MgCl 2 wurde gegebenenfalls bei Expressionen in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt, um die Löslichkeit der produzierten Proteine zu erhöhen
D- Phe-L-Pro-DKP [µM]
7 Diskussion
7.1 Untersuchung von TycA-Bindungstaschen-Mutanten
7.1.2 Nebenspezifitäten der TycA-Bindungstaschen-Mutanten
Nach Ermittlung der katalytischen Aktivitäten der TycA-Derivate wurden, ebenfalls mittels Aminosäure-abhängiger ATP/PPi-Austauschreaktionen, die Aus-wirkungen der eingebrachten Mutationen auf die Substratselektivität untersucht.
Diese Analysen standen – im Gegensatz zu den kinetischen Messungen – im engen Bezug zur angestrebten Etablierung eines in vitro-Evolutionssystems, da neben den verbleibenden 19 proteinogenen Aminosäuren auch weitere Aminosäuren wie N-Acetyl-D-Phenylalanin und N-Methyl-D-Phenylalanin im Hinblick auf den Aufbau eines Selektionssystems getestet wurden. Gegen die nicht-proteinogenen, mis-kognaten Substrate 3-Nitro-Tyrosin und O-Phospho-Tyrosin waren entsprechende Antikörper kommerziell verfügbar. Des weiteren wurden die Carbonsäure-Derivate
Diskussion 111
Fluorescein und Luciferin getestet, da diese nach Aktivierung und kovalenter Thioester-Bindung aufgrund ihrer fluorophoren Eigenschaften eine direkte Detektion ermöglichen würden.
Die Darstellung eines Enzyms mit (Neben-)Selektivität für die genannten mis-kognaten Substrate war eigentlich nicht die ursprüngliche Intention bei der Generierung der Bindungstaschenmutanten. Vielmehr ging es – dem Beispiel von Wang et al. folgend – um die Schaffung einer A-Domäne, deren Substrat-bindungstasche nahezu vollständig aus Alanin-Resten aufgebaut ist und die als Ausgangsbasis für nachfolgende evolutive Ansätze dienen sollte. Insofern konnte nicht unmittelbar mit einer Erkennung und Aktivierung dieser Amino- und Carboxysäuren gerechnet werden. Aus vorangegangenen Studien war jedoch bekannt, dass die Phenylalanin-selektive A-Domäne des TycA (PheA) einige signifikante Nebenspezifitäten für mis-kognate Aminosäuren (u. a. Tryptophan, Tyrosin und Leucin) besitzt. Darüber hinaus konnte in Mutationsstudien an der homologen A-Domäne von GrsA gezeigt werden, dass eine formale Vergrößerung der Substratbindungstasche prinzipiell mit einer Relaxierung der Substratselektivität verbunden ist, während eine formale Verengung mit einer Reduktion der Nebenspezifitäten gekoppelt war. Als Beispiele können Mutationen an der Position A301 angeführt werden, wo durch die Einführung eines Glycin-Restes die Austauschrate in Anwesenheit der mis-kognaten Aminosäure L-Leucin verdoppelt werden konnte, während durch die Einführung eines Valin-Restes jegliche Nebenaktivitäten verloren gingen [Stachelhaus, 1999].
Die in dieser Arbeit eingeführten Alanin-Mutationen in der TycA-Bindungstasche führten allesamt zu deren formaler Vergrößerung. Vor diesem Hintergrund bestand also eine gewisse Wahrscheinlichkeit, dass zumindest einige der generierten TycA-Derivate neue und/oder erhöhte Nebenspezifitäten aufweisen könnten. Überraschender W eise war dies jedoch nicht der Fall. Im Gegenteil wurde gerade für das Wildtyp-TycA-Protein von allen untersuchten Enzymen das breiteste Spektrum an Nebenspezifitäten beobachtet (Tabelle 7-2). Neben den fünf proteinogenen Aminosäuren L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Leucin, L-Valin und
L-Methionin waren dies auch das Amino-substituierte Substrat
N-Acetyl-L-Phenylalanin, sowie insbesondere 3-Nitro-Tyrosin.
112 Diskussion
Tabelle 7-2: Beobachtete Nebenspezifitäten der TycA-Derivate. Farblich markiert sind die Umsatzraten der einzelnen TycA-Derivate für die entsprechenden Substrate. Buchstaben:
1-Buchstaben-Code der Aminosäuren. Zahlen: Zusatzsubstrate (siehe Legende).
