In vorangegangenen Versuchen mit dem RUSITEC-System wurden die folgenden Parameter als Fermentationskontrollparameter diskutiert und für geeignet befunden:
• Gasvolumen s. SCHIRMER (1990)
• Gaszusammensetzung s. HÖLTERSHINKEN (1990)
• Konzentration der flüchtigen Fettsäuren s. MAIWORM (1994)
Die Auswirkungen des Kohlenhydratstoffwechsels auf die flüchtigen Fettsäuren und die Gasproduktion sind, ebenso wie der Einfluss der Schadsilagen auf den ruminalen Gesamtphenol- und o-Diphenolgehalt bei GÖRES (2016) diskutiert. Eine kritische Betrachtung der pH-Werte, des bakteriellen Proteins nach BRADFORD (1976) und der Enzymaktivität erfolgte bei ILLE (2017).
In dieser Arbeit werden die Wirkungen von Schadsilagen auf die folgenden Parameter im RUSITEC beurteilt:
• Polyamine und GABA
• Aminosäuren
• Ammoniak
• i-Butter- und i-Valeriansäure 5.3.1 Probenbearbeitung
Zur Messung der Polyamine und der Aminosäuren wurde flüssiger Fermenterinhalt mittels Einwegspritze nach Durchmischung der Fermenterflüssigkeit während der Beladung gewonnen. Je 1 g uS fester Fermenterinhalt wurde aus beiden identisch beladenen Fermentern aus den Futtersäcken nach Abpressen der Fermentations-flüssigkeit mit einer Pinzette entnommen und durch Homogenisieren gepoolt. Eine Beeinflussung der Analyseergebnisse durch die Entnahme der Feststoffproben aus der Ursprungssubstanz kann nicht ausgeschlossen werden, zumal die Grassilagen sich vor der Inkubation erheblich in den TS-Gehalten unterschieden. Allerdings ist dieser Einfluss durch die lange Inkubation der Grassilagen von 48 Stunden und aufgrund von nicht veröffentlichten, vorherigen Untersuchungen aus dem Pansenlabor und dem Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover als relativ gering einzuschätzen3.
Zur Denaturierung und Mikroextraktion der Proben wurde die Aufbereitung mit dem Ultraschallbad verwendet (FELLENBERG et al. 2012; MAYR u. SCHIEBERLE 2012;
3 Laut persönlicher Mitteilung von Dr. M. Höltershinken, Hannover am 10.12.2016
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ÖZMEN 2014). Da sich die Deproteinisierung der Proben mit 30 %iger 5-Sulfosalicyl-säure bei GRESNER (2011) und THEERMANN (2011) bewährt hat und um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse sowie ein Aufbrechen der möglichen Polyamin-verbindungen (s. Kap. 3.2.4.5.10) zu erreichen, wurde dieser Aufarbeitungsschritt beibehalten. Der interne Standard 1,7 Diaminoheptan (1,7 DAH) wurde in der Literatur bereits als stabiler Standard für Polyamine und Aminosäuren sowohl mit als auch ohne Derivatisierung eingesetzt (LOZANOV et al. 2004; HÄKKINEN et al. 2007; SÁNCHEZ-LÓPEZ et al. 2009).
Die Variationskoeffizienten des internen Standard 1,7 DAH während der Proben-analytik waren mit 5,2–28 % relativ weit gestreut (s. Tab. 9.9). Ursachen dafür könnten unter anderem Verschmutzungen durch das Probenmaterial und der sogenannte Matrixeffekt sein (AL-HADITHI u. SAAD 2011; s. Kap. 5.3.2), da in den Vorversuchen mit Reinstoffen ein sehr guter VK von 3,58 % in 18 unabhängigen Messungen erreicht wurde (s. Tab. 3.7 u. Abb. 3.16).
Der interne Standard für die Aminosäuren Norvalin-HCL trat nur sporadisch als Peak auf und wurde somit nicht weiter ausgewertet. Da 1,7 DAH jedoch auch als Standard für die Aminosäureanalyse erfolgreich eingesetzt wurde (LOZANOV et al. 2004), sind die Ergebnisse annehmbar. Möglicherweise hat das geringe Masse-zu-Ladungs-verhältnis von Norvalin-HCL (m/z 55) bei der Auftrennung mit der LC-MS/MS dazu geführt, dass derart kleine Fragmente (m/z < 55) gebildet wurden, dass diese aufgrund der technischen Bedingungen der Anlage nicht mehr detektierbar waren (s. Kap. 3.2.4.5.8). Bei THEERMANN (2011) hatte die Lagerungszeit der Proben einen Einfluss auf die Ergebnisse des Standards Norvalin-HCL. Analog zu WICHERN (2011) wurde die Zentrifugation der Proben durchgeführt, bevor selbige in Reagiergefäßen eingefroren wurden. Dieses Verfahren hat sich ebenso als geeignet erwiesen, wie die Filtration der Proben nach dem Auftauen und vor der Analyse durch 0,2 µm RC-Sterilfilter (s. Kap. 3.2.4.5.6; WICHERN 2011; ÖZMEN 2014).
