2.6.1 Biochemische Eigenschaften und Biotypisierung
Zur Unterscheidung der verschiedenenEnterobacteriaceae können die Stoffwechselleistun-gen auf Differenzialnährmedien Stoffwechselleistun-genutzt werden. Beispielsweise nutzen Salmonellen Citrat als alleinige Kohlenstoffquelle. Salmonellen zählen zu den Oxidase-negativen und Glucose fermentierenden Bakterien, mit Ausnahme von S. Typhi. Die Fermentation von Gluco-ronat auf einem SMID-Agar zeigt sich als eine Umfärbung der Kolonie in ein Pink. Die Aminosäuren Lysin, Arginin und Ornithin werden von Salmonellen decarboxyliert. Auch hier zählt S. Typhi zu den Ausnahmen. In Nährmedien enthaltene Schwefelverbindungen sind gut nutzbar um Bakterien wie Salmonella spp. oderClostridia spp. durch Schwefel-wasserstoffbildung zu identifizieren. Fast alle Salmonellen bilden auf Dreizuckerreisagar H2S und somit Sulfide (ausgenommen S. Choleraesuis und S. Paratyphi A). Dies zeigt sich auf einem XLT 4-Agar als schwärzlich erscheinende Koloniebildung. Bei dem säure-bildenden Abbau von Propylenglycol (exkl. S. Choleraesuis) verfärbt sich die Kolonie auf Rambach-Agar charakteristisch pink-rot. Mit Ausnahme derS. enterica Subspezies arizo-nae und diarizonae sind Salmonellen auf z. B. Gassner-Agar unfähig Lactose zu spalten.
Bei Salmonella Spezies sind außerdem sowohl die Indolreaktion als auch die Ureasere-aktion negativ. Eine weitere charakteristische Stoffwechselleistung ist die Reduktion von Nitat zu Nitrit [Rambach, 1990] [Baumgart u. Becker, 1994] [Holt, 2000] [Garrity et al., 2001] [Schoenenbruecher, 2006] [Rolle u. Mayr, 2007].
2.6.2 Serotypisierung
Neben der bakteriologischen Diagnostik spielt auch die serologische Diagnostik (verschie-dene enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Methoden ) bei den Salmonellen eine wichtige Rolle. Mit Hilfe dieser Methode wird auch die Einordnung in das internationale Kauffmann-White-Schema vorgenommen. Alle Salmonellen besitzen für die serologische Diagnostik wichtige somatische O-Antigene. Hierbei handelt es sich um hitzestabile Lipo-polysaccharide, die ein Bestandteil der Zellwand sind. Neben den O-Antigenen verfügen alle Salmonellen auch über hitzelabile Proteine, die die Geißeln bilden. Diese werden als H-Antigene oder auch als Geißelantigene bezeichnet. Auch diese Antigene sind für die Einordnung von Bedeutung. Nur eine geringe Rolle spielen die Kapsel-Antigene (Vi- bzw.
K-Antigene). Denn diese kommen nicht bei allen Salmonellen Spezies vor. Fimbrienanti-gene (F-AntiFimbrienanti-gene), besonders das SEF 14, dienen wie auch die H-AntiFimbrienanti-gene g und m der Identifizierung von Enteritidisstämmen. Insbesondere die O- und die H-Antigene
bezie-hungsweise die Kombination ihres Auftretens machen die Serovar-Spezifität aus [Baum-gart u. Becker, 1994] [Waltmann, 1999] [Holt, 2000] [Andrews et al., 2001] [Rolle u. Mayr, 2007] [Hahn et al., 2009a]. Die Bezeichnung „O“ bedeutet Wachstum „ohne Hauch“. Die Bezeichnung „H“-Antigen soll Wachstum „mit Hauch“ heißen. Dies ist historisch auf die Tatsache zurückzuführen, dass die durch Begeißelung stark beweglichen Keime der Gattung Proteus Nährböden hauchförmig dünn und vollständig bedecken. Unbegeißelte und somit unbewegliche Varianten bilden nicht schwärmende, begrenzte Kolonien ohne
„Hauch“ [Schramme, 2000][Rolle u. Mayr, 2007][Hahn et al., 2009b]. Antigen-Antikörper-Reaktionen können sichtbar gemacht werden, indem die beiden Ausgangsprodukte durch die Agglutinationsreaktion sichtbar verklumpen (z. B. durch Latexpartikel). Bei der re-versen passiven Latexagglutination (RPLA) werden mit den Partikeln verbundene An-tikörper zu den Isolaten gegeben. Passen Antigen und AnAn-tikörper zusammen, kommt es zur Agglutination, die durch den Trägerstoff sichtbar gemacht wird [Baumgart u. Becker, 1994] [SIFIN, 2005] [Andrews et al., 2001]. Bei einer serologischen Untersuchung, wie bei-spielsweise durch eine ELISA Methode, sind falsch negative Ergebnisse aufgrund einer zu frischen Infektion von Nachteil. Dafür handelt es sich hierbei um die kostengünstigere und schnellere Variante, bei der zudem auch bei geringer Erregerausscheidung ein Nachweis erfolgen kann [Rolle u. Mayr, 2007].
