hz in digitale Signale umgewandelt.
Mittels des TDT-Systems wurden die eingehenden digitalen Signale bei 300 Hz Hochpass und 3000 Hz Tiefpass gefiltert. Die Potential-Ausschluss-Schwellen zur Trennung der Mittelungen von Artefakten waren 100 – 200 µV. Zwischen 200 - 250 Ableitungen wurden pro Frequenz und Stimulusintensität gemittelt. Die Auswertung erfolgte offline. Die Hörschwelle je Frequenz wurde definiert als die niedrigste Stimulusintensität, welche reproduzierbare AABRs mit einer Amplitude von mindestens 0,5 µV evozierte (Yamagata et al. 2004).
2.2.2 Ertaubung von Meerschweinchen
Um die Ausgangssituation eines CI-Patienten mit sensorineuralem Hörverlust modellhaft darstellen zu können, muss eine gezielte Zerstörung der Haarzellen im Versuchstier gewährleistet sein. Es sind einige Methoden entwickelt worden, um einen schnellen und vollständigen Hörverlust bei Meerschweinchen zu erreichen. Aminoglykosidantibiotika sind bekannt für ihr hohes ototoxisches Potential. Einen wirkungsvollen Vertreter dieser Gruppe stellt das Kanamycin (2.1.4) dar. West et al. 1973 konnten nachweisen, dass eine Kombination Kanamycins mit dem Schleifendiuretikum Ethacrynsäure (2.1.4), welches mit einer Latenz von zwei Stunden verabreicht werden soll, zur permanenten Zerstörung fast aller Haarzellen führt. Für die Ertaubung der Tiere wurden 400 mg Kanamycin/kg KGW s.c.
injiziert. Nach einer Stunde wurden die Tiere narkotisiert (2.1.4.), die akustische Hörschwelle bestimmt und die Tiere für die Operation vorbereitet. Zunächst wurde ein linksseitiger
Material und Methoden
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35 paramedianer Hautschnitt an der ventralen Halsseite vorgenommen, die Halsmuskulatur den anatomischen Strukturen folgend stumpf durchtrennt und die externe V. jugularis vorgelagert.
Um das Gefäß wurden drei Schlaufen aus resorbierbarem Nahtmaterial gelegt. Der herzwärtsgelegene Faden wurde legiert, während die zwei übrigen locker als Schlaufen um das Gefäß verblieben. Unter mikroskopischer Sicht (7.3) wurde mittels einer feinen chirurgischen Schere (7.2) oberhalb der Legierung eine feine Venotomie durchgeführt, durch welche ein Silikonschlauch (7.2) ca. 1,5 cm in kraniale Richtung in die V. jugularis eingeführt wurde. Das Gefäß wurde durch sanftes Anziehen der mittleren Schlaufe um den Schlauch fixiert und die richtige Positionierung des Schlauches durch eine mit Natriumchlorid (NaCl;
2.1.4) gefüllte Spritze (7.3) überprüft. Floß bei Aspiration das Blut ohne jegliche Behinderung in den Schlauch bzw. floss bei Injektion keine Flüssigkeit neben das Gefäß, so lag der Schlauch optimal in der Vene. Anschließend wurde die NaCl-Spritze durch die Ethacrynsäure enthaltende Spritze ersetzt und 40 mg/kg KGW des Diuretikums langsam intravenös (i.v.) appliziert. Zum Durchspülen des Schlauches wurde anschließend wiederum die NaCl-haltige Spritze verwendet. Nach erfolgter Applikation wurde der Schlauch soweit zurückgezogen, dass seine Öffnung zwischen mittlerer und kranialer Schlaufe lag. Die oberste Schlinge wurde straff zugezogen und der Schlauch vollständig entfernt. Anschließend wurde die mittlere Ligatur entfernt, das Gefäß unter Sichtkontrolle zurückgelagert, die Muskulatur mit resorbierbarem Nahtmaterial (7.2) mittels Einzelheften verschlossen und die Haut mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial (7.2) adaptiert.
