MgCl 2 wurde gegebenenfalls bei Expressionen in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt, um die Löslichkeit der produzierten Proteine zu erhöhen
4 Methoden
4.1 Molekularbiologische Methoden
Die durchgeführten molekularbiologischen Arbeiten beruhen im Wesentlichen auf etablierten und bereits publizierten Methoden und Vorschriften [Sambrook et al., 1989]. Daher werden im Folgenden nur die Konstruktion der Plasmide und Verfahren beschrieben, die von den Standardtechniken abweichen.
4.1.1 Plasmid-Konstruktion
Die zur Klonierung erforderlichen Genfragmente wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des „TripleMaster® PCR Systems“ (Eppendorf, Hamburg), des „Expand Long Template PCR-Systems“
(Roche, Mannheim) oder der „Pfu-DNA-Polymerase“ (Stratagene, Heidelberg) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme bzw. Mutationen wurden über synthetische Oilgonucleotide (MWG-Biotech, Ebersberg) eingeführt. Die Reinigung der PCR-Ansätze erfolgte mit dem „QIAquick-spin PCR Purification Kit“ oder dem „QIAEX II Gel Extraction Kit“ (QIAGEN, Hilden) nach Vorgabe des Herstellers. Plasmide aus E. coli-Zellen wurden mit dem
„QIAprep® Spin Miniprep Kit“ (QIAGEN, Hilden) oder dem „NucleoSpin® Plasmid-Kit“
(Macherey-Nagel, Düren) präpariert. Die Verifizierung der Plasmide erfolgte durch spezifischen Verdau mit Restriktionsendonucleasen und DNA-Sequenzierung.
Die Sequenzen der im Folgenden genannten synthetischen Oligonucleotide sind in Tabelle 8-1 (siehe Anhang) angegeben.
4.1.1.1 Plasmide der in vitro-Systeme
pSU18-tycA(T278A) und pSU18-tycA(T278A,I299A)
Die Plasmide pSU18-tycA(T278A) und pSU18-tycA(T278A,I299A) wurden durch ortsspezifische Mutagenese mit Hilfe des „QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit“ (Stratagene, Heidelberg) durch Verwendung der Oligonucleotide SG042, SG043 und SG044 nach den Angaben des Herstellers konstruiert. Für die PCR wurde als Templat-DNA das Plasmid pSU18-tycA (siehe Kapitel 4.1.1.2) eingesetzt. Nach der PCR wurde die Templat-DNA mit der Restriktionsendonuclease
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DpnI verdaut. Dadurch sollten Transformanden, die aus der Wildtyp-DNA entstehen und somit keine Mutationen tragen, vermieden werden. Die Selektion erfolgte durch LB(Cm20)-Platten. Ursprünglich sollte die Vierfach-Mutante pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A,C331A) (s. u.) unter Einsatz der Oligonucleotide SG042, SG043 und SG044 auf diesem Wege konstruiert werden. Allerdings konnten unter den Transformanden nur die Mutanten pSU18-tycA(T278A) (Primer SG042) und pSU18-tycA(T278A,I299A) (Primer SG042 und SG043) isoliert werden.
pSU18-tycA(I299A), pSU18-tycA(I330A), pSU18-tycA(C331A) und pSU18-tycA(I330A,C331A)
Die Einführung der Punktmutationen für die Plasmide pSU18-tycA(I299A), pSU18-tycA(I330A), pSU18-tycA(C331A) und pSU18-tycA(I330,C331A) erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese durch den Einsatz des „QuikChange® Site Directed Mutagenesis Kit“ (Stratagene, Heidelberg) mit den Oligonucleotiden SG043/SG058 für pSU18-tycA(I299A), SG052/SG053 für pSU18-tycA(I330A) und SG054/SG055 für pSU18-tycA(C331A). Als Templat-DNA diente das Plasmid tycA (siehe Kapitel 4.1.1.2). Für die Generierung der Doppelmutante pSU18-tycA(I330,C331A) wurde auf Basis des Plasmides pSU18-tycA(C331A) eine PCR mit den Oligonucleotiden SG059 und SG060 durchgeführt. Die Selektion erfolgte über LB(Cm20)-Platten.
