In vitro Verdauungsstudien im RUSITEC mit Pansensaft vom Rind zum Vorkommen von phenolhaltigen Substanzen aus Grassilagen sowie deren Bindungsverhalten mit Eiweißen

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Tierärztliche Hochschule Hannover

In vitro Verdauungsstudien im RUSITEC mit Pansensaft vom Rind zum Vorkommen von phenolhaltigen Substanzen aus Grassilagen sowie

deren Bindungsverhalten mit Eiweißen

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Corinne Hunsche

Ibbenbüren

Hannover 2017

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker Klinik für Rinder

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Dr. M. Höltershinken

Klinik für Rinder

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker 2. Gutachter: PD Dr. S. Leonhard-Marek

Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2017

Gefördert durch den Milchförderungsfonds Hannover-Braunschweig

(3)

Meiner Familie

(4)

(5)

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ... V

1 Einleitung ... 1

2 Schrifttum ... 2

2.1 Phenolische Substanzen – Einführung ... 3

2.1.1 Struktureller Aufbau ... 3

2.1.2 Klassifizierung... 5

2.2 Entstehung von phenolischen Substanzen: Stoffwechselwege in Grassilagen, Gräsern und Heu ... 6

2.2.1 Phenylalaninstoffwechsel ... 7

2.2.2 Phenylpropanoidstoffwechsel ... 10

2.2.3 Flavonoidstoffwechsel ... 14

2.3 Fähigkeiten zur Komplexbildung ... 21

2.3.1 Komplexformen ... 21

2.3.2 Einflüsse auf die Komplexbildung ... 23

2.3.3 Phenol-Proteinkomplex ... 26

2.3.4 Einfluss phenolischer Substanzen auf Sojaproteine ... 28

2.3.4.1 Glycinin und Trypsininhibitoren ... 28

2.3.4.2 β-Conglycinin ... 30

2.3.5 Enzymhemmung durch phenolische Substanzen ... 30

2.3.6 Einfluss von Pepsin und dem pH-Wert auf die Struktur der Sojaproteine 32 2.4 Aufnahme von phenolischen Substanzen: Auswirkungen auf den Wiederkäuer ... 33

3 Eigene Untersuchungen ... 40

3.1 Versuchsziel ... 40

3.2 Material und Methoden ... 40

3.2.1 Rumen Simulation Technique (RUSITEC) ... 41

3.2.1.1 Aufbau und Funktionsweise ... 41

3.2.1.2 Inbetriebnahme ... 41

3.2.1.3 Dauerbetrieb ... 42

3.2.1.4 Zusammensetzung der Pufferlösung ... 44

3.2.2 Spendertier ... 44

3.2.2.1 Identität ... 44

3.2.2.2 Haltung und Fütterung ... 44

3.2.2.3 Pansensaftentnahme ... 45

3.2.3 Futterkomponenten ... 45

3.2.3.1 Herkunft und Beschaffenheit der Grassilagen ... 45

3.2.3.1.1 Kontrollsilage ... 45

3.2.3.1.2 Schadsilage ... 45

3.2.3.2 Herkunft und Beschaffenheit der Maisstärke ... 48

3.2.3.3 Herkunft und Beschaffenheit des Sojaproteins ... 48

3.2.3.4 Herkunft und Beschaffenheit des Kraftfutters ... 48

(6)

Inhaltsverzeichnis

II

3.2.4 Versuchsdurchführung ... 49

3.3 Analytik ... 52

3.3.1 Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren ... 52

3.3.2 Enzymatische Bestimmung des Phenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit sowie nach Fermentation in der Überstandsflüssigkeit ... 55

3.3.2.1 Bestimmung des Gesamtphenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit ... 55

3.3.2.2 Bestimmung des o-Diphenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit ... 58

3.3.2.3 Bezeichnung der drei Testgruppen der Überstandsgefäße ... 62

3.3.2.4 Enzymatischer Verdau der Überstandsflüssigkeit: Einfluss von Pepsin auf den Gehalt an phenolischen Substanzen ... 62

3.3.2.5 Bestimmung des Gesamtphenolgehalts in der Überstandsflüssigkeit ... 63

3.3.2.6 Kalibrierung ... 63

3.3.2.7 Methodenüberprüfung ... 64

3.3.2.8 Bestimmung des o-Diphenolgehalts in der Überstandsflüssigkeit ... 64

3.3.2.9 Kalibrierung ... 65

3.3.2.10 Überprüfung der Methode ... 65

3.3.3 Abschließende Beurteilung der neuen Methode ... 66

3.3.4 Statistische Datenauswertung ... 66

4 Ergebnisse ... 67

4.1 Flüchtige Fettsäuren ... 67

4.1.1 Essigsäurekonzentration ... 68

4.1.2 Essigsäureproduktion ... 69

4.1.3 Propionsäurekonzentration ... 70

4.1.4 Propionsäureproduktion ... 71

4.1.5 n-Buttersäurekonzentration ... 72

4.1.6 n-Buttersäureproduktion ... 73

4.1.7 n-Valeriansäurekonzentration ... 74

4.1.8 n-Valeriansäureproduktion ... 75

4.1.9 Hexansäurekonzentration ... 76

4.1.10 Hexansäureproduktion ... 77

4.1.11 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Konzentration ... 78

4.1.12 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Produktion ... 79

4.2 Gehalt an phenolischen Substanzen in den Fermentern ... 80

4.2.1 Gesamtphenolgehalt in den Fermentern ... 80

4.2.2 o-Diphenolgehalt in den Fermentern ... 81

4.3 Gehalt an phenolischen Substanzen in der Überstandsflüssigkeit nach Pepsinverdau ... 82

4.3.1 Gesamtphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit nach Pepsinverdau ... 83

4.3.2 o-Diphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit nach Pepsinverdau ... 86

4.4 Ergebnisüberblick ... 89

5 Diskussion ... 91

5.1 Intention der Arbeit ... 91

5.2 Kritische Betrachtung des Versuchsaufbaus ... 91

5.2.1 Das RUSITEC-System ... 91

5.2.2 Eingesetzte Grassilagen ... 92

(7)

Inhaltsverzeichnis

III

5.3 Kritische Betrachtung der verwendeten Parameter ... 93

5.3.1 Flüchtige Fettsäuren ... 93

5.3.2 Gesamtphenole im Fermenter ... 93

5.3.3 o-Diphenole im Fermenter ... 94

5.4 Einfluss des Verdauungsenzyms Pepsin auf den Gehalt an phenolischen Substanzen in der Überstandsflüssigkeit ... 95

5.5 Gesamtphenole und o-Diphenole im Überstand ... 95

5.6 Auswirkungen von Schadsilagen und Sojaprotein auf das Fermentationsmuster der flüchtigen Fettsäuren ... 97

5.6.1 Übersicht ... 97

5.6.2 Einfluss ausgewählter Pansenbakterien auf den Gehalt an flüchtigen Fettsäuren ... 98

5.6.3 Einordnung der Produktion der flüchtigen Fettsäuren (L39-42) im Gesamtprojekt ... 103

5.7 Auswirkungen der Schadsilagen auf das Reaktionsverhalten phenolischer Substanzen ... 104

5.7.1 Reaktionswege phenolischer Substanzen im Pansen ... 104

5.7.2 Reaktionswege phenolischer Substanzen im Labmagen ... 107

5.8 Einflüsse phenolischer Substanzen auf das Pansenmikrobiom und somit auf den Gehalt der flüchtigen Fettsäuren ... 108

5.9 Ausblick ... 110

6 Zusammenfassung ... 111

7 Summary ... 113

8 Schrifttumsverzeichnis ... 115

9 Anhang ... 135

9.1 Bisherige Dissertationen aus dem Pansenlabor ... 135

9.2 Probenentnahme und Parameterverteilung ... 136

9.3 Parameterverteilung ... 138

9.4 Einfluss von Pepsin auf den Gehalt an phenolischen Substanzen: Messung ohne und mit Pepsinverdau ... 139

9.5 Pepsininkubation zu zwei verschiedenen Zeitpunkten ... 143

9.6 Kalibrationsgerade zur Ermittlung des Gesamtphenolgehalts in der Überstandsflüssigkeit ... 144

9.7 Methodenüberprüfung: 4-Hydroxyphenylessigsäure ... 144

9.8 Kalibrationsgerade zur Ermittlung der o-Diphenolgehalt in der Überstandsflüssigkeit ... 145

9.9 Methodenüberprüfung: Chlorogensäure ... 145

9.10 Ergebnisse ... 146

9.10.1 Statistische Daten ... 146

9.11 Relevante Ergebnisse aus vorherigen Disserationen ... 165

9.11.1 Essigsäure ... 165

9.11.2 Essigsäureproduktion ... 166

9.11.3 Propionsäurekonzentration ... 167

9.11.4 Propionsäureproduktion ... 168

9.11.5 n-Buttersäurekonzentration ... 169

(8)

Inhaltsverzeichnis

IV

9.11.6 n-Buttersäureproduktion ... 170

9.11.7 n-Valeriansäurekonzentration ... 171

9.11.8 n-Valeriansäureproduktion ... 172

9.11.9 Hexansäurekonzentration ... 173

9.11.10 Hexansäureproduktion ... 174

9.11.11 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Konzentration ... 175

9.11.12 Summe der flüchtigen Fettsäuren: Produktion ... 176

9.11.13 Gesamtphenolgehalt im Fermenter ... 177

9.11.14 o-Diphenolgehalt im Fermenter ... 178

9.12 Vorkommen von Aminosäuren und GABA in den eingesetzten Gras- silagen ... 179

10 Danksagung ... 181

(9)

Abkürzungsverzeichnis

V

Abkürzungsverzeichnis

A. bidest. Aqua bidestillata Abb. Abbildung

ADF acid detergent fiber (saure Detergens-Faser)

Art.-Nr. Artikelnummer

BRENDA BRaunschweig ENzyme DAtabase

bspw. beispielsweise bzw. beziehungsweise

C Kohlenstoff

°C Grad Celsius

ca. circa

cm Zentimeter

CO2 Kohlenstoffdioxid d. h. das heißt

EC enzyme commission numbers; Klassifizierungs- system für Enzyme

EtOH Ethanol etc. et cetera

F Fermenter

Fa. Firma

FIP-U/g Enzymeinheit

FlFS flüchtige Fettsäuren

FMOC Fluorenylmethoxycarbonyl

g Gramm

GABA Gamma-Aminobuttersäure GC Gaschromatograph

ggf.

ggr.