2.2.3 Schlauch- und Pumpen-Implantation
Am Vortag der Implantationsoperation (Tag vier) wurden die osmotischen Pumpen steril mit der jeweils anzuwendenden Lösung (7.4) befüllt. Am Experimentaltag fünf wurde zunächst der Erfolg der Ertaubung mittels AABR-Messung verifiziert. Nachfolgend wurde zur Freilegung der linksseitigen Bulla die Haut und das Platysma postaurikulär inzisiert, die Muskulatur nach kaudal verlagert und der mastoidale Anteil des Musculus sternocleidomastoideus von seinem Ursprung entfernt. Die Bulla wurde von ihrem Periost befreit, das Mittelohr mittels einer 11er Skalpellklinge (7.2) eröffnet und eine Cochleostomie der basalen Windung durchgeführt (Abb. 13). Eine zur Aufnahme der osmotischen Pumpe dienende subkutane Tasche wurde zwischen den Schulterblättern liegend angefertigt. Der Applikationsschlauch wurde mit der zu injizierenden Substanz gefüllt und mittels Epiglu® am Flow Moderator der osmotischen Pumpe befestigt. Die Pumpe wurde in der subkutanen Tasche zwischen den Scapulae positioniert (Brown et al. 1993) und der Schlauch wurde durch
Material und Methoden
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37 2.2.4 Pumpenwechsel
Da die verwendeten Mikropumpen eine Applikationsdauer von 14 Tagen aufweisen, die Tiere jedoch 28 Tage mit Substanzen versorgt werden sollten, fand am Versuchstag 19, 14 Tage nach der Implantation, ein Wechsel der Pumpen statt. Hierfür wurde am narkotisierten Tier ein medianer Hautschnitt zwischen den Schulterblättern geführt, die Pumpe vorgelagert und die korrekte Adaptation der Pumpe am Silikonschlauch makroskopisch kontrolliert. Alle am Versuchstag 19 untersuchten Schlauch-Pumpen-Verbindungen waren intakt. Nachfolgend wurde die Pumpe zusammen mit ca. 3 cm des Applikationsschlauches vom Rest des Schlauches getrennt und eine neue Pumpe befestigt. Diese wurde s.c. in die Position der verbrauchten Pumpe gebracht und die Wunde wurde dreischichtig verschlossen.
2.2.5 Gewinnung und Aufarbeitung der Cochlea 2.2.5.1 Transkardiale Perfusion
Am 33. Versuchstag wurden die Tiere erneut anästhesiert und zur Tötung transkardial perfundiert. Zuvor wurde dem betreffenden Tier 10 ml Xylonest® s.c. entlang der nachfolgenden Schnittlinien verabreicht: 1. median entlang der Linea alba bis zum Schlüsselbein, 2. in einem Bogen von der Apertura thoraxis bis in die rechte Achselhöhle, 3.
dem rechten letzen Rippenbogen ca. 2 cm folgend. Zunächst wurde eine Thorakotomie durchgeführt, das Herz freigelegt und der Herzbeutel eröffnet. Ein Schnitt in den rechten Vorhof ermöglichte den Abfluss von Blut und Perfusionslösung (Reuter 1997). In die linke Kammer wurde eine an einen Infusionsschlauch angeschlossene Kanüle (7.2) eingeführt über welche dem Herzen 200 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphat buffered saline, PBS (7.4)) zur Ausspülung des Blutes aus dem Kreislaufsystem zugeführt wurde.
Anschließend wurde der Körper durch Zufuhr von 200 ml 4 %-igem Paraformaldehyd (PFA (7.1)) fixiert.
2.2.5.2 Pumpentest
Nach erfolgter Perfusion wurde die Haut oberhalb der Mikropumpe eröffnet. Die korrekte Adaptation der Pumpe am Silikonschlauch wurde kontrolliert. Alle untersuchten Schlauch- Pumpen-Verbindungen waren intakt. Nachfolgend wurde der Silikonschlauch ca. 3 cm vor der Pumpe durchtrennt. Mittels einer Kanüle und einer Spritze wurde eine Luftblase ca. 0,5 cm vor dem Flow Moderator platziert und ihre Lage mittels eines wasserfesten Stiftes markiert. Anschließend wurden die Pumpen-Schlauch-Kombinationen waagerecht in einem Glasbehälter in NaCl gelagert und in einem Wärmeschrank bei 37 °C aufbewahrt. Nach ca. 24
Material und Methoden
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38 Stunden wurde die Bewegung der Luftblase beurteilt. Hatte sich diese in Richtung der Schlauchöffnung bewegt, so war die entsprechende Pumpe funktionell intakt. Der gleiche Funktionstest wurde mit den am Versuchstag 19 explantierten Pumpen durchgeführt. Alle getesteten Pumpen wiesen zum Zeitpunkt der Explantation volle Funktionalität auf.
2.2.5.3 Felsenbeinentnahme und Gewinnung der Cochlea
Der Fixierung folgten die Dekapitierung und die Abpräparation der Schädelhaut. Die Schädeldecke wurde durch zwei Scherenschnitte (7.2) vom Hinterhauptsloch in Richtung rostral zu den kaudalen Augenwinkeln hin gelöst und durch Umklappen nach rostral entfernt.
