Alle im Verlauf dieses Kapitels beschriebenen Chemikalien und Verbrauchsmaterialien sind in Tabelle 9.1 detailliert aufgeführt. Die vorliegenden Untersuchungen sind Teil eines gemeinsamen RUSITEC-Verdauungsprojektes aus dem sechs Dissertationen hervorgehen (s. Tab. 3.1).
Tab. 3.1: Übersicht über Literaturschwerpunkte und Autoren der gemeinsamen RUSITEC-Versuche aus dem Pansenlabor der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Literaturschwerpunkt Autor/Jahr
Eigenschaften von Proteinen in Soja, Gras und
Raps GÖRES 2016
Abbau und Toxizität von Schadsubstanzen im
Pansen EBHARDT (in Vorbereitung)
Vorkommen von phenolhaltigen Substanzen in
Pansen und Labmagen HUNSCHE 2017
Auswirkungen von Grassilagen auf den
ruminalen Peptidstoffwechsel und die Bedeutung von Prevotella spp. sowie des Mikrobioms
ILLE 2017 Vorkommen, Wirkung und Stoffwechsel von
nicht-proteinogenen Aminosäuren SCHULTE (in Vorbereitung)
30 3.2.1 Herkunft der Proben
Die zu untersuchenden Proben setzen sich zum einen aus den Proben der verwendeten Kontroll- bzw. Schadsilagen (s. Tab. 3.2 u. Tab. 9.3) und zum anderen aus den Proben der RUSITEC-Fermenter nach der Inkubation zusammen, wobei flüssiger und fester Inhalt gleichermaßen gewonnen wurden. Die Probenanalyse der Grassilagen erfolgte aus Lagerungsgründen aus gefriergetrocknetem Material.
Eine Schadsilage wurde nach GAST 2010 als solche definiert, wenn der Quotient aus RE/Rp < 50 % beträgt und bei Fütterung derselben Tiere die beschriebene Krankheits-symptomatik (s. Kap. 1) zeigten. Eine Kontrollsilage hatte einen RE/Rp Quotienten
> 50 % und kann nicht mit Erkrankungen in Zusammenhang gebracht werden (GAST 2010). Um den Einfluss der Vegetation und des Standortes gering zu halten, wurden im Gegensatz zu den Forschungsprojekten von GAST (2010), GRESNER (2011), LUMPP (2011), THEERMANN (2011) und WICHERN (2011) zwei Betriebe ausgewählt, die sowohl eine Kontroll- als auch eine Schadsilage von den gleichen Nutzflächen bereitstellen konnten (s. Tab. 3.2). Aufgrund der vorherigen Unter-suchungen wurde die Nummerierung der Läufe und analog der eingesetzten Grassilagen bei Nummer 30 fortgesetzt, wobei ungerade Zahlen die Schadsilagen beziffern. Die Futtermittelanalysen der Grassilagen wurden mit anerkannter nasschemischer Analysemethode nach VDLUFA-Richtlinien im Institut für Tier-ernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die Bestimmung des Reineiweißgehaltes nach der BARNSTEIN-Methode (1900) gelegt. Um die Qualität der in den Versuchen eingesetzten Grassilagen möglichst wenig zu beeinflussen, wurden diese bis zum Fütterungseinsatz im RUSITEC tiefgefroren gelagert.
Tab. 3.2: Übersicht zur Bezifferung der eingesetzten Kontroll- bzw. Schadsilagen (Nährstoffgehalte s. Tab. 9.3)
Bezeichnung Einheit Kontrollsilage Schadsilage Laufblock I
L31–L34
Laufblock II L35–L38
Laufblock I L31–L34
Laufblock II L35–L38 Betrieb A Betrieb B Betrieb A Betrieb B
K-30 K-32 S-31 S-33
RE / Rp % 60,6 59,5 42,9 40,3
31 3.2.2 RUSITEC
Der RUSITEC (RUmen SImulation TEChnique) ist ein von CZERKAWSKI und BRECKENRIDGE (1977) entwickeltes Langzeitinkubationssystem zur Durchführung von Verdauungsstudien im Pansenmilieu (s. Abb. 3.1 u. Abb. 3.2).