Gegebenenfalls geringgradig

h Stunde(n)

H Wasserstoff

HCL hgr.

Salzsäure hochgradig

HPLC high-performance liquid chromatography

K-30 Kontrollsilage Lauf 31–34 K-32 Kontrollsilage Lauf 35–38 k. A. Keine Angabe

Kap. Kapitel

KF-30 Kontrollfermenter (Fer- menter 1 u. 2) Lauf 31–34 KF-32 Kontrollfermenter (Fer-

menter 1 u. 2) Lauf 35–38

kg Kilogramm

L Lauf

l Liter

LC/MS liquid chromatography/

mass spectrometry Lsg. Lösung

M Molekulargewicht (g/mol) ME metabolizable energy

(umsetzbare Energie) mg

mgr.

Milligramm mittelgradig min Minute(n)

MJ Megajoule

ml Milliliter mm Millimeter mmol/l Millimol µl Mikroliter

mol Mol

mS mit Sojazulage

n Anzahl

N Stickstoff

NDF neutral detergent fiber (neutrale Detergens- Faser)

NEL Nettoenergie-Laktation NfE nitrogen free extractives

(N-freie Extraktstoffe) NH2 Aminogruppe

NH3 Ammoniak

nm Nanometer

NPN Nicht-Protein-Stickstoff

Nr. Nummer

O Sauerstoff

o- ortho-

p Signifikanz der Differenz PCR Polymerasekettenreaktion

pH pH-Wert

Ra Rohasche

RE Reineiweiß

Rfa Rohfaser

Rfe Rohfett Rp Rohprotein

RUSITEC RUmen SImulation TEChnique

S-31 Schadsilage Lauf 31–34 S-33 Schadsilage Lauf 35–38

(10)

Abkürzungsverzeichnis

VI S-35 Schadsilage Lauf 39-42

s Standardabweichung

s. siehe

Sek Sekunde

Seradest ionenfreies Wasser

sp. Art/Spezies/species (keine weitere Artendefinition möglich)

sp. nov. Neue Spezies spp. Species pluralis Std.

s.u.

Stunde siehe unten

Syn. Synonym

Tab. Tabelle

TF-31 Testfermenter (Fermenter 3 u. 4) Lauf 31–34

TF-33 Testfermenter (Fermenter 3 u. 4) Lauf 35–38

TF-35 Testfermenter (Fermenter 3 u. 4) Lauf 39-42

TF-31mS Testfermenter mit Sojazu- lage (Fermenter 5 u. 6) Lauf 31–34

TF-33mS Testfermenter mit Sojazu- lage (Fermenter 5 u. 6) Lauf 35–38

TF-35mS Testfermenter mit Sojazu- lage (Fermenter 5 u. 6) Lauf 39-42

TS Trockensubstanz

u. und

Ü Überstand

u. a. unter anderem

uS Ursprüngliche Substanz (Frischsubstanz)

VDLUFA Verband deutscher landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten versch. verschiedene

vgl. verglichen Vgl. Vergleich

VK Variationskoeffizient Vol. % Volumenprozent

x̅ arithmetischer Mittelwert x g mal Erdbeschleunigung z. B. zum Beispiel

% Prozent

>/< größer/kleiner als

≈ gleich/equal to

*/#/° schwach signifikant (p < 0,05)

**/##/°° signifikant (p < 0,01)

***/###/°°° hoch signifikant (p < 0,001)

x Multiplikationszeichen

(11)

Einleitung

1

1 Einleitung

Seit einigen Jahren tritt auf Milchviehbetrieben in Norddeutschland ein unspezifi- sches Krankheitsbild (Absinken der Milchleistung, Anstieg der Zellzahl, Fressunlust, Klauenprobleme, Verdauungs- und Fertilitätsstörungen, atypisches Festliegen der Tiere etc.), beschrieben als „Faktorenerkrankung Milchviehherde“, auf.

Untersuchungen des Grundfutters haben ergeben, dass erkrankte Tiere mit einer Grassilage gefüttert wurden, die einen Reineiweißanteil (RE) am Rohprotein (RP) von unter 50 % aufweisen. Nach Absetzen oder Verschneiden der Silage sowie Supplementierung mit Sojaextraktionsschrot konnte die Herdengesundheit verbes- sert werden (EICKEN 2005a; EICKEN u. TIEDEMANN 2013).

Ergebnisse aus in vitro Versuchen des Pansenlabors der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, sollen zur Klärung beitragen, ob Silagen mit einem Reineiweißgehalt am Rohprotein unter 50 % negative Einflüsse auf die Funktion des Pansens haben. In vorangegangenen Versuchen wurden bereits Auswirkungen der Schadsilagefütterung (im Vergleich zur Kontrollsilage) auf den Kohlenhydrat- stoffwechsel, Polypeptidabbau und den Proteinstoffwechsel überprüft sowie Analy- sen zu Abwehrstoffen von Pflanzen durchgeführt.

In der vorliegenden Arbeit werden Auswirkungen einer Schadsilagefütterung und einer Supplementierung mit Sojaprotein auf den Gehalt an phenolischen Substanzen an zwei in vitro Entnahmeorten (im Fermenter = Pansen, im Überstand = Labmagen) sowie auf den Kohlenhydratstoffwechsel in vitro untersucht. Phenolische Substanzen zählen zu den sekundären Pflanzeninhaltsstoffen (McMANUS et al. 1981; STICHER et al. 2015). Sie werden in der Vakuole gespeichert oder liegen gebunden an der Zellwand vor. Sie sind in der Lage, komplexe Verbindungen mit anderen Stoffen einzugehen. Hierzu werden sie durch Enzyme, Polyphenoloxidasen, zu reaktiven Stof- fen, den Chinonen, katalysiert (LE BOURVELLEC u. RENARD 2012).

Gerade in der Wiederkäuerernährung sind diese Verbindungen von großem Interes- se. Auf Grund der hohen Variabilität im Vorkommen der phenolischen Substanzen sind ihre Stoffwechselwege sowie Wirkungen im Tier bislang nicht eindeutig geklärt.

Neben negativen Aspekten wie der schlechteren Futteraufnahme durch Vorhanden- sein bestimmter Phenolsäuren sowie die geringere Verfügbarkeit nutzbaren Proteins durch die Bindung der Phenolsäuren an Eiweiße werden auch positive Wirkungen wie antioxidative und antiinflammatorische Effekte beschrieben (HO et al. 1992;

RAWEL et al. 2005).

.

(12)

Schrifttum

2

2 Schrifttum

Die folgenden Abschnitte befassen sich mit dem Vorhandensein phenolischer Sub- stanzen in Gräsern und ihren chemischen Eigenschaften, Komplexe mit anderen Substanzen (u.a. Proteine) bilden zu können, sowie ihren Auswirkungen auf den Wiederkäuer. ÖZMEN (2014) und GÖRES (2016; vorherige Arbeiten im Pansenlabor der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover s. Tab. 9.1) wiesen ein Vorkommen von phenolischen Substanzen in Grassilagen, Gräsern, Heu und Pansensaft nach. ÖZMEN (2014) konnte aufzeigen, dass diese Substanzen im Gras als Einzelkomponenten vorliegen, im Pansensaft jedoch nicht mehr. Eine Erklärung hierfür könnte ihre Fähigkeit zur Komplexbildung sein.

(13)

Schrifttum

3

2.1 Phenolische Substanzen – Einführung

Phenolische Substanzen zählen zu den niedermolekularen Naturstoffen (Syn. Se- kundärmetabolite; WALD 2003; STICHER et al. 2015), sie kommen nur in bestimmten Pflanzengruppen und Entwicklungsstadien vor (WATZL u. LEITZMANN 2005).

Es gibt verschiedene Faktoren (Pflanzenspezies, Erntezeitpunkt, Boden und Klima), die den spezifischen Gehalt an sekundären Pflanzeninhaltsstoffen in einer Pflanze beeinflussen (WALD 2003). Phenolische Substanzen sind nicht am Primärstoffwech- sel (Energiestoffwechsel, Zellwachstum und -teilung) der Pflanze beteiligt, sondern im sekundären Stoffwechsel (Syn. spezieller Stoffwechsel; McMANUS et al. 1981), ihre Funktionalität liegt im Bereich der Wechselwirkungen einer Pflanze mit der Um- welt (STICHER et al. 2015). Zunächst entstehen Sekundärmetabolite durch eine zu- fällige Mutation. Ansammlungen dieser Stoffe können Pflanzen oft für sich als phy- siologischen Vorteil nutzen (STICHER et al. 2015). Sie nutzen sie als Wachstumsre- gulatoren und Farbstoffe (WATZL u. LEITZMANN 2005) sowie zu ihrem eigenen Er- halt (WALD 2003; STICHER et al. 2015). Sie setzen die Stoffe als Schutzmechanis- mus u.a. gegen den Befall von pathogenen Mikroorganismen oder vor Fraßfeinden ein (STICHER et al. 2015). Phenolische Substanzen sind auch wegen ihrer pharma- kologischen Wirkungen in den Fokus gerückt (HARBORNE u. WILLIAMS 2000;

STICHER et al. 2015). Sie können z.B. antioxidativ, antimikrobiell, antikanzerogen und antithrombotisch wirksam sein (HO et al. 1992; RAWEL et al. 2005; STICHER et al. 2015).

