Die Problematik bezüglich der Isolierung und Kultivierung aus Lebensmitteln besteht darin, dass ähnlich wie bei Tierfutter die Wasseraktivität gering ist und die Salmonellen stark dehydriert sind. Die Aufbereitung muss demnach eine Rehydrierung der gestressten Bakterienzellen erlauben [Andrews et al., 2001] [Tschäpe u. Bockemühl, 2002].
Auf einem Universalnährboden sind Salmonellen nicht von anderen Enterobakterien zu differenzieren. Daher machen Salmonellen eine selektiv angereicherte Anzüchtung
er-Tabelle 2.2: Nährmedien und Koloniemorphologie
Nährmedium Beschreibung
BPLS (Brilliantgrün-Phenolrot-Lactose-Saccharose-Agar) Nährmedium
2 mm – 3 mm große, runde, erhabene, glatte, glänzende, transparente Kolonien vor leuch-tendrotem Hintergrund
XLD
(Xylose-Lysine-Desoxcholate-Agar) Nährmedium
3 mm – 4 mm große, runde, erhabene, glatte, glänzende, schwarze Kolonien mit farblosem Randsaum und hellrotem Hof
XLT4 (Xylose Lactose Tergitol™
4-Agar) Nährmedium
Stecknadelkopfgroße, runde, erhabene, glat-te, glänzende, schwarze Kolonien mit farblo-sem Randsaum und gelbrotem Hof
2 mm große, runde, erhabene, glatte, glän-zende, rosafarbene Kolonien
OSCM (Oxoid Salmonella
Chromogenic Medium) Nährmedium
2 mm große, runde, erhabene, glatte, glän-zende, purpurfarbene Kolonien
Rambach Nährmedium 2 mm – 3 mm runde erhabene glatte, teilweise auch gezackte Kolonien, glänzende pink-rote
forderlich. Für eine nichtselektive Voranreicherung wird häufig Peptonwasser verwendet, einige Autoren sprechen von einer noch größeren Erregerausbeute bei der Verwendung von Anreicherungskombinationen [Rolle u. Mayr, 2007] [Hoorfar u. Baggesen, 1998]. Durch die Voranreicherung kann mit der Aktivierung subletal geschädigter Bakterien ein höherer Salmonellenertrag bewirkt werden [Thomason et al., 1977] [Andrews et al., 2001] [Rol-le u. Mayr, 2007] [Neu, 2007] [Merck, 2008]. Peptonwasser wird aus tierischem Gewebe gewonnen und enthält Stickstoff, Vitamine, Aminosäuren und Kohlenstoff. Proben mit fester Konsistenz werden mit einem Stomacher gewalkt. Die Voranreicherung erfolgt im Verhältnis 1:10 und wird bei 37°C für eine Dauer von 24 Stunden bebrütet [Merck, 2008]
[Merck].
Es ist möglich für die Hauptanreicherung modifizierte Müller-Kauffmann- und Rappa-port-Vassiliadis-Medien zu verwenden oder aber man benutzt Selenit-Cystin-Medien zur Kultivierung [Sinell, 2004]. Rappaport- und Vassiliadis-Bouillon dienen zur selektiven An-reicherung von Salmonella, mit Ausnahme von Salmonella Typhi und Salmonella Para-typhi A, aus Lebensmitteln und anderen Materialien. Der Nährboden entspricht Emp-fehlungen der American Public Health Association (APHA) aus dem Jahr 1992 und dem ISO Standard 6579 vom Jahr 2002, 4. Auflage zur Untersuchung von Lebensmitteln. Der Rappaport-Bouillon ist ein Salmonella-Anreicherungsbouillon, der einem nach Rappa-port modifizierten RV-Medium (vorgeschlagen durch Vassiliadis) entspricht (MERCK, Art. Nr. 1.10236). Das Medium weist gegenüber anderen vergleichbaren Nährböden ins-besondere bei einer Bebrütungstemperatur von 43°C eine erhöhte Selektivität und eine verbesserte Ausbeute an Salmonella auf. Desweiteren wird durch Zugabe des Antibioti-kums Novobiocin und eine Absenkung des pH-Wertes auf 5,2 das Wachstum einer Be-gleitflora gehemmt. Die Zusammensetzung des Nährmediums besteht aus 4,5 g/l Pep-ton aus Sojamehl, 29 g/l Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 8 g/l Natriumchlorid, 0,4 g/l di-Kaliumhydrogenphosphat, 0,6 g/l Kaliumdihydrogenphosphat und 0,036 g/l Malachit-grün. Die Hauptanreicherung erfolgt über einer Überimpfung aus der Voranreicherungs-kultur im Verhältnis 1:100 mit einer 24 stündigen Bebrütung bei 43°C [Andrews et al., 2001] [Merck KGaA, 2004b].
