Prävalenz von Salmonella ssp. in der primären Geflügelproduktion und Broilerschlachtung

Prävalenz von Salmonella ssp. in der primären Geflügelproduktion und Broilerschlachtung – Salmonelleneintrag bei Schlachtgeflügel während des

Schlachtprozesses

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Katharina Grewe

aus Paderborn

Hannover 2011

Univ. Prof. Dr. G. Klein

Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. V. Atanassova Univ. Prof. Dr. G. Klein 2. Gutachter: Prof. Dr. R. Goethe

Tag der mündlichen Prüfung: 11. November 2011

1 Einleitung und Fragestellung 1

1.1 Problemstellung . . . 1

1.2 Zielsetzung . . . 5

2 Literaturübersicht 7 2.1 Historie . . . 7

2.2 Taxonomie und Klassifikation . . . 8

2.3 Das Bakterium - Morphologie und Physiologie . . . 12

2.3.1 Morphologie . . . 12

2.3.2 Koloniemorphologie . . . 12

2.3.3 Wachstum . . . 13

2.3.4 Eigenschaften . . . 13

2.4 Kultivierung und Diagnostik . . . 13

2.5 Standardmethoden . . . 17

2.6 Differenzierung . . . 21

2.6.1 Biochemische Eigenschaften und Biotypisierung . . . 21

2.6.2 Serotypisierung . . . 21

2.6.3 Qualitative PCR . . . 22

2.6.4 Real Time PCR . . . 23

2.6.5 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) . . . 23

2.6.6 Entwicklung der Nachweismethoden . . . 24

2.7 Pathogenität und Virulenz . . . 24

2.8 Tenazität . . . 26

2.8.1 Temperatur . . . 27

2.8.2 Feuchtigkeit . . . 28

2.8.3 pH-Wert . . . 29

2.8.4 Desinfektionsmittel und organische Säuren . . . 31

2.9 Epidemiologie . . . 31

2.12 Übertragung durch Lebensmittel . . . 44

2.13 Bekämpfung . . . 49

2.14 Salmonellose Fälle . . . 52

2.15 Resistenzermittlung . . . 60

2.16 Resistenzlage . . . 62

2.17 Rechtslage . . . 68

2.18 Prävalenz . . . 70

3 Material und Methoden 73 3.1 Material . . . 73

3.1.1 Entnahme der Sockentupferproben auf dem Mastbetrieb . . . 73

3.1.2 Entnahme der Kloakentupfer im Schlachtbetrieb . . . 73

3.1.3 Entnahme der Brühwasservorprobe und der Brühwasserabtropfproben 74 3.1.4 Entnahme von Halshautproben . . . 74

3.1.5 Untersuchung der Proben im Labor . . . 74

3.2 Methode . . . 75

4 Ergebnisse 81 4.1 Mikrobiologischer Ausgangsstatus des Brühwassers vor Schlachtbeginn . . . 81

4.2 Salmonellen im Produktionsprozess . . . 81

4.3 Herdenprävalenz . . . 92

4.4 Gesamtprävalenzen von Salmonella im Schlachtprozess . . . 93

4.5 Serovarverteilung insgesamt . . . 95

4.6 Verlauf der Prävalenz über den Produktionsprozess . . . 96

4.7 Der Prävalenzverlauf in Abhängigkeit von der Herdenklassifizierung inSal- monella positiv und Salmonella negativ . . . 102

4.8 Saisonabhängigkeit des Prävalenzverlaufs . . . 104

4.9 Resistenzlage . . . 105

5 Diskussion 113 5.1 Schlussfolgerungen . . . 124

6 Zusammenfassung 127

7 Summary 129

Abkürzungsverzeichnis 133

Abbildungsverzeichnis 135

Tabellenverzeichnis 137

Literaturverzeichnis 139

Gesetze, Richtlinien und Verordnungen 161

Index 163

Einleitung und Fragestellung

1.1 Problemstellung

Geflügelprodukte, aber auch lebende Hühner sind Eintragsquellen von Salmonellen in die Lebensmittelkette. Daher ist es von großer Bedeutung, Zoonosen, die auf Salmonellen zu- rückzuführen sind zu bekämpfen und so der Gesetzgebung nachzukommen. Im Dachgesetz des deutschen Lebensmittelrechts, dem Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futter- mittelgesetzbuch (LFGB) ist unter § 5 zu finden, was zum Schutz der Gesundheit verboten ist. So wird in Absatz 1 erklärt, dass es verboten ist Lebensmittel für andere derart her- zustellen oder zu behandeln, dass ihr Verzehr gesundheitsschädlich ist [BMJ LFGB 2005].

Dies ist bezogen auf die EG Verordnung 178/2002. In Artikel 14 Absatz 2 wird in der Verordnung bestimmt, dass nur sichere Lebensmittel in Verkehr gebracht werden dürfen.

Im weiteren wird erläutert, was unter den Begriffen „sicher“ und „gesundheitsschädlich“

zu verstehen ist [EG VO 178/2002]. Am 17. November 2003 wurde eine neue Richtlinie zur Bekämpfung von Salmonellen und anderen durch Lebensmittel übertragbare Zoono- seerregern vom Europäischen Parlament und Rat erlassen, die Richtlinie (EG)2160/2003.

Diese Richtlinie legt fest, dass es anzustreben ist, nur Geflügelfleisch zu vermarkten, bei dem mit ausreichender Sicherheit davon ausgegangen werden kann, dass es frei von den betreffenden Salmonellen ist. Mit der Richtlinie (EG)2160/2003 soll die Prävalenz, also der Anteil der salmonellentragenden Tiere an der Gesamtheit auf unter 1% reduziert wer- den. Die Bekämpfungsmaßnahmen sollen dabei die gesamte Lebensmittelkette erfassen [EG VO 2160/2003]. Aus der oben genannten Richtlinie sind EG Verordnungen hervor- gegangen, die die Richtlinie umsetzen sollen. Sie sollen helfen, dieses oberste Ziel, die Salmonellenreduktion durch Pflichtimpfmaßnahmen, Probenahmen, Bekämpfungsstrate- gien und Vermarktungsvorschriften zu erreichen. Die EG Verordnung 1177/2006 bestimmt beispielsweise die Durchführung der o. g. Verordnung hinsichtlich der Bestimmungen über

die Anwendung von spezifischen Bekämpfungsmethoden im Rahmen der nationalen Pro- gramme zur Bekämpfung von Salmonellen beim Geflügel [EG VO 1177/2006]. Die Ver- ordnungen 646/2007 und 584/2003 sind zur Durchführung der Verordnung 2160/2003 des Europäischen Parlamentes und des Rates über ein Gemeinschaftsziel zur Senkung der Prävalenz von Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium bei Masthähnchen bzw. bei Puten erlassen worden [EG VO 646/2007] [EG VO 584/2008]. Das deutsche Bekämpfungsprogramm umfasst alle Ebenen der Primärproduktion wie z. B. die Futter- mittelherstellung, die Geflügelzucht und Geflügelaufzucht für die Legehennenhaltung so- wie Maßnahmen für die Schlachtung von Zucht- und Aufzuchthühnern und die Nutzung von Eiern aus der Geflügelzucht. Die Durchführung des Bekämpfungsprogramms wird durch die für Deutschland geltende Verordnung zum Schutz gegen bestimmte Salmonel- leninfektionen beim Haushuhn, die sogenannte Hühner-Salmonellen-Verordnung, geregelt [BMELV, 2009].

Die Salmonellose zählt trotz rückläufiger Zahlen seit dem Jahr 1992 zu den häufigs- ten lebensmittelbedingten Erkrankungen [Ammon u. Bräunig, 2002]. Die Zahlen aus dem Jahr 2006 belegen, dass Salmonellosen außerdem zu den häufigsten bakterienbedingten Zoonosen gehören. Insgesamt 52.319 Salmonellosefälle wurden im Jahr 2006 gemeldet.

Somit waren Darminfektionen aufgrund von Salmonellen noch vor Campylobacter En- teritiden zu verzeichnen. Im Jahr 2009 wurden dem Robert Koch Institut (RKI) 31.397 Salmonellosefälle gemeldet, die Salmonellengefahr scheint demnach bereits geringfügig auf dem Rückmarsch zu sein. Unter den Salmonella enterica Serovaren ist das Serovar Ente- ritidis am häufigsten vertreten. Im Jahr 2006 machte das Serovar Enteritidis 43,94% der gemeldeten Salmonelleninfektionen aus, in den Jahren 2005 und 2008 sogar 62% und stieg im Jahr 2007 auf 71%. Im Jahr 2009 sank der Anteil des Serovars Enteritidis auf 58%. S.