Weitere Plasmide auf pSU18-Basis
Unter Verwendung der internen Restriktionsendonuclease-Schnittstellen für NdeI und NsiI war es möglich, die codierenden Bereiche der Bindungstasche der bislang konstruierten Expressionsplasmide mittels Subklonierung untereinander zu den restlichen Doppel- und Tripelmutanten sowie der Vierfachmutante zu kombinieren. NsiI schneidet die DNA zwischen den Positionen I299 und I330 im Codon für N321, und NdeI hat seine Erkennungssequenz an Position Y35. Durch den Verdau mit den Enzymen NdeI und NsiI entsteht ein 855 bp großes DNA-Fragment, das die Positionen T278 und I299 umfasst, sowie ein zweites Fragment mit einer Größe von 4928 bp, das entsprechend die Positionen I330 und C331 beinhaltet. Zur Konstruktion der Tripelmutante pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A) wurden die Doppelmutante pSU18-tycA(T278A,I299A) und die Einzelmutante pSU18-tycA(I330A) jeweils mit NdeI und NsiI geschnitten. Die Ligation des 855 bp
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großen DNA-Fragments aus dem Verdau der Doppelmutante mit dem 4928 bp großen Fragment aus dem Verdau der Einzelmutante ergab das Plasmid pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A). Analog wurden die Plasmide pSU18-tycA(T278A,I330A), pSU18-tycA(T278A,C331A), pSU18-tycA(I299A,I330A), pSU18-tycA(I299A,C331A), tycA(T278A,I299A,C331A), tycA(T278A,I330A,C331A), pSU18-tycA(I299A,I330A,C331A) und pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A,C331A) durch Liga-tion der entsprechenden DNA-Fragmente konstruiert. Eine Übersicht der durch Subklonierung generierten Konstrukte unter Angabe der Ursprungsplasmide und der verwendeten DNA-Fragmente zeigt Tabelle 4-1.
Tabelle 4-1: Konstruktion von Doppel-, Tripel- und Vierfachmutanten von pSU18-tycA durch Subklonierung.
pIVEX2.5d-pheAT-HAtag
Das Gen pheAT, das für die ersten beiden Domänen A-PCP aus dem Initiationsmodul der Tyrocidin-Synthetase TycA codiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonucleotide HM98-12 und SG033 und des Plasmides pSU18-tycA als Templat-DNA amplifiziert. Nach Verdau des PCR-Amplifikates mit den Restriktionsendonucleasen NcoI und SalI wurde das 1803 bp große Fragment mit einem analog geschnittenen pIVEX2.5d-Vektor ligiert, wodurch das Plasmid pIVEX2.5d-pheAT-HAtag-0 erhalten wurde. Die Selektion erfolgte auf LB(Amp50 )-Platten.
Da für die geplante Mutagenese unter anderem nur der codierende Bereich der Bindungstasche und nicht die gesamte A-Domäne verwendet werden sollte, wurden die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonucleasen KpnI (GGTACC,
Ursprungsplasmide Produkt
855 bp-Fragment 4928 bp-Fragment pSU18-tycA(T278A,I330A) pSU18-tycA(T278A) pSU18-tycA(I330A) pSU18-tycA(T278A,C331A) pSU18-tycA(T278A) pSU18-tycA(C331A)
pSU18-tycA(I299A,I330A) pSU18-tycA(I299A) pSU18-tycA(I330A) pSU18-tycA(I299A,C331A) pSU18-tycA(I299A) pSU18-tycA(C331A) pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A) pSU18-tycA(T278A,I299A) pSU18-tycA(I330A) pSU18-tycA(T278A,I299A,C331A) pSU18-tycA(T278A,I299A) pSU18-tycA(C331A) pSU18-tycA(T278A,I330A,C331A) pSU18-tycA(T278A) pSU18-tycA(I330A,C331A)
pSU18-tycA(I299A,I330A,C331A) pSU18-tycA(I299A) pSU18-tycA(I330A,C331A) pSU18-tycA(T278A,I299A,I330A,C331A) pSU18-tycA(T278A,I299A) pSU18-tycA(I330A,C331A)
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102 bp stromaufwärts des Codons von Asp235) und HpaI (GTTACC, 90 bp stromabwärts des Codons von Cys331) mittels ortsspezifischer Mutagenese in das codierende Genfragment pheAT eingeführt, welche die Subklonierung der erzeugten error-prone-PCR-Amplifikate ermöglicht. Dazu wurde das „QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit“ (Stratagene, Heidelberg) unter Verwendung von pIVEX2.5d-pheAT-HAtag-0 als Templat-DNA und der Oligonucleotide SG034 und SG035 eingesetzt. Durch spezifischen Verdau mit Restriktionsendonucleasen und DNA-Sequenzierung konnte die Integrität des erhaltenen Plasmides pIVEX2.5d-pheAT-HAtag bestätigt werden.
