Untersuchungen zum Stoffwechsel von Aminen und Polyaminen bei Einsatz von Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißgehalten unter Zulage von Soja im Pansen in vitro

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zum Stoffwechsel von Aminen und Polyaminen bei Einsatz von Grassilagen mit

unterschiedlichen Reineiweißgehalten unter Zulage von Soja im Pansen in vitro

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Anna Thomsen

Itzehoe

Hannover 2018

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker Klinik für Rinder

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Dr. M. Höltershinken

Klinik für Rinder

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. S. Leonhard-Marek

Tag der mündlichen Prüfung: 07.05.2018

Gefördert durch den Milchförderungsfonds Hannover-Braunschweig

Du bist ewig für das verantwortlich, was du dir

vertraut gemacht hast.

Du bist für deine Rose verantwortlich.

Antoine de Saint-Exupéry aus „Der kleine Prinz“

Meiner Familie

Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgender Tagung präsentiert:

70. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie – Hannover, 08.–10.03.2016,

Posterbeitrag Nr. 42

GÖRES, N., K. GLÖCKL, C. HUNSCHE, M. ILLE, C. SCHULTE, A. THOMSEN M. HOEDEMAKER und M. HÖLTERSHINKEN (2016):

Impact of soybean protein on ruminal phenolic content by feeding grass silages containing different levels of true protein in vitro.

Proceedings of the Society of Nutrition Physiology 25, S. 58 Vortragsbeitrag Nr. 21

HÖLTERSHINKEN, M., M. COENEN, K. GLÖCKL, N. GÖRES, W. HEIMBECK, M. HOEDEMAKER, C. HUNSCHE, M. ILLE, C. PARYS, C. SCHULTE, A.

THOMSEN, P. WOLF und K. EICKEN (20016):

Amino acid Composition of grass silages containing different levels of true protein in total crude protein.

Proceedings of the Society of Nutrition Physiology 25, S. 37 Posterbeitrag Nr. 43

THOMSEN, A., K. GLÖCKL, N. GÖRES, C. HUNSCHE, M. ILLE, C. SCHULTE, M. HOEDEMAKER und M. HÖLTERSHINKEN (2016):

Studies on the metabolism of amines when feeding grass silage containing different levels of true protein and the influence of soybean meal using the RUSITEC-System.