Typhimurium wurde dagegen 2008 und 2009 nur zu 30% bzw. 33% isoliert [Robert Koch Institut, 2007a] [Robert Koch Institut, 2010]. Bis Ende der Siebziger Jahre war S. Ty- phimurium das am häufigsten isolierte Salmonellaserovar. Heute zeigt sich eine Umkehr der Verhältnisse und S. Typhimurium liegt nach S. Enteritidis nur noch an zweiter Stelle [Atanassova et al., 1994]. In Portugal wurde zwischen 1995 und 1996 in 60% der beprob- ten Hähnchenprodukte ebenfallsS. Enteritidis gemeinsam mitS. Hadar am häufigsten als Kontaminante isoliert [Antunes et al., 2003]. Auch in anderen Ländern wie den USA gilt der SerotypS. Enteritidis als vorherrschender Erreger noch vor S. Typhimurium. Bei der Versuchsdurchführung von Altekruse et al. gab es über die Jahre von 2000 bis zum Jahr 2005 einen signifikanten Anstieg von Schlachthöfen in denen S. Enteritidis in Spülproben von Karkassen nach der Kühlung nachgewiesen wurden. Im Jahr 2000 sind noch 9% der in der Studie untersuchten Schlachtstätten positiv getestet worden während im Jahr 2005

schon 25% mit positivem Ergebnis auffielen [Altekruse et al., 2006]. Bei einer österreichi- schen Studie fanden Pless et al. ebenfalls ein verstärktes Vorkommen von S. Enteritidis (60%) vor [Pless u. Köfer, 1998]. Eine französische wissenschaftliche Untersuchung zeigte, dass in anderen Ländern zum Teil andere Serovaren an der Spitze liegen. Zwischen 2005 und 2006 wurde in Frankreich am häufigsten das Serovar S. Hadar isoliert, gefolgt vonS.

Anatum undS. Mbandaka [Le Bouquin et al., 2010]. Schätzungen der Europäischen Behör- de für Lebensmittelsicherheit (EFSA) ergaben für den Zeitraum 2005–2006, dass 11% der Broilerherden in der EU S. Enteritidis und/oderS. Typhimurium positiv sind. Allerdings variiert die Prävalenz hier von S. Enteritidis und S. Typhimurium je nach Mitgliedsstaat stark (zwischen 0% und 39,3%). Bei der Studie der EFSA war auch S. Enteritidis das am häufigsten vertretene Salmonellaserovar. In absteigender Reihenfolge folgten S. Infantis, S. Mbandaka, S. Typhimurium und S. Hadar. In Deutschland wurden hauptsächlich Sal- monellatypen der Gruppe B (30,8%), sowie S. Anatum (20,0%) und S. Paratyphi B der Variante Java (10,8%) nachgewiesen. In der Studie lag Deutschland mit 17,2%Salmonel- la positiv getesteten Broilerherden eher im mittleren Bereich. Die Schlusslichter mit den höchsten ermittelten Salmonellenprävalenzen bildeten Ungarn mit 65,7% Salmonella po- sitiven Masthähnchenherden und Polen mit 57,7% positiv getesteten Broilerherden. Auch die in Tschechien, Griechenland, Irland, Italien, Portugal und Spanien beprobten Broiler- herden zeigten positive Salmonellenergebnisse mit Prävalenzen zwischen 22,5% und 42,8%.

Wie in vielen anderen Studien zeigte sich auch in dieser Versuchsdurchführung, dass in den nordischen Länder wie z. B. Dänemark (3,1%), Estland (2,2%), Finnland (0,3%) und Schweden (0,0%) nur einige sehr wenige oder gar keine Salmonella positiven Bestände im Land vertreten sind. Dies spricht für das gut funktionierende, jahrelang existierende Be- kämpfungsprogramm dieser Staaten [European Food Safety Authority, 2007a] [European Food Safety Authority, 2010c]. Das dänische Bekämpfungsprogramm hat als oberstes Ziel, Salmonella infizierte Broilerbestände auf unter 5% zu reduzieren. Es soll möglichst eine Salmonellenfreiheit auf jeder Stufe der gesamten „Pyramide der Broilerzucht“ gewähr- leisten. Infizierte Zuchtherden werden gemerzt und infizierte Masttiere werden getrennt geschlachtet. Tiere mit dem Status „Salmonella frei“ werden dem Erzeuger besser bezahlt und Hähnchenprodukte aus Salmonella freien Beständen dürfen mit der Bezeichnung

„Salmonella frei“ beworben werden. Der Erfolg dieses Bekämpfungsprogramms zeigt sich deutlich. Im ersten Jahr zwischen 1988 und 1989 wurden noch über 65% der Broilerherden Salmonella positiv getestet. Bereits 11 Jahre später, im Jahr 2000 lag der Anteil schon unter 5%. Auch der Anteil der Salmonella positiven Karkassen in den Schlachthäusern reduzierte sich zeitgleich [Wegener et al., 2003]. Schon im Jahr 2002 lag dänischen Studien zufolge die im Rahmen des dänischen Salmonellenüberwachungs- und Kontrollprogramms

monatlich gemessene Salmonellaprävalenz im Mittel um 1,5%. Auch die Prävalenz der Salmonella positiven Karkassen pro Monat lag lediglich zwischen 1,0% und 1,8% [Danish Zoonosis Centre et al., 2002]. Die geschätzten Kosten für das Programm liegen im Ver- gleich zu der kostenintensiveren Initialphase des Konzeptes bei noch lediglich 4,2 Mio.

US$ pro Jahr. Die Kosten stellen für den Staat demnach eine relativ geringe wirtschaft- liche Belastung im Vergleich zu den Kosten, die bei möglichen Lebensmittelinfektionen entstehen können, dar [Aarestrup et al., 2007] [Wegener et al., 2003]. Auch in Finnland besteht ein effizientes Salmonellen Kontroll Programm (FSCP). Die Prävalenz lag hier bei- spielsweise zwischen 1990 und 1994 bei geringen 0,5% bis 2,9%. Das Programm soll eine Salmonellenprävalenz in verschiedenen vom Tier stammenden Produkten von weniger als 1% sichern. Das Programm regelt Untersuchungen von der Primärproduktion bis zu den nachfolgenden Stufen und regelt das Eingreifen bei Erregerisolierung. Auch hier zeigen die Autoren Kangas et al. und Maijala et al., dass das Modell im Vergleich zu den ent- stehenden Kosten bei Salmonelloseerkrankungen rentabel ist. Dieses Programm wird mit etwa 990.400 e pro Jahr angesetzt. Es stehen hier Kontrollkosten von 0,02 e/kg Broiler gegenüber Kosten für einen potentiellen Salmonellosefall ohne Mortalität von 554 ebzw.

einen Salmonellosefall mit Mortalität von 589 e gegenüber [Kangas et al., 2007] [Maijala et al., 2005]. Das Kontrollprogramm von Schweden wurde bereits 1950 eingeführt und ba- siert aktuell auf den Prinzipien des „hazard analysis of critical control point“ (HACCP) und bezieht jegliches Geflügelfleisch ein. Werden beispielsweise in einer Futtermittelfabrik an einem „critical control point“ Salmonellen identifiziert, werden diese Inhaltsstoffe vor einer Weiterverarbeitung mit organischen Säuren behandelt [Koyuncu u. Haggblom, 2009]

[European Food Safety Authority, 2010c]. Im Gegensatz zu diesem gut funktionierenden Kontrollprogramm weist Deutschland noch großen Nachholbedarf auf. Das Bundesinsti- tut für Risikobewertung gab im Jahr 2006 eine Presseinformation mit dem Inhalt, dass in der Bundesrepublik jeder sechste Masthähnchenbestand mit Salmonellen infiziert sei, heraus. Die Untersuchungen, die zwischen dem 1. Oktober 2005 und dem 30. September 2006 durchgeführt wurden, ergaben dabei eine Salmonellenprävalenz von 17,5% [Bundes- institut für Risikobewertung, 2006b] [Bundesinstitut für Risikobewertung, 2007]. In der etwa gleichen Zeit wurde in Frankreich eine Untersuchung zur Prävalenz durchgeführt.

Hier waren lediglich 8,6 % der Herden positiv [Le Bouquin et al., 2010]. In einem EU wei- ten Programm zur Ermittlung der Prävalenz von Salmonellen zeigte sich eine Belastung bei den untersuchten Broilerherden von 23,7% (95% Konfidenzintervall = 23.0%–24.5%).

Diese Prozentangabe sagt aus, dass im Durchschnitt jede 4. Masthähnchenherde in der EU, im Untersuchungszeitraum von Oktober 2005 bis September 2006, während der letz- ten drei Wochen vor der Schlachtung positiv mit Salmonellen infiziert waren und dies

mit Hilfe von Sockentupferproben nachgewiesen werden konnte [European Food Safety Authority, 2007a].