2.6.3 Qualitative PCR
Bereits 1985 entwickelte K. Mullis die bis heute zu den wichtigsten und renomiertesten molekularbiologische Nachweismethoden zählende qualitative Polymerasekettenreaktion (PCR). Hierbei werden nach Denaturierung bei 95°C und somit Auftrennung der dop-pelsträngigen DNA definierte kurze Abschnitte der DNA mittels spezifischer Primeroli-gonukleotide in sich wiederholenden Zyklen vervielfältigt. Bei einer Temperatur von 37°C bis 65°C erfolgt die Annealingphase, in der sich die Primer an die Bindungsstellen der Einzelstränge anlagern. Die Elongationsphase, die bei 72°C von den Primern ausgeht, verlängert mittels der Taq-Polymerase den DNA Strang. Die entstandenen Doppelsträn-ge entsprechen den AusgangsdoppelstränDoppelsträn-gen. Diese zyklischen Phasen können in einem sogenannten Thermocycler automatisiert erfolgen. Die Produktion des Produkts erfolgt dabei exponentiell. Das entstandene Amplicon kann mit Agarosegelelektrophorese wei-ter analysiert werden. Dabei erfolgt die Auswertung allein über die Produktgröße und nicht über die Sequenz [McKillip u. Drake, 2004] [Anderson, 2009]. Durch anschließende Restriktionsanalysen oder Hybridisierung mit spezifischen DNA-Sonden kann auch eine sequenzielle Auswertung erfolgen [Anderson, 2009]. In einer Veröffentlichung wurden tra-ditionell verwendete Kulturmethoden und die Verwendung einer Salmonella-spezifischen
Polymerasenkettenreaktion verglichen. Dabei wurden mit Hilfe der Anzüchtung auf Kul-turmedien bei 16% der Proben Salmonellen isoliert. Die PCR dagegen wies in 19% der Proben Salmonellen nach. Bei einer Kombination der beiden Verfahren konnte sogar eine Salmonellenausbeute aus 23% der Proben erfolgen. Demnach erscheint die PCR die sen-sitivere Methode zu sein, besonders aber die Kombination aus den zwei Tests scheint eine große Sensitivität zu haben [Whyte et al., 2002].
2.6.4 Real Time PCR
Vor dem Einsatz einer PCR erfolgt immer noch die Voranreicherung mit gepuffertem Peptonwasser, gefolgt von einer selektiven Anreicherung beispielsweise in Rappaport-Vasilliadis-Soja-Bouillon [O’Reagan et al., 2008]. Die sogenannte Real Time PCR ist eine Weiterentwicklung der qualitativen PCR. Bei dieser Methode wird das DNA Zielprodukt zusätzlich quantifiziert. Im Grunde wird die DNA wie bei der qualitativen PCR vervielfäl-tigt. Hier wird der anschließende mühselige Weg der weiteren Analyse wie beispielsweise die Gelelektrophorese bereits gespart. Die Menge des Produktes wird z. B. mittels einer Sonde (TaqMan-Sonde) mit zweifacher fluoreszierender Markierung ermittelt. Der eine Farbstoff, der sogenannte Quencher (TAMRA) am einen Ende der Sonde unterdrückt die Fluoreszenz des Reporter Farbstoffes solange, bis die 5’-3’-Exonuclease-Aktivität der Taq Polymerase den Sondenabbau bewirkt und somit auch die Trennung des Quenchers. Das vom Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (FAM) emittierte Lichtsignal kann nun gemessen wer-den. Die Abspaltung von Sonden-Molekülen verhält sich proportional zum PCR-Produkt.
Das heißt, dass mit jedem Zyklus auch die Fluoreszenzintensität steigt [Heid et al., 1996]
[Anderson, 2009]. O’Reagan et al. kamen bei Versuchen mit der Real Time Multiplex PCR zu dem Ergebnis, dass diese Methode genauso sensitiv wie die kulturelle Metho-de Salmonella Spezies in Broilerproben aufspürt und verschiedene Serovaren identifiziert [O’Reagan et al., 2008].
2.6.5 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)
Die PFGE dient zum DNA Fingerprinting und ist in der Lage verschiedene Stämme einer Spezies zu differenzieren. So können beispielsweise auch Salmonella Klone identifiziert werden und Kontaminationsrisiken während des Schlachtprozesses und bei der Verar-beitung erkannt werden [Tassios et al., 2000] [Wonderling et al., 2003]. In Agarosegel eingebettete DNA wird hier zunächst mittels Ristriktionsendonukleasen aufgeschlossen.
Im nachfolgenden Schritt werden die Restriktionsfragmente dann durch Elektrophorese
separiert. Durch UV Licht können DNA Banden anschließend sichtbar gemacht werden [Zhao et al., 2007].
2.6.6 Entwicklung der Nachweismethoden
Teilweise sind in Lebensmittelproben und in latent infizierten Tieren relativ niedrige Keimkonzentrationen enthalten. Daher muss bei der Weiterentwicklung der Nachweis-methoden gerade hierauf ein Augenmerk gelegt werden. Es wird unter anderem an Mem-branfiltertechniken gearbeitet, um die Erregerkonzentration zu erhöhen. Weitere Mög-lichkeiten bieten Impedanzmessungen, bei denen Änderungen des Widerstandes und der Leitfähigkeiten gemessen werden. Diese Änderungen entstehen durch das Wachstum der Salmonellen in Selektivnährmedien. Für einen Antigennachweis werden zur Serovarbe-stimmung sehr spezifische Antikörper (Ak), z. B. monoklonale Ak eingesetzt, aber auch Fangantikörper, die zunächst möglichst viele Serovaren binden. Auch Gensonden und PCR werden angewandt um Erreger besser nachzuweisen. Schließlich sind noch immu-nologische Separations- und Konzentrationstechniken zu erwähnen. Bei dieser Technik ist eine Selektivanreicherung trotzdem nicht überflüssig, da sie als Bestätigungstest, zur Resistenzbestimmung und zur epidemiologischen Typisierung dient [Baumgart u. Becker, 1994] [Andrews et al., 2001] [Snaidr, 2002] [Thieman u. Palladino, 2007] [Rolle u. Mayr, 2007].