Proceedings ot the Society of Nutrition Physiology 25, S. 59

I Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Schrifttum ... 3

2.1 Amine und Polyamine – Bezug zu vorherigen Untersuchungen ... 3

2.2 Eigenschaften der Polyamine und Amine ... 5

2.2.1 Amin- und Polyaminmetabolismus in der Pflanze ... 6

2.2.2 Amin- und Polyaminmetabolismus im Pansen ... 9

2.2.3 Amine und Bakterien ... 14

2.2.4 Enzymsysteme... 16

2.2.5 Polyamine und Phenole ... 20

2.2.6 Transglutaminasen ... 21

2.2.7 Bedeutung der biologischen Wirkung und möglichen Toxizität von Aminen ... 22

2.3 Zusammenfassende Wertung ... 27

2.4 Zielsetzung der Arbeit ... 28

3 Material und Methodik ... 29

3.1 Ziel der Methodik ... 29

3.2 Material und Methoden ... 29

3.2.1 Herkunft der Proben ... 30

3.2.2 RUSITEC ... 31

3.2.3 Dauerbetrieb des RUSITEC ... 36

3.2.4 Analytik ... 37

3.2.4.1 Analyse der flüchtigen Fettsäuren (i-Säuren) ... 37

3.2.4.2 Bestimmung des Ammoniakgehaltes ... 38

3.2.4.3 Bestimmung der Überstandsvolumina ... 38

3.2.4.4 Datenverarbeitung der Aminosäureanalyse von Grassilagen (EVONIK Nutrition & Care GmbH) ... 38

3.2.4.5 Analyse der Amine, Polyamine und Aminosäuren (LC-MS/MS) ... 39

3.2.4.5.1 Entwicklung der Methode zur Messung von Aminen ... 39

3.2.4.5.2 Auswahl der erfassten Amine ... 40

3.2.4.5.3 Probenmaterial zur Methodenentwicklung ... 44

3.2.4.5.4 Auswahl des Extraktionsverfahrens ... 44

3.2.4.5.5 Derivatisierung von Standards mit FMOC-Chlorid als Ansatz ... 45

3.2.4.5.6 Gewinnung und Aufbereitung der Fermenterproben ... 46

3.2.4.5.7 Aufbereitung der gefriergetrockneten Grassilagen ... 48

3.2.4.5.8 Laufbedingungen der LC-MS/MS ... 48

3.2.4.5.9 Bestimmung der Wiederfindungsrate ... 49

3.2.4.5.10 Mögliche Polyaminverbindungen ... 52

3.2.4.5.11 Standardlösungen ... 53

3.2.4.5.12 Interne Standards ... 54

3.2.4.5.13 Externer Standard ... 54

3.2.4.5.14 Kalibration ... 54

3.2.4.5.15 Messroutine der LC-MS/MS ... 62

3.2.4.5.16 Überprüfung der Messgenauigkeit der LC-MS/MS ... 62

3.2.4.5.17 Art der Auswertung... 63

II

3.2.4.5.18 Zusammenfassende Wertung der Methode ... 65

3.2.5 Statistische Auswertung ... 66

3.2.5.1 Verteilungsanalyse ... 66

4 Ergebnisse ... 67

4.1 Vorkommen von flüchtigen Fettsäuren (i-Säuren) ... 67

4.1.1 Vorkommen von i-Buttersäure ... 68

4.1.2 Vorkommen von i-Valeriansäure ... 72

4.2 Vorkommen von Ammoniak ... 76

4.3 Ergebnisse der Aminosäureanalyse (EVONIK Nutrition & Care GmbH)... 78

4.4 Beziehung zwischen g-Aminobuttersäure und Glutamat ... 81

4.5 Vorkommen von Polyaminen und Aminosäuren im RUSITEC ... 81

4.5.1 Vorkommen von Cadaverin im flüssigen Fermenterinhalt ... 82

4.5.2 Vorkommen von L-Lysin im flüssigen Fermenterinhalt ... 84

4.5.3 Vorkommen von Putrescin im flüssigen Fermenterinhalt ... 86

4.5.4 Vorkommen von Spermidin im flüssigen Fermenterinhalt ... 88

4.5.5 Vorkommen von Spermin im flüssigen Fermenterinhalt ... 90

4.5.6 Summe der Polyamingehalte von Putrescin, Spermidin und Spermin im flüssigen Fermenterinhalt ... 92

4.5.7 Vorkommen von m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) im flüssigen Fermenterinhalt ... 94

4.5.8 Vorkommen von L-Arginin im flüssigen Fermenterinhalt ... 94

4.5.9 Vorkommen von L-Ornithin im flüssigen Fermenterinhalt ... 96

4.5.10 Vorkommen von L-Methionin im flüssigen Fermenterinhalt ... 98

4.5.11 Summe der Aminosäuregehalte von L-Arginin, L-Methionin und L-Ornithin im flüssigen Fermenterinhalt ... 100

4.5.12 Vorkommen von β-Alanin im flüssigen Fermenterinhalt ... 102

4.5.13Vorkommen von γ-Aminobuttersäure im flüssigen Fermenterinhalt ... 104

4.5.14 Vorkommen von gelöstem Cadaverin im festen Fermenterinhalt... 106

4.5.15 Vorkommen von gelöstem L-Lysin im festen Fermenterinhalt ... 108

4.5.16 Vorkommen von gelöstem Putrescin im festen Fermenterinhalt ... 110

4.5.17 Vorkommen von gelöstem Spermidin im festen Fermenterinhalt ... 112

4.5.18 Vorkommen von gelöstem Spermin im festen Fermenterinhalt... 114

4.5.19 Summe der gelösten Polyamine Putrescin, Spermidin und Spermin im festen Fermenterinhalt ... 116

4.5.20 Vorkommen von gelöstem m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) im festen Fermenterinhalt ... 118

4.5.21 Vorkommen von gelöstem L-Arginin im festen Fermenterinhalt... 120

4.5.22 Vorkommen von gelöstem L-Ornithin im festen Fermenterinhalt ... 122

4.5.23 Vorkommen von gelöstem L-Methionin im festen Fermenterinhalt ... 124

4.5.24 Summe der löslichen Aminosäuren L-Arginin, L-Methionin und L-Ornithin im festen Fermenterinhalt ... 126

4.5.25 Vorkommen von gelöstem β-Alanin im festen Fermenterinhalt ... 128

4.5.26 Vorkommen von gelöstem GABA im festen Fermenterinhalt ... 130

4.6 Zusammenfassung der erhobenen Ergebnisse ... 132

III

4.7 Vergleich der Amin- und Aminosäuregehalte im RUSITEC und in

den eingesetzten Grassilagen ... 135

5 Diskussion ... 139

5.1 Intention der Arbeit ... 139

5.2 Kritische Betrachtung des Versuchsaufbaus ... 139

5.2.1 RUSITEC-System ... 139

5.2.2 Eingesetzte Futtermittel ... 140

5.3 Ausgewertete Parameter ... 141

5.3.1 Probenbearbeitung ... 141

5.3.2 Methode der LC-MS/MS ... 142

5.3.3 Auswahl der Standards ... 143

5.3.4 Statistik ... 144

5.4 Auswirkungen der Schadsilagen auf den ruminalen Stoffwechsel von Aminen, Polyaminen und Aminosäuren ... 145

5.4.1 Cadaverin und L-Lysin ... 145

5.4.2 Putrescin, Spermidin und Spermin sowie L-Arginin, L-Methionin und L-Orntihin ... 148

5.4.3 m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) ... 154

5.4.4 β-Alanin ... 155

5.4.5 γ-Aminobuttersäure ... 156

5.4.6 Evaluation der Polyamine und Aminosäuren im festen Fermenterinhalt ... 159

5.4.7 Ammoniak ... 160

5.4.8 Flüchtige Fettsäuren: i-Butter- und i-Valeriansäure... 164

5.4.9 Zusammenhang zwischen i-Buttersäure, i-Valeriansäure und Ammoniak ... 166

5.5 Schlussfolgerung und Ausblick ... 168

6 Zusammenfassung ... 170

7 Summary ... 172

8 Schrifttumsverzeichnis ... 174

9 Anhang ... 198

9.1 Informationen zu Material und Methodik ... 198

9.1.1 Eingesetzte Standards, Lösungsmittel und Reagenzien ... 198

9.1.2 Probenentnahme während der RUSITEC-Läufe ... 200

9.1.3 Ergebnisse aus der Derivatisierung mit FMOC-Chlorid ... 201

9.2 Futtermittelanalysen ... 202

9.2.1 Futtermittelanalysen der Grassilagen ... 202

9.2.2 Futtermittelanalyse des Sojaproteins ... 203

9.2.3 Inhaltsstoffe des Kraftfutters ... 203

9.3 Messungen von Aminosäure- und Polyaminstandards und 1,7 Diaminoheptan ... 204

9.3.1 Bestimmung der Messgenauigkeit an der LC-M/MS durch Wiederholungsmessungen von 1,7 Diaminoheptan ... 205

IV

9.3.2 Untere Nachweisgrenze der bestimmten Polyamine und

Aminosäuren ... 205

9.3.3 Variationskoeffizient des internen Standards während der Probenanalytik an der LC-MS/MS... 206

9.3.4 Konzentrationen des externen Standards während der Probenanalytik ... 207

9.3.5 Retentionszeiten des externen Standards während der Probenanalytik ... 208

9.4 Grafiken der Ergebnisse und Tabellen der Statistik ... 209

9.4.1 Überstände, flüchtige Fettsäuren und Ammoniak ... 209

9.4.2 Ergebnisse der Grassilageanalysen an der LC-MS/MS ... 209

9.4.3 Cadaverin ... 218

9.4.4 L-Lysin ... 220

9.4.5 Putrescin ... 222

9.4.6 Spermidin ... 224

9.4.7 Spermin ... 226

9.4.8 Summe der Polyamingehalte Putrescin, Spermidin und Spermin ... 228

9.4.9 m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) ... 230

9.4.10L-Arginin ... 231

9.4.11 L-Ornithin ... 233

9.4.12 L-Methionin ... 235

9.4.13 Summe der Aminosäuregehalte L-Arginin, L-Methionin und L-Ornithin ... 237

9.4.14 β-Alanin ... 239

9.4.15 γ-Aminobuttersäure ... 241

9.5 Grafiken und Tabellen der Diskussion ... 243

9.5.1 Literaturübersicht zu Aminosäuregehalten in Grassilagen ... 243

9.5.2 Beziehung zwischen Polyaminen und GABA im RUSITEC ... 244

10 Danksagung ... 245

V Abkürzungsverzeichnis

1,7 DAH 1,7 Diaminoheptan

AA Aminosäure

AAHDL N-Acetyl-β-Alanin- Amidohydrolase

ADAM Amantadinhydrochlorid ADC Arginin-Decarboxylase AMADH Aminoaldehyd-

Dehydrogenase APAO N¹-Acetylpolyamin-

Oxydase Appl. Applikation AS-

Gehalte

Summe der Aminosäuren

L-Arginin, LOrnithin und L-Methionin

Bov. bovin

BSCFA branched short chain fatty acids

c Konzentration

CaCl2 Calciumchlorid Cad. Cadaverin Cl. Clostridium CP crude protein

CuAO Kupfer-Amin-Oxydase

FA Ameisensäure

fAA Freie Aminosäuren FlFS Flüchtige Fettsäuren FMOC-

Chlorid

9-Fluorenylmethyloxy- carbonylchlorid

GABA γ-Aminobuttersäure ges. AS Gesamte Aminosäuren ggr. geringgradig

Glc. Glukose

h Stunde

HAP-

Spezies Hyperammonium-

produzierende Bakterien HCl Salzsäure

HClO4 Perchlorsäure Hist. Histamin

HSS Homospermin-Synthase i. rum. intra ruminal

Kb-Werte Basenkonstante KCl Kaliumchlorid KF Kontrollfermenter

kg Kilogramm

KM Körpermasse

LC-ESI- MS/MS

liquid chromatography- electrospray ionization- mass spectrometry LC-

MS/MS liquid chromatography- mass spectrometry LDC Lysin-Decarboxylase LOD limit of detection LPS Lipopolysaccharide

M. Megasphaera

m/z Masse-zu-Ladung MAT Methionin-Adenosyl-

Transferase mg Milligramm

MgCl2 Magnesiumchlorid Methylam. Methylamin

Min. Minute

N Stickstoff

n.d. Nicht näher definiert n.n. Nicht nachweisbar Na2HPO4 Di-Natriumhydrogen-

phosphat NaCl Natriumchlorid NaHCO3 Natriumhydrogen-

carbonat NaOH Natronlauge

NH3 Ammoniak

nmol Nanomol

NPN Non-Protein-Stickstoff NSpd. Norspermidin

NSPDS Norspermidin-Synthase NSpm. Norspermin

NSPMS Norspermin-Synthase ODC Ornithin-Decarboxylase

Ov. ovin

p. os Fütterung per os p.p. post partum

PA Polyamine

PA- Gehalte

Summe der Polyamine Putrescin, Spermidin und Spermin

PAO Polyamin-Oxydase Put. Putrescin

RC-Filter regenerierte Cellulose- Filter

VI

RE Reineiweiß

Rp Rohprotein

RP-HPLC Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography rpm rounds per minute RSA Rinderserum Albumin Rt Retentionszeit

s. siehe

S. Selenomonas

Sc. Streptococcus Spd. Spermidin

SPDS Spermidin-Synthase SPE Solidphase extraction SOP Standard operation

procedure Spm. Spermin

SPMS Spermin-Synthase SSAT Spermidin/Spermin-N¹-

Acetyltransferase TF Testfermenter TFA Trifluoressigsäure TFmS Testfermenter mit Soja ThSpm. Thermospermin