Im Rahmen des Projektes wurden acht Läufe zu je 28 Tagen in zwei Laufblöcken (L31–L34 und L35–L38) durchgeführt. In jedem Lauf wurden gleichzeitig sechs Fermenter eingesetzt. Dabei gliederte sich der Lauf in eine Einlauf-, eine Kontroll-, eine Zulage- und eine Erholungsphase (s. Tab. 3.4). Gestartet wurde der RUSITEC an Tag null mit Kontrollsilage (s. Tab. 9.3) im ersten Futterbeutel sowie festem Panseninhalt (Futterbeutel 2) und Pansenflüssigkeit von einem kontrolliert gehaltenen, fistulierten Rind. Das Spendertier wurde täglich zweimal mit 5 kg (uS) Kontrollsilage und 800 g (uS) Kraftfutter (s. Tab. 9.5) sowie Heu ad libitum gefüttert. Tiefergehende Informationen zum Spendertier sind bei GÖRES (2016) beschrieben. In der sechstägigen Einlaufphase und der sich anschließenden Kontrollphase (über zwei Tage) wurden alle sechs Fermenter mit Kontrollsilage und Maisstärke als Kohlenhydratquelle (Fa. Cerestar Deutschland GmbH, Krefeld, Deutschland, Art.-Nr. 03402) „gefüttert“. Jeder Futterbeutel blieb während des Laufes für 48 Stunden im Fermenter, sodass pro Versuchstag je nur ein Futterbeutel ausgewechselt wurde.
Puffervorrats-behälter
Gas-beutel
Gas
Überstandsgefäß
Absperrhahn Flüssigkeits- und
Gasentweichung
Schlauchpumpe Elektromotor
Wasserbad 39 °C Fermenter
Innenbehälter mit Nylon-Futtersäcken Hubgestänge
Abb. 3.1: Schematischer Aufbau des RUSITEC nach BLANCHART et al. (1989) ergänzt
32
Nur der feste Panseninhalt von Tag null wurde bereits nach 24 h Fermentation ausge-wechselt.
Bis zur Kontrollphase an Tag sieben und acht stellte sich ein steady state im Fermentationssystem ein (CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977).
Während der sich anschließenden Zulagephase (zehn Tage) wurde die Schadsilage mit einem RE/Rp < 50 % (s. Tab. 9.3) anstelle der Kontrollsilage in den vier Testfermentern (TF) eingesetzt. Eine Zulage von Sojaprotein erfolgte entsprechend des Reineiweißdefizites in zwei der vier Testfermenter (TFmS; s. Abb. 3.2). Die zwei verbliebenen Fermenter liefen als Kontrollen weiterhin mit Kontrollsilage (KF;
s. Abb. 3.2).
Am Ende des RUSITEC-Laufes folgte eine zehntägige Erholungsphase, in der wieder Kontrollsilage und Maisstärke inkubiert wurden. In dieser Phase wurde anhand von Stoffwechselparametern (flüchtige Fettsäuren, Ammoniak, Gasvolumen und Gaskonzentration, pH-Werte und bakterielles Protein nach BRADFORD (1976)) überprüft, ob das System in der Lage ist, seinen Ausgangszustand wieder zu erlangen.
Die Bezeichnung und Nummerierung der Fermenter erfolgte analog zu ihrer Funktion und der Bezeichnung der eingesetzten Grassilage (s. Abb. 3.2 u. Tab. 3.4).
Um die Stoffwechselprodukte aus der Fermentation unter in-vitro-Bedingungen zu puffern wurde dem RUSITEC kontinuierlich eine Pufferlösung als Speichelersatz zugeführt. Die Pufferzusammensetzung des RUSITEC-Puffers (s. Tab. 3.3 u. Tab. 9.1) orientierte sich an den Untersuchungen zum Speichel von Wiederkäuern von McDougall (1948). Über 24 Stunden förderte eine Sechskanalschlauchpumpe (Type 103 29.41.BA, Fa. OLE DICH, Hvidovre, Dänemark) kontinuierlich 400 ml RUSITEC-Puffer in die RUSITEC-Fermenter. Ein Hubmotor (Type DM 90-60 Fa. Eickelbaum Elektromaschinen GmbH) sorgte mit acht Hüben pro Minute für die nötige „Motilität“
im RUSITEC-System.
Tab. 3.3: Zusammensetzung und Herstellung des RUSITEC-Puffers nach McDOUGALL (1948)
Lösung Zusammensetzung
A
49,0 g NaHCO3
46,5 g Na2HPO4 12•H2O
Ad 4950 ml ionenfreies Wasser (Seradest®)
B
47,0 g NaCl 57,0 g KCl
12,8 g MgCl2 6•H2O 5,3 g CaCl2 2•H2O
Ad 1000 ml ionenfreies Wasser (Seradest®)
Zu 4950 ml Lösung A werden 50 ml Lösung B mittels Pipette unter kontinuierlichem Rühren eingetropft.
33
Foto: GÖRES 2016
Abb. 3.2: Beladung und Betrieb des RUSITECS in der Zulagephase
Kontrolle (Fermenter 1 u. 2) = KF-30 bzw. KF-32 enthaltene Kontrollsilage (K-30 bzw. K-32) und Maisstärke;
Test 1 (Fermenter 3 u. 4) = TF-31 bzw. TF-33 enthaltene Schadsilage (S-31 bzw. S-33) und Maisstärke;
Test 2 (Fermenter 5 u. 6) = TF-31mS bzw. TF-33mS enthaltene Schadsilage (S-31 bzw. S-33), Maisstärke und Sojaprotein.