Nach Entfernung der Hirnanteile wurden die Felsenbeine manuell aus dem Schädel gelöst und in PBS (7.4) überführt. Die weitere Dissektion erfolgte unter einem Auflichtstereomikroskop (7.3) mittels feiner Pinzetten (7.2). Dabei wurde zunächst das Felsenbein eröffnet und die Bullawand großflächig entfernt. An den rechten Cochleae wurden die Membranen sowohl des runden wie auch des ovalen Fensters mittels einer feinen Pinzette (7.2) zerstört. An den linken Cochleae wurde das ovale Fenster eröffnet und die Schläuche wurden vorsichtig entfernt.
Allen Cochleae wurde eine kleine Öffnung in den Apex gebohrt. Anschließend wurden sie vom runden Fenster aus in Richtung Apex mit 4 %-igem PFA vorsichtig durchgespült, in 4%- iges PFA überführt und für 24 Stunden bei 4 °C im Dunkeln fixiert.
2.2.5.4 Aufbereitungen der Cochlea für die lichtmikroskopische Untersuchung Im Anschluss an den Fixationsvorgang wurden die Cochleae für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schwingtisch (7.3) in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (7.4) gespült. Zur Entkalkung wurden die Cochleae bei Raumtemperatur in Entkalkungslösung (EDTA; 7.4) auf einem Schwingtisch gelagert, welche täglich gewechselt wurde. Die Verweildauer war vom jeweiligen Verknöcherungsgrad abhängig und betrug ungefähr 3 bis 4 Wochen. Erneute Zugabe von Spülpuffer und eine Einwirkzeit von einer Stunde auf dem Schwingtisch beendeten die Entkalkung. Die Entwässerung erfolgte durch eine aufsteigende Alkoholreihe: 50 %-iges, 70 %-iges, 90 %-iges und 100 %-iges Ethanol (7.1), wobei die einzelnen Konzentrationen jeweils eine Stunde einwirkten. Anschließend wurden die Proben für 3 ½ Stunden in Benzol (7.1) unter dem Abzug eingelagert. Danach erfolgte die Einbettung der Präparate in Paraffin (7.1): die Cochleae wurden mit flüssigem Paraffin durchtränkt und über Nacht im 62 °C warmen Trockenschrank (7.3) belassen.
Nachfolgend wurden sie mit senkrecht stehender Schneckenachse in Einbettschälchen
Material und Methoden
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39 gestellt, welche mit Paraffin ausgegossen wurden. Die Paraffin-Cochlea-Blöcke erkalteten und erstarrten bei Zimmertemperatur.
2.2.5.5 Schneiden und Färben der Cochleae
Die Paraffin-Cochlea-Blöcke wurden aus ihren Schälchen herausgelöst und auf kleine Holzklötze aufgeschmolzen, welche in die Präparathalterung des Mikrotoms (7.3) eingesetzt wurden. Serienschnitte mit einer Stärke von 5 µm wurden angefertigt. Die Schnittrichtung wurde senkrecht zur Modiolusachse gewählt. Alle Schnitte wurden auf Objektträger (7.2) aufgezogen und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Die beschickten Objektträger wurden nach folgendem Hämalaun/Eosin-Färbeschema weiterbehandelt:
1. Xylol 2 x 8 Min.
2. 100 % Ethanol 5 Min.
3. 90 % Ethanol 5 Min.
4. 70 % Ethanol 5 Min.
5. Aqua dest. 5 Min.
6. Hämalaun 1,5 Min.
7. Leitungswasser 5 Min., anfangs wechseln
8. Eosin 0,5 Min.
9. Leitungswasser 5 Min., anfangs wechseln 10. 70 % Ethanol 5 Min.
11. 90 % Ethanol 5 Min.
12. 100 % Ethanol 5 Min.
13. Xylol 2 x 8 Min.
Die hier aufgeführten Substanzen werden unter 8.1 genauer aufgeführt. Nach der Färbung wurden die Schnitte mit Entellan® (7.1) eingedeckelt und für mindestens 24 Stunden zum Trocknen unter den Abzug gestellt.
2.2.6 Lichtmikroskopische Auswertung
Ein mitmodiolarer Schnitt wurde zufällig ausgewählt. Dieser erste Schnitt und jeder fünfte nachfolgende Schnitt wurden analysiert. SGZ erreichen einen maximalen Somadurchmesser von 22 μm im Meerschweinchen (Kellerhals 1967). Wählt man jeden fünften der Schnitte mit einer Dicke von 5 μm, ist gewährleistet, dass keine SGZ doppelt gezählt wird. Insgesamt wurden je Cochlea fünf Schnitte mit je sieben Querschnitten des Rosenthal’scher Kanals für die quantitative Analyse der SGZ herangezogen. Die Rosenthal´schen Kanäle wurden entlang
Material und Methoden
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40 der Windung von basal nach apikal als untere basale und obere basale Windung, als erste, zweite, dritte und vierte mittlere Windung sowie als apikale Windung bezeichnet (Abb. 14).