TP true protein TS Trockensubstanz TSPMS Thermospermin-

Synthase Tyr. Tyramin

uS Ursprüngliche Substanz V. Veillonella

VDLUFA Verband Deutscher landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten VK Variationskoeffizient

vs. versus

WFR Wiederfindungsrate

1 1 Einleitung

In der heute zunehmend leistungsorientierten Rinderhaltung und Milchproduktion ist die Versorgung der Tiere mit Grundfutter von guter Qualität essentiell. Dennoch gibt es auch bei Verwendung von hochwertigem Pflanzenmaterial und sorgsamer Einsilierung desselbigen immer wieder gesundheitliche Probleme in den Milchvieh- herden, die mit der Verfütterung von grassilagebetonten Rationen mit mehr als 50 % Grassilageanteil am Grobfutter in Zusammenhang gebracht werden konnten (EICKEN 2005b; LEIFERT 2014; VEAUTHIER 2014). Aufgrund dessen wird eine nutritive Genese der gesundheitlichen Probleme vermutet. Schon vor zwölf Jahren konnte EICKEN (2005b) eine Verbindung zwischen der Mehrfütterung von Grassilagen und einem unspezifischen Krankheitsgeschehen in Milchviehherden darstellen. Der Abbau des Proteins im Futter wird nach neuesten Erkenntnissen in den ersten Stunden nach dem Schnitt des Grünfutters vorrangig durch pflanzliche Proteasen katalysiert. Es konnte herausgestellt werden, dass dieser Vorgang in der Pflanze beginnt und nicht, wie zuvor angenommen, durch die Pansenflora initiiert wird (McDONALD et al. 1981;

SEYFARTH et al. 1989; ZHU et al. 1999; BUXTON u. MUCK 2003; HOEDTKE et al.

2010). Witterungseinflüsse und Management bestimmen die Anwelkzeit der geernteten Gräser und beeinflussen somit in erheblichem Umfang die Proteinfraktionen in der fütterungsfertigen Silage (EDMUNDS et al. 2012). Dabei können, je nach Aufwuchs- und Witterungsbedingungen zum Erntezeitpunkt, unterschiedliche Proteine, Peptide, NPN-Verbindungen, Aminosäuren, Amine und auch Polyamine entstehen (DAWSON et al. 1999; OWENS et al. 1999; HOEDTKE et al. 2010; HOEDTKE et al. 2011; EDMUNDS et al. 2012).

Da das Erkrankungsbild vermutlich durch mehrere Faktoren entsteht, wurde es als

„Faktorenerkrankung Milchviehherde“ bezeichnet (EICKEN 2005b). Zu den vielfältigen Symptomen des Krankheitskomplexes gehören unter anderem schwerste Verdauungsstörungen, wie das vermehrte Auftreten einer Dislocatio abomasi, Erkrankungen des Reproduktionssystems, wie Retentio secundinarum und Sterilität, erhöhte Zellgehalte in der Milch, Lahmheiten, Stoffwechselerkrankungen, Festliegen (Downer Cow Syndrom) und plötzliche Todesfälle. Die Fütterung von Grassilagen von verminderter Qualität, das heißt einem Reineiweißgehalt am Rohprotein RE/Rp

< 50 % führt darüber hinaus zu Immunsuppressionen, die sich durch das gehäufte Auftreten von infektiösen Erkrankungen äußern (EICKEN 2005b). Im Allgemeinen kommt es zu einer verringerten Futteraufnahme und zur Leistungsreduktion der Tiere.

In der Praxis konnte gezeigt werden, dass die negativen Auswirkungen der veränderten Grassilagen sich insbesondere durch die Ergänzung der Ration mit Sojaextraktionsschrot als alternative Proteinquelle abfangen lassen (EICKEN 2005a;

LEIFERT 2014). Diese Annahme wird gestützt durch die Beobachtung, dass erkrankte Tiere sich erholen können, wenn eine weitere Fütterung der schadhaften Grassilage unterbleibt und die Erkrankung noch nicht zu lange (d.h. weniger als zwei Monate) andauert. Somit bestätigt sich die Vermutung, dass ursächlich eine nutritive Genese der Pathogenese der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ zu Grunde liegt.

Dieses Forschungsprojekt liefert als Teil eines Gruppenprojektes (GÖRES 2016;

EBHARDT (in Arbeit); HUNSCHE (2017); ILLE 2017; SCHULTE (in Arbeit))

2

Erkenntnisse zur Hypothese, inwieweit der verminderte Reineiweißgehalt einer Grassilage den Gehalt der Amine ß-Alanin und Tyramin sowie der Polyamine Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin und Thermospermin im Pansen in vitro beeinflusst bzw. erhöht.

Es gibt Hinweise darauf, dass Amine bzw. Aminverbindungen in Pflanzen akkumulieren (HEGARTY u. PETERSON 1973). Die Funktion und Wirkung sowie mögliche Toxizität dieser Moleküle in den Organismen Pflanze, Tier und Bakterium wird im Literaturteil erläutert. So ist aus pharmakologischen Studien bekannt, dass verschiedene Amine und ihre Derivate auch eine zentralnervöse Wirkung haben (BLAGBROUGH u. USHERWOOD 1992; MASUKO et al. 2010). Aber auch im physiologischen Zellzyklus haben gerade Polyamine vielfältige Funktionen und damit Auswirkungen auf den Organismus (RAMANI et al. 2014). In größeren Mengen sind auch toxische Wirkungen der Amine und Polyamine auf den Organismus entdeckt worden (TIL et al. 1997; PEGG 2013).

Einen weiteren Schwerpunkt bilden der Einfluss von Sojazulagen (EICKEN 2005a) zu den verschiedenen Grassilagen und die Auswirkung dieser im Hinblick auf das Vorkommen der Amine und ihrer Verbindungen im Pansensaft in vitro. Für die Analyse der Amine war die Entwicklung einer entsprechenden Methode an der LC-MS/MS notwendig.

3 2 Schrifttum

2.1 Amine und Polyamine – Bezug zu vorherigen Untersuchungen

In der Praxis stellte sich heraus, dass Grassilagen, die nach den DLG-Richtlinien eine gute Qualität haben, teilweise einen geringen Gehalt an Reinweiß aufweisen. Daher wird ab einem nasschemisch bestimmten Quotienten von RE/Rp < 50 % der Protein- gehalt in Grassilagen als qualitativ vermindert angesehen (EICKEN 2005b). Da Rinder nach Verfütterung von Grassilagen mit diesem geringen RE/Rp-Quotienten erkranken können, wird selbige auch als Schadsilage bezeichnet (GAST 2010). In zurück- liegenden Untersuchungen wurde bereits intensiv an den möglichen Hintergründen des Krankheitsgeschehens gearbeitet (s. Tab. 2.1).

Tab. 2.1: Forschungsergebnisse zu RUSITEC-Versuchen mit Grassilagen mit geringen Rein- eiweißgehalten (RE/Rp < 50 %) aus dem Pansenlabor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Thema Ergebnis Literatur

Einfluss auf die Zahl der

Bakterien und Protozoen

Es konnte eine Verschiebung der Protozoen- und Bakterienanzahl im RUSITEC-Inhalt beobachtet werden. Der erhöhte Bakteriengehalt bei Einsatz von Silagen mit geringem Reineiweißgehalt wurde aufgrund der höheren Nukleobasenkonzentration unterstellt. Die Protozoenanzahl sank unter Einfluss von Schadsilagen.