Der Arbeitskreis Geflügel des Westfälisch-Lippischen Landwirtschaftsverbands (WLV) brachte 2009 Ergebnisse eines Untersuchungs- und Hygieneprogramms zur Bekämpfung von Salmonellen in der Legehennenhaltung im Bundesland NRW heraus. In dieser Studie wurden bei nur etwa 12% der teilnehmenden 500 Betriebe Salmonellen in Staub oder im Kot nachgewiesen [Quakernack, 2009]. Diese Ergebnisse liegen jedoch weit unter dem Bundesdurchschnitt bei Broilerherden, der bei 17,5% liegt [Bundesinstitut für Risiko- bewertung, 2006b] [Bundesinstitut für Risikobewertung, 2007]. Mit dem Prozentsatz von 17,5% salmonellenbelasteter Hähnchenmastbetriebe liegt Deutschland damit im Vergleich zu anderen europäischen Ländern im oberen Bereich. Wie bereits erwähnt, wird in skandi- navischen Länder bereits seit mehreren Jahren ein intensives Bekämpfungsprogramm ge- fahren, so dass diese Länder mit ihren Salmonellenraten sehr viel niedriger als Deutschland liegen [Bundesinstitut für Risikobewertung, 2007]. Die Prävalenz von Salmonellen variiert in den Untersuchungen der EFSA je nach EU Land zwischen 0% bis 68,2% [European Food Safety Authority, 2007a]. Für die Zukunft haben in Deutschland stärkere Bekämp- fungsmaßnahmen daher höchste Priorität. Diese Maßnahmen müssen bereits während der Aufzucht und Mast erfolgen sowie den Transport zum Schlachthof einbeziehen. Während des Schlachtprozesses müssen Maßnahmen eingeleitet werden, die bei Salmonella freien Schlachtkörpern eine Kontamination verhindern. Die nachfolgenden Produktionsschritte wie die Herstellung, die Verpackung und der Vertrieb von Geflügelfleischprodukten müs- sen in die Bekämpfungsstrategie fest mit einbezogen werden, damit Rekontaminationen vermieden werden [Bundesinstitut für Risikobewertung, 2007].

1.2 Zielsetzung

In der vorliegenden Arbeit sollen wichtige Eintragsquellen für Salmonellen durch die Er- mittlung der Prävalenz auf verschiedenen Ebenen der Produktionskette aufgedeckt wer- den, so besser auf diese kritischen Punkte mit Maßnahmen reagieren zu können. Durch den Eintrag von Salmonellen in die Lebensmittelkette besteht eine permanente Gefahr für die menschliche Gesundheit. Die Kontamination mit Salmonella kann auf verschiedenen Stufen der Produktionskette eines Lebensmittels erfolgen, daher ist es von größter Be- deutung bereits frühzeitig auf den ersten Stufen der Lebensmittelkette einzugreifen und mögliche Kontaminationsrisikopunkte zu erkennen und zu bewerten. Nur auf diesem Wege können im Anschluss diese Punkte besser kontrolliert werden und Maßnahmen eingelei- tet werden. Nicht nur die Verantwortung gegenüber der Gesundheit verlangt nach einer

Reduktion der Salmonellaprävalenz. Auch die Gesetzgebung fordert eine deutliche Präva- lenzsenkung. Dies ist jedoch nur möglich wenn immer mehr Informationen zur derzeitigen Prävalenzlage und Produktionskette ermittelt und untersucht werden. Die Eintragsquellen von Salmonellen sollen ab der Stufe des Broilermästers untersucht werden. Dabei sollen mögliche Erregerquellen während der Aufzucht abgewogen, beurteilt und Möglichkeiten zur Abstellung erarbeitet werden. Weiter sollen im Rahmen des Produktionsprozesses auf dem Schlachthof Kontaminationspunkte aufgedeckt werden und Möglichkeiten zur Re- duktion der Kontamination diskutiert werden. Die Verfolgbarkeit von Erregereinträgen in die Produktionskette ist jedoch sehr schwierig. Aeran et al. haben versucht den Salmo- nelleneintrag von Zuchtfarmen über Brütereien und Mastbetriebe bis in die Schlachthöfe zu verfolgen bzw. zu identifizieren. In ihren Studien waren zwar einige Eintragsquellen verfolgbar, einige Serovaren tauchten jedoch auch nur auf einigen Ebenen ihrer Untersu- chungen auf oder waren zwischen verschiedenen Stufen nicht mehr nachweisbar, um dann auf den nachfolgenden Stufen doch wieder aufzutauchen [Aeran et al., 2007]. Im Rahmen der Untersuchungen soll auch ein Überblick über die vorherrschenden Serovare und die Resistenzsituation der Isolate gegeben werden.

Literaturübersicht

2.1 Historie

Das sogenannte enterische Fieber wurde vor dem Jahr 1822 trotz der differierenden Er- scheinungsform mit typischen Ulcerationen im Bereich des Caecums nicht von der Tu- berkulose abgegrenzt. Erst im Jahr 1829 wurden die Symptome des enterischen Fiebers unter dem Begriff der typhoiden Symptomatik zusammengefasst. Der „typhoide Bacil- lus“ wurde erstmals 1880 während der Sektion von an Typhus abdominalis gestorbenen Menschen in Milzen und mesenterialen Lymphknoten durch den Pathologen K. J. Eberth festgestellt. Dieser Befund wurde im selben Jahr durch den Mediziner R. Koch bestätigt.

Vier Jahre später im Jahr 1884 glückte dem Bakteriologen G. T. A. Gaffky die Kul- tivierung dieses Bakteriums in Form einer Reinkultur. Die Unterscheidung zu anderen Darmbakterien war jedoch zu diesem Zeitpunkt noch nicht möglich [Le Minor, 1981]. Un- ter der Leitung des Tierarztes D. E. Salmon wurden in den USA in den Jahren 1884/1885 Salmonellen aus Schweinedärmen isoliert. Salmon benannte das Bakterium Bacillus cho- leraesuis (Hogcholera-Bacillus) [Su u. Chiu, 2007]. Mit M. v. Grubers und H. E. Durhams Agglutinationsversuchen mit Serum von Typhus immunisierten Tieren konnte das Bak- terium im Jahr 1896 zweifellos festgestellt werden [Le Minor, 1981]. Im Jahr 1900 schlug der Wissenschaftler J. Lignieres die Genusbezeichnung Salmonellanach D. E. Salmon für den Erreger der Schweinecholera vor (Salmonella choleraesuis). Salmonella choleraesuis ist 1987 dann inSalmonella enterica umbenannt worden. Um Serotypen zu identifizieren, müssen spezifische Antiseren verwendet werden [Su u. Chiu, 2007].SalmonellaSpezies und Subspezies unterscheiden sich auch in ihren biochemischen Eigenschaften und Stoffwech- selvorgängen [Grimont u. Weill, 2007]. Der Bakteriologe F. Kauffmann stellte seinerzeit (1899–1978) die Theorie auf, dass jedes Serovar eine eigene Spezies sein könnte. Daher wurden nach 1966 identifizierteSalmonella Serovaren hauptsächlich nach ihren Antigenen

benannt. Einige klinisch relevante Salmonellen, die vor dieser Zeit entdeckt worden sind, haben Bezeichnungen nach der Erkrankung die sie hervorrufen oder nach dem Tier be- kommen, aus dem sie isoliert wurden. Andere tragen Namen der Städte oder der Regionen in denen der jeweilige Stamm zuerst isoliert worden ist. Beispiele isolierter Salmonellen vor 1966 sind Salmonella Typhi,Salmonella Typhimurium,Salmonella Abortusovis,Sal- monella London oder Salmonella Panama. Diese Bezeichnungen haben sich eingebürgert und sind nicht nach ihrem vorhandenen Antigen umbezeichnet worden [Su u. Chiu, 2007].

Der Bakteriologe P. B. White stellte 1926 das erste Antigenschema auf, dass von seinem Berufskollegen F. Kauffmann weiterentwickelt wurde. Im Jahr 1941 beinhaltete dieses Schema gerade einmal 100 Serotypen [Le Minor, 1981]. Brenner et al. gaben im Jahr 2000 eine Anzahl von 2.463 bekannten Salmonellaserovaren bzw. -typen an [Brenner et al., 2000]. Popoff et al. veröffentlichten 2004 noch Zahlen von 2.541 verschiedenen Salmo- nellaserovaren [Popoff et al., 2004]. Im Jahr 2007 bezifferten Grimont et al. schon 2.579 identifizierte Serovaren [Grimont u. Weill, 2007].

2.2 Taxonomie und Klassifikation

Das International Committee on Systematics of Prokaryotes und dessen Judicial Com- mission of the International Committee on the Systematics of Prokaryotes (ICSP) regeln die Nomenklatur und Taxonomie in der Mikrobiologie [Su u. Chiu, 2007].

Die GattungSalmonella wird im Reich der Prokaryoten dem Stamm derGracilicutes (lat. gracilis schlank, cutis Haut, Zellwand) zugeordnet. Salmonellen zählen zu der Klasse der Proteobacteriae (griech. Gott Proteus). Aufgrund von rRNA-Unterschieden werden Salmonellen der Subklasse der Gamma-Proteobacteriae zugeordnet [Brenner et al., 2000].