In jedem Paraffinschnitt wurde jeder Querschnitt des Rosenthal’scher Kanals beurteilt. Die Auswertung erfolgte unter Verwendung eines Mikroskops (7.3) und einer CCD-Kamera (7.3) mit angeschlossenem rechnergestütztem Bildbearbeitungssystem Analysis® (7.3). Zunächst erfolgte eine digitale Aufnahme jedes Rosenthal´schen Kanals. Dessen Kontur wurde mittels des Bildverarbeitungsprogramms nachgezogen und die jeweilige Fläche wurde computergestützt berechnet. Nachfolgend wurde die SGZ-Zahl pro Querschnitt bestimmt (Abb. 15). Einschlusskriterien für die SGZ in die Zählung waren ein Neurondurchmesser von mindestens 12 µm und ein sichtbarer Nucleus, wobei keine Differenzierung zwischen Typ I- und Typ II-SGZ (Spoendlin 1975) vorgenommen wurde. Aus der Fläche eines Rosenthal´schen Kanals und der sich darin befindenden SGZ-Anzahl wurde die SGZ-Dichte berechnet, welche als SGZ-Zahl pro 10.000 µm2 (SGZ/10.000 µm2) angegeben wurde. Auf Grund von Variabilitäten beim Schneidevorgang waren im apikalen Bereich der Cochlea nicht immer zuverlässige Flächenbestimmungen und Messungen der SGZ-Zahl möglich. Daher wurden diese Werte mit denen der vierten mittleren Windung kombiniert. Die erhobenen Daten der durchschnittlichen SGZ-Dichte jeder Cochlea wurden rechnergestützt unter Verwendung des Programms Graph Pad Prism (7.2) mittels Varianzanalyse (ANOVA, analysis of variance; 8.2) und Bonferroni-Test statistisch ausgewertet. Die Definition des im Ergebnisteil dargestellten Signifikanzniveaus wurde wie folgt bestimmt: p > 0,05 = nicht signifikant unterschiedlich (ns); p < 0,05 = signifikant unterschiedlich (*); p < 0,01 = hoch signifikant unterschiedlich (**); p < 0,001 = höchst signifikant unterschiedlich (***).
Ergebnisse
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43
3 Ergebnisse
3.1 Ertaubung - elektrophysiologische Ergebnisse
Einschlusskriterium für Tiere in die Versuchsreihe war ein mittels AABR als normal ermitteltes Hörvermögen der Tiere am Versuchstag 0 (Hörschwelle ≤ 50 dB SPL). Die Ertaubung der Meerschweinchen erfolgte systemisch durch die s.c. Verabreichung des ototoxischen Aminoglykosid-Antibiotikums Kanamycin und einer i.v. Gabe des Schleifendiuretikums Ethacrynsäure, um eine lokale Manipulation mit direkter Schädigung des Innenohrs zu vermeiden. Um die Ertaubung zu verifizieren, wurde vor Implantation des Schlauch-Mikropumpensystems eine erneute AABR-Messung durchgeführt. Eine Erhöhung der Hörschwelle um mindestens 50 dB belegte den Erfolg der Ertaubung (Agterberg et al.
2009). Die Hörschwelle je Frequenz wurde definiert als die niedrigste Stimulusintensität, welche reproduzierbare AABR mit einer Amplitude von mindestens 0,5 µV evozierte (Yamagata et al. 2004). Alle Tiere zeigten bei der initialen AABR-Messung normale Hörschwellen. Nach dem Eingriff zur Ertaubung wiesen alle Versuchstiere eine Hörschwellenerhöhung von mindestens 50 dB auf. Abb. 16 zeigt eine frequenzspezifische AABR-Messung an einem zunächst normal hörenden und nachfolgend ertaubten Meerschweinchen.
Ergebnisse
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44
Abb. 16: Beispielhafte Darstellung einer vor (Versuchstag 0, A) und nach (Versuchstag 5, B) Ertaubung durchgeführten AABR-Messung (Tier A 16). Je Frequenz sind die ersten 10 ms nach Stimulusgabe gegen die Stimulusamplitude aufgetragen. Die Reizintensitäten (dB SPL) sind links außen beschrieben. Abb. 16A zeigt die frequenzspezifischen Hörschwellen des normal hörenden Tieres, die evozierten Potentiale sind klar zu erkennen. Am Versuchstag 5 wurde die zur Abb. 16B gehörende Messung durchgeführt. Trotz starker Verringerung der Darstellung von 64,1 µV vor der Ertaubung auf 8,7 µV fünf Tage nach Ertaubung ist bei keiner Frequenz eine Reizantwort detektierbar.