GAST 2010

Einfluss auf den Eiweißstoff- wechsel

Die Ammoniakgehalte in den Fermentern mit Schadsilagen waren erhöht, wobei die Gesamt- konzentration der freien Aminosäuren und das bakterielle Protein nur geringe Abweichungen zeigten. Es wurde ein erhöhter Stickstoff-Turnover vermutet. Eine höhere Aktivität von aminosäure- fermentierenden Bakterien wurde beobachtet.

GRESNER 2011

Einfluss auf den Kohlenhydrat- stoffwechsel

Die Gehalte der flüchtigen n- und i-Butter- bzw.

Valeriansäure sowie der Hexansäure stiegen im Vergleich zur Fermentation von Kontrollsilagen in den Schadsilagefermentern deutlich an. Die energetisch wichtige Essig- und Propionsäure waren jedoch nur wenig erhöht. Es konnte eine Verschiebung des Fettsäurefermentationsmusters aufgezeigt werden.

Die Essig- und Propionsäureergebnisse ließen vermuten, dass die beschriebene Abmagerung der Rinder (EICKEN, 2005b) nicht Ursache eines Energiemangels ist.

LUMPP 2011

4

Fortsetzung Tab. 2.1

Thema Ergebnis Literatur

Einfluss auf Aminosäuren und biogene Amine

Beobachtet wurde eine Veränderung der Amino- säuremuster bei der Fermentation von Schadsilagen gegenüber der Kontrollsilagen (Analyse mittels FMOC-Chlorid-Derivatisierung). Die Gehalte von γ- Aminobuttersäure (GABA) waren sowohl in den Futterproben der Schadsilagen (Analyse durch EVONIK Nutrition & Care GmbH), als auch in der Fermenterflüssigkeit im RUSITEC deutlich erhöht gegenüber den jeweiligen Kontrollen. Die biogenen Amine (Agmatin, Citrullin, Indolessigsäure, Histamin, und Serotonin) unterschieden sich nur gering zwischen Kontroll- und Schadsilagezusatz in den Fermentern.

THEERMANN 2011

Einfluss auf den Gehalt bislang nicht

identifizierter Substanzen

Sechs verschiedene, unbekannte Substanzen, die sich durch die Fermentation von auffälligen Gras- silagen im RUSITEC anreicherten, wurden charak- terisiert. Substanz 6 konnte ÖZMEN (2014) als 3-Phenylpropionsäure identifizieren.

WICHERN 2011

Einfluss von Clostridien- zugaben auf die Fermentation von Grassilagen

In vitro konnten proteolytische Clostridien durch eine Verschiebung des Pansenmilieus und der Bakterien- flora bei Einsatz von Grassilagen mit niedrigem Rein- eiweißgehalt im Pansen länger verweilen. Die Am- moniakkonzentration war während der Clostridien- zulage in der Fermenterflüssigkeit erhöht.

IRLE 2011

Erkenntnisse aus den vorherigen Studien lassen folgendes annehmen:

Eine Populationsverschiebung der Bakterien (Näheres s. GAST 2010) könnte sich aufgrund der Symbiose von Wiederkäuer und Pansenflora in vivo negativ auf die Gesundheit des Tieres auswirken und vermutlich durch einen erhöhten Stickstoff- turnover (GRESNER 2011; IRLE 2011; GRESNER et al. 2015) zu einer Beein- trächtigung der proteo- und peptidolytisch aktiven Spezies im Pansen führen. Auch die festgestellte Verschiebung der flüchtigen n- bzw. i-Fettsäuren (LUMPP 2011; GÖRES 2016) – letztere entstehen durch die Desaminierung von freien Aminosäuren und waren in den Schadsilagen erhöht – sowie die Verschiebung des Aminosäuremusters (THEERMANN 2011; GRESNER et al. 2015) könnten somit erklärt werden. Diese Verschiebungen werden als mögliche Ursachen des Krankheitsbildes angesehen.

ÖZMEN (2014) veröffentlichte in ihrer Dissertation neue Erkenntnisse zur Biosynthese und Degradation sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe in der Rinderernährung. In ihren Untersuchungen wurden in Grassilagen vor allem Flavone, Flavonole, Isoflavone, Phenolsäuren, Aminosäuren und ein biogenes Amin (Histamin) mittels Auftrennung durch RP-HPLC und LC-ESI-MS/MS identifiziert. Von den zuvor bei WICHERN (2011) untersuchten unbekannten Substanzen konnte Substanz 6 als 3-Phenylpropionsäure identifiziert werden (ÖZMEN 2014). Die Stoffwechselwege der Flavonoide wurden für die unterschiedlichen Zusammensetzungen der verschiedenen Grassilagen ausgearbeitet und es konnte ein Zusammenhang zwischen den Grassilagen, ihren Reineiweißgehalten und sekundären Pflanzeninhaltsstoffen hergestellt werden (ÖZMEN 2014).

5 2.2 Eigenschaften der Polyamine und Amine

Polyamine und Amine sind in erster Linie Ammoniumverbindungen, die eine oder mehrere Ammoniumgruppen enthalten und deren Rest eine unterschiedliche Struktur haben kann. Polyamine sind langkettige polyvalente Kationen (pH-abhängig), die aufgrund ihrer Ladung sehr reaktiv sind und unter anderem durch Bindung an Proteine und Nukleinsäuren vielfältige Funktionen im Zellstoffwechsel einnehmen. Neben der aliphatischen Kettenstruktur können auch aromatische Ringstrukturen bei Aminen (z.B. Tyramin) oder Alkoholgruppen (z.B. Ethanolamin) auftreten. Monoamine besitzen nur eine Ammoniumgruppe, die anhängig von der Grundstruktur unterschiedlich reaktiv sein kann. Je nach Anzahl der Ammoniumgruppen werden bei den aliphatischen Polyaminen Di-, Tri-, Tetra,- Penta- und Hexamine unterschieden (COHEN 1998a). Für die in dieser Dissertation betrachteten aliphatischen Polyamine gilt folgende Einteilung:

• Diamine

1. Cadaverin H2N(CH2)5NH2

2. Putrescin H2N(CH2)4NH2

• Triamine

3. Spermidin H2N(CH2)3NH(CH2)4NH2

4. Norspermidin H2N(CH2)3NH(CH2)3NH2

• Tetraamine

5. Spermin H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2

6. Norspermin H2N(CH2)3NH(CH2)3NH(CH2)3NH2

7. Thermospermin H2N(CH2)3NH(CH2)3NH(CH2)4NH2

Aufgrund der Ionisierbarkeit von Aminen, welche durch die Ammoniumgruppen bedingt ist, besteht eine pH-Abhängigkeit für die Wasserlöslichkeit dieser Stoffe. Im Pansen liegt der physiologische pH-Wert bei 5,5–7,5 (VON ENGELHARDT et al.

2015). Die meisten aliphatischen Polyamine sind wasserlöslich (s. Tab. 3.9). Die Eigenschaften der am Polyaminmetabolismus beteiligten Enzymsysteme zeigen eine breite pH-Toleranz mit Aktivität bei pH-Werten von pH 1,4–11 (s. Tab. 2.7).

Zudem bedingen die Ammoniumgruppen eine hohe Alkalität der Stoffe. Die Kb-Werte (Kb = Basenkonstante bzw. Maß der alkalischen Reaktion von Stoffen) von aliphatischen Polyaminen liegen bei 10^-3 bis10^-4 mol/l und sind damit 50–100fach stärker als der von Ammoniak (Kb 1,8 x 10^-5 mol/l). So neigen gerade Polyamine im alkalischen Milieu zur Abgabe von Protonen, was zur Bildung von freien Aminen führt, während sie im sauren Milieu als reaktive Kationen vorliegen (COHEN 1998a).

Es ist also anzunehmen, dass die im Pansen vorkommenden Amine bei gut angepasster Fütterung als wasserlösliche Kationen auftreten. Zudem ist eine Proteinbindung im Pansen wahrscheinlich.

