In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur Evolution nichtribosomaler Peptidsynthetasen

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(1)In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur Evolution nichtribosomaler Peptidsynthetasen. Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.). dem Fachbereich Chemie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von. Stephan Grünewald aus Iserlohn. Marburg/Lahn 2005.

(2) Vom Fachbereich Chemie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am 5. August 2005 angenommen.. Erstgutachter:. Prof. Dr. Mohamed A. Marahiel. Zweitgutachter: Prof. Dr. Lars O. Essen. Tag der mündlichen Prüfung: 5. August 2005.

(3) Zusammenfassung Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPSs) katalysieren die Synthese einer großen Anzahl strukturell vielfältiger Naturstoffe. Hierbei bestimmen die Anzahl und Organisation von sich wiederholenden Modulen und Domänen innerhalb eines Proteintemplates die Primärstruktur, Größe und Komplexität des synthetisierten PeptidProduktes. Aufgrund der modularen Organisation sind NRPSs für ein rationales Design prädestiniert, da durch Veränderung der Proteintemplate völlig neuartige Naturstoffderivate generiert werden können. In der Vergangenheit führten derartige Manipulationen zu erheblichen Einbußen in der Produktivität der konstruierten, artifiziellen Systeme, was auf eine gestörte Kommunikation zurückgeführt wurde. Diese Limitationen ließen sich durch den Einsatz evolutiver Verfahren überwinden, wobei jedoch der Aufbau solcher Systeme aufgrund der enormen Größe von NRPSs nicht ohne weiteres möglich ist. In der vorliegenden Arbeit sollten die Grundlagen für den Aufbau von Modellsystemen für die Evolution von NRPSs geschaffen werden. Zum einen wurde ein System für die in vitro-Evolution der Substratselektivität von Adenylierungs-(A)-Domänen aufgebaut. In Anlehnung an vergleichbare Arbeiten an tRNA-Synthetasen wurde hierzu zunächst – ausgehend von TycA – eine A-Domäne geschaffen, in der nahezu alle Konstituenten der Substratbindungstasche zu Alanin mutiert wurden. Auf dem Weg hierhin wurden insgesamt 15 Einzel- und Mehrfachmutanten generiert, die hinsichtlich ihrer katalytischen Effizienz bei der Aktivierung der kognaten Aminosäure L-Phenylalanin, sowie auf die Aktivierung mis- und non-kognater Substrate untersucht wurden. Zur Implementierung des sogenannten in vitro compartmentalization-(IVC)-Systems wurde nachfolgend die beobachtete Nebenselektivität für 3-Nitro-Tyrosin ausgenutzt. Hierbei konnten alle Teilschritte des IVC-Systems zur Evolution der A-Domänenselektivität erfolgreich etabliert werden. Einzig die finale Detektion des Enzym-gebundenen 3-Nitro-Tyrosins scheiterte aufgrund einer unzureichenden Spezifität der kommerziell verfügbaren Antikörper. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine in vivo-Methode für die Evolution von NRPSs entwickelt. Ausgangspunkt bildete die Konstruktion verschiedener, dimodularer NRPS-Systeme für die heterologe Produktion des zyklischen Dipeptides D-PheL-Pro-Diketopiperazin (DKP). Dieses Dipeptid besitzt verschiedene Bioaktivitäten u. a. als Biosensor und Antibiotikum, die im Hinblick auf die Etablierung von in vivoSelektionssystemen ausgenutzt werden können. Die konstruierten NRPS-Systeme wurden in E. coli untersucht und nachfolgend hinsichtlich ihrer Effizienz optimiert. Durch Variation endo- und exogener Parameter konnte hierbei die Produktivität des heterologen Wirtes E. coli für die nichtribosomale Synthese von D-Phe-L-Pro-DKP um 400 % auf 38 µM (12 mg/g BDW) gesteigert werden. Dieser Produkttiter liegt in einem Bereich, der das generierte NRPS-System für den Aufbau eines auf der antibiotischen Wirkung von DKP basierten in vivo-Selektionssystems qualifiziert..

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(5) Inhaltsverzeichnis. I. Inhaltsverzeichnis 1. ABKÜRZUNGEN. 1. 2. EINLEITUNG. 4. EVOLUTION. 4. 2.1. 2.1.1 DIE NATÜRLICHE EVOLUTION. 4. 2.1.2 DIE EVOLUTION IM REAGENZGLAS. 5. 2.2. DAS IN VITRO COMPARTMENTALIZATION-SYSTEM. 7. 2.3. WARUM PROTEINEVOLUTION?. 9. 2.4. RIBOSOMALE PROTEINBIOSYNTHESE. 11. 2.5. NICHTRIBOSOMALE PEPTIDSYNTHESE. 13. 2.6. DIE DOMÄNEN DER NICHTRIBOSOMALEN PEPTIDSYNTHETASEN. 14. 2.7. GERICHTETE MANIPULATION UND EVOLUTION VON NICHT-RIBOSOMALEN. PEPTIDSYNTHETASEN. 18. 2.8. 22. 3. AUFGABENSTELLUNG MATERIAL. 23. 3.1. CHEMIKALIEN, ENZYME UND LABORPRODUKTE. 23. 3.2. GERÄTE. 24. 3.3. VEKTOREN. 25. 3.3.1. PQE60. 25. 3.3.2. PQE61. 25. 3.3.3. PSU18. 25. 3.3.4. PTRC99A. 26. 3.3.5. PIVEX2.5D. 26. 3.3.6. PREP4[GSP]. 26. 3.4. MIKROORGANISMEN. 27. 3.5. MEDIEN UND ZUSÄTZE. 28. 3.5.1 MEDIEN FÜR DIE ANZUCHT VON E. COLI. 28. 3.5.1.1 LB-Medium. 28. 3.5.1.2 M9-Medium. 28. 3.5.2 MEDIEN FÜR DIE ANZUCHT VON VIBRIO-STÄMMEN. 28.

(6) II. Inhaltsverzeichnis. 3.5.2.1 Medium 101. 28. 3.5.2.2 Medium115. 29. 3.5.2.3 Medium 246a. 29. 3.5.2.4 Medium 514. 29. 3.5.3 FESTE NÄHRMEDIEN. 30. 3.5.4 ANTIBIOTIKA UND ZUSÄTZE. 30. 4. 31. 4.1. METHODEN MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN. 31. 4.1.1 PLASMID-KONSTRUKTION. 31. 4.1.1.1 Plasmide der in vitro-Systeme. 31. 4.1.1.2 Plasmide der in vivo-Systeme. 34. 4.2. 35. PROTEINCHEMISCHE METHODEN. 4.2.1 ALLGEMEINE METHODEN. 35. 4.2.2 GENEXPRESSION. 36. 4.2.2.1 Genexpression in Systemen der TycA-Derivate. 36. 4.2.2.2 Genexpression in Systemen der in vivo-D-Phe-L-Pro-DKP-Produktion. 36. 4.2.3 ZELLAUFSCHLUSS. 37. 4.2.4 PROTEINREINIGUNG MITTELS STREPTACTIN-AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE 2+. 38. 4.2.5 PROTEINREINIGUNG MITTELS NI -NTA-AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE. 39. 4.2.6 PROTEINREINIGUNG MITTELS ANTI-HA-AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE. 40. 4.2.7 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG. 41. 4.2.7.1 ATP/PPi-Austauschreaktion. 41. 4.2.7.2 Ermittlung der kinetische Konstanten KM und kcat. 42. 4.2.7.3 Direkte Beladungsreaktion. 42. 4.2.7.4 Indirekte Beladungsreaktion. 43. 4.2.8 DOT-BLOT-ANALYSE. 44. 4.2.9 IN VITRO-PRODUKTBILDUNGSASSAY. 45. 4.2.10 IN VITRO-TRANSLATION. 46. 4.2.11 KOPPLUNG IN VITRO-TRANSLATIERTER PROTEINE AN STREPTAVIDIN-BESCHICHTETE BEADS 47 4.3. ANALYTISCHE METHODEN. 49. 4.3.1 PRÄPARATION VON D-PHE-L-PRO-DKP. 49. 4.3.2 HPLC-ANALYSE. 49.

(7) Inhaltsverzeichnis. III. 4.3.3 HPLC/MS-ANALYSE. 50. 4.4. 50. 5. KULTIVIERUNG DER VIBRIO-STÄMME ERGEBNISSE I: ENTWICKLUNG EINES MODELLSYSTEMS FÜR DIE IN. VITRO-EVOLUTION VON NICHTRIBOSOMALEN PEPTID-SYNTHETASEN. 51. 5.1. STRATEGIE. 51. 5.2. VARIATION DER BINDUNGSTASCHE FÜR DIE EVOLUTION VON A-DOMÄNEN. 52. 5.3. KONSTRUKTION UND ÜBERPRODUKTION DER TYCA-DERIVATE. 53. 5.4. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TYCA-DERIVATE. 55. 5.5. KATALYTISCHE EFFIZIENZ DER TYCA-DERIVATE. 56. 5.6. UNTERSUCHUNG DER SUBSTRATSELEKTIVITÄT. 60. 5.7. ZUSAMMENFASSUNG: VARIATION DER BINDUNGSTASCHE FÜR DIE EVOLUTION VON A-. DOMÄNEN. 65. 5.8. DAS IN VITRO-COMPARTMENTALIZATION-SYSTEM. 67. 5.9. AKTIVIERUNG UND KOVALENTE BINDUNG VON 3-NITRO-TYROSIN. 69. 5.9.1 NEBENSPEZIFITÄT DER TYCA-A-DOMÄNE FÜR 3-NITRO-TYROSIN. 69. 5.9.2 KOVALENTE BINDUNG VON 3-NITRO-TYROSIN. 70. 5.10 KONSTRUKTION DES IN VITRO-TRANSLATIONSSYSTEMS. 73. 5.10.1 KONSTRUKTION UND ANALYSE DER TEMPLAT-DNA. 73. 5.10.2 IN VITRO-TRANSLATION. 75. 5.11 AKTIVITÄT VON IMMOBILISIERTEM PHEAT-HA-TAG. 77. 5.11.1 SENSITIVITÄT DER ATP/PPI-AUSTAUSCHREAKTION. 77. 5.11.2 SUBSTRAT-AKTIVIERUNG DURCH IMMOBILISIERTES PROTEIN. 78. 5.12 ANIKÖRPER-DETEKTION DES GEBUNDENEN 3-NITRO-TYROSINS. 79. 5.13 ANWENDBARKEIT DES IN VITRO-COMPARTMENTALIZATION-SYSTEMS FÜR DIE EVOLUTION VON NICHTRIBOSOMALEN PEPTIDSYNTHETASEN 6. 81. ERGEBNISSE II: ETABLIERUNG EINES SYSTEMS FÜR DIE IN VIVO-. EVOLUTION VON NICHTRIBOSOMALEN PEPTID-SYNTHETASEN IN ESCHERICHIA COLI. 82. 6.1. STRATEGIE. 82. 6.2. KONSTRUKTION EINES NRPS-SYSTEMS FÜR DIE IN VIVO-PRODUKTION VON D-PHE-L-. PRO-DKP. 83.