2.1.1 Struktureller Aufbau

Phenolische Substanzen weisen eine große strukturelle Vielfalt auf (STICHER et al.

2015). Die große Anzahl an unterschiedlichen phenolischen Substanzen entsteht durch die vielfältige Ableitung (Methylierung, Hydroxylierung und Glykosylierung) der Strukturen von einem Grundgerüst (WOLLENWEBER 1982; DIXON u. PAIVA 1995).

Dieses besteht aus einem aromatischen Ring, an dem eine oder mehrere Hydro- xylgruppen sowie funktionelle Gruppen (Ether, Aldehyde, Ester, Glykoside) gebunden sind (Tab. 2.1; HO et al. 1992).

Viele phenolische Substanzen besitzen zwei oder mehr Hydroxylgruppen (HO et al. 1992), die in ortho-Stellung zueinander liegen. Hierbei handelt es sich um sogenannte o-Diphenole (HOLLOWAY 1979). McMANUS et al. (1981) beschreiben die ortho-Dihydroxygruppen der phenolischen Substanzen als die entscheidenden Stellen, an denen eine Komplexbildung mit anderen Substanzen möglich ist.

(14)

Schrifttum

4

Tab. 2.1: Summen- und Strukturformeln ausgewählter phenolischer Substanzen Phenolische Substanz

mit Summenformel

Strukturformel Phenol

C6H5OH

Gallussäure C7H6O5

p-Cumarsäure C9H8O3

Kaffeesäure C9H8O4

Ferulasäure C10H10O4

Apigenin C15H10O5

Diosmetin C16H12O6

(15)

Schrifttum

5 2.1.2 Klassifizierung

Es gibt zahlreiche Untergruppen von phenolischen Substanzen (HO et al. 1992;

HUEP 2008; HUNGER 2014; ÖZMEN 2014), die über die unterschiedlichsten Stoff- wechselwege entstehen (s. Kap. 2.2). Zu den jeweiligen Untergruppen gehören wiederum unzählige Substanzen, die durch Bindung von verschiedenen funktionellen Gruppen und anderen Substanzen entstehen können. Tabelle 2.2 zeigt eine Über- sicht der wichtigsten Untergruppen.

Tab. 2.2: Ausgewählte Untergruppen phenolischer Substanzen (mit Beispielen)

Untergruppe Beispiele

Hydroxybenzoesäuren Gallussäure: genutzt zur Synthese von hydrolysierbaren Tanninen

Salicylsäure

p-Hydroxybenzoesäure Vanillinsäure

Hydroxyzimtsäuren Kaffeesäure

Ferulasäure Cumarsäure Ester aromatischer Hydroxycarbonsäu-

ren

Chlorogensäure: Ester zwischen China- und Kaffeesäure

Cumarine Cumarin

Chalkone Isoliquiritigenin

Flavanone Hesperitin

Naringenin

Flavonole Kaempferol

Quercetin Rutin

Leucoanthocyanidine Leucocyanidin

Anthocyane Cyanidin

Flavanole Catechin

Epicatechin Proanthocyanidine

(kondensierte Tannine)

Aus Catechin entstehend

Flavanonole Taxifolin

Aromadendrin

Isoflavone Daidzein

Genistein

(16)

Schrifttum

6

2.2 Entstehung von phenolischen Substanzen: Stoffwechselwege in Grassilagen, Gräsern und Heu

Der Stoffwechselweg phenolischer Substanzen kann in drei Abschnitte unterteilt werden (DIXON u. PAIVA 1995; HERRMANN 1995; FRANGNE et al. 2002;

ÖZMEN 2014):

Im ersten Abschnitt werden Aminosäuren gebildet, diese stellen eine Verbindung zwischen dem Grundstoffwechsel und dem sekundären Stoffwechsel dar (STICHER et al. 2015). Aminosäuren entstammen dem Shikimsäureweg (s. Tab. 2.3), daneben gibt es die Möglichkeit, aromatische Verbindungen über den Acetat-Malonat-Weg oder dem Acetat-Mevalonat-Weg zu bilden (HERRMANN u. WEAVER 1999;

STICHER et al. 2015).

Aus ihnen gehen im zweiten Abschnitt die niedermolekularen Naturstoffe, u.a. die Zimtsäurederivate, hervor (Tab 2.4; ÖZMEN 2014).

Der dritte Abschnitt befasst sich mit dem Stoffwechselweg komplexer Phenole, u.a.

den Flavonen und Flavonolen (Tab. 2.5).

Die von ÖZMEN (2014) dargestellten Substanzen wurden in Extrakten von Grassila- gen, Gräsern und Heu mittels LC-ESI-MS/MS- und FMOC-HPLC-Methode ermittelt.

Hierbei konnten einige bekannte, im Stoffwechselweg von Pflanzen (z.B. Legumino- sen) entstehende, phenolische Substanzen in Grassilagen, Gräsern und Heu nicht identifiziert werden, da sie zum einen nicht gebildet (z.B. Cumarin) oder direkt abgebaut (z.B. Zimtsäure) werden. Auf weitere Synthesewege, wie z.B. die Entstehung der einzelnen kondensierten Tannine, wird hier nicht näher eingegangen, da sie, verglichen mit den Phenolsäuren p-Cumar- und Ferulasäure, eine untergeordnete Rolle in Gräsern spielen (LOWRY et al. 1993; ÖZMEN 2014). Sie sind in vorangegangenen Studien vor allem in Leguminosen ermittelt worden (BARRY u. MANLEY 1984b; BARRY 1985; WAGHORN et al. 1994; WANG et al. 1994; MIN et al. 2005;

WAGHORN 2008). Näheres zum Reaktionsweg in Pflanzen und Gräsern s. ÖZMEN (2014).

Zusätzlich wurden die Proben von ÖZMEN (2014) mittels dem Langzeitinkubations- system RUSITEC (näheres hierzu s. Kap. 3) fermentiert und anschließend auf das Vorhandensein der zuvor identifizierten Substanzen untersucht. Außer den im ersten Abschnitt gebildeten Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tyrosin sowie ein biogenes Amin und ein Abbauprodukt der Flavonoide konnten keine phenolischen Substanzen (als ungebundene Reinsubstanz) im Fermenterinhalt von ÖZMEN (2014) nachgewiesen werden.

(17)

Schrifttum

7 2.2.1 Phenylalaninstoffwechsel

Im ersten Abschnitt (Phenylalaninstoffwechsel) werden die Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan über den Shikimsäureweg als Endpro- dukte gebildet (HERRMANN u. WEAVER 1999; ÖZMEN 2014). Die in der Pflanze als Nebenprodukte vorkommenden Substanzen (Gallussäure und Chinasäure) sowie das Zwischenprodukt (Phenylbrenztraubensäure) konnten nicht in allen von ÖZMEN (2014) analysierten Extrakten identifiziert werden. Ein Vorhandensein der über den Shikimsäureweg im ersten Abschnitt des Stoffwechsels gebildeten Sub- stanzen wurden auch in Fermenterproben (Probengewinnung mit Hilfe eines Lang- zeitinkubationssystems) untersucht (ÖZMEN 2014, s. Tab. 2.3). Wie in vorangegangenen Untersuchungen, GRESNER (2011) und THEERMANN (2011), wurden nur die Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tyrosin im Fermenterinhalt nachgewiesen, alle anderen Substanzen wurden nicht identifiziert (ÖZMEN 2014).

(18)

Schrifttum

8

Tab. 2.3: Biosynsthese der identifizierten Substanzen (ÖZMEN 2014): 1. Abschnitt (Phenylalaninstoffwechsel) 1. Abschnitt: Phenylalaninstoffwechsel

Phenolische Substanz

Hervorgehend aus

Bedingt durch

(Enzym) Info Vorkommen Literatur

Phenylbrenz- traubensäure

Prephensäure (über Shikim- und Chorismin- säure)

Decarboxylierung, Wasserabspaltung, Prephenat-

Dehydratase (EC¹ 4.2.1.51)

Zwischenprodukt, nicht in Grassila- gen, da vollständi- ge Umwandlung zu Phenylalanin und Tyrosin

Gras, Heu HERRMANN

1995;

DOSSELAERE u.

VANDERLEYDEN 2001; ÖZMEN 2014

L-Phenylalanin Phenylbrenz- traubensäure

Transaminierung Endprodukt im Shikimsäureweg

Grassilagen, Gras, Heu, Fermenter

HERRMANN 1995;

HERRMANN u.

WEAVER 1999;

ÖZMEN 2014 L-Tyrosin Phenylbrenz-

traubensäure

Transaminierung Endprodukt im Shikimsäureweg

Grassilagen, Gras, Heu, Fermenter

HERRMANN 1995;

HERRMANN u.

WEAVER 1999;

ÖZMEN 2014 L-Tryptophan Indol Tryptophan-

Synthase

(EC 4.2.1.20) mit Aminosäure Serin

Endprodukt im Shikimsäureweg

Grassilagen, Gras, Heu

CRAWFORD u.

YANOFSKY 1958;

ANDERSON et al.