pQE60-pheAT-HAtag
Das Plasmid pQE60-pheAT-HAtag wurde durch Subklonierung des PheAT-HA-Tag codierende DNA-Bereichs in den pQE60 Expressionsvektor (Qiagen, Hilden) konstruiert. Dazu wurde mittels der internen Erkennungssequenzen der Restriktionsendonucleasen NcoI und BamHI ein 1902 bp großes Genfragment aus dem Plasmid pIVEX2.5d-pheAT-HAtag herausgeschnitten und in den entsprechend modifizierten Vektor pQE60 kloniert. Die Selektion erfolgte auf LB(Amp50)-Platten.
4.1.1.2 Plasmide der in vivo-Systeme ptycA/tycB1 (EPS):
Die für die ersten beiden Module des Tyrocidin-Biosynthesesystems codierenden Gene tycA und tycB1 wurden gemeinsam unter Verwendung der Oligonucleotide HM98-12 und HM98-2 mittels PCR amplifiziert. Als Templat-DNA diente chromosomale DNA aus B. brevis ATCC8185. Nach Verdau des PCR-Produktes mit den Restriktionsendonucleasen NcoI und BamHI wurde das 6495 bp große DNA-Fragment in einen entsprechend geschnittenen pQE61-Vektor kloniert.
Für die Transformation wurden elektrokompetente E. coli XL1Blue-Zellen verwendet und die Selektion erfolgte auf LB(Amp50)-Platten
pSU18-tycA
Als Grundlage für die Konstruktion des Expressionsplasmides pSU18-tycA diente das von H. Mootz konstruierte Plasmid pSU18-tycA-His6Tag [Gruenewald, 2004]. Es trägt das Gen der ersten Tyrocidin-Synthetase TycA unter Kontrolle des IPTG-induzierbaren Plac-Promotors mit einer C-terminalen His6Tag-Fusion Um eine spätere
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unabhängige Reinigung der Peptidsynthetasen aus dem neu zu konstruierenden Zweiplasmidsystem (siehe Kapitel 6.4.2) zu ermöglichen, sollte am C-Terminus des tycA-Gens die für einen StrepTag codierende DNA-Sequenz mit anschließendem Stop-Codon eingeführt werden. Dazu wurde das Plasmid pSU18-tycA-His6Tag mit der Restriktionsendonuclease BamHI, deren Erkennungssequenz 7 bp upstream des His6Tags liegt, geschnitten und mit zuvor über T4-Polynucleotid-Kinase phosphorylierten, anschließend für 5 min bei 95 °C denaturierten und für 2 min bei 4 °C annealten synthetischen Oligonucleotiden, die für den StrepTag codieren, ligiert.
Die Primer wurden so konstruiert, dass an ihren Enden nach dem Annealing zur BamHI-Schnittstelle kompatible Enden entstehen (Primer: SG031 und SG032), dennoch aber die Erkennungssequenz für das Enzym zerstört wird. Bei den folgenden Verdaus der erhaltenen Plasmide mit spezifischen Restriktions-endonucleasen konnte somit auf den Verlust der BamHI-Schnittstelle selektiert werden, was ein Indiz für die Integrität der erhaltenen Plasmide pSU18-tycA war. Die endgültige Verifizierung erfolgte über DNA-Sequenzierung.
pTrc99a-tycB1
Das Plasmid pTrc99a-tycB1 entstand durch Verdau des auf pQE60 basierenden Ausgangsvektors pTycB1 [Mootz, 2000] mit den Restriktions-endonucleasen NcoI und XbaI und anschließender Klonierung des 4146 bp großen Fragmentes in den analog geschnittenen Vektor pTrc99a. Bei der Klonierung wurden die ribosomale Bindungsstelle sowie die den His6Tag codierende Sequenz mit in den pTrc99a-Vektor übernommen. Die Selektion der Plasmide erfolgte auf LB(Amp50 )-Platten.