Die Anreicherungen werden anschließend auf festen Nährmedien (z. B. Rambach- oder XLD-Agar) subkultiviert [Sinell, 2004]. Der Rambach-Agar dient zum differenzialdiagno-stischen Nachweis von Salmonellen mit Ausnahme von S. Typhi und S. Paratyphi aus Lebensmitteln und klinischen Proben. Die enthaltenen Nährsubstrate bewirken ein gu-tes Enterobacteriaceen-Wachstum. Durch Natriumdesoxycholat wird eine grampositive Begleitflora im Wachstum gehemmt. Durch enthaltenes Propylenglycol, das Salmonellen zu einer Säure umwandeln, können Salmonellen eindeutig von anderen Bakterien
unter-schieden werden. Ein pH-Indikator zeigt die Salmonellen als charakteristisch pink-rote Kolonien an. Coliforme Keime wachsen durch enthaltenes Chromogen als bläulich-grüne oder bläulich-violette Kolonien und können so von Salmonellen abgegrenzt werden. Die übrigen Enterobacteriaceen und gramnegative Bakterien lassen sich als farblose bzw. gelb-liche Kolonien identifizieren. Die Zusammensetzung eines Rambach-Agars besteht aus 8 g/l Pepton, 5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l aus Natriumdesoxycholat, 1,5 g/l einer Chromo-genmischung, 10,5 g Propylenglycol und 15 g/l Agar-Agar. Die Kultur wird auf 1/4 der Agarplatte ausgeimpft. Einzelkolonien werden durch Ausimpfen mit derselben Öse auf dem restlichen 3/4 Anteil der Platte erzielt. Die aerobe Bebrütung erfolgt im Anschluss bei 35–37°C über 24 bis 48 Stunden [Merck KGaA, 2004a].
Der Xylolose-Lysin-Desoxycholat-Agar, kurz XLD-Agar dient zur Isolierung und Dif-ferenzierung pathogener Enterobacteriaceen. Insbesondere zur Identifizierung von Salmo-nella und Shigella. Der Nährboden entspricht den Empfehlungen der United States Phar-macopeia XXIII (1995), der European PharPhar-macopeia II und APHA (1992). Wird XLD-Agar mit einer geeigneten Anreicherung kombiniert, sind hier weitaus größere Mengen an Salmonellen und Shigellen nachzuweisen als auf anderen Selektivnährmedien [Merck KGaA, 2004d]. Ellerbroek et al. stellten bei ihren Untersuchungen zum Vorkommen von Salmonellen bei deutschem Nutzgeflügel und Geflügelfleisch jedoch fest, dass die Sensiti-vität von Rambach-Agar in ihren Versuchsdurchläufen im Mittel höher war, als die des XLD-Agars (96,2 % zu 91,3 %). Der stärkste Unterschied ergab sich bei der Untersuchung von Gazekotproben (95,9 % zu 80,4 %) [Ellerbroek et al., 2001]. Laut der Firma Merck zeigt sich der XLD-Agar auch im Direktausstrich anderen Nährböden überlegen. Beim Abbau von Xylolose, Lactose und Saccharose zu Säure ergibt sich ein Farbumschlag von Phenolrot nach Gelb. Thiosulfat und Eisen(III)-Salz sind Indikatoren für für eine Bildung von Schwefelwasserstoff. Dabei fällt schwarzes Eisensulfid in den Kolonien an. Durch eine purpurrote Verfärbung um die Kolonien wird eine pH Wert Erhöhung angezeigt. Diese erfolgt, wenn Bakterien Lysin zu Cadaverin decarboxylieren. Es ist möglich, dass mehrere dieser Reaktionen zugleich oder nacheinander erfolgen. Die Folge ist eine Färbung des pH-Indikators in verschiedene Nuancen oder bei längerer Bebrütung ein Farbumschlag von gelb nach rot. Der Nährboden besitzt nur eine sehr schwache Hemmwirkung. XLD-Agar besteht aus 3 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid, 3,5 g/l D (+)- Xylolose, 7,5 g/l Lactose, 7,5 g/l Saccharose, 5 g/l L(+)- Lysin, 2,5 g/l Natriumdesoxycholat, 6,8 g/l Natriumthiosulfat, 0,8 g/l Ammoniumeisen(III)-citrat, 0,008 g/l Phenolrot und 13,5 g/l Agar-Agar. Der Nährboden wird im Oberflächenausstrich dünn beimpft und bei 37°C für 48 Stunden bebrütet. Danach sollten Untersuchungen zur Identifizierung der Kolonien folgen.Salmonella-Kolonien zeigen sich in der Farbe des Nährbodens, transparent,
manch-mal mit einem schwarzen Zentrum. Das Medium selbst wechselt die Farbe bei Salmonellen nicht. Bei Stämmen von Salmonella Typhi, die Xylolose-positiv reagieren, erscheinen die Kolonien orange bis etwas opak [Merck KGaA, 2004d].
Im Anschluss erfolgt die Anzüchtung auf Standard-I-Agar. Dieser Nährboden ist be-sonders für die Anzüchtung anspruchsvoller Bakterien geeignet. Man verwendet diesen Agar u. a. zur Bestimmung der Keimzahl, zur Keimisolierung und zur Anreicherung. Der Agar setzt sich aus 15 g/l Pepton, 3 g/l Hefeextrakt, 6 g/l Natriumchlorid 1 g/l D (+) Glucose und 12 g/l Agar-Agar zusammen. Der Nährboden ist klar gelblich. Die Bebrü-tung erfolgt bei diesem Nährboden für 24 Stunden bei 25°C unter aeroben Bedingungen [Merck KGaA, 2004c].
Weiter differenziert werden können die Bakterien nun mit Hilfe von Testkits mit be-stimmten Antikörpern, die an bestimmte Salmonellaantigene wie z. B. an O-, H- oder Vi-Antigene binden und eine Trübung der Flüssigkeit durch Agglutination bewirken. Das Probenmaterial wird auf einem Objektträger mit den Testflüssigkeiten mittels einer Öse verrieben und anschließend auf einer dunklen Unterlage beurteilt. Das Salmonellenergeb-nis kann so serologisch bestätigt werden [Baumgart u. Becker, 1994] [Waltmann, 1999]
[Andrews et al., 2001] [SIFIN, 2005].