1991; ÖZMEN 2014

1 BRaunschweig ENzyme Database; URL: www.brenda-enzymes.org

(19)

Schrifttum

9 Fortsetzung Tab. 2.3

Gallussäure 5-Dehydro- shikimsäure

Oxidation, Enoli- sierung

Nebenprodukt;

nicht in Grassila- gen, da Verbrauch bei Gallotannin- synthese (zur Bil- dung von hydrolysierbaren Tanni- nen) oder an Zu- cker gebunden

Gras, Heu ÖZMEN 2014

Chinasäure 5-Dehydro- chinasäure

Reduktion, 5-Dehydroquinat- Dehydratase (EC 1.1.1.24)

Nebenprodukt;

nicht in Grassila- gen, da Reaktion mit veresterter Kaf- feesäure zur Ent- stehung von Chlo- rogensäure

Gras, Heu ÖZMEN 2014

(20)

Schrifttum

10 2.2.2 Phenylpropanoidstoffwechsel

Im zweiten Abschnitt (s. Tab. 2.4) konnten einige der Phenylpropanoide, hierzu zäh- len die Phenolcarbonsäuren (z.B. Hydroxyzimtsäuren), in Grassilagen, Gräsern und Heu identifiziert werden (ÖZMEN 2014). Diese Gruppe kennzeichnet ein C6C3-Grundgerüst. Es gibt Substanzen, wie die Benzoesäure und die Zimtsäure, die nicht in Grassilagen identifiziert werden konnten, da sie durch Veresterung an Phe- nolsäuren gebunden oder umgewandelt werden und sich somit der Analyse entzie- hen (DIXON u. PAIVA 1995; STICHER et al. 2015). Die Ferulasäure kommt als Zwi- schenprodukt vor, sie wird während der Ligninsynthese verbraucht (RALPH et al. 1994; ÖZMEN 2014).

(21)

Schrifttum

11

Tab. 2.4: Biosynthese der identifizierten Substanzen (ÖZMEN 2014): 2. Abschnitt (Phenylpropanoidstoffwechsel) 2. Abschnitt: Phenylpropanoidstoffwechsel

Hervorgehend aus

Bedingt durch

Zimtsäure Phenylalanin L-Phenylalanin- Ammoniaklyase (PAL, EC 4.3.1.24), oxidative Desami- nierung

Nicht in Grassila- gen, da schneller Umbau zur p-Cumarsäure

Gras, Heu ÖZMEN 2014;

STICHER et al.

2015

Benzoesäure trans-Zimtsäure Abspaltung C2-Fragment

Derivatbildung:

Salicylsäure, 3-Hydroxybenzoe- säure,

3,4-Dihydroxy- benzoesäure, werden in Grassilagen durch Veresterung an Phenolsäure gebunden

DIXON u. PAIVA 1995; ÖZMEN 2014

Salicylsäure Benzoesäure Derivat der Ben- zoesäure

ÖZMEN 2014

(22)

Schrifttum

p-Cumarsäure trans-Zimtsäure oder L-Tyrosin

Enzymatische Hyd- roxylierung des Aromaten in pa- ra-Stellung (der Zimtsäure) zum Propensäurerest oder Tyrosin- Ammoniaklyase (TAL, EC 4.3.1.23) katalysierte Desa- minierung

Grassilage, Gras DIXON u. PAIVA 1995; ÖZMEN 2014; STICHER et al. 2015

Kaffeesäure p-Cumarsäure Hydroxylierung durch Phenolase

Schlüsselsubstanz zur Bildung der Cumarine, Chloro- gensäure, Feru- lasäure, Sinapin- säure und Lignine

BARRIÈRE et al.

2007; DIXON u.

PAIVA 1995;

ÖZMEN 2014

Chlorogensäure Kaffeesäure Chinasäure Grassilagen, Gras,

Heu

ÖZMEN 2014 Ferulasäure Kaffeesäure Methylierung mit

Hilfe von Kaffee- säure-O-Methyl- transferase

Zwischenprodukt in Grassilagen, Gras und Heu für Ligninsynthese

Grassilagen, Gras RALPH et al.

1994; ÖZMEN 2014

Cumarin p-Cumarsäure In Grassilagen,

Gras und Heu nicht gebildet

ÖZMEN 2014

5-Hydroxy- ferulasäure

Ferulasäure In Grassilagen,

Gras und Heu nicht gebildet

ÖZMEN 2014

(23)

Schrifttum

Sinapinsäure 5-Hydroxy- ferulasäure

In Grassilagen, Gras und Heu nicht gebildet

ÖZMEN 2014

(24)

Schrifttum

14 2.2.3 Flavonoidstoffwechsel

Der dritte Abschnitt der Synthese (Flavonoidstoffwechsel) beginnt mit der Bildung eines Naringeninchalkon aus drei Molekülen Malonyl-CoA, einem Molekül p-Cumaroyl-CoA (aus p-Cumarsäure) und unter Abspaltung von Kohlenstoffdioxid, aus dem das Naringenin hervorgeht (LEWINSOHN et al. 1989; PETER et al. 1991).

In Grassilagen hingegen konnte das Naringenin nicht identifiziert werden, da es wahrscheinlich schnell zu Apigenin (Flavon), Genistein (5-Hydroxyisoflavonoid) und Kaempferol (Flavonol) dehydriert (s. Kap. 2.2: weitere Substanzen durch schnelle Verstoffwechselung nicht gefunden; ÖZMEN 2014). Die in Pflanzen beschriebenen weiteren aus Naringenin hervorgehenden Substanzen (u.a. Stilbene, Aurone, Flava- none und Anthocyane) wurden von ÖZMEN (2014) nicht gefunden. Aus Apigenin, Genistein und Kaempferol werden mittels unterschiedlicher enzymatischer Synthe- sen verschiedene Glykoside (Zwischenprodukte), Rutinoside und weitere Flavone, Flavonole und Isoflavonole gebildet (ÖZMEN 2014). Die Flavonole und Isoflavone konnten allerdings nur in wenigen Extrakten nachgewiesen werden (sie sind als Ne- benprodukte anzusehen), es wurden hauptsächlich Flavone gebildet (ÖZMEN 2014).

Tabelle 2.5 zeigt die im dritten Abschnitt identifizierten (und nicht identifizierten) Sub- stanzen.

(25)

Schrifttum

15

Tab. 2.5: Biosynthese der identifizierten Substanzen (ÖZMEN 2014): 3. Abschnitt (Flavonoidstoffwechsel) 3. Abschnitt: Flavonoidstoffwechsel

Hervorgehend aus

Bedingt durch

Naringenin 5,7,4’-Trihydroxy- chalkon,

Chalkon aus drei Molekülen Malo- nyl-CoA und ein Molekül

p-Cumaroyl-CoA (aus p-Cumar- säure)

Chalkon- Isomerase (EC 5.5.1.6)

Keine Identifizie- rung in Grassila- gen, Gras und Heu auf Grund voll- ständiger Dehydra- tation des

C-Ringes; dehydriert zu Apigenin, Kaempferol und Genistein

LEWINSOHN et al. 1989; DIXON u.

PAIVA 1995;

ÖZMEN 2014;

STICHER et al.

2015

Apigenin 5,7,4’-Trihydroxy- chalkon

Flavon-Synthase (EC 1.14.11.22)

Grassilagen:

Reaktion läuft vor allem in Richtung der Flavone

Grassilagen, Heu BENAVENTE- GARCIA et al.

1993; ÖZMEN 2014

Genistein 5,7,4’-Trihydroxy- chalkon

2-Hydroxy- isoflavanon- Dehydratase

Nebenprodukt Grassilagen DIXON u. PAIVA 1995; ÖZMEN 2014

Biochanin A Genistein Isoflavon-Methyl- transferase

Nebenprodukt;

Bildung nur in Grassilagen

Grassilagen ÖZMEN 2014

Daidzein Naringenin 2-Hydroxy- isoflavanon- Dehydratase

Vollständiger Ver- brauch zur Formo- nonetinsynthese

Formononetin Daidzein Isoflavon-Methyl- transferase

Nebenprodukt;

Bildung nur in Grassilagen

(26)

Schrifttum

Kaempferol 5,7,4’-Trihydroxy- chalkon und Dihydroflavanol

Flavanon 3-Hydroxylase (EC 1.14.11.9)

Nebenprodukt Grassilagen, Gras, Heu

ÖZMEN 2014

Quercetin Kaempferol Flavon-Synthase (EC 1.14.11.22)

Nebenprodukt Grassilagen ÖZMEN 2014 Quercetin

3-O-Glucosid

Quercetin Flavonol 3-O- Glycosyl- transferase (EC 2.4.1.91)

ÖZMEN 2014

Rutin Quercetin

3-O-Glucosid

Flavonol 3-O- Glycosid-L-Rham- nosyltransferase (EC 2.4.1.159)

Nebenprodukt;

Identifizierung in einer Grassilage, zwei Heuproben und einem Gras

ÖZMEN 2014

Vitexin (Flavon 8-C-Glycosid)

Apigenin Enzym nicht cha- rakterisiert

Direkte Derivatisie- rung der C-Atome des Grundgerüstes am entsprechen- den C-Glycosid ist sehr selten → nicht in allen Gras- silagen vorhanden, kein Vorkommen in Gras und Heu

(27)

Schrifttum

Apigenin 7-O-Glycosid

Apigenin Glykosylierung mittels Flavon 7-O-ß-Glycosyl- transferase (EC 2.4.1.81)

Zwischenprodukt;

keine Identifizie- rung in Grassila- gen, da Flavon 7-O-Glykoside sehr schnell durch Enzyme zu Flavon 7-O-Rutinoside umgewandelt werden

BENAVENTE- GARCIA et al.

1993; ÖZMEN 2014; STICHER et al. 2015

Apigenin 7-O-Rutinosid

Apigenin 7-O-Glycosid

Flavanon 7-O- Glycosid-2‘‘-O-ß- L-Rhamnosyl- transferase (EC 2.4.1.236)

Grassilagen, Gras und Heu: Glycosy- lierung häufig an Hydroxylgruppen

LEWINSOHN et al. 1989; BAR- PELED et al.