Durch die oben genannten Eigenschaften, die gegebene Stereochemie und die schnelle Veränderung des Pansenmillieus ist eine entsprechend hohe Reaktivität der Amine im Pansen denkbar. Bekannte Reaktionen von Aminen sind die Alkylierung, die Bildung von salpetriger Säure und die Bildung von Amiden durch Acetylierung.

Darüber hinaus ist die Oxidation im Polyaminstoffwechsel eine der relevantesten

6

Reaktionen, die einerseits zu toxischen Abbauprodukten führt, andererseits auch eine antioxidative Schutzfunktion für Proteine darstellt (BOUCHEREAU et al. 1999;

KUSANO et al. 2008; TAVLADORAKI et al. 2012).

2.2.1 Amin- und Polyaminmetabolismus in der Pflanze

Amine und Polyamine haben Kernfunktionen in der Regulation von Wachstum und Entwicklung, in der Stressantwort bei biotischem und abiotischem Stress, beim Schutz vor freien Radikalen, bei der Stomatabewegung und in der Signalkaskade von Pflanzen (s. Tab. 2.2).

Tab. 2.2: Zusammenfassende Literatur zum Polyaminstoffwechsel in der Pflanze

Polyamine Thema Literatur

Cadaverin Putrescin Spermidin

Spermin

Polyaminbiosynthese, -katabolismus und -regulation in höheren Pflanzen unter

Stresseinwirkung – osmotischer Stress,

Salzstress, Hypoxie, Schadstoffbelastung und Funktion der Enzyme ADC und ODC¹

BOUCHEREAU et al. 1999

Cadaverin Putrescin Spermidin

Spermin

Polyaminbiosynthese und -oxidation in Pflanzen, Vorkommen von ungewöhnlichen Polyaminen, Alkaloidbildung und Konjugation von Polyaminen an Amide, Hydroxyzimtsäuren

und Proteine

BAGNI u.

TASSONI 2001

Cadaverin Putrescin Spermidin

Spermin

Polyamine in der Regulation von pflanzlichem Stress (oxidativer u. osmotischer Stress), Stresstoleranz und Adaptation, sowie Funktion

als Second Messenger

KUZNETSOV et al. 2006 Norspermidin

Norspermin Putrescin Spermidin

Spermin

Funktionen von Aminoxidasen während der Entwicklung und bei Pathogenabwehr in Pflanzen, Signalkaskaden zur Bildung von

H2O2 und Polyaminregulation durch Lichteinfluss

CONA et al.

2006

Cadaverin Putrescin Spermidin

Spermin Thermospermin

Essentielle Polyamine für Pflanzenwachstum und Überlebensstrategien bei Stresseinflüssen (Säuren, oxidativer Stress, osmotischer Stress, neuronaler Stress und Pathogenbefall) sowie

Regulation von Ionenkanälen

KUSANO et al.

2008

Putrescin Spermidin

Bildung von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus Polyaminen (Putrescin u. Spermidin), Darstellung der beteiligten Enzyme (u.a. HSS)²

OBER u.

KALTENEGGER 2009 Putrescin

Spermidin Spermin

Transgen erreichte biotische und abiotische Stresstoleranz in Pflanzen sowie Mechanismen der Stresstoleranz induziert

durch Polyamine

HUSSAIN et al.

2011

1 Arginin- bzw. Ornithin-Decarboxylase

2 Homospermidin-Synthase

7

Fortsetzung Tab. 2.2

Polyamine Thema Literatur

Cadaverin Putrescin Spermidin

Spermin Thermospermin

Pflanzliche Abwehr bei biotischem Stress durch Mikroorganismen –

Proteinstabilität durch Polyamine sowie Signalkaskaden durch Polyaminabbau

(Jasmonsäure, H2O2)

JIMÉNEZ- BREMONT et al.

2014 Putrescin

Spermidin Spermin Thermospermin

Polyamine im Lebenszyklus der Pflanzenentwicklung und bei Stress, Genmodulation, Alkaloidbildung (Pyrrolizidin- und Tropanalkaloide) und Zellspezialisierung

TIBURCIO et al.

2014

Putrescin Spermidin

Spermin Thermospermin

Polyamine und ihre Enzyme in der Pflanze sowie beteiligte Gene –

Signaltransduktion und Induktion von H2O2 bei Wachstum und abiotischem Stress (osmotischer Stress, Trockenheit, Frost, Hitze,

Oxidation)

MATTOO et al.

2015

Norspermidin Norspermin

Putrescin Spermidin

Spermin

Übersicht zur Toleranz von abiotischem Stress in Pflanzen, beteiligte Enzymsysteme und Funktionswege der Polyamine in transgenen

Pflanzen

PATHAK et al.

2015

Pflanzen reagieren auf Stress innerhalb von drei Stunden mit einem Anstieg der zur Polyaminsynthese relevanten Aminosäuredecarboxylasen (ADC = EC 4.1.1.19 und ODC = EC 4.1.1.17; YOUNG u. GALSTON 1983; GALSTON u. SAWHNEY 1990). Ein Überschuss an Kalium kann mit einer Akkumulation von Spermidin in Verbindung gebracht werden, während ein Kaliummangel zu instabilem Protein und infolgedessen zu einem Anstieg der freien Aminosäuren und Akkumulation von N-Verbindungen und Putrescin in den pflanzlichen Zellen führt (COHEN 1998b). Exogen zugeführtes Ammonium führt ebenfalls zu einem Anstieg der freien Polyamine (COHEN 1998b).

Auch unter Sauerstoffmangel tritt eine Akkumulation von Putrescin auf (REGGIANI et al. 1989). Zudem kommt es bei physiologischen Wachstumsprozessen in Pflanzen zu einem Anstieg der Polyamine (RAMAKKISHNA u. ADIGA 1975; TAKAHASHI u.

KAKEHI 2010).

Zunehmend werden längerkettige, sogenannte ungewöhnliche Polyamine (Thermospermin, Homospermidin) in Pflanzen identifiziert, die ebenfalls mit in die Funktion von Wachstum und Entwicklung in Pflanzen eingebunden sind (RODRIGUEZ-GARAY et al. 1989; GALSTON u. SAWHNEY 1990; HAMANA 1992;

BAGNI u. TASSONI 2001; NAKA et al. 2010; TAKAHASHI u. KAKEHI 2010).

OSHIMA (1979) beschrieb die Substanz Thermospermin zum ersten Mal in extrem thermophilen Bakterien der Gattung Thermus thermophilus in einer heißen Quelle.

Später konnten BAGGA et al. (1997) in stresstoleranter Luzerne (Medicago sativa) unter anderem verschiedene komplexe Polyamine und Thermospermin nachweisen.

Zudem konnten unterschiedliche Gene für die Thermosperminsynthase in der Schotenkresse (Arabidopsis thaliana) identifiziert werden und es wurde entdeckt, dass der Stoff für das Längenwachstum vonnöten ist (KNOTT et al. 2007; KAKEHI et al.

2008).

8

Gerade pflanzlicher Stress induziert die Bildung von Polyaminen (MATTOO et al.

2015). Diese Stressinduktion kann auch beim Silierungsprozess durch den Gras- schnitt, den Wasserentzug und die Erwärmung während der Milchsäuregärung entstehen. Bei Verletzung der pflanzlichen Kutikula werden die Gene zur Polyaminsynthese innerhalb einer Zeit von 30 Minuten bis zwei Stunden hochreguliert und infolgedessen steigen die Polyamingehalte innerhalb von zwei bis zehn Stunden deutlich an, was die schnelle Reaktion in der Stoffwechselkaskade von Aminen verdeutlicht (PEREZ-AMADOR et al. 2014).

Entsprechend sind auch in den auf Ertrag gezüchteten Futterpflanzen (u.a. Gras und Mais) Wirkungen der Polyamine bei pflanzlichem Stress und Wachstum zu erwarten.