5.3.2 Methode der LC-MS/MS
Bei der LC-MS/MS handelt es sich um eine Form der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit mehrfacher Massenspektrometrie, durch die die Molekülmasse der gesuchten Stoffe und ihre Teilfragmente genau charakterisiert werden können. Die verwendete Methode nach WICHERN (2011), HUNGER (2014) und ÖZMEN (2014) wurde aufgrund der größeren Säulenmaße (150 x 3,0 mm vs. 150 x 4,6 mm) optimiert.
Die Wahl der Eluenten A und B (destilliertes Wasser + 0,1 % FA bzw. Acetonitril + 0,1 % FA) orientierte sich an HÄKKINEN et al. (2007) und eignete sich für die Messung der Amine Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin, Thermospermin bzw.
dessen Teilfragment m/z 173 sowie b-Alanin und der Aminosäuren L-Arginin, L-Lysin, L-Methionin, L-Ornithin sowie des Abbauproduktes GABA. In Vorversuchen konnten die Stoffe Ethanolamin, Histamin, Norspermidin, Norspermin, Serotonin, Tryptamin und Tyramin mit der vorhandenen Messtechnik nicht mit befriedigendem Resultat nachgewiesen werden (s. Kap. 3.2.4.5.14). Die Ringstruktur bzw. das geringe Molekulargewicht dieser Stoffe, sowie die unbekannte Fragmentbildung der langkettigen Polyamine könnte hier ausschlaggebend für die Schwierigkeiten in der Analytik sein (s. Tab. 3.9). Die absoluten Counts x Min. der Flächenintegrale in den Vorversuchen sind aufgrund des anfangs verwendeten kleineren Säulendurchmessers
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nicht vergleichbar mit den Werten der Kalibration (s. Kap. 3.2.4.5.9). Der interne Standard 1,7 DAH lag mit einer Konzentration von 10 µmol/l in den Proben vor. Er eignet sich der Literatur nach gleichermaßen gut als interner Standard für Polyamine und Aminosäuren (LOZANOV et al. 2004; MINOCHA u. LONG 2004; HÄKKINEN et al. 2007) und wurde entsprechend ausgewertet. Die Electrospray-Ionisation (ESI) erfolgte im positiven Modus analog zu HÄKKINEN et al. (2007). Diese Form der Ionisation hat sich auch bei WICHERN (2011), HUNGER (2014) und ÖZMEN (2014) als sinnvoll erwiesen.
Dennoch muss bei der LC-MS/MS auf die Problematik der Ionensupression, des Carry-Overs und eine mögliche Kontamination der MS-Quelle hingewiesen werden (AL-HADITHI u. SAAD 2011). Um das daraus entstehende Grundrauschen und die Verschiebung der Retentionszeiten zu minimieren, wurden regelmäßige System-spülungen nach jeweils acht Analysen vorgenommen und die Vorsäule nach je 76 Analysen gewechselt (WICHERN 2011; s. Kap. 3.2.4.5.15).
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels MS Work-Station (Varian®, Palo Alto, CA, USA) nach den in Kapitel 3.2.4.5.17 beschriebenen Kriterien. Die Gehalte der einzelnen Stoffe wurden mittels der in den Kalibrationen bestimmten Gleichungen im Anschluss an die Erhebung der Flächenintegrale umgerechnet (s. Kap. 3.2.4.5.14).
Durch die Vielzahl der Proben und ausgewerteten Stoffe war dieser Schritt arbeitsintensiv, jedoch mittels der zur Verfügung stehenden Software zielorientiert durchführbar. Um den personenbezogenen Fehler gering zu halten, wurden die Auswertungen nur von zwei Personen durchgeführt. Die Präzision der Mess-ergebnisse zeigt sich zum einen im mittleren VK von 17,5 % im internen Standard der Proben und in der Wiederholungsmessung von 1,7 DAH (VK: 3,58 %; s. Kap.
3.2.4.5.16 bzw. Tab. 9.6) sowie zum anderen in den Ergebnissen des extern gemessenen Standards 1,7 DAH und seiner bestimmten Retentionszeiten (s. Abb. 9.2 u. Abb. 9.3).