(8) IV. Inhaltsverzeichnis. 6.3. IN VIVO-PRODUKTION VON D-PHE-L-PRO-DKP. 85. 6.3.1 DKP-PRODUKTION IN LB-MEDIUM. 85. 6.3.2 DKP-PRODUKTION IN M9*-MEDIUM. 87. 6.3.3 EINFLUSS DER FERMENTATIONSBEDINGUNGEN AUF DIE DKP-BILDUNG. 88. 6.4. VERGLEICH UNTERSCHIEDLICHER SYSTEME FÜR DIE D-PHE-L-PRO-DKP-. PRODUKTION. 90. 6.4.1. D-PHE-L-PRO-DKP-PRODUKTION AM FUSIONSSYSTEM TYCA-TYCB1. 91. 6.4.2. D-PHE-L-PRO-DKP-PRODUKTION IN ABHÄNGIGKEIT EINES AKZEPTOR-MODUL-. ÜBERSCHUSSES. 92. 6.4.2.1 Ermittlung des optimalen Verhältnisses von TycA zu TycB1 für die D-Phe-L-ProDKP-Bildung. 93. 6.4.2.2 Konstruktion und Charakterisierung des Zweiplasmidsystems. 94. 6.4.2.3 Untersuchung der DKP-Produktion im Zweiplasmidsystem. 97. 6.4.2.4 Biochemische Charakterisierung der im Zweiplasmidsystem produzierten Enzyme TycA und TycB1 6.5 7 7.1. UNTERSUCHUNG DER DKP-SENSITIVITÄT VON VIBRIO-STÄMMEN DISKUSSION UNTERSUCHUNG VON TYCA-BINDUNGSTASCHEN-MUTANTEN. 98 102 105 106. 7.1.1 KATALYTISCHE EFFIZIENZ DER TYCA-BINDUNGSTASCHEN-MUTANTEN. 108. 7.1.2 NEBENSPEZIFITÄTEN DER TYCA-BINDUNGSTASCHEN-MUTANTEN. 110. 7.2. 114. DAS IN VITRO-COMPARTMENTALIZATION-SYSTEM. 7.2.1 KONSTRUKTION EINES IN VITRO-TRANSLATIONSSYSTEMS. 116. 7.2.2 AKTIVITÄT DES IMMOBILISIERTEN PROTEINS PHEAT-HATAG. 117. 7.2.3 AKTIVIERUNG UND KOVALENTE BINDUNG VON 3-NITRO-TYROSIN. 118. 7.2.4 ANTIKÖRPER-DETEKTION DES GEBUNDENEN SUBSTRATES. 120. 7.2.5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK. 122. 7.3. 124. IN VIVO-EVOLUTIONSSYSTEME FÜR NICHTRIBOSOMALE PEPTID-SYNTHETASEN. 7.3.1 DIKETOPIPERAZINE – BIOAKTIVE DIPEPTIDE. 124. 7.3.2 DIE IN VIVO-PRODUKTION VON D-PHE-L-PRO-DIKETOPIPERAZIN. 126. 7.3.3 ANSÄTZE ZUR OPTIMIERUNG DES DKP-PRODUKTIONSSYSTEMS. 128. 7.3.4 OPTIMIERUNG DER IN VIVO D-PHE-L-PRO-DKP-PRODUKTION. 130. 7.3.5 EINFLUSS DER WACHSTUMSBEDINGUNGEN AUF DIE KATALYTISCHE AKTIVITÄT VON NICHTRIBOSOMALEN PEPTIDSYNTHETASEN. 132.

(9) Inhaltsverzeichnis. V. 7.3.6 ETABLIERUNG EINES PHE-PRO-DKP-BASIERTEN SELEKTIONSSYSTEMS. 134. 7.3.7 HETEROLOGE PRODUKTION ARTIFIZIELLER, NICHTRIBOSOMALER PEPTIDE. 135. 8. 137. 8.1 9. ANHANG OLIGONUCLEOTIDE LITERATURVERZEICHNIS. 137 138.

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(11) Abkürzungen. 1. 1. Abkürzungen. A-Domäne. Adenylierungs-Domäne. Ampn. Ampicillin (n µg/ml Endkonzentration). AS. Aminosäure. ATCC. Stammsammlung (American Type Culture Collection). ATP. Adenosin-5’-triphosphat. BDW. Biotrockenmasse (biomass dry weight). bp. Basenpaare. BSA. Rinderserumalbumin (bovine serum albumin). C-Domäne. Kondensations-Domäne (condensation domain). Cmn. Chloramphenicol (n µg/ml Endkonzentration). CoA. Coenzym A. COM-Domäne kommunikations-vermittelnde Domäne (communication mediating domain) cpm. gezählte Zerfälle pro Minute (counts per minute). Da. Dalton. DKP. Diketopiperazin. DNA. Desoxyribonucleinsäure. dpm. Zählrate (desinetgrations per minute). E-Domäne. Epimerisierungs-Domäne. EDTA. Ethylendiamintetraessigsäure. EK. Endkonzentration. EPS. Einplasmidsystem. FPLC. fast protein liquid chromatography. FS. Fusionssystem. HABA. 2-[4’-Hydroxybenzeneazol]benzoic acid. HEPES. N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-ethansulfonsäure. HPLC. Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (high performance liquid chromatography). HRP. horseradish peroxidase. IPTG. Isopropyl-β-D-thiogalactosid. IVC. in vitro compartmentalization.

(12) 2. Abkürzungen. k. kilo (103). Kann. Kanamycin (n µg/ml Endkonzentration). kb. Kilobasenpaare. l. Liter. m. milli (10-3). M. molar (mol/l). µ. micro (10-6). mRNA. messenger-RNA. MS. Massenspektrometrie. n. nano (10-9). NRPS. nichtribosomale Peptidsynthetase. ODλ. optische Dichte bei der Wellenlänge λ [nm]. p. pico (10-12). PAGE. Polyacrylamidgelelektrophorese. PCP. Thiolierungsdomäne (peptidyl-carrier-protein). PCR. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction). Ppant. 4’-Phosphopantethein. PPi. anorganisches Pyrophosphat (inorganic pyrophosphate). RNA. Ribonucleinsäure. ssDNA. einzelsträngige DNA (single stranded). SDS. Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate). TCA. Trichloressigsäure. Te-Domäne. Thioesterase-Domäne. TFA. Trifluoressigsäure. tRNA. transfer-RNA. Upm. Umdrehungen pro Minute. UV. ultraviolett. v/v. Volumen/Volumen. w/v. Gewicht/Volumen (weight per volume). ZPS. Zweiplasmidsystem.

(13) Abkürzungen. 3. Tabelle 1-1: Aminosäuren. Aminosäure. 3-BuchstabenCode. 1-BuchstabenCode. Molekulargewicht [g mol-1]. Alanin. Ala. A. 89. Arginin. Arg. R. 174. Asparagin. Asn. N. 132. Aspartat. Asp. D. 133. Cystein. Cys. C. 121. Glutamat. Glu. E. 147. Glutamin. Gln. Q. 146. Glycin. Gly. G. 75. Histidin. His. H. 155. Isoleucin. Ile. I. 131. Leucin. Leu. L. 131. Lysin. Lys. K. 146. Methionin. Met. M. 149. Ornithin. Orn. O. 132. Phenylalanin. Phe. F. 165. Prolin. Pro. P. 115. Serin. Ser. S. 105. Threonin. Thr. T. 119. Tryptophan. Trp. W. 204. Tyrosin. Tyr. Y. 181. Valin. Val. V. 117.

(14) 4. Einleitung. 2. Einleitung. 2.1. Evolution. 2.1.1. Die natürliche Evolution Bis zum Ende des 18. Jahrhunderts galt in der Biologie die vorherrschende. Lehrmeinung von der Unveränderlichkeit der Arten, die aus dem biblischen Schöpfungsbericht abgeleitet wurde. So vertrat der schwedische Naturforscher Carl von Linné (1707 – 1778) die Ansicht, dass die Arten, so wie sie jetzt vorgefunden werden, seit Beginn der Welt vorhanden seien. Jean de Lamarck (1744 – 1829) kam zur Erkenntnis der Homologie von Organen und erklärte diese durch Verwandtschaft der Organismen. In seinem Buch „Philosophie zoologique“ (1809) vertrat er eine Stammesentwicklung der Organismen und wurde somit zum Begründer der Evolutionstheorie. Er nahm an, dass die Lebewesen sich durch Gebrauch oder Nichtgebrauch ihrer Organe unmittelbar an die Bedürfnisse anpassen, und dass sich eine solche individuell erworbene Anpassung auf die Nachkommen vererbt. Diese Hypothese wurde allerdings mit der Entdeckung der Genetik widerlegt. Charles Darwin (1809 – 1882) schließlich beschrieb in seinem Buch „On the origin of species by means of natural selection“ den Gedanken, dass die heutigen Lebewesen von früheren, einfachen Formen abstammen und durch natürliche Selektion entstanden sind. In diesem Zusammenhang prägte er den wohl bekanntesten Begriff der Evolutionsforschung: „survival of the fittest“ (Überleben des Tauglichsten). In dem Wettbewerb oder „Kampf ums Dasein“ (struggle for life) überleben die am besten an ihre Umwelt angepassten Individuen, wobei mit besonders tauglich im Sinne der Evolutionstheorie nicht der Stärkste gemeint ist, sondern das Individuum, das die höchste Zahl von Nachkommen hat, die ihrerseits wieder zur Fortpflanzung gelangen.. Dabei. führt. die. natürliche. Selektion. durch. eine. sich. ständig. vervollkommnende Anpassung an die Umweltverhältnisse zu einer allmählichen Umbildung der Arten. Seit dem 20. Jahrhundert schließlich tragen vor allem die Genetik und die Molekularbiologie. zur. Erklärung. und. dem. besseren. Verständnis. des. Evolutionsvorganges bei, der durch mehrere Faktoren beeinflusst wird (Abb 2-1). Zum einen führen Mutationen zu einer hohen genetischen Variabilität und schaffen neue bzw. veränderte Gene, die allen erblichen Merkmalen zugrunde liegen, und damit neue Eigenschaften. Die Selektion wählt anschließend vorteilhafte Phänotypen.

(15) Einleitung. 5. aus dem veränderten Gen-Pool der Population aus. Darüber hinaus kann sich die Zusammensetzung des Gen-Pools einer Population auch dann von einer Generation zur anderen verändern, wenn weder Mutationen auftreten, noch die Selektion wirkt. Diese Änderungen durch zufälligen Tod oder zufälliges Überleben von Trägern bestimmter Merkmale bezeichnet man als Gendrift [Linder, 1989].. Abb 2-1: Zusammenwirken der Evolutionsfaktoren. Durch Mutation wird der Gen-Pool durch Änderung oder Neubildung von Genen verändert. Die Selektion verändert den Gen-Pool durch Auslese von Individuen, die Träger vorteilhafter Gene und Genkombinationen sind. Die zufällig erfolgende Gendrift verändert den Gen-Pool durch Verlust oder Häufigkeitsveränderung von Genen. Abbildung nach [Linder, 1989].. 2.1.2. Die Evolution im Reagenzglas Durch die rasante Entwicklung der Genetik und Molekularbiologie gewann. der Mensch einen immer tieferen Einblick in die molekularen Grundlagen der Evolution. Gerade in den letzten zwei Jahrzehnten versuchte er, sich diese Kenntnisse zu Nutze zu machen und durch die Entwicklung geeigneter Verfahren im Labor der natürlichen Evolution vorzugreifen. Dazu war es notwendig, die bereits in Kapitel 2.1.1 vorgestellten Evolutionsfaktoren Mutation und Selektion zu kontrollieren und miteinander zu verbinden. Der Angriffspunkt der Evolutionsmechanismen liegt bei den Genen, deren willkürliche Veränderung bzw. Mutation die Grundlage der Evolution bildet. Dazu wurden anfangs Methoden wie die Bestrahlung von Zielorganismen mit UV- oder.