Zusammen mit Escherichia, Klebsiella,Pantoea, Serratia,Shigella, Proteus und Yersinia gehören die Salmonellen zu der Familie der Enterobacteriaceae (griech. enteron Darm) [Campbell, 1997] [White, 2000] [Garrity et al., 2001] [Schoenenbruecher, 2006].

Salmonellen gehören der Gruppe der gramnegativen, fakultativ anaeroben Stäbchen- bakterien an. Während zu Beginn der taxonomischen Einteilung Bakterien lediglich nach ihrer äußeren Erscheinung und ihrem biochemischen Verhalten eingeteilt wurden, wird inzwischen eine Genanalyse zur weitergehenden Klassifizierung genutzt. Nach DNA ana- lytischen Untersuchungen besteht das Genus Salmonella aus zwei verschiedenen Spezies.

Die Spezies Salmonella enterica und die Spezies Salmonella bongori. Die Spezies Salmo- nella enterica, früher choleraesuis wird in sechs Subspezies unterteilt. Zu den Subspezies zählenS. entericasubsp.enterica,S. entericasubsp.salamae,S. entericasubsp.arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae und S. enterica subsp. indica

[Campbell, 1997] [Holt, 2000] [Rolle u. Mayr, 2007] [Grimont u. Weill, 2007] [Hahn et al., 2009a].

Die weitere Einteilung des GenusSalmonellaerfolgt nach dem international anerkann- ten Kauffmann-White-Schema. Hierin werden Salmonellen anhand ihrer O-Antigene (so- matisches Antigen) und H-Antigene (Geißelantigen) eingeordnet. Da immer wieder neue Salmonellenarten isoliert werden, wird das Kauffmann-White-Schema regelmäßig jährlich vom WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella am Pasteur Institut in Paris aktualisiert [Brenner et al., 2000] [Holt, 2000] [Grimont u. Weill, 2007].

Bisher sind über 2.500 Serovaren von Salmonella isoliert worden. Die Tabelle (Tab. 2.1) unterteilt die im Jahr 2007 2.579 identifizierten Serovaren der GattungSalmonella in ihre Subspezies und Serovaren [Grimont u. Weill, 2007].

Tabelle 2.1: Serovaren der Spezies und Subspezies der GattungSalmonellanach [Grimont u. Weill, 2007]

Spezies Subspezies Serovaren

S. enterica 2.557

ssp. enterica 1.531

ssp. salamae 505

ssp. arizonae 99

ssp. diarizonae 336

ssp. houtenae 73

ssp. indica 13

S. bongori

ssp. bongori 22

Gesamt 2.579

Erst im Jahr 1987 erfolgte die Umbenennung der Spezies Salmonella choleraesuis in Salmonella enterica. Für die Serovaren der SpeziesSalmonella entericamit der Subspezies enterica werden Eigennamen verwendet. Alle anderen Serovaren werden mit Antigenfor- meln angegeben. Üblicherweise werden der Gattungsname und folgend lediglich der groß- geschriebene Serovarenname zur besseren Übersicht in der Schreibweise verwendet [Rolle u. Mayr, 2007]. So schreibt man beispielsweise S. enterica subsp.enterica Serovar Typhi- murium oder einfach nur S. Typhimurium. Die Großschreibung gibt hierbei an, dass es sich bei der Bezeichnung um keinen Speziesnamen handelt [Tschäpe u. Bockemühl, 2002]

[Hahn et al., 2009a]. Zur besseren Übersicht über die Bezeichnung der Serovaren ist die Aufgliederung in Abbildung 2.1 beigefügt.

Serovaren können weiter nach ihren biochemischen Eigenschaften in Biovare und nach ihrer Empfindlichkeit gegenüber Bakteriophagen in Phagovare unterschieden werden. Die

Stämme eines Serovars lassen sich durch verschiedene Antibiotika-Resistenzmuster cha- rakterisieren. Zur Feindifferenzierung können Pulsfeld-Gelelektrophorese, Random Ampli- fication of Polymorphic DNA und Plasmid-Fingerprinting genutzt werden [Sinell, 2004].

ca. 1.500*ca. 500ca. 100ca. 325ca. 70ca. 15ca. 20 S. enterica subsp.enterica (subsp. I)

S. enterica subsp.salamae (subsp. II) S. enterica subsp.arizonae (subsp. IIIa) S. enterica subsp.diarizonae (subsp. IIIb) S. enterica subsp.houtenae (subsp. IV)

S. enterica subsp.indica (subsp. VI) Gemäß prominenter O(berflächen)-Antigene bilden Serovare verschiedener Subspezies ca. 50 gemischte Gruppen (z.B. A, C2, Z, O:51, O:67). So enthält z.B. „Gruppe B“ 145 Serovare, darunter die subsp.-I-Serovare S. Paratyphi B, S. Typhimurium undS. Derby, aber auch 23 Serovare von subsp. II.

Salmonella entericaSalmonella bongori (ehem. subsp. V)

Salmonella Subspezies (Gruppen) Serovare (unterschieden auf Basis von O- (Oberflächen) und H- (Geißel)- Antigenen)

Spezies

Gattung S. enterica subsp. I Serovar Agona**

S. enterica subsp. II Serovar 6,4:m,t:- S. enterica subsp. IIIa Serovar 62:z29:- S. enterica subsp. IIIb Serovar 65:c:z53

S. enterica subsp. IV Serovar 50:z4,z24:- S. enterica subsp. VI Serovar 6,14:l,v:z88S. bongori Serovar 44:z39:-

Beispiel Serovar-Lang- bezeichnung z.B. Salmonella Agona oderS. Agona

Beispiel Serovar-Kurz- bezeichnung darunter auch S. Typhi undS. Paratyphi A, B oder C, aber auchS. Enteritidis (Gruppe D1) und S. Typhimurium (Gruppe B)* nur Serovare der subsp. I tragen krankheitsbeschreibende, Personen- oder Ortsnamen (z.B. S. Enteritidis,S. Virchow, S. London), Serovar-Varianten werden mit der Antigenformel bezeichnet (z.B. eine monophasische Variante von S. Typhimurium mit 4,[5],12:i.-)**

Abbildung 2.1: Stammbaum Salmonella mit Übersicht über die Serovarenbezeichnung (entnommen aus [Robert Koch Institut, 2009a]).

2.3 Das Bakterium - Morphologie und Physiologie

2.3.1 Morphologie

Salmonellen zählen zu den gramnegativen Bakterien mit Stäbchenform. Ihre Größe va- riiert mit etwa 0,7µm bis 1,5µm in der Breite und 2,0µm bis 5,0µm in der Länge. Fast alle Salmonellen sind peritrich begeißelt und somit beweglich [Holt, 2000] [Sinell, 2004]

[Schoenenbruecher, 2006] [Rolle u. Mayr, 2007].

2.3.2 Koloniemorphologie

Die Koloniemorphologie ist bei Salmonellaspezies nur von geringer Aussagekraft, sodass Salmonellen durch verschiedene biochemische Reaktionen unterschieden werden. Durch den Abbau von verschiedenen Kohlenhydraten in der sogenannten „Bunten Reihe“ oder mit Hilfe von Selektivnährmedien können Salmonellen von anderen Enterobacteriaceae abgegrenzt werden [Specker, 1996] [Hahn et al., 2009b]. Das Erscheinungsbild der Salmo- nellenkolonien ist je nach Selektivnährmedium unterschiedlich. Bei der „Bunten Reihe“

identifiziert man die Mikroorganismen mittels unterschiedlicher Stoffwechselleistungen wie Substratumsetzung oder die Aktivität verschiedener Enzyme.

Auf einem Rambach-Agar erscheinen durch Abbau von Propylenglykol die Salmonel- lakolonien in einem recht typischen kirschrot bis pink, während sie auf einem XLD Nähr- medium schwarze Kolonien mit transparentem Rand zeigen [Baumgart u. Becker, 1994]

[Rambach, 1990] [Schramme, 2000]. Die schwarzen Kolonien auf XLD-Agar entstehen durch Xyloseabbau und Decarboxylierung von Lysin und eine daraufhin folgende pH-Wert Erhöhung [Waltmann, 1999] [Rolle u. Mayr, 2007]. Bei einigen wenigen Salmonellasubspe- zies wachsen auf Rambach-Agar auch blaugrüne Kolonien, die durch β-D-Galactosidase Produktion entstehen. Diese lassen sich dann nicht mehr von lactosefermentierenden En- terobacteriaceae, wie E. coli unterscheiden [Kühn et al., 1994]. Rambach-Agar ist für die Anzucht für Salmonella Typhi nicht geeignet, denn hier fehlt die pinke Färbung der Kolonie. In diesem Fall wächst eine farblose Kolonie heran. Auch andere Salmonellacha- rakteristika, wie die H₂S Bildung und der säurebildende Abbau von Propylenglycol fehlen hier [Rambach, 1990].