1991;

1993; ÖZMEN 2014

Saponarin (Apigenin 6-C-Glucosid- 7-O-Glucosid)

Apigenin 7-O-Glykosid

LEWINSOHN et al. 1989; BAR- PELED et al.

1991;

1993; ÖZMEN 2014

(28)

Schrifttum

Acacetin Apigenin Methoxylierung mittels Apigenin 4‘-O-Methyl- transferase (EC 2.1.1.75)

Grassilagen, Heu LEWINSOHN et al. 1989;

1993; ÖZMEN 2014

Acacetin 7-O-Glycosid

Acacetin Flavon 7-O-ß- Glycosyltrans- ferase

Zwischenprodukt;

keine Identifizie- rung in Grassila- gen, da Flavon 7-O-Glycoside sehr schnell durch Enzyme zu Flavon 7-O-Rutinoside umgewandelt werden

1993; ÖZMEN 2014

Aaciin (Acacetin 7-O-Rutinosid)

Acacetin 7-O-Glycosid

Hauptprodukt;

BAR-PELED et al.

1991; ÖZMEN 2014

Luteolin Apigenin Hydroxylierung mittels Flavonoid 3‘-Monooxygenase (EC 1.14.13.21)

(29)

Schrifttum

Luteolin 7-O-Glycosid

Luteolin Zwischenprodukt;

keine Identifizie- rung in Grassila- gen, da Flavon 7-O-Glycoside sehr schnell durch Enzyme zu Flavon 7-O-Rutinoside umgewandelt werden

STICHER et al.

2015

Luteolin 7-O-Rutinosid

BAR-PELED et al.

1991; ÖZMEN 2014

Orientin (Flavon 8-C-Glycosid)

Direkte Derivatisie- rung der C-Atome des Grundgerüstes am entsprechen- den C-Glycosid ist sehr selten → nicht in allen Gras- silagen vorhanden, kein Vorkommen in Gras

Grassilagen, Heu ÖZMEN 2014

Isoorientin Luteolin 7-O-Glycosid

ÖZMEN 2014

Diosmetin Luteolin Grassilagen, Gras,

Heu

ÖZMEN 2014

(30)

Schrifttum

Diosmetin 7-O-Glycosid

Zwischenprodukt;

Keine Identifizie- rung in Grassila- gen, da Flavon 7-O-Glycoside sehr schnell durch Enzyme zu Flavon 7-O-Rutinoside umgewandelt werden

ÖZMEN 2014;

STICHER et al.

2015

Diosmin (Diosmetin 7-O-Rutinosid)

Hauptprodukt;

ÖZMEN 2014

(31)

Schrifttum

21 2.3 Fähigkeiten zur Komplexbildung

Pflanzen sind in der Lage, phenolische Substanzen zu speichern und zu ihrem eigenen Vorteil einzusetzen. Diese Substanzen können wasserlöslich sein, somit in der Vakuole gespeichert werden, bzw. nicht wasserlöslich sein (STICHER et al. 2015).

Als lösliche Subtstanzen kommen sie in der Vakuole vor, als nicht lösliche als Be- standteil von Lignin oder der Pflanzenzellwand (BORNEMAN et al. 1986). Wenn die Zellstruktur der Pflanze herabgesetzt ist, durch Alterung, Ernte, oder Schädigung durch Feinde, können diese Stoffe mit anderen Substanzen reagieren und Komplexe bilden (HO et al. 1992; RAWEL et al. 2002).

Komplexe können durch einfache phenolische Substanzen gebildet werden (Mono- phenole), sowie durch o-Diphenole und o-Chinone. Die beiden letztgenannten entstehen durch enzymatische Oxydation mittels Polyphenoloxidase, einem in der Pflanze ubiquitär vorkommenden Enzym (HASLAM 1974; LE BOURVELLEC u.

RENARD 2012). Dieses Enzym besteht aus Catecholoxidase (EC 1.10.3.1) und Lac- case (EC 1.10.3.2). Die Catecholoxidase katalysiert sowohl die Reaktion von Mono- phenolen zu o-Diphenolen (können über ortho-Gruppen andere Substanzen stärker binden; McMANUS et al. 1981; RAWEL et al. 2007; STICHER et al. 2015) als auch die aus o-Diphenolen entstehenden o-Chinone (HO et al. 1992; KROLL et al. 2001;

RAWEL et al. 2007; LE BOURVELLEC u. RENARD 2012; STICHER et al. 2015).

O-Chinone sind die reaktiveren Substanzen, sie sind in der Lage kovalente Bindun- gen einzugehen (ROHN et al. 2006; PRIGENT et al. 2008). Durch kovalente Bindun- gen können irreversible Komplexe entstehen (s. Kap. 2.3.1). RAWEL et al. (2002) sprechen sogar davon, dass die Vorstufe der Komplexbildung, die Bildung von Chi- nonen aus Diphenolen, erforderlich ist, um reaktivere Partner herzustellen.

2.3.1 Komplexformen

Phenolische Substanzen können mit weiteren Stoffen (z.B. mit Proteinen) u.a. reversible und irreversible Komplexe bilden (HASLAM 1974; AUSTIN et al. 1989;

HASLAM 1996; TSAI u. SHE 2006; LE BOURVELLEC u. RENARD 2012; AYDEMIR u. YEMENICIOGLU 2013). Diese unterscheiden sich anhand der Bindung, die zwischen der phenolischen Substanz und dem Reaktionspartner entsteht (s. Tab. 2.6;

HASLAM 1974; PEREZ-MALDONADO et al. 1995; HOFMANN et al. 2006; LE BOURVELLEC u. RENARD 2012). Ob es bevorzugte Bindungsarten und -stellen gibt, ist bis heute nicht vollständig geklärt. Es wird angenommen, dass u.a. die Kon- zentration der vorliegenden Reaktionspartner von entscheidender Rolle ist (s. Abb. 2.1; HASLAM 1974; BAXTER et al. 1997; LE BOURVELLEC u.

RENARD 2012). SIEBERT et al. (1996) und LE BOURVELLEC u. RENARD (2012) unterstellen eine schrittweise entstehende Komplexbildung, die initial durch eine re-

(32)

Schrifttum

22

versible Bindung (s. Tab. 2.6) der Reaktionspartner gestartet wird. Liegen multidentale phenolische Substanzen (mehrere funktionelle Gruppen besitzend) sowie Proteine in hoher Konzentration vor, können phenolische Substanzen an mehreren Proteinen binden, diese Quervernetzungen entstehen durch irreversible, kovalente Bindungen (s. Abb. 2.1; TSAI u. SHE 2006). Charakteristisch für die kovalenten Bindungen sind die o-Chinone. Zur Entstehung irreversibler Komplexe wird, nach HO et al. (1992), die Unterstützung von zusätzlichen Reagenzien (z.B. metallische Ionen) benötigt.

Tab. 2.6: Mögliche Bindungen der Reaktionspartner im Komplex und die daraus resultierende Komplexform

Komplexform Bindung Eigenschaft Literatur

Reversibel Wasserstoffbrücken- bindung (hydrogene Bindung)

Hydroxylgruppen der Phenole und Amid- oder Carbonylgrup- pen der anderen Stof- fe sind optimale Re- aktionspartner zur Bildung von Wasser- stoffbrückenbindun- gen

McMANUS et al.

1981; SIEBERT et al. 1996;

BEVERIDGE et al.

2000; AYDEMIR u.

YEMENICIOGLU 2013; OZDAL et al. 2013

Hydrophobe Wech- selwirkung

Wechselwirkung zwischen dem aromatischen Ring der phenolischen Substanz und der hydrophoben Seite des Proteins;

vermutlich stärkste Kraft der reversiblen Bindung

SIEBERT et al.

1996; LE

BOURVELLEC u.

RENARD 2012;

AYDEMIR u.

YEMENICIOGLU 2013

Van-der-Waals-Kraft Schwache Bindung, beeinflusst durch das umgebende Medium

CHARLTON et al.

2002 Ionenbindung Anion der Phenole

mit Kation der Protei- ne

HASLAM 1996

Irreversibel Kovalente Bindung Kondensation der oxidierten phenolischen Gruppen mit den nukleophilen Gruppen

(-SH, -OH, -NH2) der Proteine; Entstehung neuer Substanzen möglich

HASLAM 1974;

RAWEL et al.

2002;

RAWEL et al.

2005; ROHN et al.

2006; AYDEMIR u.

YEMENICIOGLU 2013

(33)

Schrifttum

23 2.3.2 Einflüsse auf die Komplexbildung

Es gibt Faktoren, wie z.B. den pH-Wert, die Konzentration, die molekulare Größe, die Temperatur, die die Komplexbildung fördernd oder hemmend beeinflussen. Diese Einflüsse können vom umgebenden Medium, von der phenolischen Substanz selber oder vom Reaktionspartner stammen (s. Tab. 2.7). Der Einfluss der Temperatur ist nicht eindeutig geklärt. PRIGENT et al. (2003) sowie TSAI und SHE (2006) sagen, dass die Auswirkungen der Temperatur sehr unterschiedlich sein können, sie sind abhängig von den chemischen Eigenschaften der Reaktionspartner.

(34)

Schrifttum

24 Tab. 2.7: Einflüsse auf die Komplexbildung

Einfluss Auswirkung auf Komplexbildung

Literratur

fördernd hemmend

pH-Wert pH 3,5-7,5: stabiler Komplex;

pH-Wert im Bereich des isoelektrischen Punktes des Pro- teins

pH <3,5: Komplex zerfällt JONES u.