(16) 6. Einleitung. Röntgenstrahlung eingesetzt [Benado, 1976; Nothel, 1987]. Später wurde die von Kary B. Mullis entwickelte Polymerasekettenreaktion (PCR) sicherlich zum wichtigsten Instrument in der artifiziellen Evolution [Saiki, 1985; Mullis, 1987]. Dieses Verfahren ermöglichte vor allem die Veränderung einzelner Gene und ihrer Produkte – der Proteine. Durch eine stete Weiterentwicklung und Modifikation der PCR, die ursprünglich zur gezielten Vervielfältigung einzelner Gene eingesetzt wurde, stehen heute eine Vielzahl von Methoden zur Mutation bzw. Variation von Genen zur Verfügung. So wird bei der „Error-prone“-PCR [Beckmann, 1985; Cadwell, 1992] der Reaktion gezielt Manganchlorid zugesetzt, das die Spezifität der DNA-Polymerase herabsetzt und damit zu einer Erhöhung der Fehlerrate während der PCR führt. Beim „DNA-Shuffling“ [Stemmer, 1994] werden zuvor fragmentierte homologe Gene miteinander rekombiniert, wobei die Ausgangs-Genfragmente zugleich als Primer dienen. Eine dem „DNA-Shuffling“ verwandte Methode ist der „Staggered extension process (StEP)“ [Zhao, 1998]. Bei diesem Verfahren werden ebenfalls homologe Gene rekombiniert, die zuvor jedoch nicht fragmentiert werden müssen. Durch sehr kurze oder überhaupt nicht eingeführte Elongationszeiten, kommt es zu einer KreuzHybridisierung, einem Wechsel des Eltern-DNA-Stranges der wachsenden DNAAmplifikate, während der PCR. Durch diese und ähnliche Methoden ist es mittlerweile möglich, DNA-Bibliotheken von bis zu 1015 unterschiedlichen Molekülen zu generieren. Nachdem eine DNA-Bibliothek generiert wurde, muss diese anschließend transkribiert und translatiert werden. Die Translation kann sowohl in vivo, wie z. B. beim „Phage Display“ [Smith, 1997], oder in vitro, wie z. B. beim „Ribosome Display“ [Hanes, 1998; Roberts, 1999] oder bei der mRNA-Protein-Fusion [Roberts,. 1997;. Roberts,. 1999],. erfolgen. Gemein haben alle Verfahren, dass. anschließend die an die genetische Information gekoppelte Proteinbibliothek hinsichtlich der gewünschten Funktion selektiert wird. Die Selektion erfolgt dabei häufig über die Bindung der Proteine z. B. an immobilisierten Antikörpern oder aber z. B. über die Markierung durch Fluoreszenzmarker. Eine wichtige Grundvoraussetzung für die Evolution im Labor ist die Kopplung von Genotyp und Phänotyp, damit nach erfolgter Selektion ein evolviertes Molekül auch dem entsprechenden Gen zugeordnet werden kann. Teilweise umfassen Nucleinsäuren gleichzeitig die Funktion von Genotyp, einer Sequenz, die repliziert werden kann, und Phänotyp, einer funktionellen Einheit. Meist codieren die Gene jedoch für Proteine, die aufgrund ihrer katalytischen Aktivität selektiert werden.

(17) Einleitung. 7. können. Beim Phage-Display werden die Proteine an der Phagen-Oberfläche präsentiert und sind somit an die im Phagen-Innern enthaltene DNA gebunden. Die mRNA-Protein-Fusion macht sich einen DNA-Puromycin-Linker zu Nutze, der eine kovalente Bindung des synthetisierten Proteins über das Ribosom an die mRNA ausbildet. Beim Ribosome Display wird die Translation zu einem bestimmten Zeitpunkt gestoppt, so dass die Kopplung zwischen mRNA und Protein lediglich durch das Ribosom gebildet wird. Diese artifiziellen physikalischen GenotypPhänotyp-Kopplungen unterscheiden sich grundlegend vom Beispiel der Natur. Hier werden Gene, die durch sie codierten Proteine und ihre Produkte in kleinen Kompartimenten, den Zellen, zusammengehalten. Im folgenden Abschnitt wird ein neuartiges Verfahren vorgestellt, das der natürlichen Umgebung, in der die Evolution stattfindet, nachempfunden ist.. 2.2. Das in vitro compartmentalization-System Im in vitro-compartmentalization-(IVC)-System liegen Gene, die durch sie. codierten Enzyme und deren Produkte zusammen in einem abgeschlossenen Raum vor [Tawfik, 1998; Griffiths, 2000]. Dadurch werden die Zellen, in denen die natürliche Evolution abläuft, imitiert. Das IVC-System beruht auf der Ausbildung von Wasser-inÖl-Emulsionen. In den wässrigen Tröpfchen können einzelne, zuvor mutierte Gene transkribiert und translatiert werden. (Abb 2-2).. 1. 2. Genbibliothek Enzym. Substrat. mRNA. 6. Gen. ausgewähltes Gen. 3 5. 4. Enzym. Produkt. Abb 2-2: Funktionsweise des IVC-Systems. (1) Ausbildung der Wasser-in-Öl-Emulsion, (2) Transkription und Translation, (3) Substratumsatz durch evolvierte Enzyme, (4) Aufbrechen der Emulsion, (5) Auswahlverfahren oder (6) neue Evolutionsrunde. Abbildung nach [Tawfik, 1998]..

(18) 8. Einleitung. Zunächst wird eine DNA-Bibliothek erstellt, deren Gene mit einem bestimmten Substrat verbunden sind, das aufgrund der gewünschten Aktivität der evolvierten Proteine umgesetzt werden kann. Diese modifizierte Gen-Bibliothek wird anschließend mit einem Transkriptions-/Translationsmix vermischt und in eine Wasser-in-Öl-Emulsion überführt (1), in der statistisch pro Kompartiment jeweils ein Gen-Substrat-Komplex enthalten ist. Innerhalb der wässrigen Tröpfchen werden die Gene nun transkribiert und translatiert (2). Weisen die synthetisierten Proteine die gewünschte enzymatische Aktivität auf, so werden die Gen-gebundenen Substrate in diesen Kompartimenten umgesetzt (3). Diese Reaktion bleibt entsprechend in Kompartimenten. mit. inaktiven. Enzymen. aus.. Danach. wird. die. Emulsion. aufgebrochen (4), alle Reaktionen werden gestoppt und die Gen-Substrat- bzw. GenProdukt-Komplexe vereint. Schließlich werden die Gene, die mit einem Produkt verbunden sind, selektiv über geeignete z. B. auf Bindung oder Fluoreszenz basierende Auswahlverfahren angereichert (5) und können weiterhin amplifiziert und charakterisiert werden. Alternativ können die Moleküle der ersten Evolutionsrunde, die für gewöhnlich zunächst eine sehr geringe Aktivität aufweisen, in weiteren Runden zu effektiveren Enzymen evolviert werden, vorausgesetzt, sie haben die erste Selektions-Barriere überwunden (6). Die Wasser-in-Öl-Emulsionen bieten gute Voraussetzungen für die in vitroEvolution [Griffiths, 2000], da: i) die externe Phase biochemisch inert ist, so dass keine Störungen durch äußere Faktoren auftreten; ii) allein die interne Phase biochemisch aktiv ist und neben der DNA den gesamten erforderlichen Transkriptions-/Translationsmix enthält; iii) die Kopplung von Genotyp und Phänotyp gewahrt wird, da keine Diffusion der Gene oder Proteine zwischen den einzelnen Kompartimenten stattfindet; iv) die Größe der Wassertröpfchen zwischen 0,1 und 50 µm variieren kann, so dass stets eine Optimierung für die Transkription einzelner Gene stattfinden kann; v) eine Emulsion von 1 ml mit einer durchschnittlichen Tröpfchengröße von 2,6 µm ca. 1010 Kompartimente umfasst, die statistisch jeweils ein Gen enthalten. 1 ml einer Bakterienkultur enthält zum Vergleich nur etwa 10 8 Zellen; vi) die Emulsionen in einem Temperaturbereich zwischen 4 und 45 °C über mehrere Tage äußerst stabil sind;.

(19) Einleitung. 9. vii) die Emulsionen leicht innerhalb von kürzester Zeit durch Rühren hergestellt und durch Zentrifugation und anschließender Behandlung mit Ether wieder gebrochen werden können.. Das IVC-System zeigt auch gegenüber anderen Evolutionssystemen deutliche Vorteile. Dazu gehört die vollständige Durchführung in vitro, wodurch die potentielle Bibliotheksgröße enorm erweitert wird (1010 – 1015). In vivo-Verfahren wie Phage-Display. und. Yeast-Display. enthalten. immer. Transformations-. bzw.. Transfektionsschritte, die aufgrund der natürlichen Effizienz limitierend wirken (Bibliotheken zwischen 106 und 109). Darüber hinaus arbeitet das IVC-System mit DNA und ermöglicht somit eine einfachere Handhabung im Vergleich zu der weitaus instabileren RNA, die z. B. im Ribosome-Display eingesetzt wird. Schließlich bietet das IVC-System durch die vollständige Isolierung, die durch die Kompartiment-Bildung hervorgerufen wird und die Synthese gleich mehrerer Proteine pro Tröpfchen die einzigartige Möglichkeit, auch die katalytischen Fähigkeiten der Proteine zu untersuchen. Schafft man eine physikalische Bindung zwischen Gen und den durch die Proteine umgewandelten Substraten, so kann deren Anzahl als Maß für die katalytische Aktivität des untersuchten Proteins angesehen werden.. 2.3. Warum Proteinevolution? Enzyme sind in der Lage, die unterschiedlichsten chemischen Reaktionen. zu katalysieren. Sie können Umsetzungen innerhalb von Minuten oder gar Sekunden vollziehen, die unkatalysiert möglicherweise Jahrhunderte dauern würden, und somit die Umsatzrate um Faktoren bis zu 1017 beschleunigen [Griffiths, 2000]. Diese Eigenschaften machen sie für solche industrielle Anwendungen interessant, in denen sie die chemische Synthese von Zielverbindungen ergänzen bzw. ersetzen können. Enzyme arbeiten für gewöhnlich in wässrigem Milieu und bei moderaten Temperaturen. Für industrielle Zwecke ist es jedoch zum Teil vorteilhaft, wenn diese Biokatalysatoren auch bei höheren Temperaturen, hohen Substratkonzentrationen und in organischen Lösemitteln stabil wären. Zu diesem Zweck werden Proteine bestimmten. Evolutionsmechanismen. unterworfen.. Das. Ziel. eines. solchen. Evolutionsprozesses ist neben der Erhöhung der Enzymstabilität zumeist die.