Teilweise zeigen verschiedene Serotypen auch atypische Koloniemorphologie. So er- scheint S. Enteritidis auf XLD-Agar gewöhnlich als schwarze Kolonie und auf Rambach- Agar als pinkfarbene Kolonie während bei S. Indiana auf XLD-Agar eine atypische, nicht positiv zu bewertende gelbe Kolonie entsteht und auf dem Rambach-Agar eine ebenfalls atypische grüne Kolonie heranwächst [Zewde, 2002]. Auch die Subspezies IIIa, IIIb und V

zeigen auf Rambach-Agar eine atypische Kolonievervärbung in blaugrün. Diese entsteht wahrscheinlich durchβ-D-Galactosidase Aktivität [Kühn et al., 1994]. Schon im Jahr 1921 wurde von Arkwright auch über zwei morphologische Variationen bei gleichen Salmonel- lastämmen berichtet, die glattgeränderte s-Form (smooth) und die r-Form (rough), bei der die Koloniebegrenzung unregelmäßig erscheint [Nutt, 1927] [Caselitz, 1949]. In Ta- belle 2.2 ist eine Übersicht nach [Merck KGaA, 2004a], [Schoenenbruecher, 2006] und [Rolle u. Mayr, 2007] zu der Koloniemorphologie von Salmonellen auf unterschiedlichen Selektivnährmedien angegeben.

2.3.3 Wachstum

Salmonellen bilden auf Nährmedien im aeroben oder fakultativ anaeroben Milieu durch- schnittlich 2 mm bis 4 mm große Kolonien, selten werden nur etwa 1 mm große Kolonien gebildet. Die optimale Wachstumstemperatur für Salmonellen liegt zwischen 10°C und 47°C. In einigen Fällen zeigen Salmonellen auch bereits bei 6–8°C Wachstum [Dünnebier, 2005].

2.3.4 Eigenschaften

Die meisten Salmonellen sind durch die peritriche Begeißelung beweglich und nutzen Che- motaxis [Le Minor, 1981] [Finlay u. Falkow, 1989]. Zwei Ausnahmen stellen hier S. Galli- narum und S. Pullorum dar, aber auch einige andere Serovaren haben Stämme, die sich nicht bewegen können. Diese Stämme sind zwar begeißelt, haben jedoch eine Funktionsbe- einträchtigung ihrer Geißeln [Sinell, 2004] [Chappell et al., 2009]. Viele Salmonellenarten sind sogenannte Zoonoseerreger. Dies bedeutet, dass Infektionen mit diesen Bakterien zwischen Mensch und Tier hin- und her übertragen werden können [Rolle u. Mayr, 2007].

Salmonellen besitzen die Fähigkeit zu sowohl aerobem als auch anaerobem Stoffwechsel [Yamamoto u. Droffner, 1985] [Holt, 2000] [Garrity et al., 2001] [Schoenenbruecher, 2006].

2.4 Kultivierung und Diagnostik

Die Problematik bezüglich der Isolierung und Kultivierung aus Lebensmitteln besteht darin, dass ähnlich wie bei Tierfutter die Wasseraktivität gering ist und die Salmonellen stark dehydriert sind. Die Aufbereitung muss demnach eine Rehydrierung der gestressten Bakterienzellen erlauben [Andrews et al., 2001] [Tschäpe u. Bockemühl, 2002].

Auf einem Universalnährboden sind Salmonellen nicht von anderen Enterobakterien zu differenzieren. Daher machen Salmonellen eine selektiv angereicherte Anzüchtung er-

Tabelle 2.2: Nährmedien und Koloniemorphologie

Nährmedium Beschreibung

BPLS (Brilliantgrün-Phenolrot- Lactose-Saccharose-Agar) Nährmedium

2 mm – 3 mm große, runde, erhabene, glatte, glänzende, transparente Kolonien vor leuch- tendrotem Hintergrund

XLD

(Xylose-Lysine-Desoxcholate-Agar) Nährmedium

3 mm – 4 mm große, runde, erhabene, glatte, glänzende, schwarze Kolonien mit farblosem Randsaum und hellrotem Hof

XLT4 (Xylose Lactose Tergitol™

4-Agar) Nährmedium

Stecknadelkopfgroße, runde, erhabene, glat- te, glänzende, schwarze Kolonien mit farblo- sem Randsaum und gelbrotem Hof

MM (Miller-Mallinson-Agar) Nährmedium

Stecknadelkopfgroße, runde, erhabene, glat- te, glänzende, schwarze Kolonien

ASAP (AES(Labor) Salmonella Agar Plate) Nährmedium

2 mm große, runde, erhabene, glatte, glän- zende, rosafarbene Kolonien

OSCM (Oxoid Salmonella

Chromogenic Medium) Nährmedium

2 mm große, runde, erhabene, glatte, glän- zende, purpurfarbene Kolonien

Rambach Nährmedium 2 mm – 3 mm runde erhabene glatte, teilweise auch gezackte Kolonien, glänzende pink-rote Kolonien

SMID (Salmonella Identification Medium) Nährmedium

pinke Kolonien

Gassner Nährmedium gelblicher Farbumschlag

forderlich. Für eine nichtselektive Voranreicherung wird häufig Peptonwasser verwendet, einige Autoren sprechen von einer noch größeren Erregerausbeute bei der Verwendung von Anreicherungskombinationen [Rolle u. Mayr, 2007] [Hoorfar u. Baggesen, 1998]. Durch die Voranreicherung kann mit der Aktivierung subletal geschädigter Bakterien ein höherer Salmonellenertrag bewirkt werden [Thomason et al., 1977] [Andrews et al., 2001] [Rol- le u. Mayr, 2007] [Neu, 2007] [Merck, 2008]. Peptonwasser wird aus tierischem Gewebe gewonnen und enthält Stickstoff, Vitamine, Aminosäuren und Kohlenstoff. Proben mit fester Konsistenz werden mit einem Stomacher gewalkt. Die Voranreicherung erfolgt im Verhältnis 1:10 und wird bei 37°C für eine Dauer von 24 Stunden bebrütet [Merck, 2008]

[Merck].

Es ist möglich für die Hauptanreicherung modifizierte Müller-Kauffmann- und Rappa- port-Vassiliadis-Medien zu verwenden oder aber man benutzt Selenit-Cystin-Medien zur Kultivierung [Sinell, 2004]. Rappaport- und Vassiliadis-Bouillon dienen zur selektiven An- reicherung von Salmonella, mit Ausnahme von Salmonella Typhi und Salmonella Para- typhi A, aus Lebensmitteln und anderen Materialien. Der Nährboden entspricht Emp- fehlungen der American Public Health Association (APHA) aus dem Jahr 1992 und dem ISO Standard 6579 vom Jahr 2002, 4. Auflage zur Untersuchung von Lebensmitteln. Der Rappaport-Bouillon ist ein Salmonella-Anreicherungsbouillon, der einem nach Rappa- port modifizierten RV-Medium (vorgeschlagen durch Vassiliadis) entspricht (MERCK, Art. Nr. 1.10236). Das Medium weist gegenüber anderen vergleichbaren Nährböden ins- besondere bei einer Bebrütungstemperatur von 43°C eine erhöhte Selektivität und eine verbesserte Ausbeute an Salmonella auf. Desweiteren wird durch Zugabe des Antibioti- kums Novobiocin und eine Absenkung des pH-Wertes auf 5,2 das Wachstum einer Be- gleitflora gehemmt. Die Zusammensetzung des Nährmediums besteht aus 4,5 g/l Pep- ton aus Sojamehl, 29 g/l Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 8 g/l Natriumchlorid, 0,4 g/l di-Kaliumhydrogenphosphat, 0,6 g/l Kaliumdihydrogenphosphat und 0,036 g/l Malachit- grün. Die Hauptanreicherung erfolgt über einer Überimpfung aus der Voranreicherungs- kultur im Verhältnis 1:100 mit einer 24 stündigen Bebrütung bei 43°C [Andrews et al., 2001] [Merck KGaA, 2004b].