F A R B D C Q E G H I L K M P S T W Y V 1 2 3 4 5 6
TycAWT TycA(T278A)
TycA(I299A) TycA(I330A) TycA(C331A) TycA(T278A,I299A) TycA(T278A,I330A) TycA(T278A,C331A) TycA(I299A,I330A) TycA(I299A,C331A) TycA(I330A,C331A) TycA(T278A,I299A,I330A) TycA(T278A,I299A,C331A) TycA(T278A,I330A,C331A) TycA(I299A,I330A,C331A) TycA(T278A,I299A,I330A,C331A)
Vergleich der Umsatzraten V [min-1] TycA-Derivat
1 2 3
3-Nitro-L-Tyrosin O-Phospho-L-Tyrosin Fluorescein
- 0,5 min-1 - 5 min-1
> 5 min-1 - 0,01 min-1
-0,05 min-1 - 0,1 min-1
4 5 6
Luciferin
N-Acetyl-D-Phenylalanin N-Methyl-D-Phenylalanin
F A R B D C Q E G H I L K M P S T W Y V 1 2 3 4 5 6
TycAWT TycA(T278A)
TycA(I299A) TycA(I330A) TycA(C331A) TycA(T278A,I299A) TycA(T278A,I330A) TycA(T278A,C331A) TycA(I299A,I330A) TycA(I299A,C331A) TycA(I330A,C331A) TycA(T278A,I299A,I330A) TycA(T278A,I299A,C331A) TycA(T278A,I330A,C331A) TycA(I299A,I330A,C331A) TycA(T278A,I299A,I330A,C331A)
Vergleich der Umsatzraten V [min-1] TycA-Derivat
1 2 3
3-Nitro-L-Tyrosin O-Phospho-L-Tyrosin Fluorescein
- 0,5 min-1 - 5 min-1
> 5 min-1 - 0,01 min-1
-0,05 min-1 - 0,1 min-1
4 5 6
Luciferin
N-Acetyl-D-Phenylalanin N-Methyl-D-Phenylalanin 1
2 3
3-Nitro-L-Tyrosin O-Phospho-L-Tyrosin Fluorescein
- 0,5 min-1 - 5 min-1
> 5 min-1 - 0,01 min-1
-0,05 min-1 - 0,1 min-1
4 5 6
Luciferin
N-Acetyl-D-Phenylalanin N-Methyl-D-Phenylalanin
Generell ist festzustellen, dass die für das native TycAWT-Protein ermittelten Nebenselektivitäten bei vielen Mutanten in abgeschwächter Form wieder auftreten.
Die Häufigkeit von Nebenselektivitäten nimmt erwartungsgemäß mit steigender Anzahl von Mutationen in der Bindungstasche ab. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen für die Entwicklung der katalytischen Effizienz der Einzelmutanten, zeigen die TycA-Derivate TycA(T278A) und TycA(I330A) auch bei den Neben-selektivitäten ein verringertes Spektrum. TycA(T278A) ist in der Lage, L-Leucin und
L-Valin zu aktivieren, TycA(I330A) aktiviert L-Methionin und L-Valin, wohingegen für die Mutanten TycA(I299A) und TycA(C331A) ein weitaus breiteres Spektrum von Nebenselektivitäten beobachtet wurde, das L-Leucin, L-Methionin, L-Tryptophan,
L-Valin (nicht TycA(I299A)), 3-Nitro-Tyrosin sowie N-Acetyl-D-Phenylalanin umfasst.
Eine gewisse Sonderstellung nahm die proteinogene, mis-kognate Aminosäure L-Valin ein, für die durch die Einführung von Punktmutationen als einziges der getesteten Substrate eine Erhöhung der Umsatzrate beobachtet werden konnte. Im Vergleich zum Wildtyp-Protein (Umsatzrate: 0,028 min-1) konnte bei den Mutanten TycA(C331A) und TycA(I299A, C331A) eine Verdoppelung (0,06 min-1), bzw. bei den Mutanten TycA(T278A, I299A) und TycA(T278A, C331A) sogar eine Verdreifachung (0,09 min-1) der Umsatzraten beobachtet werden. Selbst die
Diskussion 113
Vierfachmutante zeigte gegenüber dem Wildtyp eine leicht höhere Austauschrate (0,046 min-1).
Die meist geringere Aktivierung mis-kognater Substrate lässt sich durch einen Vergleich der Aminosäurereste der nativen, Phenylalanin-aktivierenden Bindungstasche mit Bindungstaschen, die für Aminosäuren codieren, für die eine Nebenselektivität festgestellt wurde, ansatzweise erklären (Tabelle 7-3).
Tabelle 7-3: Vergleich der Selektivitäts-Codes von TycAWT (Selektivität: Phe), der Vierfachmutante TycA(T278A, I299A, I330A, C331A) (Selektivität: X) sowie Bindungstaschen unterschiedlicher Herkunft mit Selektivitäten für Leucin, Tryptophan, Tyrosin und Valin. Rot:
Position stimmt mit TycAWT überein. Gelb: Position stimmt mit der neu generierten Vierfachmutante TycA(T278A, I299A, I330A, C331A) überein.