(20) 10. Einleitung. Veränderung der Substratspezifität, die Erhöhung der katalytischen Aktivität oder die Veränderung der Enantioselektivität. Es scheint naheliegend zu sein, dass man sich für die Proteinevolution zunächst bekannter Enzyme bedient und in diesen bestimmte Positionen des aktiven Zentrums, die für die katalytische W irksamkeit bzw. die Bindung des Substrates verantwortlich sind, variiert. Ein Austausch von Aminosäure-Resten kann somit zu einer Verbesserung hinsichtlich der gewünschten Aktivität des Enzyms führen. Ein solches rationales Protein-Design setzt jedoch die Kenntnis der Kristallstruktur des Zielproteins voraus, wodurch dieser Ansatz für die meisten Enzyme nicht verfolgt werden kann. Eine Lösung für dieses Problem bietet die Zufallsmutagenese (Methoden vgl. Kapitel 2.1.2), durch die DNA-Bibliotheken von enormer Größe geschaffen werden können. Dabei werden über das ganze Gen bzw. einen zuvor bestimmten Genbereich statistisch Mutationen generiert. Anschließend werden diese Bibliotheken auf eine gewünschte Proteinfunktion hin untersucht und selektiert – man spricht von gerichteter Evolution. In der Literatur sind zahlreiche Beispiele für eine erfolgreich durchgeführte Proteinevolution bekannt. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Aktivität der FLP-Rekombinase aus Saccharomyces cerevisiae um das vier- bis zehnfache gesteigert werden konnte [Buchholz, 1998]. Ebenso konnte die Thermostabilität der 3-Isopropylmalat-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis erhöht werden [Akanuma, 1998]. Beachtliche Ergebnisse wurden auch für die Evolution einer Lipase. aus Pseudomonas aeruginosa hinsichtlich ihrer Stereoselektivität, die von 2 % Enantiomerenüberschuss (ee) auf über 90 % ee gesteigert werden konnte, erzielt [Jaeger, 2000; Reetz, 2000]. Zahlreiche Beispiele sind darüber hinaus für die. Veränderung der Substratspezifität einiger Proteine bekannt. So gelang es Oue et al., die Spezifität einer Aspartat-Aminotransferase hin zu dem unnatürlichen Substrat Valin zu verändern [Oue, 1999]. Erstaunlich war die Feststellung, dass in dem mutierten Protein von insgesamt 17 veränderten Aminosäuren aufgrund der Proteinstruktur nur eine einzige in Kontakt mit dem Substrat treten kann. Die weiteren. ausgetauschten. Aminosäuren. haben. weder. einen. Bezug. zur. Substratbindungstasche, noch zum Coenzym. Diese Beobachtung zeigt noch einmal eindrucksvoll das Potential der gerichteten Evolution im Vergleich zum rationalen Design, da bei der ersten Methode auch Bereiche des Proteins berücksichtigt.

(21) Einleitung. 11. werden, die weit von den aktiven Zentren oder Substratbindungsstellen entfernt liegen, aber dennoch für die Funktion des Enzyms wichtig sein können.. 2.4. Ribosomale Proteinbiosynthese Die ribosomale Proteinbiosynthese verläuft in drei Schritten: Initiation,. Elongation und Termination [Stryer, 1996]. Die Initiation führt zur Bindung der InitiatortRNA an das Startsignal AUG der mRNA, wobei sie die P-(Peptidyl-)Stelle eines Ribosoms besetzt (Abb 2-3). Bei der Elongation bindet zunächst eine beladene Aminoacyl-tRNA an die zweite tRNA-Bindungsstelle, die als A-(Aminoacyl-)Stelle bezeichnet wird. Anschließend wird eine Peptidbindung zwischen der Aminogruppe der eintretenden Aminoacyl-tRNA und der Carboxylgruppe des Formylmethionins, mit dem die Initiator-tRNA beladen ist, ausgebildet. Die entstandene Dipeptidyl-RNA bewegt sich dann von der A- zur P-Stelle, und das Initiator-tRNA-Molekül gelangt in die E-(Exit-)Stelle, bevor es das Ribosom verlässt.. Abb 2-3: Elongationszyklus der Proteinsynthese: Bindung der Aminoacyl-tRNA, Knüpfung der Peptidbindung und Translokation. 50S und 30S: Untereinheiten des Ribosoms. Abbildung nach [Stryer, 1996]..

(22) 12. Einleitung. Danach bindet eine neue Aminoacyl-tRNA an die freie A-Stelle und setzt somit einen erneuten Elongationszyklus in Gang. Die Termination erfolgt, wenn ein sogenannter Freisetzungsfaktor ein Stopp-Signal auf der mRNA erreicht. Das führt dann zur Freisetzung der gebildeten Polypeptidkette vom Ribosom. Die aktivierten Vorstufen der Aminosäuren, die Aminoacyl-tRNAs, entstehen durch Verknüpfung einer Aminosäure mit einer ihr entsprechenden tRNA, wobei für jede Aminosäure jeweils mindestens eine spezifische tRNA vorhanden ist. Diese Reaktion wird durch Aminoacyl-tRNA-Synthetasen katalysiert, die jeweils eine hohe Selektivität für die durch sie aktivierte Aminosäure sowie den tRNA-Akzeptor aufweisen. Die meisten tRNA-Synthetasen besitzen neben dem Synthesezentrum noch ein zusätzliches Hydrolysezentrum, das eine Korrekturfunktion übernimmt und fälschlich gebundene Aminosäuren wieder hydrolysiert. Die entsprechende tRNA erkennen die tRNA-Synthetasen hauptsächlich an der Anticodonschleife und darüber hinaus am Akzeptorstamm nahe der Aminosäurebindungsstelle [Stryer, 1996].. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Untersuchungen an AminoacyltRNA-Synthetasen / tRNA-Paaren durchgeführt, die letztlich den Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine ermöglichten. Dazu wurde die Anticodonschleife einer tRNA derart verändert, dass das modifizierte Molekül in der Lage war, die Sequenz des Amber-Stoppcodons TAG zu erkennen. Gleichzeitig wurde eine entsprechende Aminoacyl-tRNA-Synthetase evolutiv umgeformt, so dass die zuvor entwickelte Suppressor-tRNA durch das modifizierte Enzym mit einer unnatürlichen Aminosäure beladen werden kann [Michaels, 1990; Wang, 2001; Chin, 2003; Köhrer, 2004]. Dadurch gelang es, den genetischen Code artifiziell zu erweitern. Unlängst konnten zudem Suppressor-tRNAs für die beiden weiteren Stopp-Signale, das Ochre-Codon TAA und das Opal-Codon TGA, generiert werden [Köhrer, 2003; Köhrer, 2004; Zhang, 2004].. Kürzlich entwickelten Anderson et al. ein tRNA-Synthetase / tRNA-Paar, das die Inkorporation von L-Homoglutamin über ein Quadruplet-Codon ermöglicht [Anderson, 2004]. Dazu wurde das Anticodon der betreffenden tRNA um eine Base. erweitert, so dass es die Sequenz AGGA erkennt. Dieses Beispiel zeigt, dass weder die Anzahl der zur Verfügung stehenden Triplet-Codons, noch die TranslationsMaschinerie selbst, ein gravierendes Hindernis für die Erweiterung des genetischen Codes darstellen..

(23) Einleitung. 2.5. 13. Nichtribosomale Peptidsynthese Viele niedermolekulare Naturstoffe werden auf einem zur ribosomalen. Proteinbiosynthese alternativen Weg gebildet. Die nichtribosomale Peptidsynthese erfolgt an großen, modular organisierten Multienzymkomplexen, den sogenannten nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPSs), die Templat und BiosyntheseMaschinerie in sich vereinen. Die Biosynthesesysteme besitzen einen modularen Aufbau, wobei ein Modul als die Einheit definiert wird, welche für die Aktivierung, Inkorporation und Modifizierung eines Aminosäurebausteines in die wachsende Peptidkette verantwortlich ist [Marahiel, 1997; von Döhren, 1997]. Im Allgemeinen entspricht die Anzahl und Position der Aminosäurebausteine in dem Peptid-Produkt der. Anzahl. und. Position. der. Templat-NRPSs. Man. spricht. daher. vom. Kolinearitätsprinzip. Es werden jedoch immer neue NRPSs gefunden, die diesem Prinzip nicht ausschließlich gehorchen [Mootz, 2002]. So kommen wie im Beispiel der Bacillibactin-Synthese [May, 2001] iterative Systeme zum Einsatz, die eine oder mehrere NRPSs wiederholt verwenden. Das Syntheseprinzip soll im Folgenden anhand der Synthese des zyklischen Dekapeptid-Antibiotikums Tyrocidin A erläutert werden (Abb 2-4) [Mootz, 1997].. Abb 2-4: Das Tyrocidin Biosynthesesystem. Das enzymatische Fließband des zyklischen Dekapeptid-Antibiotikums Tyrocidin besteht aus drei Peptidsynthetasen, TycABC, die durch die Gene tycABC codiert werden. Die Proteine sind aus einem, drei bzw. sechs Modulen aufgebaut, von denen jedes einzelne für den Einbau einer Aminosäure in die wachsende Peptidkette verantwortlich ist..

(24) 14. Einleitung. Die von den drei Genen tycA, tycB und tycC codierten Peptidsynthetasen, TycA, TycB und TycC enthalten insgesamt zehn Module, entlang derer die wachsende Peptidkette von einem auf das nächste Modul transferiert wird. Während der gesamten Synthese bleiben die Intermediate dabei kovalent an den Cofaktoren der NRPSs gebunden (multiple-carrier-thiotemplate-Modell) [Stein, 1996]. Am letzten Modul angekommen, wird das lineare Dekapeptid unter Makrozyklisierung von der Synthese-Maschinerie des Tyrocidin-Biosynthesesystems abgespalten.. 2.6. Die Domänen der nichtribosomalen Peptidsynthetasen Jedes Modul einer nichtribosomalen Peptidsynthetase lässt sich weiter in. einzelne Domänen unterteilen, welche die eigentlichen enzymatischen Einheiten darstellen und die einzelnen Schritte der nichtribosomalen Peptidsynthese katalysieren [Schwarzer, 2003].. Für die Erkennung und Aktivierung der jeweiligen Substrataminosäure ist die ca. 550 Aminosäuren große Adenylierungs-(A)-Domäne verantwortlich, welche in einer ATP-abhängigen Reaktion die Bildung eines Aminoacyladenylats katalysiert (Abb 2-5) [Turgay, 1992; Stachelhaus, 1995].. Abb 2-5: Die A-Domäne erkennt spezifisch die Substrataminosäure und aktiviert diese in Gegenwart von ATP und Mg 2+ unter Abspaltung von anorganischem Pyrophosphat als Aminoacyladenylat.. Somit ähneln A-Domänen in ihrer Funktion, Aminosäuren zu aktivieren, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen der ribosomalen Proteinbiosynthese, besitzen aber in der Regel eine geringere Selektivität [Lipmann, 1980, Kleinkauf, 1996]. Daher können durch eine Peptidsynthetase häufig mehrere Produkte unterschiedlicher Zusammensetzung synthetisiert werden. So entstehen z. B. die Tyrocidine B, C und D durch eine Spezifitätsbreite der dritten, vierten bzw. siebten A-Domäne des Biosynthese-.