MANGAN 1977; RAWEL et al. 2005; OZDAL et al.

2013

Temperatur Zu hohe Temperatur kann zur

Proteindenaturierung führen

RAWEL et al. 2005 Mit steigender Temperatur

(5°C, 25°C, 60°C) sinkt die Bindungskapazität

PRIGENT et al. 2003

Temperatur um 40°C HOFMANN et al. 2006

38°C: reversible Komplexe 5°C: irreversible Komplexe

PEREZ-MALDONADO et al. 1995

Proteinstruktur Flexible, offene Struktur und hoher Gehalt von Prolin

Starre Moleküle HO et al. 1992; HASLAM 1996; SHAHIDI u.

NACZK 2004;

HOFMANN et al. 2006 Molekulare Größe Größere phenolische Substan-

zen weisen höhere Bindungs- affinität auf und können an mehr als einer Stelle binden (multidentaler Ligand)

HASNI et al. 2011;

OZDAL et al. 2013

Flexibilität des Phenols Geringe molekulare Flexibilität HO et al. 1992

(35)

Schrifttum

Salze und metallische Ionen

Aluminium, Kalzium → binden sich an beide Komponenten:

 Proteine: an die Kar- boxylgruppen

 phenolischen Substanz:

über deren ortho-dihydroxy Gruppen

HO et al. 1992;

HASLAM 1996

Aceton Löst hydrogene Bindung

(s. Tab. 2.6) auf

HO et al. 1992; OZDAL et al. 2013

Formamid Löst hydrogene Bindung auf HO et al. 1992

Saponine Fördern die Entwicklung einer hydrophoben Schicht an der Proteinoberfläche, die Anhäu- fung und die Ausfällung des Komplexes

HO et al. 1992

Tertiäre Amidgruppen der Co-Substrate

Fördern Phenol-Proteinbin- dung

HO et al. 1992;

HOFMANN et al. 2006 Polysaccharide: Pektin,

Polygalacturonsäure, Gummiarabikum, Dex- transulfat, Xanthan, Car- rageen

Kapseln phenolische Substan- zen ein, sodass diese keine Komplexbildung mit anderen Substanzen eingehen können

McMANUS et al. 1985;

HO et al. 1992; LUCK et al. 1994

Natriumkasein Konkurriert mit Protein HO et al. 1992

N,N-dimethylformamid Harnstoff

Hydrogene Bindung-Akzeptor LE BOURVELLEC u.

RENARD 2012

Dioxan Nichtpolarer Stoff LE BOURVELLEC u.

RENARD 2012

Cytochrom C Kann den Komplex dissoziie-

ren

LE BOURVELLEC u.

RENARD 2012

(36)

Schrifttum

26 2.3.3 Phenol-Proteinkomplex

Die Phenol-Proteinbindung wird von mehreren Faktoren beeinflusst (s. Tab. 2.7).

Wichtig ist hier die Konzentration der Proteine (s.u., KAWAMOTO u.

NAKATSUBO 1997). Hinzu kommen die individuellen Eigenschaften verschiedener Proteine und Phenole, wie die Hydrophobizität, der isoelektrische Punkt, die funktionellen Gruppen, der strukturelle Aufbau (TSAI u. SHE 2006; OZDAL et al. 2013) sowie die Bedingungen der Umgebung (s. Tab. 2.7; KAWAMOTO u.

NAKATSUBO 1997).

Kleine, strukturell eher geschlossene, kugelige Proteine haben nur eine geringe Affi- nität, phenolische Substanzen zu binden (HASLAM 1996). Proteine mit einer offe- nen, flexiblen Struktur, die zudem prolinreich sind, weisen deutlich höhere Bindungs- vorlieben auf (HO et al. 1992; HASLAM 1996; SHAHIDI u. NACZK 2004). Treffen phenolische Substanzen und Proteine aufeinander, können die phenolischen Sub- stanzen über ihre funktionellen Gruppen und ihren aromatischen Kern einen Kom- plex formen, der, wie oben beschrieben, reversibel oder irreversibel ist.

Liegen nur wenige Proteine vor, agieren die phenolischen Substanzen (mit mehreren funktionellen Gruppen) als eine Art Monolayer, der am Protein an einer oder mehreren Stellen reversibel bindet und somit eine weniger hydrophile Oberfläche bildet als die des Proteins, anschließend kommt es zur Ausfällung des Komplexes in Lösung (s. Abb. 2.1; McMANUS et al. 1981; SPENCER et al. 1988; HASLAM 1996;

STICHER et al. 2015). Sind viele Proteine vorhanden, können die phenolischen Sub- stanzen (mit mehreren funktionellen Gruppen) als multidentale Liganden an der Pro- teinoberfläche agieren, d.h., eine phenolische Substanz kann an mehrere Proteine binden (s. Kap. 2.3.1; McMANUS et al. 1981; HASLAM 1996). Durch Quervernet- zungen mehrerer Proteine bildet sich eine hydrophobe Oberfläche, der Komplex prä- zipitiert in Lösung (s. Abb. 2.1; HASLAM 1996; STICHER et al. 2015). Eine nicht vor- handene Präzipitation bedeutet jedoch nicht, dass keine Komplexe vorhanden sind (SHAHIDI u. NACZK 2004). Der multidentale Komplex kann zu einer strukturellen Änderung der Reaktionspartner führen (SPENCER et al. 1988; PRIGENT et al. 2003). Aber auch einfache phenolische Substanzen können mit Proteinen reagieren und diese in Lösung ausfällen. Sie müssen in Lösung in einer Konzentration vorhanden sein, die das Gleichgewicht zugunsten der Phenol-Proteinkomplexe halten und somit eine hydrophobe Schicht auf der Oberfläche der Proteine bilden kann (s. Abb. 2.2; HASLAM 1974; McMANUS et al. 1981; SPENCER et al. 1988).

Die Komplexbildung führt neben der strukturellen Veränderung auch zur Änderung der Funktion und Eigenschaft der Substanz (RAWEL et al. 2005; OZDAL et al. 2013).

Zudem können Proteine in ihrer Löslichkeit und Verdaulichkeit beeinträchtigt werden (OZDAL et al. 2013).

(37)

Schrifttum

27

Abb. 2.1: Phenol-Proteinkomplexbildung, phenolische Substanz mit zwei oder mehr funktionellen Gruppen: a) reversible Bindung, b) irreversible Bin- dung; modifiziert nach McMANUS et al. (1981)

Abb. 2.2: Phenol-Proteinkomplexbildung, einfaches Phenol; modifiziert nach McMANUS et al. (1981)

Protein

Protein Protein

Phenolische Substanz (viele funktionelle Gruppen)

a) Es liegen wenige Proteine vor, Phenole agieren als Monolayer

b) Es liegen viele Proteine vor, Phenole verbinden Proteine („cross-link“)

Protein Einfaches Phenol

Protein

(38)

Schrifttum

28

2.3.4 Einfluss phenolischer Substanzen auf Sojaproteine

In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen einer Fütterung von Silagen mit einem RE-Anteil am RP von <50 %, aufgewertet durch eine Sojaproteinzulage, auf die Fer- mentationsvorgänge im Verdauungstrakt in vitro getestet (s. Kap. 3). Speziell für diese Arbeit ist die Bindung von phenolischen Substanzen mit Sojaproteinen bedeutend.

RAWEL et al. (2002) untersuchten die Reaktionen verschiedener Phenolsäuren und Flavonoide mit Sojaproteinen (s. Kap 2.3.4.1). Die wichtigsten in der Sojabohne vorkommenden Proteine sind das Glycinin (11S-Speicherproteinfamilie) und β-Conglycinin (Glycoprotein, 7S-Speicherproteinfamilie; TSUMURA et al. 2004;

MO et al. 2006; RAWEL et al. 2007; MARUYAMA et al. 2015; GAN et al. 2016). Hin- zu kommen das γ-Conglycinin, die Trypsininhibitoren und Lectine (nähere Informati- onen zum Aufbau des Sojaproteins s. GÖRES 2016). Glycinin hat eine, verglichen mit β-Conglycinin, kompaktere Konformation, die zur Limitierung der funktionellen Eigenschaften führt (CUI et al. 2013).

2.3.4.1 Glycinin und Trypsininhibitoren

RAWEL et al. (2002) wiesen nach, dass Glycinin und Trypsininhibitoren durch Chlo- rogen-, Kaffee- und Gallussäure sowie verschiedene Flavonoide, Flavone, Apigenin, Kaempferol, Quercetin und Myricetin komplexiert werden und überwiegend über kovalente Bindungen, an den nukleophilen Seitenketten der Proteine, verbunden sind. Nach ALU’DATT et al. (2014) wurden hauptsächlich p-Cumar-, Syringasäure und Hesperidin, gebunden an Sojaproteinisolaten, gefunden, Gallus-, Hydroxyben- zoe-, Kaffee-, Syringa-, p-Cumar- und Ferulasäure an Leinsamproteinisolaten.

Zwischen den von RAWEL et al. (2002) getesteten Proteinen und Phenolsäuren sowie Quercetin und Myricetin entstehen während der Komplexierung neben den kovalenten Bindungen vermutlich auch nicht-kovalente Bindungen (s. Tab. 2.6), die auf die Caroboxyl- bzw Hydroxylgruppen (Flavonoide) zurückzuführen sind. Die neuen Komplexe weisen einen in den niedrigeren pH-Bereich verschobenen isoelektrischen Punkt sowie höhere molekulare Fraktionen auf. Die isoelektrischen Punkte von Gly- cininkomplexen verschieben sich von pH 5 zu pH 3,5, die isoelektrischen Punkte der Trypsininhibitorkomplexe sinken über einen größeren pH-Bereich. Die Glycininkom- plexe (Glycinin und Chlorogensäure, sowie Glycinin und Quercetin) haben ähnliche Löslichkeiten (in Ethanol und deionisiertem Wasser), die Trypsininhibitorkomplexe (Trypsininhibitoren und Chlorogensäure, Kaffeesäure, Gallussäure und Quercetin) weisen stark voneinander abweichende Löslichkeiten auf.