34
Tab. 3.4: Übersicht der Versuchsphasen und eingesetzten Futtermittel im RUSITEC Fermenter
Phase
KF-30 bzw. KF-32 2 Kontrollfermenter
TF-31 bzw. TF-33 2 Testfermenter
TF-31mS bzw.
TF-33mS 2 Testfermenter Beladung
Tag 0
500 ml flüssiger Panseninhalt + 200 ml RUSITEC-Puffer + 100 ml ionenfreies Wasser (Seradest®)
Futterbeutel 1: 80 g (uS) fester Panseninhalt + 2,6 g (uS) Maisstärke Futterbeutel 2: 10,5 g (TS) Kontrollsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke Einlaufphase
Tag 1–6 10,5 g (TS) Kontrollsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke Kontrollphase
Tag 7–8 10,5 g (TS) Kontrollsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke
Zulagephase Tag 9–18
10,5 g (TS) Kontrollsilage
+ 2,6 g (uS) Maisstärke
+10,5 g (TS) Schadsilage + 2,6 g (uS)
Maisstärke
+10,5 g (TS) Schadsilage + 2,6 g (uS)
Maisstärke + 0,33 g (uS)
Sojaprotein Erholungsphase
Tag 19–28 10,5 g (TS) Kontrollsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke
Bei diesem angewendeten Versuchsaufbau muss die Verschiebung des messbaren Zulageeffektes beachtet werden, d.h. der Einfluss der zugelegten Schadsilage vom Versuchstag neun ist in den gewonnenen Proben erst ab Versuchstag zehn messbar (s. Tab. 3.5).
35
35
Versuchsabschnitt Inhalt der Futterbeutel nach der täglichen Beladung
Beutel 0EinlaufphaseKPZulagephaseErholungsphase 1KKKKKKKKKZZZZZZZZZZKKKKKKKKKK 2PIKKKKKKKKKZZZZZZZZZZKKKKKKKKK Versuchstag012345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Messergebnis - PI KKKKKKKKKK ZZZZZZZZZZZ KKKKKKKKK 0: Beladungstag; KP: Kontrollphase; K (Kontrolle): Kontrollsilage + Stärke; PI: fester Panseninhalt vom Spendertier; Z (Zulage): Kontrollsilage + Stärke (KF), Schadsilage + Stärke (TF) bzw. Schadsilage + Stärke + Sojaprotein (TFmS); Der Pfeil zeigt beispielhaft die zeitliche Verschiebung der Auswirkung der Futterzulage auf das Messergebnis für Tag 0
Tab. 3.5: Beladungsschema und Verschiebung des messbaren Zulageeffekts durch den Probenentnahmezeitpunkt modifiziert nach LUMPP (2011)
36 3.2.3 Dauerbetrieb des RUSITEC
Die Reihenfolge der täglichen Arbeitsschritte am RUSITEC und ihr Zeitaufwand sind in Tabelle 3.6 erfasst.
Tab. 3.6: Zeitlicher Ablauf eines Versuchstages (modifiziert nach GAST 2010 u. LUMPP 2011) Abschnitt Zeit
[Min.] Arbeitsschritt
Vor- be- rei- tung -40 - Eichung des Gaschromatographen GC-8A (GÖRES 2016) 0 - Abschalten des RUSITEC-Systems (Pufferzufuhr, Hubmotor) 1 - Abkoppeln der Gasbeutel
Beladung
2–45
- Entnahme des ersten Fermenters aus dem Wasserbad und Öffnung
- Entnahme von 6 ml Fermenterprobe zur Bestimmung der FlFS-Konzentrationen
- Entnahme von 10 ml Fermenterprobe zur Polyamin- und Aminosäureanalyse
- Entnahme von 26 ml Fermenterinhalt für weitere Untersuchungen des Gesamtprojektes (s. GÖRES 2016; s. Tab. 9.2)
- Entnahme des seit 48 h im Fermenter inkubierten Futterbeutels - Einsetzen eines neuen Futterbeutels in den
RUSITEC-Innenbehälter
- Entleerung und Spülung des entnommenen Futterbeutels mit 50 ml vorgewärmtem RUSITEC-Puffer
- Rückführung der Spülflüssigkeit in den Fermenter
- Verschluss des Fermenters und Arretierung im Wasserbad - Wiederholung des Beladungsvorgangs an den Fermentern 2–6
Direktbestim- mung
2–122
- Bestimmung des Überstandsvolumens und Entnahme von 10 ml Überstandsflüssigkeit zur Bestimmung der FlFS-Produktion - Vorlegen von 40 ml verdünnter Salzsäure (18,5 %) (s. Tab. 9.1) in
die Überstandsgefäße
- Messung des Gasvolumens in den Gasbeuteln (GÖRES 2016) - Entnahme von 1 ml Gasprobe und Messung der
Gaszusammensetzung am Gaschromatographen (GC-8A) (GÖRES 2016)
Start
45 - Einschalten der Pufferzufuhr
45–60
- Begasung der Fermenter (je 1 Min.) mit CO2 (s. Tab. 9.1) - Anschließen eines leeren Gasbeutels direkt nach dem Begasen