5.3.3 Auswahl der Standards
Die für die Kalibration, die Bestimmung des „Limits of Detektion“ (LOD; s. Kap. 9.3.2) und der Wiederfindungsrate genutzten Polyamin- und Aminosäurestandards stammten alle aus industrieller Herstellung (s. Tab. 9.1). Die Auswahl der Standards ergab sich aus den Stoffen, die in der Literaturrecherche als relevant erachtet wurden (s. Kap. 3.2.4.5.2) und aus den Analysen der Vorversuche (s. Kap. 3.2.4.5.14). In den Vorversuchen zur Wiederfindungsrate wurde ein Polyaminstandardgemisch aus verschiedenen Polyaminen zum einen nativem Pansensaft und zum anderen einer aufbereiteten Grassilageprobe zugesetzt. Die Ergebnisse waren sehr heterogen und ergaben nicht die erwarteten höheren Polyaminwerte in den zugelegten Proben (s. Kap. 3.2.4.5.9). Hier wird aufgrund der biologischen Aktivität der Polyamine eine Konjugation bzw. ein Um- oder Abbau der Stoffe vermutet. So beschreiben SERAFINI-FRACASSINI und DEL DUCA (2008) die Polyaminbindung an Proteine mittels Transglutaminasen. Denkbar wäre, dass die zugelegten Polyamine in den Vorversuchen einer derartigen Bindung unterlegen haben. Auch die Bindung von Polyaminen an Phenole ist beschrieben und könnte zu einem ähnlichen Effekt führen (FIXON-OWOO et al. 2003; BASSARD et al. 2010; ONKOKESUNG 2010). Aufgrund dieser ersten Messergebnisse an der LC-MS/MS erfolgte in der späteren
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aufbereitung während der Versuche der Zusatz von 5-Sulfosalicylsäure zur Deproteinisierung (s. Kap. 3.2.4.5.6). Da die Polyamine und Amine in den durchgeführten RUSITEC-Proben ebenso konstant nachgewiesen werden konnten wie der interne Standard, wird angenommen, dass die freien Amine mittels der verwendeten Extraktionsmethose ausreichend erfasst werden konnten.
Speziell der Standard Thermospermin war aufgrund der geringen zur Verfügung stehenden Menge eine Herausforderung in der Präanalytik. In den für diese RUSITEC-Läufe unternommenen Vorversuchen wurde bei der Vermessung neben der Masse-zu-Ladungszahl m/z 206 und m/z 191, die Masse-Masse-zu-Ladungszahl m/z 173 detektiert.
Dabei zeigte m/z 173 die am besten abgegrenzten Peaks im Chromatogramm. Bei der Methodenentwicklung zur Messung von aliphatischen, langkettigen Polyaminen mittels LC-MS/MS konnten vergleichbare Teilfragmente von BRIDOUX et al. (2011) bestätigt werden. Daraus wurde abgeleitet, dass mit m/z 173 möglicherweise Thermospermin nachgewiesen werden konnte (s. Kap. 5.3.2).
Im Rahmen der Kalibration wurden auch die „Limits of Detektion“ (LOD) der Polyamine bestimmt (s. Tab. 9.8). Diese lagen mit < 0,05 bis 25 µmol/l zwar deutlich höher als die von HÄKKINEN et al. (2008) und STEVENS et al. (2010) bestimmten LODs, jedoch sind die Leistungsfähigkeit und die Komponenten der hier genutzten LC-MS/MS als limitierende Faktoren zu beachten (s. Kap. 3.2.4.5.8; HUNGER 2014). Zudem konnten die Proben aufgrund der technischen Ausstattung nicht weiter verdünnt werden als in Tabelle 9.8 erfasst. War die kleinste Verdünnung jedoch gut detektierbar, wurde die Stufe mit < x gekennzeichnet. Danach befanden sich lediglich die Analyseergebnisse von Spermin, b-Alanin und GABA zum Teil unterhalb der für diese Stoffe festgestellten LOD und sind infolgedessen vorsichtig zu bewerten.
5.3.4 Statistik
Die in Kapitel 4 aufgeführten berechneten statistischen Signifikanzen (s. a. Kap. 9.4) sind aufgrund der geringen Wiederholungszahl (n = 8 im flüssigen Fermenterinhalt bzw. n = 4 im festen Fermenterinhalt) nur als eingeschränkt aussagekräftig anzusehen. Als Wiederholungen wurden im flüssigen Fermenterinhalt analog zu den Untersuchungen von GÖRES (2016) die Messwerte der zwei Fermenter mit gleicher Beladung am selbigen Messtag je Lauf angesehen. Die Betrachtung des ersten bzw.
zweiten Laufblockes (L31–L34 bzw. L35–L38) erfolgte aufgrund des Einsatzes unterschiedlicher Grassilagen getrennt. Durch die Gewinnung von Poolproben im festen Fermenterinhalt reduzierte sich die n-Anzahl (s.o.). Die einzelnen Tage eines RUSITEC-Laufes sind durch das Stoffwechselgeschehen voneinander abhängig. Alle Daten wurden vor der weiteren statistischen Auswertung auf Normalverteilung getestet. Auch hier ist die geringe n-Anzahl zu berücksichtigen, jedoch konnte weitestgehend von einer Normalverteilung ausgegangen werden. Der t-Test für verbundene Stichproben wurde nach Rücksprache mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover analog zu den vorherigen Untersuchungen gewählt, da alle RUSITEC-Fermenter entsprechend gleich behandelt wurden und jeweils nur zwei Behandlungsformen (Kontrollsilage bzw. Schadsilage oder Schadsilage mit Sojazusatz) zum Messzeitpunkt verglichen werden sollten.
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5.4 Auswirkungen der Schadsilagen auf den ruminalen Stoffwechsel von