Die Anreicherungen werden anschließend auf festen Nährmedien (z. B. Rambach- oder XLD-Agar) subkultiviert [Sinell, 2004]. Der Rambach-Agar dient zum differenzialdiagno- stischen Nachweis von Salmonellen mit Ausnahme von S. Typhi und S. Paratyphi aus Lebensmitteln und klinischen Proben. Die enthaltenen Nährsubstrate bewirken ein gu- tes Enterobacteriaceen-Wachstum. Durch Natriumdesoxycholat wird eine grampositive Begleitflora im Wachstum gehemmt. Durch enthaltenes Propylenglycol, das Salmonellen zu einer Säure umwandeln, können Salmonellen eindeutig von anderen Bakterien unter-

schieden werden. Ein pH-Indikator zeigt die Salmonellen als charakteristisch pink-rote Kolonien an. Coliforme Keime wachsen durch enthaltenes Chromogen als bläulich-grüne oder bläulich-violette Kolonien und können so von Salmonellen abgegrenzt werden. Die übrigen Enterobacteriaceen und gramnegative Bakterien lassen sich als farblose bzw. gelb- liche Kolonien identifizieren. Die Zusammensetzung eines Rambach-Agars besteht aus 8 g/l Pepton, 5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l aus Natriumdesoxycholat, 1,5 g/l einer Chromo- genmischung, 10,5 g Propylenglycol und 15 g/l Agar-Agar. Die Kultur wird auf 1/4 der Agarplatte ausgeimpft. Einzelkolonien werden durch Ausimpfen mit derselben Öse auf dem restlichen 3/4 Anteil der Platte erzielt. Die aerobe Bebrütung erfolgt im Anschluss bei 35–37°C über 24 bis 48 Stunden [Merck KGaA, 2004a].

Der Xylolose-Lysin-Desoxycholat-Agar, kurz XLD-Agar dient zur Isolierung und Dif- ferenzierung pathogener Enterobacteriaceen. Insbesondere zur Identifizierung von Salmo- nella und Shigella. Der Nährboden entspricht den Empfehlungen der United States Phar- macopeia XXIII (1995), der European Pharmacopeia II und APHA (1992). Wird XLD- Agar mit einer geeigneten Anreicherung kombiniert, sind hier weitaus größere Mengen an Salmonellen und Shigellen nachzuweisen als auf anderen Selektivnährmedien [Merck KGaA, 2004d]. Ellerbroek et al. stellten bei ihren Untersuchungen zum Vorkommen von Salmonellen bei deutschem Nutzgeflügel und Geflügelfleisch jedoch fest, dass die Sensiti- vität von Rambach-Agar in ihren Versuchsdurchläufen im Mittel höher war, als die des XLD-Agars (96,2 % zu 91,3 %). Der stärkste Unterschied ergab sich bei der Untersuchung von Gazekotproben (95,9 % zu 80,4 %) [Ellerbroek et al., 2001]. Laut der Firma Merck zeigt sich der XLD-Agar auch im Direktausstrich anderen Nährböden überlegen. Beim Abbau von Xylolose, Lactose und Saccharose zu Säure ergibt sich ein Farbumschlag von Phenolrot nach Gelb. Thiosulfat und Eisen(III)-Salz sind Indikatoren für für eine Bildung von Schwefelwasserstoff. Dabei fällt schwarzes Eisensulfid in den Kolonien an. Durch eine purpurrote Verfärbung um die Kolonien wird eine pH Wert Erhöhung angezeigt. Diese erfolgt, wenn Bakterien Lysin zu Cadaverin decarboxylieren. Es ist möglich, dass mehrere dieser Reaktionen zugleich oder nacheinander erfolgen. Die Folge ist eine Färbung des pH-Indikators in verschiedene Nuancen oder bei längerer Bebrütung ein Farbumschlag von gelb nach rot. Der Nährboden besitzt nur eine sehr schwache Hemmwirkung. XLD- Agar besteht aus 3 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid, 3,5 g/l D (+)- Xylolose, 7,5 g/l Lactose, 7,5 g/l Saccharose, 5 g/l L(+)- Lysin, 2,5 g/l Natriumdesoxycholat, 6,8 g/l Natriumthiosulfat, 0,8 g/l Ammoniumeisen(III)-citrat, 0,008 g/l Phenolrot und 13,5 g/l Agar-Agar. Der Nährboden wird im Oberflächenausstrich dünn beimpft und bei 37°C für 48 Stunden bebrütet. Danach sollten Untersuchungen zur Identifizierung der Kolonien folgen.Salmonella-Kolonien zeigen sich in der Farbe des Nährbodens, transparent, manch-

mal mit einem schwarzen Zentrum. Das Medium selbst wechselt die Farbe bei Salmonellen nicht. Bei Stämmen von Salmonella Typhi, die Xylolose-positiv reagieren, erscheinen die Kolonien orange bis etwas opak [Merck KGaA, 2004d].

Im Anschluss erfolgt die Anzüchtung auf Standard-I-Agar. Dieser Nährboden ist be- sonders für die Anzüchtung anspruchsvoller Bakterien geeignet. Man verwendet diesen Agar u. a. zur Bestimmung der Keimzahl, zur Keimisolierung und zur Anreicherung. Der Agar setzt sich aus 15 g/l Pepton, 3 g/l Hefeextrakt, 6 g/l Natriumchlorid 1 g/l D (+) Glucose und 12 g/l Agar-Agar zusammen. Der Nährboden ist klar gelblich. Die Bebrü- tung erfolgt bei diesem Nährboden für 24 Stunden bei 25°C unter aeroben Bedingungen [Merck KGaA, 2004c].

Weiter differenziert werden können die Bakterien nun mit Hilfe von Testkits mit be- stimmten Antikörpern, die an bestimmte Salmonellaantigene wie z. B. an O-, H- oder Vi-Antigene binden und eine Trübung der Flüssigkeit durch Agglutination bewirken. Das Probenmaterial wird auf einem Objektträger mit den Testflüssigkeiten mittels einer Öse verrieben und anschließend auf einer dunklen Unterlage beurteilt. Das Salmonellenergeb- nis kann so serologisch bestätigt werden [Baumgart u. Becker, 1994] [Waltmann, 1999]

[Andrews et al., 2001] [SIFIN, 2005].

2.5 Standardmethoden

Salmonellen werden in Lebensmitteln mit Hilfe von standardisierten Verfahren nachge- wiesen. In Europa gelten Referenzverfahren aus der Amtlichen Sammlung von Untersu- chungsverfahren (ASUV) nach §64 Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB), vormals §35 Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz (LMBG). Auf internationaler Ebene werden durch die Internationale Normierungsorganisation ISO („International Or- ganization for Standardization“), durch die Weltgesundheitsbehörde WHO bzw. Welter- nährungsbehörde FAO („Food and Agriculture Organization“) und durch die Internatio- nale Kommission für mikrobiologische Lebensmittelspezifikationen ICMSF („Internatio- nal Commission of Microbiological Specifications for Foods“) Referenzverfahren veröffent- licht. In der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren (ASUV) §64 LFGB, der Ausgabe 12/2008 ist unter der Lebensmittelmethode L 00.00–20 eine Untersuchung von Lebensmitteln mithilfe des horizontalen Verfahrens zum Nachweis von Salmonella spp.

in Lebensmitteln beschrieben (Übernahme der gleichnamigen Norm DIN EN ISO 6579, Ausgabe Oktober 2007). Dieses horizontale Verfahren dient nach [DIN EN ISO 6579:2002]

zum Nachweis von Salmonellen in Lebensmitteln und Futtermitteln. Die endgültige Be- stätigung von Salmonellen erfolgt nach der Lebensmittelmethode L 00.00–20a, Ausgabe

12/2004 und wird im nationalen Referenzlabor für Salmonellen (NRL-Salm) in Berlin durchgeführt. In den vertikalen Lebensmittelmethoden L 01.00–13 (Milch), L 02.00–8 (Milchprodukte), L 03.00–7 (Käse), L 04.00–11 (Butter), L 05.00–9 (Eier), L 06.00–11 (Fleisch), L 07.00–11 (Fleischerzeugnisse), L 08.00–13 (Wurstwaren), L 20.01–9 (Majonä- sen und Soßen), L 39.05.02–5 (Laktose), L 42.00–4 (Speiseeis) und L 48.01–16 (Säuglings- und Kleinkindernahrung) wird unmittelbar auf die horizontale Methode nach L 00.00–20 verwiesen.

Beim horizontalen Referenzverfahren (siehe Abb. 2.2), beschrieben durch das Deutsche Akkreditierungssystem Prüfwesen (DAP), wird Probenmaterial in einem 1:10-Verhältnis in gepuffertem Peptonwasser (BPW, Buffered Peptone Water), einem nichtselektiven, flüssigen Nährmedium, für 16 bis 20 Stunden vorangereichert [Schoenenbruecher, 2006].

Subletal geschädigte Errerger werden durch die Voranreicherung reaktiviert und der Kei- mertrag wird somit erhöht [Thomason et al., 1977] [Hoorfar u. Baggesen, 1998] [Andrews et al., 2001] [Neu, 2007]. Aus dieser Voranreicherung wird auf zwei selektive, flüssige Nähr- medien überimpft (z. B. Rappaport-Bouillon). Bei Tetrathionatanreicherung nach Müller- Kauffmann mit Novobiocin (MKTTn) wird bei 37°C bebrütet, bei Rappaport-Vassiliadis- Sojamehlpepton-Bouillon (RVS) wird bei 41,5°C inkubiert [Koyuncu u. Haggblom, 2009].