des jeweiligen Fermenters - Einschalten des Hubmotors
Nachbe- reitung
60–
210
- Probenaufbereitung und Probenanalytik bzw. -asservierung (s. Kap. 3.2.4.5.6)
- Vorbereitung der Futtermittel und Bedarfsgegenstände für den folgenden Versuchstag
- Reinigungs- und Aufräumarbeiten
37 3.2.4 Analytik
Der RUSITEC ist ein semikontinuierliches in-vitro-System des Pansens, dass biologischen Schwankungen unterliegt. Daher müssen während der jeweiligen Versuchsläufe verschiedene Parameter zur Kontrolle und Überwachung des Systems erhoben werden, deren Messmethodik sich bereits in diversen Untersuchungen als geeignet erwiesen hat (s. Tab. 3.7). Teil dieser Arbeit war neben der Analyse von Aminen und Aminosäuren die Erfassung des Ammoniakgehaltes, der Überstands-menge und der Gehalte der flüchtigen i-Fettsäuren. Zudem wurden der pH-Wert, der Gehalt des bakteriellen Proteins (bestimmt nach BRADFORD 1976), das Gasvolumen und die Gaszusammensetzung gemessen (Parametereinteilung s. a. Tab. 9.2).
Die beobachteten Parameter sind sowohl Überwachungsparameter als auch beeinflusste Größen, die sich je nach Versuchsansatz verändern können. Zur Über-prüfung der Genauigkeit der Analyseverfahren wurde jeweils eigens der Variations-koeffizient (VK) bestimmt (s. Tab. 3.7).
Tab. 3.7: Literaturübersicht zu den Messverfahren der untersuchten Parameter im RUSITEC und ihre Evaluation
Parameter Messverfahren Einheit Literatur der
Messverfahren VK [%]
pH-Wert Elektrode pH ZIPORI 1989 0,59
Gasproduktion volumetrisch ml SCHIRMER 1990
Methan gaschromatogr. Vol.-% HÖLTERSHINKEN 1990 GÖRES 2016
0,30
Sauerstoff gaschromatogr. Vol.-% 3,59
Kohlenstoffdioxid gaschromatogr. Vol.-% 0,22
Stickstoff gaschromatogr. Vol.-% 2,57
Essigsäure gaschromatogr. mmol/l JENSEN 1973 RANFFT 1973
GEISSLER et al. 1976
2,261/0,512
Propionsäure gaschromatogr. mmol/l 0,851/0,442
i-Buttersäure gaschromatogr. mmol/l 1,121/0,472
n-Buttersäure gaschromatogr. mmol/l 1,001/0,562
i-Valeriansäure gaschromatogr. mmol/l 0,731/0,612 n-Valeriansäure gaschromatogr. mmol/l 0,781/0,632 Hexansäure gaschromatogr. mmol/l MAIWORM 1994 0,931/0,912
FlFS-Gesamt rechnerisch mmol/l 1,091/0,532
Überstand volumetrisch ml s. SCHIRMER 1990 Bakterielles
Protein photometrisch µg RSA/ml
BRADFORD 1976
MAIWORM 1994 4,98
Ammoniak Elektrode mmol/l
ZIPORI 1989
VK: Variationskoeffizient der Analysepräzision bestimmt in einer Serie von Standardmessungen (n=10)
1 in der Fermenterflüssigkeit; 2 im Überstand; Messtechnik s. Literaturstelle
3.2.4.1 Analyse der flüchtigen Fettsäuren (i-Säuren)
Die Analyse der flüchtigen Fettsäuren gliederte sich in flüchtige n-Fettsäuren, die vornehmlich aus dem Kohlenhydratstoffwechsel stammen (HÖLTERSHINKEN 1990;
38
GÖRES 2016) und flüchtige i-Fettsäuren, welche dem Proteinstoffwechsel zugeordnet werden (CARRO u. MILLER 1999; LUMPP 2011). Im Weiteren wird nur auf die flüchtigen i-Fettsäuren eingegangen, die übrigen, gemessenen flüchtigen Fettsäuren sind detailliert bei GÖRES (2016)beschrieben. Die Analyse aus dem Fermenterinhalt und aus dem Überstand wurde am Zweikanalgaschromatographen mit Flammen-ionisationsdetektor (Typ GC-9AM Fa. Shimadzu, Kyoto, Japan) durchgeführt (GEISSLER et al. 1976). Dabei wurde im Überstand die Produktion der flüchtigen i-Fettsäuren in 24 Stunden aus der gemessenen Konzentration [mmol/l] multipliziert mit dem Überstandsvolumen [l] (abzüglich der zugesetzten 40 ml 18,5 %ige Salz-säure) berechnet. Weitere Informationen zur Probenaufbereitung sind in den Dissertationen von GÖRES (2016) und LUMPP (2011) beschrieben. Die Ergebnisse beinhalten die Messwerte der einzelnen flüchtigen Fettsäuren und die rechnerisch aus den Einzelwerten bestimmte Summe der flüchtigen Fettsäuren (Näheres s. GÖRES 2016 bzw. Kap. 4.1).