Bisher sind Amingehalte in Mais und Gras vornehmlich zum Vergleich mit in Silagen bestimmten Gehalten ermittelt worden (s. Tab. 2.3). So analysierten KRÍŽEK (1993), GERENDÁS (1995), WINTERS et al. (2001), PIETRZAK et al. (2002), STEIDLOVÁ und KALAČ (2003), KRIZSAN und RANDBY (2007) sowie SCHERER et al. (2015) die Gehalte von Aminen in Gras-, Mais- und Grünhafersilagen. Dabei konnte heraus- gestellt werden, dass Amine auch in qualitativ hochwertigen Grassilagen vorkommen (KRÍŽEK 1993; KRIZSAN u. RANDBY 2007). Zudem könnte nach SCHERER et al.

(2015) ein Zusammenhang zwischen dem TS-Gehalt von Silagen und dem Vorkommen von Aminen vermutet werden. Die unterschiedliche Messtechnik und Probenaufbereitung jedoch macht den Vergleich der Amingehalte in Abhängigkeit von der Trockensubstanz schwierig (s. Tab. 2.4). Heu weist zum Vergleich Polyamingehalte von etwa 38 mg/kg TS Cadaverin, 20 mg/kg TS Putrescin und 2 mg/kg TS Spermin auf (PHUNTSOK et al. 1998).

Tab. 2.3: Amingehalte in Futterpflanzen bzw. Silagen [mg/kg TS bzw. ^*nmol/l]

Pflanze Cadaverin Putrescin Spermidin Spermin Tyramin Literatur Zea

mays – 150–480^* 180–230* 50* – GERENDÁS

1995 Lolium

perenne 6 80 42 15 – VAN OS

et al. 1996

Festolium 1260 4610 – – 1670 NISHINO et

al. 2007 Zea

mays 4180 1100 – – 7430 NISHINO et

al. 2007

* Angabe in nmol/l

Tab. 2.4: Amingehalte in Grassilagen [g/kg TS] bei unterschiedlichen TS-Gehalten TS

[g/kg]

Cada-

verin Putrescin Sper- midin

Sper- min

Tyra- min

γ-Amino- butter-

säure

Literatur

178 5410 3730 – – 2680 –

KRIZSAN u.

RANDBY 2007

200 2559 2138 – 1 2115 – VAN OS et

al. 1996

206 1190 880 – – 1380 70 DAWSON u.

MAYNE 1996

9

Fortsetzung Tab. 2.4 TS

[g/kg]

Cada-

verin Putrescin Sper- midin

Sper- min

Tyra- min

γ-Amino- butter-

säure

Literatur

213 1210 950 – – 1760 –

KRIZSAN u.

RANDBY 2007

213 1400 1400 – – 1500 – KRIZSAN

et al. 2012

256 2320 860 – – 2000 OLT et al.

2004

500 220 83 1 1 99 – VAN OS et

al. 1996

n.d. 3987 2953 0 12 – – PHUNTSOK

et al. 1998

n.d.^* 591 551 26,8 15,7 – – KRÍŽEK 1993

n.d. 21,7–

148 18,2–71,4 – – 36,8–

155

131–

>200 COLE 1992

n.d.^** 338 199 26,7 6,6 – – KRÍŽEK 1993

n. d. = nicht näher definiert

* Grassilage unter Laborbedingungen

**Silage aus Kleegras unter Laborbedingungen siliert

Schließlich kann aus der Literatur gefolgert werden, dass vor allem Polyamine essentiell für das Wachstum und die Initiation verschiedenster Mechanismen, wie Stressresistenz, Abwehr von Herbivoren und Initiation von Signalkaskaden in Pflanzen sind. Ihre schnelle Regulation kann erhebliche Akkumulationsmöglichkeiten von Polyaminen in der Pflanze hervorrufen. Darüber hinaus gelangen die Stoffe durch die Futteraufnahme in entsprechenden Mengen in den Pansen. Unter bestimmten Bedingungen sind somit negative Effekte durch die Polyaminaufnahme auf Herbivoren denkbar.

2.2.2 Amin- und Polyaminmetabolismus im Pansen

Die Entwicklung der Untersuchung von Aminen und Polyaminen im Pansen ist stark mit der zunehmenden Technik zur Konservierung von Futtermitteln assoziiert. Zu Beginn konzentrierten sich die Untersuchungen auf Histamin als potentielles Agens in der Pathogenese der Pansentympanie (SHINOZAKI 1957). In folgenden ruminalen

10

Infusions- und Fütterungsstudien konnten verschiedene Effekte des Aminzusatzes herausgestellt werden (s. Tab. 2.5).

Tab. 2.5: Effekte von Amin- und Polyaminzusätzen und Futtermitteln bzw. der physiologischen Pansenentwicklung auf den ruminalen Amingehalt, die Pansenfermentation und das Tier

Amin Ration bzw.

Menge Appl. Tier Effekt Literatur

Histamin Tyramin Tryptamin

Induzierte Azidose durch Glukose

11 g/kg KM Glukose (Glc.:Casein

90:10)

i. rum. Schaf

Induzierte Azidose Anstieg der Amine erst während der Regeneration des

pH-Wertes (> 8 h nach Azidoseinduktion)

IRWIN et al. 1979

Putrescin GABA

6 g/kg KM

24 g/kg KM i. rum. Rind

ggr. reduzierte Futteraufnahme bei

Kombination von Putrescin und

GABA

COLE 1992

Putrescin 100 g/Tier/Tag i. rum. Rind Reduzierte Futteraufnahme

LINGAAS u.

TVEIT 1992

Putrescin Tyramin

GABA

Je 2, 4 bzw.

6 g/kg TS im Futter

i. rum. Rind

Futteraufnahme unbeeinflusst, pH-Anstieg im Pansen durch Tyr., Propionsäuregehalt reduziert bei GABA-

Infusion, Valeriansäure-

produktion gesteigert durch

Tyr.

DAWSON u.

MAYNE 1996

Cadaverin Putrescin

Tyramin

0,3–1,9 g/kg TS 0,3–1,9 g/kg TS 0,7–3,7 g/kg TS

im Futter

p. os Schaf

Adaptation der Futteraufnahme und Pansenflora an

Amingehalte durch Vorbereitungs fütterung (erhöhter

Abbau der Amine, bessere Futteraufnahme)

VAN OS et al. 1997

Cadaverin Putrescin

Spermin

2,95 g/kg TS 3,99 g/kg TS 0,012 g/kg TS

im Futter

p. os Rind

reduzierte Motilität im Pansen und

infolgedessen reduzierte Futteraufnahme mikrobielle Nutzung

der Amine

PHUNTSOK et al. 1998

11

Fortsetzung Tab. 2.5

Amin Ration bzw.

Menge Appl. Tier Effekt Literatur Putrescin

Spermidin Spermin

Analyse der Gehalte während

der Pansen- entwicklung Tag 0–160 p.p.

(Epithel u. Lumen)

– Schaf Ziege

Verletzung der Pansenwand steigert die ODC,

trotzdem wenig ruminale Absorption der PA

ELIASSEN u.

SJAASTAD 2000

Histamin

Induzierte Azidose durch HCL-Zusatz 80 µmol/l Hist. in Pansenflüssigkeit

in vitro

Ov.

Pan- sen- epi- thel

Induzierte Azidose Azidose erhöht die

Absorption von Histamin

ASCHENBACH u. GÄBEL 2000

Cadaverin Putrescin Spermidin

1,4 g/Tier/Tag (Reindosis vs.

Futterzusatz)

p. os Ziege

Reindosis führte zu Reduktion d.

Körpermasse, erhöhten Tropf- und Farbverlusten

des Fleisches, entzündliche Veränderungen im

GI-Trakt*

FUSI et al.