Weiterhin konnten RAWEL et al. (2002) nachweisen, dass die phenolischen Sub- stanzen unterschiedlich mit den Proteinen reagieren. Die Reaktivität von Chlorogen- und Kaffeesäure ist in etwa gleich, Flavonoide hingegen reagieren schneller, bedingt durch die Anzahl und Position der Hydroxylgruppen. Quercetin und Myricetin können über ihre Hydroxylgruppen am B- und C-Ring mehr Bindungen, verglichen mit Flavo-

(39)

Schrifttum

29

ne und Apigenin, mit den Tryptophanseitenketten der Proteine eingehen. Eine Pro- teinderivatisierung (sowohl Glycinin als auch die Trypsininhibitoren) mit phenolischen Substanzen hat eine Reduzierung des Tryptophangehalts zur Folge (s.u., RAWEL et al. 2002). Der Tryptophangehalt von Glycinin liegt bei 33,1 nmol mg^-1protein, bindet Chlorogensäure am Glycinin, sinkt er auf 11,6 nmol mg ^-1protein. Bindet Quercetin am Glycinin, liegt er nur bei 6,9 nmol mg ^–1protein. Seitens der Proteine werden auch Bindungen mit phenolischen Substanzen über die α-Amino- und ε-Lysinseitenketten (stark nukleophile Reaktionsseiten) vermutet (RAWEL et al. 2002).

Weiterhin fanden RAWEL et al. (2002) auch Einwirkungen auf den Gehalt an Thi- olgruppen (vom Glycinin) heraus. Diese werden nicht zu Disulfidbrücken umgebaut, sie reagieren mit den phenolischen Substanzen. Die oben genannten Phenolsäuren reagieren ähnlich mit den Thiolgruppen, bei den Flavonoiden hingegen zeigen nur Apigenin und Kaempferol eine Reaktivität, deren Mechanismus jedoch noch uner- forscht ist.

RAWEL et al. (2002) geben anhand der Analysen von Tryptophan, der freien Amino- gruppen und der Thiolgruppen eine Prognose zur Reaktion der phenolischen Sub- stanzen mit der Gesamtheit der Proteinseitenketten. Demnach kann man, unter Vor- behalt, folgende Reihenfolge zur Reaktivität und Bindungsstärke festlegen:

Gallussäure > Chlorogensäure ≈ Quercetin > Myricetin > Kaffeesäure > Kaempferol

> Apigenin > Flavone.

Weiterhin konnte ein Einfluss der phenolischen Substanzen auf die Struktur von Gly- cinin dargestellt werden. Normalerweise setzt sich unverändertes Glycinin aus α-Helix (14 %), β-Strang (35 %), β-Schleife (20 %) und ungeordneter Struktur (31 %) zusammen (RAWEL et al. 2002). Chlorogensäure führt zu jeglicher Art von Verände- rungen der sekundären Struktur, Kaffee- und Gallussäure senken geringfügig den Anteil der α-Helix-Fraktion. Flavone senken die Anteile der α-Helix- und β-Strang-Fraktionen. Apigenin, Kaempferol und Quercetin hingegen steigern den Anteil der α-Helix- und β-Strang-Fraktionen. Myricetin wirkt sich negativ auf die α-Helix aus, steigert wiederum die Anteile der β-Strang- und β-Schleife-Fraktionen.

Die Ergebnisse von RAWEL et al. (2002) zeigten auf, dass die Veränderungen der Proteinstruktur abhängig vom Komplexpartner, also der jeweiligen phenolischen Substanz, sind.

(40)

Schrifttum

30 2.3.4.2 β-Conglycinin

GAN et al. (2016) untersuchten die Bindung von β-Conglycinin mit p-Cumarsäure, Kaffeesäure, Gallussäure und Chlorogensäure. β-Conglycinin besitzt eine trimere Struktur (PICARIELLO et al. 2013; MARUYAMA et al. 2015), bestehend aus den Untereinheiten α, α' und β. Die α-,α'-Untereinheiten, Präpro-Formen, besitzen neben der Kerndomaine eine Erweiterung am N-Terminus, die β-Untereinheit, Prä-Form, besteht nur aus der Kernregion (MARUYAMA et al. 1998, 2015). Alle Untereinheiten sind N-glykosyliert und besitzen Mannose-Glykane (PICARIELLO et al. 2013;

MARUYAMA et al. 2015). GAN et al. (2016) stellten folgende Einteilung der Un- tereinheiten von β-Conglycinin auf: α-Helix (19 %, α und α‘), β-Faltblatt (28,7 %) und zufällige Wicklungen (35,3 %). β-Conglycinin weist eine hohe Affinität gegenüber Fettsäuren, Phospholipiden und aromatischen Verbindungen auf. Kaffee- und Gal- lussäure binden 7S-Speicherproteine effektiver als p-Cumarsäure, da sie eine Hyd- roxylgruppe mehr besitzen, alle vier genannten phenolischen Verbindungen führen durch ihre Bindung kaum zu Veränderungen der Proteinstruktur (im Vergleich zu Glycinin). GAN et al. (2016) stellten die These auf, dass die Proteinstruktur nicht durch phenolische Substanzen verändert oder zerstört wird. Diese Phenolproteinbin- dungen beeinflussen den enzymatischen Proteinverdau (Pepsin und Trypsin) nicht.

2.3.5 Enzymhemmung durch phenolische Substanzen

Phenolische Substanzen können die Wirkmechanismen eines Enzyms auf unterschiedliche Weise hemmen (HASLAM u. LILLEY 1988). Sie können so bspw. die Verdaulichkeit von phenolreichen Pflanzen herabsetzen. HASLAM und LILLEY (1988) beschreiben als mögliche hemmende Einflüsse Enzympräzipitation durch phenolische Substanzen, eine Phenol-Substratkomplexbildung und eine En- zym-Inhibitorkomplexbildung. Letztere wird in Abbildung 2.3 dargestellt. Binden keine phenolischen Substanzen am Enzym, kann es das Substrat aufnehmen und verar- beiten (Produkte; s. Abb. 2.3, unterer Weg). Kommt es jedoch zur Bindung der phenolischen Substanzen (Inhibitor) am Enzym, kann ein löslicher, aber inaktiver Kom- plex entstehen, sodass zwar Substrat am Enzym gebunden wird, dieses aber nicht wieder verlässt. Die Aktivität der Enzyme ist gehemmt (HASLAM u. LILLEY 1988).

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Abb. 2.3: Enzymhemmung durch phenolische Substanzen; modifiziert nach HASLAM u. LILLEY (1988)

Es gibt Substanzen, die können die hemmende Wirkung der phenolischen Substan- zen auf die Enzyme herabsetzen. Proteine, wie Lysozym, Soja und Rinderserumal- bumin, sowie einige Alkaloide können einen Komplex mit den phenolischen Substan- zen eingehen, sodass diese die Enzyme nicht inaktivieren können (HASLAM u.

LILLEY 1988).

MARTINEZ-GONZALEZ et al. (2017) sagen, dass die Interaktionen zwischen Enzy- men und phenolischen Substanzen noch nicht ausreichend erforscht sind. Sie gehen davon aus, dass die reversiblen Bindungen (Van-der-Waals-Kräfte, Ionenbindungen, etc., s. Tab. 2.6) die Enzym-Phenol-Bindungen regulieren. Des Weiteren hat die An- zahl an Hydroxylgruppen einen Einfluss, mit steigenden Hydroxylgruppen steigt bspw. die Bindung von Flavonoiden mit Trypsin. Flavonoide zeigen zudem, auf Grund ihrer komplexeren Struktur, einen stärkeren inhibitorischen Effekt auf Enzyme als Phenolsäuren (MARTINEZ-GONZALEZ et al. 2017).

Enzym

Substrat phenolische

Substanzen (Inhibitor)

Produkte

Enzym + Substrat

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2.3.6 Einfluss von Pepsin und dem pH-Wert auf die Struktur der Sojaprote- ine

Der Wiederkäuer nimmt phenolische Substanzen über das Grundfutter auf. Das Fut- ter gelangt, nachdem es den Pansen (erster in vitro Entnahmeort, s. Kap.1) und das weitere Vormagensystem passiert hat, in den Labmagen (zweiter in vitro Entnahme- ort). Die Auswirkungen von Pepsin und des pH-Wertes stehen hier besonders im Fo- kus, da ein Einfluss dieser auf verschiedene Fütterungsmodelle (s. Kap. 3) getestet wurde. Saure Milieubedingungen (pH 2-3) führen zu einer Entfaltung der Protein- struktur, sodass auch gerade die verborgenen Strukturen im Inneren des Proteins für enzymatische Reaktionen zugänglich werden (CUI et al. 2013). Dies allein führt jedoch nicht zur vollständigen Zerlegung des Proteins, sodass eine enzymatische Re- aktion notwendig ist (CUI et al. 2013).

Das Reaktionsoptimum von Pepsin liegt im sauren pH-Bereich (pH 1,5-2;

BAKER 1954; CUI et al. 2013), sodass ein niedriger pH-Wert günstige Umgebungs- bedingungen für enzymatische Reaktionen bietet.