3.2.4.2 Bestimmung des Ammoniakgehaltes
Die Ammoniakgehalte in den flüssigen Fermenterproben wurden mittels gassensitiver Ammoniakmesselektrode (Ammoniak-Analyzer 290A Fa. Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA, vormals Orion®) bestimmt. Dafür wurde das Gerät täglich direkt vor der Messung mit einer Ammoniumchloridlösung, aus der zwei verschiedene Standardlösungen in Konzentrationen von 10-2 bzw. 10-3 mol/l hergestellt wurden, geeicht (Näheres s. GRESNER 2011). Die Stammlösung (10-1 mol/l) für die Eich-lösungen wurde aus 2,67 g Ammoniumchlorid (s. Tab. 9.1) ad 500 ml Aqua bidestillata hergestellt und lichtgeschützt aufbewahrt. Näheres ist in der Dissertation von ZIPORI (1989) beschrieben. Zur Messung der Ammoniakgehalte wurden 5 ml flüssiger Fermenterinhalt gewonnen und mit 50 µl NaOH (10 mol/l) versetzt, um alle Ammoniumionen in neutrale Ammoniakmoleküle zu überführen. Anschließend konnte der Ammoniakgehalt mittels Elektrode erfasst werden.
3.2.4.3 Bestimmung der Überstandsvolumina
Die Überstandsvolumina wurden mit einem 1000 ml Standzylinder, in den die jeweiligen Fermenterüberstände überführt wurden, gemessen (LUMPP 2011). Die in den Überstandsgefäßen zum Stoppen der Fermentation zugesetzten 40 ml verdünnte Salzsäure (18,5 %) wurden abgezogen.
3.2.4.4 Datenverarbeitung der Aminosäureanalyse von gefriergetrockneten Grassilagen (EVONIK Nutrition & Care GmbH)
Um die Verteilung der Aminosäuregehalte von Grassilagen mit unterschiedlichen RE/Rp-Quotienten zu ermitteln, wurden die Daten der Aminosäureanalyse von 315 gefriergetrockneten Grassilagen (inkl. der im RUSITEC eingesetzten Grassilagen K-30, K-32, S-31 und S-33) grafisch mit Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft®) ausgewertet. Dabei wurden aufgrund der Beziehung zu Aminen in der Literatur die Gehalte der Aminosäuren Arginin, Glutamat, Lysin und Methionin sowie der Gehalt
39
des Abbauproduktes GABA erfasst. Die Ergebnisse zur Aminosäureverteilung in Grassilagen in Abhängigkeit vom RE/Rp-Quotienten wurden in der vorliegenden Dissertation erstmalig ausgewertet (s. Kap. 4.3 u. Kap. 4.4). Eine Varianz wurde nicht mitgeteilt.
Die Analyse der Grassilageproben wurde von EVONIK Nutrition & Care GmbH, Hanau, Deutschland mittels Totalaufschluss und Ninhydrin post-column Derivatisierung durch Ionenaustausch Chromatographie nach VDLUFA III, Methode 4.11.1 (ANON. 2009) durchgeführt.
3.2.4.5 Analyse der Amine, Polyamine und Aminosäuren mittels LC-MS/MS
Die Analyse der Amine, Polyamine und Aminosäuren in den flüssigen und den Feststoffproben des RUSITEC sowie in den eingesetzten gefriergetrockneten Gras-silagen fand in Anlehnung an die Dissertationen von GRESNER (2011), THEERMANN (2011), WICHERN (2011) und ÖZMEN (2014) an der LC-MS/MS statt. Bei der LC-MS/MS handelt es sich um eine Form der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit mehrfacher Massenspektrometrie, über die die stoffspezifischen Molekülmassen und ihre Teilfragmente genau charakterisiert werden können. Sie eignet sich zur Auftrennung und anschließenden qualitativen und quantitativen Analytik komplexer Substanzgemische (AL-HADITHI u. SAAD 2011).