(25) Einleitung. 15. systems, die es ihnen erlaubt, ähnliche Aminosäuren mit unterschiedlicher Effizienz zu aktivieren [Mootz, 1997]. Diese Ähnlichkeit hinsichtlich ihrer Funktion ist umso erstaunlicher, als zwischen Primär- bzw. Tertiärstrukturen der beiden Familien keine Übereinstimmungen bestehen [Rapaport, 1987, Eriani, 1990]. Strukturell eng verwandt hingegen ist die Phenylalanin-aktivierende A-Domäne GrsA der ersten Gramicidin SSynthetase aus Bacillus brevis mit der Luciferase aus dem Glühwürmchen Photinus pyralis, trotz einer geringen Sequenzhomologie von nur 16 % [Conti, 1996; Conti, 1997]. Untereinander besitzen die NRPS-A-Domänen eine Sequenzhomologie zwischen 30 und 60 % [Marahiel, 1997]. Weitergehende Sequenzstudien erlaubten zudem die Identifizierung bestimmter, hochkonservierter Bereiche, sogenannter coreMotive (A1 – A10), die nicht nur ein charakteristisches Merkmal aller A-Domänen darstellen, sondern auch zum Teil an der Katalyse beteiligt sind [Gocht, 1994]. Die eigentliche Bindungstasche der Substrataminosäuren befindet sich in A-Domänen in einem hochvariablen Bereich von ca. 100 Aminosäuren zwischen den core-Motiven A4 und A5, wobei das katalytische Zentrum von zehn Aminosäuren aufgebaut wird. Durch Sequenzvergleiche dieses Bereiches war es möglich, Aminosäurereste zu determinieren, deren Zusammensetzung die Selektivität der jeweiligen A-Domäne bestimmen. Die Verwendung dieses Selektivitäts-Codes [Stachelhaus, 1999] ermöglicht es, eine Vorhersage über die Substrataminosäuren unbekannter A-Domänen zu treffen. Dieser Sachverhalt wird im Folgenden am Beispiel der Phenylalaninselektiven Bindungstasche von GrsA genauer erläutert (Abb 2-6). Hierbei sind die beiden. hochkonservierten. Aminosäurereste,. Asp235. und. Lys517,. für. die. Koordination der Substrataminosäure über elektrostatische Wechselwirkungen zu deren α-Amino- bzw. α-Carboxylgruppe verantwortlich. An der Unterseite der Bindungstasche befindet sich der sterisch anspruchsvolle Rest Trp239, der aufgrund seiner Größe wahrscheinlich zur Stabilisierung des aktiven Zentrums beiträgt, sowie ein Kollabieren der Bindungstasche verhindert. Die Seitenwände der Bindungstasche werden von den Aminosäureresten Cys331, Ala301, Ile330, Ala322, Ala236, Ile299 und Thr278 gebildet..

(26) 16. Einleitung. Abb 2-6: Die Phenylalanin-selektive Bindungstasche wird aus zehn Aminosäure-Resten aufgebaut. Die Substrataminosäure Phenylalanin ist in grün hervorgehoben. Abbildung nach [Stachelhaus, 1999].. Durch Vergleiche der Selektivitäts-vermittelnden Codes von A-Domänen konnte festgestellt werden, dass die Positionen 235 und 517, mit sehr wenigen Ausnahmen für Position 235, invariant und in allen A-Domänen hochkonserviert sind. Auch die Aminosäurereste an den Positionen 236, 301 und 330 weisen nur eine mäßige Variabilität auf. Sie sind wahrscheinlich primär für die katalytische Aktivität verantwortlich und nur sekundär an der Substraterkennung beteiligt. Hochvariabel hingegen zeigen sich die Positionen 239, 322 und 331 sowie 278 und 299, denen damit der entscheidende Einfluss auf die Substratselektivität zugesprochen wird, wobei die Reste 278 und 299 selbst innerhalb von A-Domänen mit derselben Selektivität stark variieren. Der Nachweis der Gültigkeit dieses Selektivitätsvermittelnden Codes wurde durch ortsspezifische Mutagenese der Bindungstaschenbildenden Aminosäurereste erbracht [Stachelhaus, 1999].. Neben den für die Erkennung und Aktivierung der Substrataminosäure verantwortlichen A-Domänen sorgen weitere Domänen innerhalb eines Moduls für die Weitergabe der als Thioester gebundenen Reaktionsintermediate sowie die Peptidbindungsknüpfung. Im Einzelnen erfolgt nach der selektiven Erkennung und Aktivierung der Substrataminosäure deren kovalente Bindung an ein ca. 100 Aminosäuren umfassendes peptidyl carrier protein (PCP). (Abb 2-7 A) unter. Abspaltung von AMP. Das PCP besitzt selbst keine katalytische Funktion, dient jedoch als Transporter, der mit Hilfe des Ppant-Arms die aktivierte Aminosäure bzw..

(27) Einleitung. 17. die im Verlauf der Synthese gebildeten Peptidyl-Intermediate von einem Modul auf das nächste weiterreicht [Stein, 1994; Stein, 1996]. Dazu muss zunächst die PCPDomäne posttranslational modifiziert und von der apo- in die aktive holo-Form überführt. werden.. Diese. als. priming. bezeichnete. Reaktion. wird. durch. 4’-Phosphopantethein-(Ppant)-Transferasen katalysiert (Abb 2-7 B). Dabei kommt es zu einem nucleophilen Angriff der Hydroxylgruppe eines hochkonservierten Serinrestes im PCP auf die β-3’-Phosphatgruppe des Co-Substrates Coenzym A (CoASH) [Lambalot, 1996; Mofid, 2002].. Abb 2-7: (A) Beladung der PCP-Domäne. Die aktivierte Aminosäure wird unter Abspaltung von AMP kovalent als Thioester auf dem Ppant-Cofaktor der PCP-Domäne gebunden. (B) PrimingReaktion. Ppant-Transferasen katalysieren die Modifikation der PCP-Domänen in die aktive holo-Form.. Die PCP Domäne reicht die Intermediate an die ca. 450 Aminosäuren umfassende Kondensations-(C)-Domäne weiter, welche die zur Elongation der Peptidkette führende Ausbildung der Peptidbindung katalysiert [Stachelhaus, 1998; Bergendahl, 2002]. Durch biochemische Untersuchungen der C-Domäne konnte gezeigt. werden, dass auch sie neben der A-Domäne eine Substratselektivität besitzt, was ihr eine gewisse Kontrollfunktion hinsichtlich des zu bildenden Peptides verleiht [Belshaw, 1999; Ehmann, 2000]. Dabei wurden eine Donor-(d)- und eine Akzeptor-(a)-Position. determiniert. Während die Donor-Position lediglich eine Unterscheidung hinsichtlich der Konfiguration der Aminosäure führt, wurde für die Akzeptor-Position eine deutliche Selektivität in Bezug auf die Seitenkette der Aminosäure beobachtet. Die Peptidbindungsbildung erfolgt durch einen nucleophilen Angriff der α-Amino-Gruppe.

(28) 18. der. Einleitung. PCP-gebundenen. Aminosäure. auf. das. Thioester-Carbonyl-C-Atom des. stromaufwärts gebundenen Aminoacyl- oder Peptidyl-Restes (Abb 2-8). Nach der Knüpfung der Peptidbindung wird das um eine Aminosäureeinheit verlängerte Intermediat vom Ppant-Arm zum nächsten Modul weitergeleitet.. Abb 2-8: Kondensationsreaktion. Die C-Domäne katalysiert die Bildung der Peptidbindung zwischen zwei auf benachbarten PCP-Domänen gebundenen Intermediaten.. Die drei bislang vorgestellten Domänen C, A und PCP sind für die nichtribosomale Peptidsynthese essentiell und bilden zusammen ein sogenanntes Elongationsmodul. Am Beginn einer Peptidsynthese steht für gewöhnlich ein Initiationsmodul, das lediglich aus den Domänen A und PCP besteht. Zusätzliche Veränderungen. wie. Epimerisierung,. Methylierung,. Formylierung,. Acylierung,. Glykosilierung und Heterozyklisierung der jeweiligen Substratbausteine können durch optionale bzw. modifizierende Domänen vorgenommen werden [Walsh, 2001]. Am Ende der Peptidsynthese wird das lineare, enzymgebundene Intermediat in der Regel von einer Thioesterase-(Te)-Domäne als lineares [Gutierrez, 1991], zyklisches [Mootz, 1997; Trauger, 2000] bzw. verzweigt-zyklisches Produkt [Konz, 1997] freigesetzt.. 2.7. Gerichtete Manipulation und ribosomalen Peptidsynthetasen. Evolution. von. nicht-. Aufgrund ihres modularen Aufbaus und der Domänenstruktur von NRPSs eignen sich diese Enzyme besonders für die gezielte Manipulation und das rationale Design zur Entwicklung neuer Peptidprodukte. Vor allem die Strukturaufklärung der C-, A-, PCP- und Te-Domänen konnte wesentlich zum Verständnis der Funktionsweise dieser Enzyme beitragen und lieferte wichtige Informationen für die Festlegung der Domänengrenzen, deren Kenntnis für das rationale Design unerlässlich ist [Conti, 1997; Weber, 2000; Bruner, 2002; Keating, 2002]. Zwischen den einzelnen Domänen. befinden sich kurze, bis zu 15 Aminosäuren lange Linkerregionen, die aus.

(29) Einleitung. 19. überwiegend unkonservierten, kleinen und hydrophoben Aminosäuren bestehen [Diekmann, 1999; Doekel, 2000; Mootz, 2000]. Diese Bereiche bieten sich für die Fusion von. Domänen und Modulen an, da Veränderungen innerhalb dieser Linkerregionen keinen Einfluss auf die enzymatische Aktivität und die Tertiärstruktur der betroffenen Proteine ausüben sollten. Für die gerichtete Manipulation von NRPSs sind verschiedene Strategien denkbar, die schematisch in Abb 2-9 zusammengefasst sind.. Abb 2-9: Strategien für die gerichtete Manipulation von NRPSs. Domänen- oder Modulfusionen (A) zwischen PCP- und C-Domäne, (B) zwischen A- und PCP-Domäne und (C) zwischen C- und A-Domäne führen zu artifiziellen Hybridsynthetasen. (D) Die Fusion der Te-Domäne führt zur Produktabspaltung der Intermediate auf den Synthetasen. (E) Der Austausch von A-PCPModulen führt zum Austausch der korrespondierenden Aminosäure im Produkt. (F) Insertion oder Deletion optionaler Domänen führt zur Modifikation einzelner Aminosäuren. (G) Durch ortsspezifische Mutagenese kann die Selektivität von A-Domänen beeinflusst werden.. Bei der Fusion von Modulen (Abb 2-9 A, B und C) ist die Auswahl der Fusionsstelle von entscheidender Bedeutung für die Funktionalität der konstruierten Hybrid-Peptidsynthetasen. Besonders zu berücksichtigen ist hierbei die Selektivität der C-Domäne (vgl. Kapitel 2.6) bezüglich der Akzeptorposition, die sowohl eine Substrat- wie auch eine Enantioselektivität aufweist, wohingegen die Donorposition lediglich eine enantioselektive Kontrolle ausführt. Daher sollte bei der Konstruktion hybrider NRPSs die native Verbindung von C- und A-Domäne möglichst nicht getrennt werden, um die enzymatische Aktivität nicht zu beeinflussen. Diese Hypothese führt zu der Definition eines Moduls als Domänenabfolge C-A-PCP bzw..