Die Sensitivität der Nährmedien wird kontrovers diskutiert. In einem Forschungsprojekt zum Vorkommen von Salmonellen bei deutschem Nutzgeflügel und Geflügelfleisch wur- de eine bessere Sensitivität bei des tetrathionathaltigen Anreicherungsbouillon gegenüber dem Rappaport-Mediums festgestellt [Wichmann-Schauer et al., 2001]. Andere Autoren stellten eine wesentlich höhere Sensitivität beim Rappaport-Vassiliadis-Mediums als Vor- anreicherungsmedium gegenüber dem Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle-Medium fest. Ins- besondere eine Kombination dieses Anreicherungsmediums mit einem XLD-Agar und ei- nem Rambach-Agar als Selektivnährmedium zeigten in Vergleichsuntersuchungen sehr hohe Nachweisraten [Atanassova et al., 1998].

Nach 24 stündiger Inkubation erfolgt eine Subkultivierung auf dem festen Referenz- selektivnährboden XLD-Agar und einem zweiten Medium nach Wahl wie beispielswei- se Brilliant-Grün-Agar [Koyuncu u. Haggblom, 2009] [Schoenenbruecher, 2006]. Im For- schungsprojekt von [Wichmann-Schauer et al., 2001] stellte sich der Rambach-Agar als sensitiveres Medium zur Subkultivierung gegenüber dem XLD-Agar, insbesondere bei Kotgazeproben dar. Die Forschungsgruppe sieht insgesamt eine Kombination aus einem Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle Anreicherungsbouillon und einem Rambach-Agar als sen- sitivste Möglichkeit, Salmonella im Rahmen von Monitoringprogrammen in der Geflügel- fleischproduktion nachzuweisen. Sie weisen darauf hin, zur Vermeidung falsch negativer Ergebnisse eine dennoch Kombination mit einem zweiten Selektivnährmedium zu verwen-

Voranreicherung in gepuffertem Peptonwasser Verhältnis 1:10

Bebrütung 16-20 Stunden bei 37°C (+/- 1°C)

Selektivanreicherung 0,1 ml der Voranreicherung in

10 ml Rappaport-Vassiliadis-Sojamehlpepton Bouillon

Bebrütung 21-27 Stunden bei 41,5°C (+/- 1°C)

Selektivanreicherung 0,1 ml der Voranreicherung in 10 ml Tetrathionatanreicherung nach Müller-Kauffmann mit Novobiocin

Bebrütung 21-27 Stunden bei 37°C (+/- 1°C)10 ml

Subkultivierung

nach 24 Stunden auf zwei feste Nährmedien XLD Agar und zweites festes Nährmedium nach Wahl

21-27 Stunden bei 37°C (+/- 1°C)

Vorläufige Bestätigung

von jedem Nährmedium Auswahl von mindestens einer präsumtiven Kolonie bei negativem Ergebnis werden 4 weitere Kolonien getestet

Ausstrich auf Nähragar

Bebrütung 21-27 Stunden bei 37°C (+/- 1°C)

Serologische und biochemische Bestätigung

Interpretation der Ergebnisse

Abbildung 2.2: Flussdiagramm zur Probenaufbereitung nach dem horizontalen Referenz- verfahrens.

den. Die zweithöchste Sensitivität zeigte die Kombination eines Rappaport-Vassiliadis- Mediums mit einem Rambach-Agar. Darauf folgten die Medienkombinationen mit Tetra- thionat-Brilliantgrün-Galle Anreicherungsbouillon und einem XLD-Agar und einem Rap- paport-Vassiliadis-Medium mit einem XLD-Agar [Wichmann-Schauer et al., 2001]. Die Sensitivität, auch „Falsch-Negativ-Rate“, ausgedrückt als relative Zahl (in %), ist der Quotient aus der Anzahl positiver Proben multipliziert mit 100, und der Summe aus der Anzahl positiver und falsch negativer Proben. Je höher der Quotient ist, desto besser ist die Sensitivität. Der Sensitivität gegenüber steht die Spezifität, auch „Falsch-Positiv- Rate“, die ebenfalls als eine relative Zahl ausgedrückt wird. Hierbei wird die Anzahl der negativen Proben mit 100 multipliziert, danach wird das Ergebnis dividiert durch die An- zahl der negativen Proben plus die Anzahl der falsch positiven Proben. Je höher hier der Quotient ist, desto besser ist die Spezifität.

In anderen Untersuchungen erwies sich ebenfalls der Rambach-Agar als sensitiver ge- genüber XLD-Agar und Oxoid Salmonella Chromogenic-Medium (OSCM) bzw. zumin- dest gegenüber anderen Nährmedien wie SMID und NBGL (Novobiocin-Brilliant-Grün- Glycerol-Lactose-Agar [Atanassova et al., 1998] [Dusch u. Altwegg, 1995] [Kühn et al., 1994] [Zewde, 2002] [Carrique-Mas et al., 2009]. In einer Vergleichsstudie mit Geflügel- fleisch beispielsweise wurden 28,95% der Proben auf XLD-Agar Salmonellen nachgewiesen und 22,62% auf Rambach-Agar. Nur 22,17% der Geflügelfleischproben zeigten ein positi- ves Ergebnis auf dem OSCM-Agar. In der Studie überzeugte der Rambach-Agar mit einer Sensitivität von 100%, es gab also keine falsch negativen Ergebnisse. XLD- und OSCM- Agar erwiesen sich mit 78,13% bzw. 76,11% als weitaus weniger sensitiv. Im Bezug auf die Spezifität zeigte sich der Rambach-Agar als Schlusslicht (83,44%). Hier schnitten der XLD-Agar (95,32%) und der OSCM-Agar (99,42%) besser ab. Die Autoren weisen darauf hin, dass durch eine Kombination des XLD- und des Rambach-Agars die Sensitivität mit 89,06% sehr gut ist. Die Spezifität liegt bei dieser Kombination bei 89,63%. Diese Kom- bination von Nährmedien erscheint sehr wichtig, da jedes Nährmedium für sich Defizite bei der Isolierung von Salmonellen zeigt. Auch in einer ähnlichenStudie mit Geflügel- fleischproben lag der Rambach-Agar mit seiner Senisitivität vorne und zweigte sich mit einer Nachweisrate von 97,6% überlegen gegenüber BPLS-Medium und XLD-Agar, die bei Nachweiswerten zwischen 80-82% lagen. Bei der Betrachtung der Selektivität erbrach- te in dieser Untersuchung der Rambach-Agar zusammen mit dem XLD-Agar mit einer Rappaport-Vassiliadis-Voranreicherung ein mit 92,5% besseres Ergebnis als in der anderen Studie, das BPLS-Medium in Kombination mit XLD-Agar und gleicher Voranreicherung erreichte lediglich eine Selektivität von 81,9%. Wie auch in der oben beschriebenen Un- tersuchung, wird auf die ideale Kombination von XLD-Agar mit Rambach-Agar und ei- ner Rappaport-Vassiliadis-Voranreicherung hingewiesen. Als Fazit erscheint der Rambach- Agar als ideales Nährmedium für Salmonellennachweise aus Lebensmitteln. Zweifelhafte Fälle können durch eine anschließende Kultivierung auf Standard-I-Agar ausgeschlossen werden [Rambach, 1990] [Atanassova et al., 1998] [Zewde, 2002].

Salmonella-verdächtige Kolonien werden nach der 24-stündigen Bebrütung identifiziert und auf einem Nähragar, wie Standard-I-Agar ausgestrichen. Nach einer weiteren 18-bis 27-stündigen Inkubation werden die Reinkulturen vorläufig bestätigt. Demnach dauert es vier Tage, um ein Salmonellen-negatives Ergebnis mit dem Referenzverfahren nach ASUV

§64 LFGB diagnostizieren zu können. Die vorläufige Bestätigung einesSalmonella positi- ven Ergebnisses anhand einer präsumtiven Kolonie verlängert die Untersuchungsdauer um zwei weitere Arbeitstage auf ein bis zu sechstägiges Verfahren [Schoenenbruecher, 2006].