Die mobile Phase des genutzten Systems setzte sich aus einem Gradienten mit zwei verschiedenen Laufmitteln zusammen, der zuerst die polaren und später die unpolaren Substanzen aus der stationären Phase löste. Eluent A für polare Stoffe bestand aus destilliertem Wasser + 0,1 % Ameisensäure (FA) und Eluent B für unpolare Substanzen aus Acetonitril + 0,1 % FA (HÄKKINEN et al. 2007; s.Tab. 9.1). Die Vermessung von Standards (s. Kap. 3.2.4.5.14 u. Kap. 3.2.4.5.17 sowie Tab. 9.1) wurde zur Charakterisierung der Chromatogramme und Identifizierung der klassischen Fragmente und der Retentionszeiten (Rt) der gesuchten Stoffe genutzt.
Dabei beschreibt die Retentionszeit die Dauer von der Probeninjektion bis zum Erfassen der Einzelkomponenten im Detektor. Je nach chemischer Eigenschaft (Größe, Ladung) der gelösten Substanzen im Probenmaterial kommt es zu unterschiedlichen Wechselwirkungen mit dem Säulenmaterial, die in stoffspezifischen Retentionszeiten resultiert. Danach wird die durch die Chromatographie aufgetrennte Probe im Massenspektrometer mit Elektronen aus einem Heizdraht beschossen.
Dabei ionisieren die Elektronen die Probenmoleküle und brechen Bindungen auf. Im MS-Detektor werden die Massen der entsprechenden Fragment-Ionen detektiert. Die Funktionsweise der genutzten LC-MS-Anlage ist auch in den Arbeiten von GRESNER (2011), WICHERN (2011) und ÖZMEN (2014) detailliert beschrieben.
3.2.4.5.1 Entwicklung der Methode zur Messung von Aminen
Für die Bestimmung von Aminen und Polyaminen aus Panseninhalt, Pflanzen oder fermentierten Lebensmitteln sind zahlreiche Methoden beschrieben (DAWSON u.
MAYNE 1996; BOUCHEREAU et al. 2000; MAYR u. SCHIEBERLE 2012). Da es sich bei Aminen bzw. Polyaminen um kleine, polykationische, wasserlösliche Moleküle handelt, neigen sie zur Bindung an negativ geladene Proteinmoleküle sowie an DNA und RNA (BERWANGER et al. 2010).
40
Für die Extraktion der Amine aus dem Probenmaterial wurden verschiedene Methoden aus der Literatur untersucht. Eine Übersicht zu den verschiedenen in der Literatur analysierten Matrizes, den erfassten Aminen und der Messtechnik enthält Tabelle 3.8.
Tab. 3.8: Literaturrecherche zu Extraktionsmethoden für Amine, Polyamine und Phenolverbindungen
Analyse-methode
Extraktions-methode Matrix Analyten Literatur
Homogenisierung2 in
Eluent A Grassilagen
u. a. sekundäre
Aqua bidestillata Kartoffeln Phenolamine CHONG et al. 2013 UV-HPLC Pufferextraktion
im Ultraschallbad Pflanzenmaterial
u. a. Putrescin,
10,2 µm Sterilfilter (Art. Nr. KC 90.1, Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Deutschland) 2 HomogenisatorMICCRA D9 40643 (MICCRA GmbH, Müllheim, Deutschland)
HPLC: High Performance Liquid Chromatography; MS: Mass Spectrometry; ESI: Electrospray-Ionisation; UHPLC: Ultra High Performance Liquid Chromatography; UV-HPLC: Ultraviolet-Detection High Performance Liquid Chromatography
3.2.4.5.2 Auswahl der erfassten Amine
Die Auswahl der als relevant erachteten Amine ergab sich aus der intensiven Literaturrecherche und beinhaltete sowohl Mono- als auch Polyamine (s. Kap. 2.1), die in Pflanzen und damit potentiell in Futtermitteln vorkommen. Die alphabetische Auflistung der recherchierten und messtechnisch in diversen Vorversuchen untersuchten Stoffe findet sich in Tabelle 3.9 (Homospermin wurde aufgrund von Lieferungsschwierigkeiten messtechnisch nicht analysiert).