(30) 20. Einleitung. PCP-C-A, wobei sich die erste Auslegung heute durchgesetzt hat. Dennoch war es möglich, neben aktiven Hybridenzymen, die durch Fusionen zwischen PCP- und C-Domäne bzw. A- und PCP-Domäne generiert wurden [Mootz, 2000], auch solche in aktiver Form zu erhalten, deren Fusionsstelle zwischen C- und A-Domäne lag [Doekel, 2000; Duerfahrt, 2003]. Fusionen, die gar innerhalb hochkonservierter Bereich von. Domänen durchgeführt wurden, führten meist zu inaktiven Enzymen [Elsner, 1997; Symmank, 1999].. Die Produktabspaltung wird in NRPS-Systemen von einer C-terminalen Te-Domäne katalysiert, die in natürlichen wie auch artifiziellen Systemen ähnliche Umsatzraten erreicht [Mootz, 2000; Schwarzer, 2001]. Neben den in vitro-Untersuchungen konnte ebenfalls in vivo die Aktivität einer künstlich fusionierten Te-Domäne beobachtet werden (Abb 2-9 D). Die Translokation der Te-Domäne des Terminationsmoduls 7 des Surfactin-Biosynthesesystems an den jeweiligen C-Terminus der internen Elongationsmodule 4 bzw. 5 führte zur Abspaltung verkürzter Surfactin-Derivate [de Ferra, 1997]. Der Austausch bzw. die Deletion von Modulen in vivo konnte erfolgreich am Beispiel des Surfactins demonstriert werden. Durch die Deletion des zweiten Moduls der Surfactin-Synthetase B wurde ein verkürztes Surfactin-Derivat produziert und nachgewiesen [Mootz, 2002]. Der Austausch von A-PCP-Einheiten (Abb 2-9 E) in den Modulen 2 und 7 der Surfactin-Synthetasen durch heterologe Module mit unterschiedlicher Substratselektivität führte zum Austausch der korrespondierenden Aminosäuren in den neu produzierten Surfactin-Derivaten. [Stachelhaus, 1995; Schneider, 1998].. Obwohl die Insertion von optionalen Domänen in NRPS-Systeme bislang erst wenig untersucht ist, konnten dennoch einige Beispiele für die Fusion von Epimerisierungs-Domänen [Linne, 2001], N-Methylierungs-Domänen [Schauwecker, 2000] und Zyklisierungsdomänen [Dürfahrt, 2003] gegeben werden (Abb 2-9 F). Neben der Modifizierung der Peptidsynthetasen durch Fusion oder Modulinsertion stellt die Manipulation einzelner Domänen eine weitere Möglichkeit dar, neue artifizielle NRPSs zu generieren. Aufgrund der Tatsache, dass innerhalb der NRPSs die A-Domänen für die Erkennung und Aktivierung der Substrataminosäuren verantwortlich sind und deren Selektivität hauptsächlich durch die zehn Aminosäurereste innerhalb der Bindungstasche bestimmt wird (vgl. Kapitel 2.6), stellt die gezielte Manipulation dieser Reste eine weitere Methode zur Bildung artifizieller.

(31) Einleitung. 21. NRPSs dar (Abb 2-9 G). So konnte bereits gezeigt werden, dass Punktmutationen, die. zur. gezielten. Veränderung. bestimmter. Aminosäurereste. der. Substrat-. bindungstasche führten, in einer Variation der Selektivität resultierten [Stachelhaus, 1999; Eppelmann, 2002].. Ein allgegenwärtiges Problem beim rationalen Design von NRPSs war und ist der meist drastische Produktivitätsabfall der artifiziellen Systeme. Da dieser Abfall auch beim Austausch heterologer Module gleicher Substratselektivität beobachtet wurde, kann ein negativer Einfluss (z. B. Toxizität oder unzureichender Transport) des veränderten Produktes nahezu ausgeschlossen werden [Stachelhaus 1995; Mootz, 2002].. Vielmehr sind die Gründe aufgrund der drastischen Eingriffe in die. Proteintemplate in der gestörten inter- und intramolekularen Kommunikation oder der Tertiärstruktur der artifiziellen Synthetasen zu suchen. Bezüglich der intermolekularen Kommunikation konnten kürzlich sogenannte COM-Domänen definiert werden. [Hahn,. 2004].. Das. paarweise. Auftreten. zweier. zueinandergehöriger. COM-Domänen kann eine effiziente Kommunikation auch zwischen solchen Modulen, die ursprünglich nicht miteinander interagieren, vermitteln und somit neue Wege zum rationalen Design eröffnen. Zur Umgehung der oben geschilderten Problematik des rationalen EnzymDesigns kann die gerichtete Evolution herangezogen werden. Sie ermöglicht eine Variation der Proteine in einem weitgefassten Sequenzbereich, ohne dadurch zwangsläufig die gesamte Architektur des Enzyms zu verändern und beschränkt sich nicht auf Insertion, Deletion oder Substitution ganzer Domänen oder Module. So werden bei der gerichteten Evolution je nach Mutationsrate z. B. die für die Kommunikation wichtigen Strukturbereiche in den meisten Fällen erhalten bleiben. Dennoch bestehen auch für die gerichtete Evolution gewisse Probleme. Aufgrund der enormen Größe der Peptidsynthetasen und ihrer Gene müssen je nach gewählter Mutationsrate sehr große Bibliotheken generiert und anschließend selektiert. werden.. Die. Selektion. erfordert. daher. sehr. leistungsstarke. Detektionssysteme. Erste. Voruntersuchungen. für. die. gerichtete. Evolution. von. NRPS. A-Domänen hinsichtlich ihrer Selektivität wurden mit dem mRNA-Protein-FusionsVerfahren bereits von A. Neumüller durchgeführt [Neumüller, 2001]. Diese Methode führt zu einer kovalenten Bindung der translatierten Proteine an die mRNA über einen. DNA-Puromycin-Linker.. Das. anschließende. Screening. sollte. über.

(32) 22. Einleitung. immobilisierte Inhibitoren erfolgen [Finking, 2003]. Die mRNA-Protein-Fusion weist allerdings zwei wesentliche Nachteile auf: i) Zum einen arbeitet das Verfahren mit der äußerst instabilen RNA und nicht mit DNA, ii) zum anderen kann pro mRNAMolekül nur ein Protein gebunden werden, wodurch keine Aussagen hinsichtlich der Enzymaktivität getroffen werden können. Zwei Nachteile, die möglicherweise durch die Implementierung des in Kapitel 2.2 beschriebenen IVC-Systems umgangen werden können.. 2.8. Aufgabenstellung Obwohl NRPSs aufgrund ihres modularen Aufbaus für das rationale Design. (Austausch, Insertion, Deletion oder Fusion von Modulen oder Domänen) prädestiniert scheinen, wurden stets Einbußen hinsichtlich der Produktivität der neu generierten, artifiziellen Systeme beobachtet. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit Verfahren für die gerichtete Evolution von NRPSs entwickelt und implementiert werden, welche die genannten Probleme möglicherweise umgehen können. Im. ersten. Teil. der. Arbeit. sollte. das. sogenannte. in. vitro-. compartmentalization-(IVC)-System für die Evolution der Substratselektivität von Adenylierungs-(A)-Domänen implementiert und angepasst werden. Dieses Verfahren beruht auf der Ausbildung von Wasser-in-Öl-Emulsionen und führt somit zur Entstehung zell-ähnlicher Kompartimente, in denen einzelne Gene einer hochdiversen Gen-Bibliothek in vitro translatiert und selektiert werden können. Als Ausgangspunkt sollte dazu eine putativ inaktive A-Domäne konstruiert werden, in der nahezu alle Konstituenten der Substrat-Bindungstasche zu Alanin mutiert werden. Von diesem Enzym ausgehend soll dann eine Selektivität für ein mis-kognates Substrat evolviert werden. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Konstruktion eines Systems für die in vivo-Evolution von NRPSs, das auf der Biosynthese des zyklischen Dipeptids D-Phe-L-Pro-Diketopiperazin. (DKP) beruht. Dieses Produkt weist Bioaktivitäten als. Biosensor bzw. als Antibiotikum auf, die für die Etablierung von in vivo-Selektionssystemen ausgenutzt werden könnten. Dazu sollte die DKP-Produktion in dem heterologen Wirt Escherichia coli optimiert werden..

(33) Material. 23. 3. Material. 3.1. Chemikalien, Enzyme und Laborprodukte In Tabelle 3-1 nicht aufgeführte Chemikalien und Laborprodukte wurden von. den Firmen Aldrich (Steinheim), Invitrogen (Karlsruhe), Roth (Karlsruhe), Sigma (Deisenhofen), Sarstedt (Nümbrecht) oder VWR International (Darmstadt) bezogen.. Tabelle 3-1: Verwendete Chemkalien, Enzyme und Laborprodukte. Hersteller. Produkt. Amersham Biosciences Europe (Freiburg). Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol, Coomassie Brilliant Blue G und R250, Hefeextrakt, Agar Nr. 1, ECL-Random Prime Labelling and Detection Systems, Nylonmembran Hybond N+. AppliChem (Darmstadt). Ampicillin, Kanamycin, IPTG, Trypton. Becton Dickinson GmbH (Heidelberg) Eurogentech (Seraing, Belgien). Casaminosäuren, Pepton, Rindfleischextrakt, Meeresbouillon. IBA (Göttingen) ICN Biochemicals, Inc. (Eschwege). StrepTactin Sepharose. Kodak (Rochester, USA). Röntgenfilm Biomax MR, Entwickler D19. Macherey-Nagel (Düren). NucleoSpin Plasmid. MWG Biotech (Ebersberg). Oligonucleotide. MBI Fermentas (St. LeonRot) Molecular Probes (Leiden, Niederlande) New England Biolabs (Frankfurt a.M.) Perkin Elmer (RodgauJügesheim) QIAGEN (Hilden). Roche (Mannheim) Sigma (Deisenhofen) Stratagene (Heidelberg). Agarose, Elektoporationsküvetten. [14C]-markierte Aminosäuren. 10 kDa Protein-Marker Anti-Nitrotyrosin Antikörper aus Kaninchen Restriktionsendonucleasen und andere DNAmodifizierende Enzyme, 1 kb DNA-Marker [32P]-Pyrophosphat QIAquik-spin PCR Purification Kit, QIAEX II Gel Extraction Kit, QIAprep Spin Miniprep Kit, Ni 2+-NTAAgarose, Expand long template PCR system, pIVEX HA-tag Vector Set, Rapid Translation System RTS 100 E. coli HY Kit Anti-Nitrotyrosin Antikörper aus Kaninchen, Monoclonal Anti-HA Agarose Conjugate Clone HA-7 PfuTurbo DNA-Polymerase, QuickChange (Multi) SiteDirected Mutagenesis Kit.