2004

Histamin Methylamin

Putrescin Tryptamin Tyramin

Induzierte Azidose durch 40 vs. 70 %

Konzentrat in der TS im Futter

p. os Rind

Induzierte Azidose Anstieg der Amin-

konzentrationen 2–6 h nach Azidoseinduktion (Hist.< Methylam., Put., Trypt. < Tyr.)

WANG et al.

2013b

Methylamin Putrescin

Gerstezusatz 0, 15, 30 bzw.

45 % der TS im Futter

p. os Rind

Anstieg der Amine durch höhere Konzentratgehalte

SALEEM et al.

2012

Cadaverin Putrescin

Tyramin

Sojaproteinzusatz je 2 g Mischung Sojaprotein/Stärke 0:0, 10:0, 7:3, 3:7,

10:0

in

vitro Rind

Nachweis von Put.

und Cad. bei Sojazusatz 10:0 u.

7:3 in vitro (48 h Inkubation)

JEONG et al.

2015

Histamin Methylamin

Putrescin Tryptamin Tyramin

Azidosepufferung:

Natriumbicarbonat 0 vs. 70 mg/kg

Substrat

in

vitro Rind

Reduktion der Aminbildung nach

12 bis 16 h Inkubation in vitro

durch NaHCO3- Zusatz (Methylam. nach

8 h reduziert) kein Effekt bei

Hist. In 24 h

MAO et al.

2016

* Gastro-Intestinal-Trakt

12

Die Aufklärung der Pansentympanie war der Beginn der Untersuchungen zu Aminen im Pansen. Für Histamin konnte keine Verbindung zur Pansentympanie hergestellt werden; vielmehr wurde entdeckt, dass neben Histamin auch Methylamin und Tyramin im Pansen durch mikrobielle Fermentationsvorgänge bzw. Aminosäuredecarboxy- lierung entstehen und dass Histamin bei intaktem Pansenepithel nicht gut absorbiert wird (SHINOZAKI 1957).

Aus der vorliegenden Literatur ist ersichtlich, dass Amine mehrfach mit einer Reduktion der Futteraufnahme in Verbindung gebracht werden (COLE 1992; LINGAAS u. TVEIT 1992; VAN OS et al. 1997; PHUNTSOK et al. 1998).

Bei Induktion von akuten und subakuten Pansenazidosen kommt es nachweislich zu einem Anstieg der Amingehalte im Pansen bzw. in der Pansenflüssigkeit in vitro (IRWIN et al. 1979; WANG et al. 2013b). MAO et al. (2016) konnten zudem zeigen, dass die Pufferung des ruminalen pH-Wertes in vitro zu einem geringeren Anstieg der Amingehalte führt, im Vergleich mit pH-Werten im Bereich von subakuten Pansen- azidosen (pH 5,2–5,8).

Auch die mikrobielle Metabolisierung von Aminen im Pansen konnte durch VAN OS et al. (1997) sowie PHUNTSOK et al. (1998) bestätigt werden.

Dies lässt eine entsprechende Verschiebung bzw. Erhöhung des Amin- und Polyamin- stoffwechsels bei der Fermentation von Grassilagen mit reduziertem Reineiweißgehalt vermuten, die durch konzentratreiche Fütterung und Proteinzusatz bzw. Beeinflussung des Proteinstoffwechsels der Mikroflora noch gesteigert werden könnte.

Zudem ist bekannt geworden, dass eine Absorption von Aminen aus dem Pansen nur in sehr geringem Umfang stattfindet, die Pansenwand jedoch durch die vorkom- menden Aminosäuredecarboxylasen in der Lage ist, Polyamine zu synthetisieren (ELIASSEN u. SJAASTAD 2000). Eine Synthese der Amine findet vor allem bei Schädigung des Epithels und bei physiologischen Entwicklungsprozessen statt (ASCHENBACH u. GÄBEL 2000; ELIASSEN u. SJAASTAD 2000).

Auch konnten in der Literatur für Amine in hohen Dosen (> 1,4 g pro Tier und Tag) bei Ziegen toxische Effekte nachgewiesen werden (FUSI et al. 2004, s. Tab. 2.5), deren potentielle Dosis es im Folgenden zu bewerten gilt.

In Abbildung 2.1 ist die Beeinflussung der Polyamine im Pansenstoffwechsel durch zugeführte Futtermittel, ruminale Mikroorganismen, Passage und in geringem Umfang Absorption dargestellt.

13 Cadaverin Putrescin Spermidin Spermin Futter

Proteolyse Aminosäuren Polyamine

Absorption

Epithelintegrität

pH

Passage

Biosynthese Amino- säuren Protein

Katabolismus

Abb. 2.1: Einflüsse auf den Polyamingehalt im Pansen

14 2.2.3 Amine und Bakterien

In einem Milliliter Pansensaft kommen rund 10–50 x 10¹² Bakterien, 10⁶ Protozoen und etwa 100.000 Hefen und Pilze vor (SALEEM et al. 2013). Diese Zahlen und die Vielfalt der Organismen und ihrer Relation zueinander verdeutlichen die enormen Möglich- keiten des Pansens, sich an unterschiedlichste Futtermittel anzupassen und erklären, warum bisher nur Bruchteile über die mikrobielle Pansenflora bekannt sind.

Im Zusammenhang mit verschiedenen Studien zu Aminen im Pansen konnte die Mikroflora bereits als wichtige Komponente des Aminmetabolismus bestätigt werden (COLE 1992; DAWSON u. MAYNE 1996; PHUNTSOK et al. 1998; WANG et al. 2013b;

GRESNER et al. 2014). In den Untersuchungen von KUSANO et al. (2008) zur Relevanz von Polyaminen für das Wachstum in Mikroorganismen, Pflanzen und Säugetieren sind die betreffenden Stoffwechselwege für Mikroorganismen beschrieben und es wird aufgezeigt, dass im Unterschied zu pflanzlichen oder Säugetierzellen keine direkte Synthese von Spermidin zu Spermin und umgekehrt möglich ist. Demnach kann ein entsprechender Polyaminmetabolismus auch in der ruminalen Mikroflora angenommen werden. Eine Zusammenfassung der bisherigen Erkenntnisse zum Stoffwechsel von Aminen durch die ruminalen und intestinalen Mikroorganismen findet sich in Tabelle 2.6.

Tab. 2.6: Nachweis und Wirkung des Aminmetabolismus in ruminalen Bakterien

Amin Bakterium Nachweis bzw. Wirkung Literatur Putrescin

Cadaverin Bov. Bakterien

Arginin und Ornithin werden zu Polyaminen abgebaut, LDC ist bei saurem pH aktiver als ODC

LEWIS u.

EMERY 1962

Putrescin

Aerobacter Enterobacter Chromobacterium

Serratia Pseudomonas

Abbau von Putrescin durch mikrobielle Transaminase und

Diaminoxidase

MICHAELS u.

KIM 1966

Histamin Bov. Bakterien Decarboxylierung von L-Histidin im Pansen

IRWIN et al.

1979 Cadaverin

Putrescin S. ruminantium

PA sind essentielle Bestandteile der Peptidoglycanwand und

damit relevant für das Wachstum

KAMIO et al.

1986

Putrescin

GABA Bov. Bakterien Erste Bestätigung, dass ruminale Bakterien infundierte

Amine abbauen

COLE 1992 Glutamin

Methylamin Cadaverin

S. ruminantium

Stoffwechselwege von Aminen in Selenomonas und genetische Aufschlüsselung des Bakteriums

RICKE et al.

1996

Cadaverin Histamin Putrescin

Ov. Bakterien

Adaptierte ruminale Mikroflora baut bis zu 70 % der zugelegten

Amine in vitro in präferierter Reihenfolge ab:

Histamin > Tyramin > Putrescin

> Cadaverin

VAN OS 1997

15

Fortsetzung Tab. 2.6

Amin Bakterium Nachweis bzw. Wirkung Literatur Cadaverin S. ruminantium

Identifikation der LDC zur Synthese von Cadaverin im Peptidoglycan sowie Darlegung

der Kinetik des Enzyms

TAKATSUKA u.