Wie oben beschrieben, besteht das Sojaprotein hauptsächlich aus Glycinin und β-Conglycinin (70 %; TSUMURA et al. 2004). Die verschiedenen Untereinheiten des Proteins führen zu einem zeitlich separierten enzymatischen Abbau. Bereits BAKER (1954) beschrieb einen Proteinabbau, der diese These unterstreicht. Es wird ein Enzym-Substratkomplex beschrieben, der normalerweise zwei Produkte entlässt.

Hier kommt es jedoch nur zur Freisetzung eines Produktes, das andere ist weiterhin am Enzym gebunden und es wird erst später entlassen. CUI et al. (2013) fanden heraus, dass die Glycininfraktion im sauren Milieu von Pepsin hydrolysiert werden kann. Bereits nach zehn Minuten kam es zu ersten Spaltungen innerhalb des Pro- teins, nach 120 Minuten war Glycinin vollständig zerlegt. β-Conglycinin hingegen zeigte innerhalb seiner drei Untereinheiten sehr unterschiedliche Reaktionsmuster.

Die α-Untereinheit verschwand mit steigender Inkubationszeit, die α‘- und β-Untereinheiten zeigten nur mäßige Auswirkungen einer enzymatischen Reaktion auf ihre Bindungen (CUI et al. 2013; YANG et al. 2016). YANG et al. (2016) legen allerdings dar, dass gerade β-Stränge anfällig sind für Hydrolysen mittels Pepsin.

GAN et al. (2016) schildern, dass das im Sojaprotein vorkommende Glycopeptid β-Conglycinin (7S) mit phenolischen Substanzen reagiert. Das Protein kann dennoch ungehindert von den Enzymen Pepsin und Trypsin abgebaut werden, da die phenolischen Substanzen und Enzyme an verschiedenen Stellen am Protein binden (es kommt zu keiner Enzymhemmung, da es keine direkte Phenol-Enzymbindung geben soll). Dieser Abbau ist sowohl bei pH-Wert 2 und 4 möglich.

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2.4 Aufnahme von phenolischen Substanzen: Auswirkungen auf den Wiederkäuer

Wiederkäuer nehmen phenolische Substanzen über das Grundfutter auf. Durch den Zerfall der Pflanzenzelle treten diese in Wechselwirkung mit anderen Stoffen, wie den Proteinen aus der Pflanze selbst, aber auch mit Speichelproteinen (McNABB et al. 1996; WAGHORN 2008). Die Wechselwirkung mit Speichelproteinen tritt vor allem bei Tieren, die ihre Nahrung selektiv aufnehmen, auf (AUSTIN et al. 1989; HAGERMAN u. ROBBINS 1993). Diese Tiere haben eine im Verhältnis zu ihrem Körpervolumen große Glandula parotis, über die Speichel mit einer hohen Konzentration an prolinreichem Protein produziert wird (WAGHORN 2008). Diese Proteine besitzen eine hohe Bindungskapazität gegen- über Tanninen, besonders kondensierten Tanninen (Entstehung über Flavonoidbio- synthese, s. Kap. 2.2). Diese Methode nutzen sie, um den seitens der Pflanze entwi- ckelten chemischen Schutz gegen Blattverlust umgehen zu können und die antinutri- tiven Effekte hoher Tanninkonzentrationen zu reduzieren. Einige dieser Tiere, wie der Elch, haben sehr spezifische Speichelproteine. Diese binden nur die phenolischen Substanzen, die normalerweise in ihrer Nahrung (Weide, Espe oder Birke) vorkommen. Domestizierte Kühe und Schafe (grasende Tiere) besitzen diese beson- dere Fähigkeit nicht (AUSTIN et al. 1989). Als mögliche Ursachen werden die Do- mestikation, Zucht und Selektion genannt (WAGHORN 2008). Hier können phenolische Substanzen verschiedene Effekte, die sowohl begünstigend als auch hemmend sein können, ausüben. So kann bereits die freiwillige Futteraufnahme reduziert sein (ULYATT et al. 1977; BARRY u. DUNCAN 1984; WAGHORN 2008).

Vorangegangene Studien befassen sich überwiegend mit dem Vorhandensein von Proanthocyanidinen (kondensierte Tannine, entstehen im Flavonoidstoffwechsel aus Dihydroquercetin und Catechin) in Leguminosen. Es fehlt jedoch eine weitere Diffe- renzierung der Substanzen und es geht nicht hervor, welche phenolischen Substan- zen im Einzelnen und in welchem Umfang zu bestimmten Auswirkungen führen. Die- se Gruppe phenolischer Substanzen kommt auch in Gräsern vor, allerdings in deutlich geringeren Konzentrationen und es zeigen sich möglicherweise schwächere Auswirkungen (ROSS u. JONES 1974; AERTS et al. 1999; WAGHORN 2008).

BORNEMAN et al. (1986) untersuchten einen Einfluss einiger, für Gräser bedeutsa- meren, Phenolsäuren (u.a. p-Cumarsäure, Ferulasäure) auf die Pansenbakterienpo- pulation. Sie fanden sowohl positive wie auch negative Einflüsse heraus. Nichtzellu- lolytische Bakterien scheinen eine größere Toleranz gegenüber phenolischen Sub- stanzen zu besitzen als zellulolytische Bakterien (BORNEMAN et al. 1986). Auch LOWRY et al. (1993) untersuchten Gräser auf das Vorhandensein und die Auswir- kungen von Phenolsäuren. Sie fanden keinen nachteiligen Effekt dieser Substanzen auf den Metabolismus der Pansenbakterien. Die dort aufgezeigten Auswirkungen der

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Phenolsäuren bezogen sich auf einen hohen Stickstoffverlust, besonders bei Fütte- rung von stickstoffarmen Futtermitteln.

Tabelle 2.8 gibt eine Übersicht bekannter Auswirkungen phenolischer Substanzen auf den Wiederkäuer. Diese sind sehr abhängig von dem Typ und der Konzentration der vorkommenden phenolischen Substanz sowie der Futterkomposition, der aktuel- len körperlichen Verfassung des Tieres und dem Vorhandensein weiterer Stoffe (WAGHORN 2008). Negative Auswirkungen zeigen sich bei einer hohen Konzentra- tion an phenolischen Substanzen in der Trockenmasse (AERTS et al. 1999).

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Tab. 2.8: Postulierte Auswirkungen phenolischer Substanzen auf den Wiederkäuer

Phenolische Substanz Vorkommen Effekt Literatur

Proanthocyanidine Lotus corniculatus Verhindern Proteinabbau (Desaminierung) durch Pansenmikroorganismen

BARRY u. MANLEY 1984; BARRY u.

McNABB 1999;

WAGHORN 2008 Proanthocyanidine Lotus pedunculatus Binden Proteine, sodass diese unlöslich

werden

BARRY u. DUNCAN 1984; WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Lotus corniculatus Hedysarum coronarium

Verringern Gefahr der Pansentympanie und schaumige Gärung

ROSS u. JONES 1974;

ULYATT et al. 1977;

JOHN u.

LANCASHIRE 1981;

BARRY u. DUNCAN 1984; MIN et al. 2003 Proanthocyanidine Lotus corniculatus Erhöhen duodenalen Proteinfluss, indem

sie den Proteinabbau im Pansen reduzieren

JOHN u.

LANCASHIRE 1981;

BARRY u. DUNCAN 1984; WAGHORN et al. 1987; PEREZ- MALDONADO et al.

1995; AERTS et al.

1999; WAGHORN 2008

Proanthocyanidine Lotus corniculatus Onobrychis coronarium

Reduzieren die proteolytische Bakterienpo- pulation

MIN et al. 2003;

WAGHORN 2008 Proanthocyanidine Lotus pedunculatus

Onobrychis coronarium

Reduzieren Aminosäureabsorption im Duo- denum

WAGHORN et al.

1994;

WAGHORN 2008 Proanthocyanidine Lotus corniculatus

Hedysarum coronarium

Erhöhen Nettoabsorption essentieller Ami- nosäuren

WAGHORN et al.

1987; MIN et al. 2003

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Proanthocyanidine Lotus corniculatus Lotus pedunculatus

Erhöhen postruminale NPN-Absorption ULYATT et al. 1977;

JOHN u.

LANCASHIRE 1981;

BARRY 1984; MIN et al. 2003

Proanthocyanidine Lotus pedunculatus Acacia aneura

Setzen die freiwillige Futteraufnahme und Trockenmasseaufnahme herab

BARRY u. DUNCAN 1984; PRITCHARD et al. 1988; WAGHORN et al. 1994

Proanthocyanidine Lotus pedunculatus Reduzieren Faserverdaulichkeit im Pansen BARRY et al. 1986 Proanthocyanidine Lotus pedunculatus

Acacia aneura

Verringern scheinbare Verdaulichkeit von strukturierten Kohlenhydraten, organischer Masse, Trockenmasse, Stickstoff

BARRY u. DUNCAN 1984; BARRY u.

MANLEY 1984;

PRITCHARD et al.

1988; WAGHORN et al. 1994; PEREZ- MALDONADO et al.

1995 Proanthocyanidine Setzten Schmackhaftigkeit des Futters her-

ab

BARRY u. DUNCAN, 1984; PEREZ-

MALDONADO et al.

1995 Proanthocyanidine Lotus corniculatus

Erhöhen Milchproduktion und Laktosege- halt ab Mitte der Laktation

BARRY u. McNABB 1999; MIN et al. 2003 Proanthocyanidine Lotus corniculatus

Gesteigerte Ovulationsrate (k. A. zum Me- chanismus)

BARRY u. McNABB 1999; MIN et al. 2003 Proanthocyanidine Lotus pedunculatus Senken die Körpermassezunahme BARRY u. McNABB

1999 Proanthocyanidine Lotus corniculatus Erhöhen das Lebendgewicht bei Lämmern

(k. A. zum Mechanismus)

WAGHORN 2008