Selektivität Herkunft
235 236 239 278 299 301 322 330 331 517
Phe D A W T I A A I C K TycA
X D A W A A A A A A K TycA(T278A,I299A,I330A,C331A)
Leu (1) D A W F L G N V V K BacA3, LchAA3, LchAB3, LicA3, LicB3, MycB1, NosA4, NosC1, SrfAA3, SrfAB3
Leu (2) D A W L Y G A V M K CssA2, CssA3, CssA8, CssA10
Leu (3) D G A Y T G E V V K GrsB4, TycC6
Leu (4) D A F M L G M V F K LchAA2, LicA2, SrfAA2
Leu (5) D A F F L G C V F K SrfAC
Trp D A W S V G S V C K CDA1.3, CDA3.2
Tyr (1) D A S T I A A V C K ApdB4, NosD1
Tyr (2) D A S T L G A I C K CepB3
Tyr (3) D T S K V A A I C K CepA2
Tyr (4) D G T I T A E V A K FenA3, FenD1, PPS2.1, PPS4.3
Tyr (5) D A L T T G E V V K MycB1, TycC3
Tyr (6) D I L Q L G L V W K SafA1
Tyr (7) D P W G L G L I D K SafA2
Val (1) D A Y F W G V T F K AcmB2, AcmC3
Val (2) D F E S T A A V Y K AcvA3
Val (3) D A W M F A A I L K CssA4, CssA9
Val (4) D G W F I G I I I K EsynA2
Val (5) D A F W I G G T F K FenE2, GrsB2, LchAB1, LicB1, PPS3.2, SrfAB1, TycC4 Position
Selektivität Herkunft
235 236 239 278 299 301 322 330 331 517
Phe D A W T I A A I C K TycA
X D A W A A A A A A K TycA(T278A,I299A,I330A,C331A)
Leu (1) D A W F L G N V V K BacA3, LchAA3, LchAB3, LicA3, LicB3, MycB1, NosA4, NosC1, SrfAA3, SrfAB3
Leu (2) D A W L Y G A V M K CssA2, CssA3, CssA8, CssA10
Leu (3) D G A Y T G E V V K GrsB4, TycC6
Leu (4) D A F M L G M V F K LchAA2, LicA2, SrfAA2
Leu (5) D A F F L G C V F K SrfAC
Trp D A W S V G S V C K CDA1.3, CDA3.2
Tyr (1) D A S T I A A V C K ApdB4, NosD1
Tyr (2) D A S T L G A I C K CepB3
Tyr (3) D T S K V A A I C K CepA2
Tyr (4) D G T I T A E V A K FenA3, FenD1, PPS2.1, PPS4.3
Tyr (5) D A L T T G E V V K MycB1, TycC3
Tyr (6) D I L Q L G L V W K SafA1
Tyr (7) D P W G L G L I D K SafA2
Val (1) D A Y F W G V T F K AcmB2, AcmC3
Val (2) D F E S T A A V Y K AcvA3
Val (3) D A W M F A A I L K CssA4, CssA9
Val (4) D G W F I G I I I K EsynA2
Val (5) D A F W I G G T F K FenE2, GrsB2, LchAB1, LicB1, PPS3.2, SrfAB1, TycC4 Position
Positionen, die mit dem Wildtyp-Protein übereinstimmen sind rot hervorgehoben, wohingegen die Reste, die mit der Vierfachmutante TycA(T278A, I299A, I330A, C331A) äquivalent sind, gelb unterlegt sind. Bei nahezu allen
114 Diskussion
dargestellten Bindungstaschen wird durch die Mutationen zu Alanin keine Annäherung des ursprünglichen L-Phenylalanin-Codes des Wildtyp-Proteins an den Selektivitäts-Code der Bindungstaschen für L-Leucin, L-Tryptophan, L-Tyrosin oder
L-Valin erreicht. Im Gegenteil gehen eher Übereinstimmungen zur Phenylalanin-aktivierenden Bindungstasche und den damit verbundenen Nebenselektivitäten verloren. Besonders deutlich wird diese Beobachtung z. B. beim Vergleich der Aminosäurereste der Bindungstaschen Phe und Tyr (1). Während in der Wildtyp-Bindungstasche noch acht von zehn Resten übereinstimmen, sind es bei der Vierfachmutante lediglich noch fünf Reste. Hier bedarf es wahrscheinlich einer genauen Strukturaufklärung um die Auswirkungen der eingeführten Mutationen eingehender evaluieren zu können.
Im Hinblick auf die Etablierung eines Selektionssystems für Protein-evolutive Ansätze konnten lediglich eine potentiell nutzbare Nebenspezifität für 3-Nitro-Tyrosin determiniert werden. Die höchsten Austauschraten wurden hierbei mit dem Wildtyp-Enzym und – bereits in deutlich abgeschwächter Form – für die Einzelmutante TycA(I299A) ermittelt. Die Aktivierung des mis-kognaten Substrates 3-Nitro-Tyrosin erschien hierbei interessant, da die gemessene Austauschaktivität (Umsatzrate: 0,6 min-1) bereits außerordentlich ausgeprägt war und spezifische Antikörper kommerziell erhältlich waren, die eine Detektion von Enzym-gebundenen 3-Nitro-Tyr-S-Ppant ermöglichen sollten. Für den nachfolgend geplanten Aufbau eines in vitro-Evolutionssystems bot es sich daher an, zunächst exemplarisch die bereits vorhandene Basalaktivität des Wildtyp-Proteins für die Aktivierung von 3-Nitro-Tyrosin auszunutzen.