41
Tab. 3.9: Amine im Pflanzenstoffwechsel Name Chemischer AufbauMolare Masse [g/mol]Synonyme Eigenschaften Literatur β-Alanin CAS-Nr. 107-95-989,093-Amino-Propionsäure, 3-Amino-Propansäure Schmelzpunkt 200°C, wasserlöslich
CONA et al. 2006; JIMÉNEZ- BREMONT et al. 2014 Agmatin CAS-Nr. 306-60-5130,192-(4-Amino-butyl)- guanidin Schmelzpunkt 101,5–103°CBASSARD et al. 2010 Cadaverin CAS-Nr. 462-94-2102,18 Pentamethyldiamin, 1,5-Diaminopentan
Schmelzpunkt 9°C, wasserlöslich, alkohollöslich
KUSANO et al. 2008 Ethanolamin CAS-Nr. 141-43-561,08
Aminoethanol, Aminoethylalkohol, Colamin, Olamin Schmelzpunkt 10°C, Siedepunkt 172°C, wasserlöslich, ethanollöslich
BOUCHER- EAU et al. 2000 Histamin CAS-Nr. 51-45-6111,152-(1H-Imidazol-4-yl)- ethanamin
Schmelzpunkt 83–84°C, Siedepunkt 167°C, wasserlöslich, ethanollöslich ZHANG et al. 2014
42
Fortsetzung Tab. 3.9 Name Chemischer AufbauMolare Masse [g/mol]Synonyme EigenschaftenLiteratur (u.a.) Homosper- min CAS-Nr. 119422-08-1 286,50 N1N14-Diethylhomo- sperminn.d.
BAGNI u. TASSONI 2001; TIBURCIO et al. 2014 Norspermidin CAS-Nr. 56-18-8131,22 Bis-(3-aminopropyl)- aminSchmelzpunkt 0–16°C
BAGGA et al. 1997; CONA et al. 2006 Norspermin CAS-Nr. 4605-14-5188,13
N,N´-Bis-(3-amino- propyl)-propan-1,3- Diamin, Sermin, Thermin Siedepunkt 98–103°C, wasserlöslich, alkohollöslich
BAGGA et al. 1997; CONA et al. 2006 Putrescin CAS-Nr. 110-60-188,15 Tetramethylendiamin, 1,4-Diaminobutan
Schmelzpunkt 25–28°C, schlecht wasserlöslich (40 g/l bei 20°C)
TIBURCIO et al. 2014 Serotonin CAS-Nr. 50-67-9176,22
5-Hydroxytryptamin, Enteramin, 3-(2-Amino-ethyl)-1H- indol-5-ol Schmelzpunkt 121°C wasserlöslich, alkohollöslich.
BASSARD et al. 2010 n.d.Nicht näher definiert
43
Fortsetzung Tab 3.9 Name Chemischer AufbauMolare Masse [g/mol]Synonyme EigenschaftenLiteratur Spermidin CAS-Nr. 124-20-9145,25 Monoamino- propylputrescin, 1,5,10-Triaza-decan, N-(3-amino-propyl)- butan-1,4-Diamin Schmelzpunkt 22–25°C, wasserlöslich (145 g/l bei 20°C)
MOSCHOU et al. 2008 Spermin CAS-Nr. 71-44-3202,34
N,N´-Bis(3-amino- propyl)1,4-butandiamin, Diaminopropylputrescin, Geronton, Neruridin Schmelzpunkt 55–60°C, wasserlöslich, ethanollöslich
HUSSAIN et al. 2011 Thermosper- min CAS-Nr. 70862-11-2
238,80
N1N14-Diethyl- homospermin, 3,8,13,18-Tetra- azaicosan, N,N´-Bis(4-(ethylamino)- butyl)tetramethylendiamin
n.d.
TAKAHASHI u. KAKEHI 2010; JIMÉNEZ- BREMONT et al. 2014; TIBURCIO et al. 2014 Tryptamin CAS-Nr. 61-54-1160,222-(3-Indolyl)-ethylamin, 3-(2-Amino-ethyl)-indol
Schmelzpunkt 113–116°C wasserlöslich
BASSARD et al. 2010 Tyramin CAS-Nr. 51-67-2137,18
2-(4-Hydroxyphenyl)- ethylamin, 4-(2-Aminoethyl)-phenol, 4-Hydroxyphenethylamin Schmelzpunkt 158–163°C, schlecht wasserlöslich (11 g/l; 15°C)
CONA et al. 2006 n.d.Nicht näher definiert
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3.2.4.5.3 Probenmaterial zur Methodenentwicklung
Für die Entwicklung der Extraktionsmethode für Amine bzw. Polyamine wurde Grassilage frisch vom neuen Silageanschnitt und ebenso frisch gewonnener Panseninhalt vom fistulierten Rind (Spendertier s. Kap. 3.2.2) verwendet.