(34) 24. 3.2. Material. Geräte. Tabelle 3-2: Verwendete Geräte. Gerät. Hersteller und Typenbezeichnung. Autoklav. Tuttnauer 5075 ELV. Dokumentation von DNAAgarosegelen. Videokamera Cybertech CS 1 Thermodrucker Mitsubishi Video Copy Processor. Elektroporation. Biorad Gene Pulser II. Elektrophoresekammern. Sigma Horizontal Electrophoresis Unit MINI / MIDI Sigma Vertical Electrophoresis Unit Z33, 957-1. ESI/MS-System. Hewlett Packard Series 1100. FPLC-Säulen. Amersham Biosciences Chelating-Column HR 10/2. FPLC-System. HPLC-Säulen. HPLC-System. Pharmacia FPLC-System, Gradienten Programmer GP250, Pumpe P-500, Uvicord Optische Einheit U-1, Uvicord Kontrolleinheit UV-1, Injektionsventil V-7, 3Wege Magnetventil PSV-100, Fraktionssammler FRAC100, 2-Kanal-Flachbrettschreiber REC-102 Macherey-Nagel C250/3 Nucleosil 120-3 C18 Macherey-Nagel C125/3 Nucleosil 120-3 C18 Beckman-Coulter System Gold Agilent Series 1100 HPLC-System: DAD-Detektor, Vakuumentgaser, quaternäre Pumpe, Autosampler, HP-Chemstation. Luftschüttler. New Brunswick Scientific, Series 25 Incubator Shaker. Photometer. Pharmacia Ultrospec 3000 UV/Visible Spectrophotometer. Reinstwasseranlage. Seral Seralpur Pro 90 CN. Schüttelinkubator. Eppendorf Thermomixer Comfort. Speedvac. Uniequip Univapo 150 H. Szintillationszähler. Packard 2100 TR Tri-CARB Liquid Scintillation Analyzer. Thermocycler. Eppendorf Mastercycler personal. UV-Inkubator. Stratagene Stratalinker UV Crosslinker Model 1800. Zellaufschluss. SLM Aminco French Pressure Cell Press Eppendorf Centrifuge 5415D Sorvall RC 26 Plus, Sorvall RC 5B Plus, Heraeus Minifuge RF. Zentrifugen.

(35) Material. 25. 3.3. Vektoren. 3.3.1. pQE60 Der Vektor pQE60 gehört zur Familie der pDS-Plasmide [Bujard, 1987] und. basiert auf dem Plasmid pDS56/RBSII [Stüber, 1990]. Er kann zur effizienten Expression von Proteinen in E. coli verwendet werden. Die Integration der DNA über die Schnittstellen der Restriktionsendonucleasen NcoI, BamHI bzw. BglII in der multiple-cloning-site (MCS) führt zur transkriptionellen Fusion mit sechs repetitiven, C-terminalen Histidincodons (His6Tag). pQE60 trägt das β-Lactamasegen bla (Ampicillin-Resistenz), einen ColE1 high-copy Replikationsursprung für E. coli aus pBR322 [Sutcliffe, 1979], sowie einen von zwei lac-Operatorsequenzen und der ribosomalen Bindungsstelle RBSII gefolgten E. coli-Phagen-T5-Promotor. Im Polylinker ist das ATG-Startcodon in eine NcoI-Erkennungssequenz eingebettet. Hinter dem Polylinker befindet sich die Codierungssequenz des His 6Tag, gefolgt von den Translations-Stopcodons in allen drei Leserastern. Ergänzend ist der Transkriptionsterminator t0 des λ-Phagen enthalten [Schwartz, 1987].. 3.3.2. pQE61 Der pQE61-Vektor ist ein Derivat des pQE60-Vektors. Der einzige. Unterschied liegt in dem Austausch der BglII-Restriktionsschnittstelle durch eine KpnI- und eine SpeI-Restriktionsschnittstelle.. 3.3.3. pSU18 Der Vektor pSU18 [Bartolomé, 1991] ist ein Derivat von pACYC184 und ist. sehr ähnlich zu pUC18, basiert jedoch auf dem Replikationsursprung P15A [Miller, 1992] und vermittelt durch das cat-Gen Resistenz gegen Chloramphenicol. Die in das. lacZ’-Gen integrierte MCS erlaubt ein Blau-Weiß-Screening auf rekombinante Plasmide. Restriktionsschnittstellen der MCS von pSU18 in der Reihenfolge der Orientierung des lac-Promotors: EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, AvaI, BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI und HindIII..

(36) 26. 3.3.4. Material. pTrc99a Der Vektor pTrc99a [Amann, 1988] wurde für die Expression von Genen in. E. coli konstruiert und ist ein Derivat von pKK233-2 [Amann, 1985]. Das Plasmid trägt einen starken trc-Promotor, die ribosomale Bindungsstelle von lacZ, eine MCS aus pUC18 und einen rrnB Transkriptionsterminator. Das ATG-Startcodon ist in eine NcoI-Erkennungssequenz eingebettet. Der Vektor enthält weiterhin einen ColE1Replikationsursprung aus pBR322 [Sutcliffe, 1979] und durch das β-Lactamasegen bla wird Resistenz gegen Ampicillin vermittelt. Restriktionsschnittstellen der MCS von pTrc99a in der Reihenfolge der Orientierung des trc-Promotors: NcoI, EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI und HindIII.. 3.3.5. pIVEX2.5d Die Rapid Translation System RTS pIVEX HA-Tag Vektoren wurden von. Roche für die in vitro-Expression von Proteinen mit einer HA-Tag-Fusion in zellfreien RTS E. coli-Systemen entwickelt. pIVEX steht dabei für In Vitro EXpression. Der in dieser Arbeit eingesetzte Vektor pIVEX2.5d enthält einen T7-Promotor, eine ribosomale Bindungsstelle gefolgt von der MCS und einem C-terminalen HA-Tag. Anschließend reiht sich ein T7-Terminator an. Restriktionsschnittstellen der MCS von pIVEX2.5d in der Reihenfolge der Orientierung des T7-Promotors: NcoI, NdeI, NotI, SalI, XhoI, SacI, XmaI und SmaI.. 3.3.6. pREP4[gsp] Das Plasmid pREP4 ist mit seinem Replikationsursprung P15A kompatibel. zu ColE1-Plasmiden und kann so in Kombination mit pQE-Vektoren in E. coli repliziert werden. Neben dem neo-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin vermittelt, trägt es das lacI-Gen, das für den Lac-Repressor codiert [Farabough, 1978]. pREP4 wurde als Helferplasmid in Kombination mit pQE-Vektoren verwendet, um durch die lac-Repressorproduktion eine Regulation der Expression der erhaltenen Gene zu ermöglichen. Das Gen gsp codiert für die Ppant-Transferase des Gramicidin SBiosynthesesystems. Es wurde im Plasmid pREP4[gsp] unter Kontrolle des T7-.

(37) Material. 27. Promotors [Studier, 1986] in den Vektor pREP4 integriert, um eine Coexpression der NRPS-Proteine mit einer Ppant-Transferase und damit die Modifikation zur holoForm in vivo zu ermöglichen.. 3.4. Mikroorganismen. Tabelle 3-3: Verwendete Mikroorganismen. Stamm. Genotyp. E. coli XL1-Blue. recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac, F[proAB, laqIq, lacZ∆M15, TN10 (Tetr)] [Bullock, 1987]. E. coli XL10-Gold. E. coli DH5α. Tetr ∆(mcrA)183, ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, lac, Hte [F’ proAB+, lacIq, lacZ∆M15, TN10 (Tetr) Amy Camr] F-, mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80d lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, supE44, λthi-1, gyrA96, relA1. E. coli GT869. thrb, pro, thi, rpsL,hsdS, lacZ∆M15 F’[lacZ∆M15, laqIq, traD, pro+] [Döring, 1988]. E. coli HM0079. GT869 nrdD::sfp-specr [Mootz, 1999; Gruenewald, 2004]. E. coli BL21. F-, dcm, hsdS, rB-mB-, ompT, gal. Vibrio aerogenes. Wildtyp-Stamm [Shieh, 2000]. Vibrio agarivorans. Wildtyp-Stamm [Macián, 2001a]. Vibrio calviensis. Wildtyp-Stamm [Denner, 2002]. Vibrio fischeri. Wildtyp-Stamm [Engebrecht, 1983]. Vibrio lentus. Wildtyp-Stamm [Macián, 2001b]. Vibrio natriegens. Wildtyp-Stamm [Payne, 1961]. Vibrio proteolyticus. Wildtyp-Stamm [Merkel, 1964]. Photobacterium iliopiscarium. Wildtyp-Stamm [Urakawa, 1999].

(38) 28. 3.5. Material. Medien und Zusätze Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Medien zur Sterilisation für. 25 min bei 121 °C und 1,5 bar autoklaviert.. 3.5.1. Medien für die Anzucht von E. coli. 3.5.1.1 LB-Medium LB-Medium diente als Standardmedium bei Klonierungsexperimenten und für die Anzucht von E. coli. 10 5 5. g/l g/l g/l. Bactotrypton NaCl Hefeextrakt. 3.5.1.2 M9-Medium M9-Medium wurde hauptsächlich für die Anzucht von E. coli für die in vivoDKP-Produktion. eingesetzt.. Für. dieses. Minimalmedium. wurden. die. zuvor. autoklavierte Lösung I und die sterilfiltrierte Lösung II im Verhältnis 89:10:1 (H2O:LsgI:LsgII) gemischt und zusätzlich mit 1 ml sterilfiltrierter Biotin/ThiaminLösung (2 g/l) versetzt.. 3.5.2. Lösung I (pH 7,4). 60 30 5 10. g/l g/l g/l g/l. Na2HPO4 KH2PO4 NaCl NH4Cl. Lösung II. 2,2 24,6 200. g/l g/l g/l. CaCl2 MgSO4 ž 7 H2O Glucose. Medien für die Anzucht von Vibrio-Stämmen. 3.5.2.1 Medium 101 Dieses Medium diente zur Anzucht von V. proteolyticus. 5 3 30 pH. g/l g/l g/l 7,0. Pepton Rinderextrakt NaCl.

(39) Material. 29. 3.5.2.2 Medium115 Dieses Medium diente zur Anzucht von V. natriegens und Photobacterium iliopiscarium. 5 3 15 pH. g/l g/l g/l 7,0. Pepton Rinderextrakt NaCl. 3.5.2.3 Medium 246a Dieses Medium diente zur Anzucht von V. fischeri. 10 10 25 75. g/l g/l % (v/v) % (v/v). künstliches Meerwasser: 28,13 g/l 0,77 g/l 1,60 g/l 4,80 g/l 0,11 g/l 3,50 g/l Pepton. und. Rinderextrakt. Pepton Rinderextrakt Leitungswasser künstliches Meerwasser. NaCl KCl CaCl2 ž 2 H2O MgCl2 ž 6 H2O NaHCO3 MgSO4 ž 7 H2O werden. unter. leichtem. Erwärmen. in. Leitungswasser gelöst und auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt. Anschließend wird dieses Lösung für 10 min gekocht und auf pH 7,3 einjustiert. Das künstliche Meerwasser wird erst hinzugegeben, wenn beide Lösungen nach dem Autoklavieren (121 °C, 1,5 bar, 20 min) auf Raumtemperatur abgekühlt sind.. 3.5.2.4 Medium 514 Dieses Medium diente zur Anzucht von V. aerogenes, V. agarivorans, V. calviensis und V. lentus. Es entspricht der „Meeresbouillon 2216“ (Becton Dickonson GmbH). Zur Herstellung werden 37,4 g Pulver in 1 l Wasser suspendiert und für 2 min gekocht. Der pH-Wert wird auf 7,6 eingestellt. Anschließend wird das Medium für 15 min bei 121 °C und 1,5 bar autoklaviert..