2.6 Differenzierung

2.6.1 Biochemische Eigenschaften und Biotypisierung

Zur Unterscheidung der verschiedenenEnterobacteriaceae können die Stoffwechselleistun- gen auf Differenzialnährmedien genutzt werden. Beispielsweise nutzen Salmonellen Citrat als alleinige Kohlenstoffquelle. Salmonellen zählen zu den Oxidase-negativen und Glucose fermentierenden Bakterien, mit Ausnahme von S. Typhi. Die Fermentation von Gluco- ronat auf einem SMID-Agar zeigt sich als eine Umfärbung der Kolonie in ein Pink. Die Aminosäuren Lysin, Arginin und Ornithin werden von Salmonellen decarboxyliert. Auch hier zählt S. Typhi zu den Ausnahmen. In Nährmedien enthaltene Schwefelverbindungen sind gut nutzbar um Bakterien wie Salmonella spp. oderClostridia spp. durch Schwefel- wasserstoffbildung zu identifizieren. Fast alle Salmonellen bilden auf Dreizuckerreisagar H₂S und somit Sulfide (ausgenommen S. Choleraesuis und S. Paratyphi A). Dies zeigt sich auf einem XLT 4-Agar als schwärzlich erscheinende Koloniebildung. Bei dem säure- bildenden Abbau von Propylenglycol (exkl. S. Choleraesuis) verfärbt sich die Kolonie auf Rambach-Agar charakteristisch pink-rot. Mit Ausnahme derS. enterica Subspeziesarizo- nae und diarizonae sind Salmonellen auf z. B. Gassner-Agar unfähig Lactose zu spalten.

Bei Salmonella Spezies sind außerdem sowohl die Indolreaktion als auch die Ureasere- aktion negativ. Eine weitere charakteristische Stoffwechselleistung ist die Reduktion von Nitat zu Nitrit [Rambach, 1990] [Baumgart u. Becker, 1994] [Holt, 2000] [Garrity et al., 2001] [Schoenenbruecher, 2006] [Rolle u. Mayr, 2007].

2.6.2 Serotypisierung

Neben der bakteriologischen Diagnostik spielt auch die serologische Diagnostik (verschie- dene enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Methoden ) bei den Salmonellen eine wichtige Rolle. Mit Hilfe dieser Methode wird auch die Einordnung in das internationale Kauffmann-White-Schema vorgenommen. Alle Salmonellen besitzen für die serologische Diagnostik wichtige somatische O-Antigene. Hierbei handelt es sich um hitzestabile Lipo- polysaccharide, die ein Bestandteil der Zellwand sind. Neben den O-Antigenen verfügen alle Salmonellen auch über hitzelabile Proteine, die die Geißeln bilden. Diese werden als H-Antigene oder auch als Geißelantigene bezeichnet. Auch diese Antigene sind für die Einordnung von Bedeutung. Nur eine geringe Rolle spielen die Kapsel-Antigene (Vi- bzw.

K-Antigene). Denn diese kommen nicht bei allen Salmonellen Spezies vor. Fimbrienanti- gene (F-Antigene), besonders das SEF 14, dienen wie auch die H-Antigene g und m der Identifizierung von Enteritidisstämmen. Insbesondere die O- und die H-Antigene bezie-

hungsweise die Kombination ihres Auftretens machen die Serovar-Spezifität aus [Baum- gart u. Becker, 1994] [Waltmann, 1999] [Holt, 2000] [Andrews et al., 2001] [Rolle u. Mayr, 2007] [Hahn et al., 2009a]. Die Bezeichnung „O“ bedeutet Wachstum „ohne Hauch“. Die Bezeichnung „H“-Antigen soll Wachstum „mit Hauch“ heißen. Dies ist historisch auf die Tatsache zurückzuführen, dass die durch Begeißelung stark beweglichen Keime der Gattung Proteus Nährböden hauchförmig dünn und vollständig bedecken. Unbegeißelte und somit unbewegliche Varianten bilden nicht schwärmende, begrenzte Kolonien ohne

„Hauch“ [Schramme, 2000][Rolle u. Mayr, 2007][Hahn et al., 2009b]. Antigen-Antikörper- Reaktionen können sichtbar gemacht werden, indem die beiden Ausgangsprodukte durch die Agglutinationsreaktion sichtbar verklumpen (z. B. durch Latexpartikel). Bei der re- versen passiven Latexagglutination (RPLA) werden mit den Partikeln verbundene An- tikörper zu den Isolaten gegeben. Passen Antigen und Antikörper zusammen, kommt es zur Agglutination, die durch den Trägerstoff sichtbar gemacht wird [Baumgart u. Becker, 1994] [SIFIN, 2005] [Andrews et al., 2001]. Bei einer serologischen Untersuchung, wie bei- spielsweise durch eine ELISA Methode, sind falsch negative Ergebnisse aufgrund einer zu frischen Infektion von Nachteil. Dafür handelt es sich hierbei um die kostengünstigere und schnellere Variante, bei der zudem auch bei geringer Erregerausscheidung ein Nachweis erfolgen kann [Rolle u. Mayr, 2007].

2.6.3 Qualitative PCR

Bereits 1985 entwickelte K. Mullis die bis heute zu den wichtigsten und renomiertesten molekularbiologische Nachweismethoden zählende qualitative Polymerasekettenreaktion (PCR). Hierbei werden nach Denaturierung bei 95°C und somit Auftrennung der dop- pelsträngigen DNA definierte kurze Abschnitte der DNA mittels spezifischer Primeroli- gonukleotide in sich wiederholenden Zyklen vervielfältigt. Bei einer Temperatur von 37°C bis 65°C erfolgt die Annealingphase, in der sich die Primer an die Bindungsstellen der Einzelstränge anlagern. Die Elongationsphase, die bei 72°C von den Primern ausgeht, verlängert mittels der Taq-Polymerase den DNA Strang. Die entstandenen Doppelsträn- ge entsprechen den Ausgangsdoppelsträngen. Diese zyklischen Phasen können in einem sogenannten Thermocycler automatisiert erfolgen. Die Produktion des Produkts erfolgt dabei exponentiell. Das entstandene Amplicon kann mit Agarosegelelektrophorese wei- ter analysiert werden. Dabei erfolgt die Auswertung allein über die Produktgröße und nicht über die Sequenz [McKillip u. Drake, 2004] [Anderson, 2009]. Durch anschließende Restriktionsanalysen oder Hybridisierung mit spezifischen DNA-Sonden kann auch eine sequenzielle Auswertung erfolgen [Anderson, 2009]. In einer Veröffentlichung wurden tra- ditionell verwendete Kulturmethoden und die Verwendung einer Salmonella-spezifischen

Polymerasenkettenreaktion verglichen. Dabei wurden mit Hilfe der Anzüchtung auf Kul- turmedien bei 16% der Proben Salmonellen isoliert. Die PCR dagegen wies in 19% der Proben Salmonellen nach. Bei einer Kombination der beiden Verfahren konnte sogar eine Salmonellenausbeute aus 23% der Proben erfolgen. Demnach erscheint die PCR die sen- sitivere Methode zu sein, besonders aber die Kombination aus den zwei Tests scheint eine große Sensitivität zu haben [Whyte et al., 2002].

2.6.4 Real Time PCR

Vor dem Einsatz einer PCR erfolgt immer noch die Voranreicherung mit gepuffertem Peptonwasser, gefolgt von einer selektiven Anreicherung beispielsweise in Rappaport- Vasilliadis-Soja-Bouillon [O’Reagan et al., 2008]. Die sogenannte Real Time PCR ist eine Weiterentwicklung der qualitativen PCR. Bei dieser Methode wird das DNA Zielprodukt zusätzlich quantifiziert. Im Grunde wird die DNA wie bei der qualitativen PCR vervielfäl- tigt. Hier wird der anschließende mühselige Weg der weiteren Analyse wie beispielsweise die Gelelektrophorese bereits gespart. Die Menge des Produktes wird z. B. mittels einer Sonde (TaqMan-Sonde) mit zweifacher fluoreszierender Markierung ermittelt. Der eine Farbstoff, der sogenannte Quencher (TAMRA) am einen Ende der Sonde unterdrückt die Fluoreszenz des Reporter Farbstoffes solange, bis die 5’-3’-Exonuclease-Aktivität der Taq Polymerase den Sondenabbau bewirkt und somit auch die Trennung des Quenchers. Das vom Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (FAM) emittierte Lichtsignal kann nun gemessen wer- den. Die Abspaltung von Sonden-Molekülen verhält sich proportional zum PCR-Produkt.

Das heißt, dass mit jedem Zyklus auch die Fluoreszenzintensität steigt [Heid et al., 1996]

[Anderson, 2009]. O’Reagan et al. kamen bei Versuchen mit der Real Time Multiplex PCR zu dem Ergebnis, dass diese Methode genauso sensitiv wie die kulturelle Metho- de Salmonella Spezies in Broilerproben aufspürt und verschiedene Serovaren identifiziert [O’Reagan et al., 2008].

2.6.5 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)

Die PFGE dient zum DNA Fingerprinting und ist in der Lage verschiedene Stämme einer Spezies zu differenzieren. So können beispielsweise auch Salmonella Klone identifiziert werden und Kontaminationsrisiken während des Schlachtprozesses und bei der Verar- beitung erkannt werden [Tassios et al., 2000] [Wonderling et al., 2003]. In Agarosegel eingebettete DNA wird hier zunächst mittels Ristriktionsendonukleasen aufgeschlossen.

Im nachfolgenden Schritt werden die Restriktionsfragmente dann durch Elektrophorese