3.2.4.5.4 Auswahl des Extraktionsverfahrens
Unterschiedliche Extraktionsverfahren der Proben (s. Tab. 3.8) wurden geprüft, um ein optimales Analyseergebnis der Amine, Polyamine und Aminosäuren an der LC-MS/MS zu erreichen. Folgende Extraktionsmethoden wurden aus der Literatur entnommen und an Grassilagen mit geringen Modifizierungen getestet (KŘÍŽEK 1991;
GOSETTI et al. 2007; CHONG et al. 2013 u. ÖZMEN 2014):
1) Homogenisierung (25.000 rpm/2 Min.) von 150 mg frischer Grassilage in 10 ml HClO4 (0,6 mol/l)
2) Homogenisierung (25.000 rpm/2 Min.) von 150 mg frischer Grassilage in 10 ml HCl (0,1 mol/l)
3) Homogenisierung (25.000 rpm/2 Min.) von 150 mg frischer Grassilage in 10 ml 50 %igem Ethanol
4) Homogenisierung (25.000 rpm/2 Min.) von 150 mg frischer Grassilage in 10 ml Eluent A [H2O mit FA (0,1 %)]
5) Inkubation von 150 mg frischer Grassilage mittels 100 ml Aqua bidestillata für 20 Min. bei 50°C und nachfolgende Abkühlung (ohne Homogenisierung) Alle Proben wurden nach der Homogenisierung bzw. Extraktion und Abkühlung (Raumtemperatur) bei 4°C und 20.000 x g für 20 Minuten zentrifugiert (Sorvall RC 5C Plus, Du Pont) und die Probenüberstände durch einen 0,2 µm RC-Sterilfilter (Art. Nr.
KC 90.1, Carl Roth® GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland)filtriert. Analysiert wurde jeweils eine Probe. In Abbildung 3.3 sind die Ergebnisse für Polyamine aus den Extraktionsversuchen zu entnehmen.
Die gefundenen Stoffe Agmatin, Ethanolamin, Histamin, Serotonin und Tryptamin konnten in den Proben aus den Vorversuchen unter den gegebenen Bedingungen der vorhandenen Messtechnik nicht sicher reproduzierbar nachgewiesen werden.
Aufgrund dessen sind sie in den folgenden Abbildungen nicht erfasst.
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Die Polyamine Cadaverin, Norspermidin, Spermidin, Norspermin und Spermin waren mit den ausgewählten Extraktionsmethoden detektierbar. Putrescin (m/z 89) konnte aufgrund der vorerst genutzten Einstellung des Massendetektionsbereiches von 100–2000 m/z am Detektor nicht detektiert werden. Diese Einstellung wurde in den späteren Versuchen auf einen Bereich von m/z 50–2000 erweitert und ermöglichte im Folgenden auch die Detektion von Putrescin.
Die Extraktionsverfahren 1 bis 5 zeigten bei den Polyaminen durchgängig detektier-bare Flächenintegrale (Counts x Min.). Dabei wies die Extraktion mit Aqua bidestillata bei 50°C die höchsten Integrale bei Norspermidin, Spermidin und Spermin auf. Die Extraktion mit 0,6 molarer HClO4 führte bei zwei der fünf Polyamine (Cadaverin und Spermidin) zu sehr geringen Ergebnissen, während die Extraktion mit 0,1 molarer HCl bzw. 50 %igem Ethanol jeweils gut messbare Flächenintegrale zeigte, wobei die Salzsäure-Extraktion für Norspermin und Spermin höhere Countwerte aufwies.
Ebenfalls gute Ergebnisse waren nach der Extraktion mit Eluent A zu beobachten.
3.2.4.5.5 Derivatisierung von Standards mit FMOC-Chlorid als Ansatz
Der Derivatisierungsprozess mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (FMOC-Chlorid) erhöht die Massezahl von Stickstoffverbindungen, was zu einer verbesserten Detektierbarkeit von Aminen, Polyaminen und Aminosäuren an der LC-MS/MS führt (BOUCHEREAU et al. 2000). Dadurch kann eine höhere Sensitivität bei der Messung dieser Stoffe erreicht werden.
Die Derivatisierung mit FMOC-Chlorid wurde mit geringen Modifizierungen nach THEERMANN (2011) durchgeführt. Aufgrund der ungenügenden Ergebnisse, die die
0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000
Cadaverin Norspermidin Spermidin Norspermin Spermin
[Counts x Min.]
Polyamine 1485000
Abb. 3.3: Polyamingehalte einer frischen Grassilage nach Aufbereitung durch fünf verschiedene Extraktionsmethoden (LC-MS/MS):
■ 1) Grassilage + Eluent A
■ 2) Grassilage + 0,1 mol/l HCl
■ 3) Grassilage + 0,6 mol/l HClO4
■ 4) Grassilage + 50 % Ethanol
■ 5) Grassilage + H2O 50°C
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Messtechnik in keiner Weise verbesserten sondern stark variierten, wurde dieser Ansatz nicht weiter verfolgt (s. Kap. 9.1.3 u. Abb. 9.1).
Messtechnik in keiner Weise verbesserten sondern stark variierten, wurde dieser Ansatz nicht weiter verfolgt (s. Kap. 9.1.3 u. Abb. 9.1).