KAMIO 2004

Agmatin Putrescin Spermidin

Spermin

Cl. sporogenes Cl. sticklandii

Sc. bovis Peptostreptococcus

spp.

S. ruminantium Veillonella spp.

Decarboxylierung von Aminosäuren führt zur Bildung

von Aminen im

Gastrointestinaltrakt und Pansen

DAI et al. 2011

Cadaverin Putrescin Spermidin

V. alcalescens V. parvula S. ruminantium

M. elsdenii A. lipolytica

Funktion und Bedeutung von Polyaminen für die

Zellwandintegrität von ruminalen Bakterien

KOJIMA u.

KAMIO 2012

Cadaverin Methylamin

Putrescin

Bov. Bakterien

Decarboxylierung von Arginin, Ornithin und Lysin und Freisetzung von Aminen unter

konzentratreicher Fütterung

SALEEM et al.

2012

Histamin Methylamin

Putrescin Tryptamin

Tyramin

Lactobacillus spp.

Sc. bovis

Induzierte, subakute Pansenazidose erhöht den Gehalt an Aminen im Pansen, der Gesamtgehalt an Bakterien

ist nicht beeinflusst

WANG et al.

2013b

Cadaverin Putrescin

Bov. Bakterien Ov. Bakterien HAP-Spezies

Erkenntnisse zu Abbauprodukten (Polyamine) aus dem Proteinstoffwechsel durch ruminale Bakterien

GRESNER et al.

2014 Histamin

Methylamin Putrescin Tryptamin

Tyramin

S. ruminantium Prevotella spp.

Durch Rationen minimal reduzierter ruminaler pH-Wert

führt zu einer Steigerung der Amingehalte im Pansen

ZHANG et al.

2014

Cadaverin Ethylamin Histamin Methylamin Phenylethyl-

amin Putrescin

Tyramin

S. ruminantium Selenomonas spp.

Bov. Bakterien

Zusatz von Sojamehl führt zu höheren Amingehalten im

Pansensaft in vitro

JEONG et al.

2015

Histamin Methylamin

Putrescin Tryptamin

Tyramin

Streptococcus spp.

Butyrivibrio spp.

Clostridien spp.

Ruminococcus spp.

Zusatz von Natriumbicarbonat zu Pansenflüssigkeit in vitro führt zu reduzierter Bildung von

Aminen und verringert die Streptococcus-Population

MAO et al. 2016

16

Aus der erhobenen Literatur ergibt sich ein noch unzureichender Überblick zum mikrobiellen Metabolismus von Aminen und Polyaminen im Pansen. Bisher ist lediglich die Bedeutung von Polyaminen in der Peptidoglycanwand einzelner Bakterienspezies geklärt. Dass Mikroorganismen an der Biosynthese und am Katabolismus von Aminen im Pansen beteiligt sind, konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Darüber hinaus begünstigt ein azidotischer pH-Wert die Bildung von Aminen durch ruminale Mikroorganismen. Um weitere Erkenntnisse zu gewinnen, müssen die Bakterien- spezies im Pansen vorerst genauer charakterisiert werden, wobei der starke Einfluss der Futterzusammensetzung bedacht werden sollte.

2.2.4 Enzymsysteme

Der Metabolismus von Aminen und Polyaminen in Pflanzen und Tieren ist sehr komplex und durch eine Kette von Enzymsystemen eng reguliert. Neben der Regulation der freien Polyamine durch die Biosynthese und den Katabolismus (s. Abb. 2.2 u. Abb. 2.3) wird der Gehalt auch durch Konjugation sowie Bindung an Ionenkanäle und nachfolgende Modulation selbiger zur Induktion von Stoffwechsel- kaskaden reguliert (CAI et al. 2014). Vielfältige Untersuchungen zu den Enzym- systemen existieren bereits in Pflanzen (s. Kap. 2.2.1), während beim Säugetier in erster Instanz Informationen zu den Enzymsystemen des Polyaminmetabolismus in verschiedensten Geweben herausgearbeitet wurden. Für Pansenmikroorganismen konnte bisher nur bei Selenomonas ruminantium ein Stoffwechselweg zum Einbau von Polyaminen in der Peptidoglycanwand herausgearbeitet werden (KAMIO et al. 1986;

KOJIMA u. KAMIO 2012; LIAO et al. 2014).

Die wichtigsten Enzymsysteme zur Polyaminsynthese und zum -katabolismus sind:

• Arginin-/Ornithindecarboxylase (ADC/ODC: EC 4.1.1.19/ EC 4.1.1.17)

• Spermidin-Synthase (SPDS: EC 2.5.1.16)

• Spermin-Synthase (SPMS: EC 2.5.1.22)

• Thermospermin-Synthase (TSPMS: EC 2.5.1.79)

• Norsperminsynthase (NSPMS: EC 2.5.1.126)

• Kupfer-Amin-Oxydase (CuAO: EC 1.4.3.21)

• Polyaminoxydase (PAO: EC 1.5.3.17)

• Spermin/Spermidin-N¹-Adenosyltransferase (SSAT: EC 2.3.1.57)

Aus der Enzymdatenbank BRENDA (BRaunschweig ENzyme DAtabase) wurden Informationen zu pH-Wert, Temperaturbereich und Vorkommen der Enzyme zusammengetragen (s. Tab. 2.7).

17

Tab. 2.7: Aktivitätsbereich der Hauptenzyme des Polyaminstoffwechsels

Enzym pH-Bereich Temperatur [°C] Vorkommen

ADC

(EC 4.1.1.19) 1,4–11 25–75^*

Maus, Ratte Pseudomonas spp.

S. ruminantium E. coli Bacillus subtilis Nicotiana tabacum

Oryza sativa

ODC

(EC 4.1.1.17) 4–9,5 22–65

Ratte, Maus, Mensch Lactobacillus spp.

Pseudomonas spp.

Saccharomyces spp.

Entamoeba histolytica Arabidopsis thaliana SPDS

(EC 2.5.1.16) 6,5–10,6 22–50^**

Rind E. coli Brassica spp.

Senecio spp.

SPMS

(EC 2.5.1.22) 7–8,1 37

Gehirn, Rind Diverse Organe, Mensch

Brassica spp.

TSPMS

(EC 2.5.1.79) 9,4–9,6 55

E. coli Thalassiosira spp.

Arabidopsis thaliana NSPMS

(EC 2.5.1.126) 7,5 95 Pyrubaculum aerophilum

CuAO

(EC 1.4.3.21) 5,6–10,2 25–40^*** Leber (Schwein, Ratte)

Arthrobacter aurescens PAO

(EC 1.5.3.17) 7–10 25–37 Maus

Arabidopsis thaliana SSAT

(EC 2.3.1.57) 6–9,1 25–45 Maus, Ratte, Mensch

Bacteroides subtilis

[Internet: URL: http://www.brenda-enzymes.org/] abgerufen am 02.08.2016

* Weitere thermophile Bakterien tolerieren bis zu 100°C

** In Thermotoga maritima bis 90°C (WU et al. 2007)

*** In Arthrobacter aurescens bis 55°C (LEE et al. 2002)

Allen Enzymen gemeinsam ist eine Umsetzung von Substrat in einem breiten Toleranzbereich der Temperatur und des pH-Wertes. Zudem wurden die Enzyme in verschiedensten Organsystemen nachgewiesen, sodass unterstellt werden kann, dass sie auch in der mikrobiellen Pansenflora sowie in der Pansenwand vorkommen.

Erste Erkenntnisse konnten ELIASSEN und SJAASTAD (2000) für die Enzyme ADC und ODC in der Pansenwand darlegen. Das erstlimitierende Enzym für den Polyaminmetabolismus in Pflanzen ist die ADC, während in Tieren und Pilzen die Limitation durch die ODC gegeben ist (TAKAHASHI u. KAKEHI 2010).