(40) 30. 3.5.3. Material. Feste Nährmedien Zur Herstellung fester Nährmedien wurden die entsprechenden Lösungen. vor dem Autoklavieren mit 1,5 % (w/v) Agar Nr. 1 versetzt. Medium, das für Softagar-Overlays verwendet wurde, enthielt lediglich 0,7 % (w/v) Agar Nr. 1.. 3.5.4. Antibiotika und Zusätze Antibiotika wurden erst nach Abkühlung des Mediums unter 50 °C in. folgenden Konzentrationen als sterilfiltrierte Lösungen zugesetzt:. 50 – 100. µg/ml. Ampicillin. 20. µg/ml. Chloramphenicol. 25. µg/ml. Kanamycin. IPTG wurde zur Induktion von Expressionen in einer Konzentration von 1 mM hinzugegeben. MgCl2 wurde gegebenenfalls bei Expressionen in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt, um die Löslichkeit der produzierten Proteine zu erhöhen..

(41) Methoden. 31. 4. Methoden. 4.1. Molekularbiologische Methoden Die. durchgeführten. molekularbiologischen. Arbeiten. beruhen. im. Wesentlichen auf etablierten und bereits publizierten Methoden und Vorschriften [Sambrook et al., 1989]. Daher werden im Folgenden nur die Konstruktion der Plasmide und Verfahren beschrieben, die von den Standardtechniken abweichen.. 4.1.1. Plasmid-Konstruktion Die. zur. Klonierung. erforderlichen. Genfragmente. wurden. mittels. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des „TripleMaster. ®. PCR. Systems“ (Eppendorf, Hamburg), des „Expand Long Template PCR-Systems“ (Roche, Mannheim) oder der „Pfu-DNA-Polymerase“ (Stratagene, Heidelberg) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme bzw. Mutationen wurden über synthetische Oilgonucleotide (MWG-Biotech, Ebersberg) eingeführt. Die Reinigung der PCR-Ansätze erfolgte mit dem „QIAquickspin PCR Purification Kit“ oder dem „QIAEX II Gel Extraction Kit“ (QIAGEN, Hilden) nach Vorgabe des Herstellers. Plasmide aus E. coli-Zellen wurden. mit dem. „QIAprep® Spin Miniprep Kit“ (QIAGEN, Hilden) oder dem „NucleoSpin® Plasmid-Kit“ (Macherey-Nagel, Düren) präpariert. Die Verifizierung der Plasmide erfolgte durch spezifischen Verdau mit Restriktionsendonucleasen und DNA-Sequenzierung. Die Sequenzen der im Folgenden genannten synthetischen Oligonucleotide sind in Tabelle 8-1 (siehe Anhang) angegeben.. 4.1.1.1 Plasmide der in vitro-Systeme pSU18-tycA(T278A) und pSU18-tycA(T278A,I299A) Die Plasmide pSU18-tycA(T278A) und pSU18-tycA(T278A,I299A) wurden durch ortsspezifische Mutagenese mit Hilfe des „QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit“ (Stratagene, Heidelberg) durch Verwendung der Oligonucleotide SG042, SG043 und SG044 nach den Angaben des Herstellers konstruiert. Für die PCR wurde als Templat-DNA das Plasmid pSU18-tycA (siehe Kapitel 4.1.1.2) eingesetzt. Nach der PCR wurde die Templat-DNA mit der Restriktionsendonuclease.

(42) 32. Methoden. DpnI verdaut. Dadurch sollten Transformanden, die aus der Wildtyp-DNA entstehen und somit keine Mutationen tragen, vermieden werden. Die Selektion erfolgte durch LB(Cm20)-Platten.. Ursprünglich. sollte. die. Vierfach-Mutante. pSU18-. tycA(T278A,I299A,I330A,C331A) (s. u.) unter Einsatz der Oligonucleotide SG042, SG043 und SG044 auf diesem Wege konstruiert werden. Allerdings konnten unter den Transformanden nur die Mutanten pSU18-tycA(T278A) (Primer SG042) und pSU18-tycA(T278A,I299A) (Primer SG042 und SG043) isoliert werden. pSU18-tycA(I299A),. pSU18-tycA(I330A),. pSU18-tycA(C331A). und. pSU18-tycA(I330A,C331A) Die Einführung der Punktmutationen für die Plasmide pSU18-tycA(I299A), pSU18-tycA(I330A), pSU18-tycA(C331A) und pSU18-tycA(I330,C331A) erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese durch den Einsatz des „QuikChange® Site Directed Mutagenesis Kit“ (Stratagene, Heidelberg) mit den Oligonucleotiden SG043/SG058 für pSU18-tycA(I299A), SG052/SG053 für pSU18-tycA(I330A) und SG054/SG055 für pSU18-tycA(C331A). Als Templat-DNA diente das Plasmid pSU18-tycA (siehe Kapitel 4.1.1.2). Für die Generierung der Doppelmutante pSU18tycA(I330,C331A) wurde auf Basis des Plasmides pSU18-tycA(C331A) eine PCR mit den Oligonucleotiden SG059 und SG060 durchgeführt. Die Selektion erfolgte über LB(Cm20)-Platten.. Weitere Plasmide auf pSU18-Basis Unter Verwendung der internen Restriktionsendonuclease-Schnittstellen für NdeI und NsiI war es möglich, die codierenden Bereiche der Bindungstasche der bislang konstruierten Expressionsplasmide mittels Subklonierung untereinander zu den restlichen Doppel- und Tripelmutanten sowie der Vierfachmutante zu kombinieren. NsiI schneidet die DNA zwischen den Positionen I299 und I330 im Codon für N321, und NdeI hat seine Erkennungssequenz an Position Y35. Durch den Verdau mit den Enzymen NdeI und NsiI entsteht ein 855 bp großes DNAFragment, das die Positionen T278 und I299 umfasst, sowie ein zweites Fragment mit einer Größe von 4928 bp, das entsprechend die Positionen I330 und C331 beinhaltet. Zur Konstruktion der Tripelmutante pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A) wurden die Doppelmutante pSU18-tycA(T278A,I299A) und die Einzelmutante pSU18-tycA(I330A) jeweils mit NdeI und NsiI geschnitten. Die Ligation des 855 bp.

(43) Methoden. 33. großen DNA-Fragments aus dem Verdau der Doppelmutante mit dem 4928 bp großen Fragment aus dem Verdau der Einzelmutante ergab das Plasmid pSU18tycA(T278A,I299A,I330A). Analog wurden die Plasmide pSU18-tycA(T278A,I330A), pSU18-tycA(T278A,C331A), pSU18-tycA(I299A,I330A), pSU18-tycA(I299A,C331A), pSU18-tycA(T278A,I299A,C331A),. pSU18-tycA(T278A,I330A,C331A),. pSU18-. tycA(I299A,I330A,C331A) und pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A,C331A) durch Ligation der entsprechenden DNA-Fragmente konstruiert. Eine Übersicht der durch Subklonierung generierten Konstrukte unter Angabe der Ursprungsplasmide und der verwendeten DNA-Fragmente zeigt Tabelle 4-1.. Tabelle 4-1: Konstruktion von Doppel-, Tripel- und Vierfachmutanten von pSU18-tycA durch Subklonierung. Produkt. Ursprungsplasmide 855 bp-Fragment. 4928 bp-Fragment. pSU18-tycA(T278A,I330A). pSU18-tycA(T278A). pSU18-tycA(I330A). pSU18-tycA(T278A,C331A). pSU18-tycA(T278A). pSU18-tycA(C331A). pSU18-tycA(I299A,I330A). pSU18-tycA(I299A). pSU18-tycA(I330A). pSU18-tycA(I299A,C331A). pSU18-tycA(I299A). pSU18-tycA(C331A). pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A). pSU18-tycA(T278A,I299A). pSU18-tycA(I330A). pSU18-tycA(T278A,I299A,C331A). pSU18-tycA(T278A,I299A). pSU18-tycA(C331A). pSU18-tycA(T278A,I330A,C331A). pSU18-tycA(T278A). pSU18-tycA(I330A,C331A). pSU18-tycA(I299A,I330A,C331A). pSU18-tycA(I299A). pSU18-tycA(I330A,C331A). pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A,C331A). pSU18-tycA(T278A,I299A) pSU18-tycA(I330A,C331A). pIVEX2.5d-pheAT-HAtag Das Gen pheAT, das für die ersten beiden Domänen A-PCP aus dem Initiationsmodul der Tyrocidin-Synthetase TycA codiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonucleotide HM98-12 und SG033 und des Plasmides pSU18tycA als Templat-DNA amplifiziert. Nach Verdau des PCR-Amplifikates mit den Restriktionsendonucleasen NcoI und SalI wurde das 1803 bp große Fragment mit einem analog geschnittenen pIVEX2.5d-Vektor ligiert, wodurch das Plasmid pIVEX2.5d-pheAT-HAtag-0 erhalten wurde. Die Selektion erfolgte auf LB(Amp50)Platten. Da für die geplante Mutagenese unter anderem nur der codierende Bereich der Bindungstasche und nicht die gesamte A-Domäne verwendet werden sollte, wurden die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonucleasen KpnI (GGTACC,.

(44) 34. Methoden. 102 bp stromaufwärts des Codons von Asp235) und HpaI (GTTACC, 90 bp stromabwärts des Codons von Cys331) mittels ortsspezifischer Mutagenese in das codierende Genfragment pheAT eingeführt, welche die Subklonierung der erzeugten error-prone-PCR-Amplifikate ermöglicht. Dazu wurde das „QuikChange® Multi SiteDirected Mutagenesis Kit“ (Stratagene, Heidelberg) unter Verwendung von pIVEX2.5d-pheAT-HAtag-0 als Templat-DNA und der Oligonucleotide SG034 und SG035 eingesetzt. Durch spezifischen Verdau mit Restriktionsendonucleasen und DNA-Sequenzierung konnte die Integrität des erhaltenen Plasmides pIVEX2.5dpheAT-HAtag bestätigt werden. pQE60-pheAT-HAtag Das Plasmid pQE60-pheAT-HAtag wurde durch Subklonierung des PheATHA-Tag codierende DNA-Bereichs in den pQE60 Expressionsvektor (Qiagen, Hilden) konstruiert.. Dazu. wurde. mittels. der. internen. Erkennungssequenzen. der. Restriktionsendonucleasen NcoI und BamHI ein 1902 bp großes Genfragment aus dem Plasmid pIVEX2.5d-pheAT-HAtag herausgeschnitten und in den entsprechend modifizierten Vektor pQE60 kloniert. Die Selektion erfolgte auf LB(Amp 50)-Platten.. 4.1.1.2 Plasmide der in vivo-Systeme ptycA/tycB1 (EPS): Die für die ersten beiden Module des Tyrocidin-Biosynthesesystems codierenden Gene tycA und tycB1 wurden gemeinsam unter Verwendung der Oligonucleotide HM98-12 und HM98-2 mittels PCR amplifiziert. Als Templat-DNA diente chromosomale DNA aus B. brevis ATCC8185. Nach Verdau des PCRProduktes mit den Restriktionsendonucleasen NcoI und BamHI wurde das 6495 bp große DNA-Fragment in einen entsprechend geschnittenen pQE61-Vektor kloniert. Für die Transformation wurden elektrokompetente E. coli XL1Blue-Zellen verwendet und die Selektion erfolgte auf LB(Amp 50)-Platten. pSU18-tycA Als Grundlage für die Konstruktion des Expressionsplasmides pSU18-tycA diente das von H. Mootz konstruierte Plasmid pSU18-tycA-His6Tag [Gruenewald, 2004]. Es trägt das Gen der ersten Tyrocidin-Synthetase TycA unter Kontrolle des IPTGinduzierbaren Plac-Promotors mit einer C-terminalen His6Tag-Fusion Um eine spätere.