Dauerbetrieb - Rumen Simulation Technique (RUSITEC)

3.2 Material und Methoden

3.2.1 Rumen Simulation Technique (RUSITEC)

3.2.1.3 Dauerbetrieb

Das Fermentationssystem lief über einen Versuchszeitraum von 28 Tagen, der in verschiedene Phasen eingeteilt war (s. Tab. 3.8). Die Futterbeutel wurden während des Dauerbetriebs mit Grassilage (10,5 g TS), Maisstärke (2,6 g uS) und Fermen-ter 5+6 zusätzlich mit Sojaprotein (0,33 g uS) befüllt (s. Tab. 3.2).

Eine tabellarische Übersicht der täglichen Aufgaben kann Tabelle 3.2 entnommen werden (abweichend vom täglichen Arbeitsablauf ist der bereits 24 Stunden nach Inbetriebnahme erfolgte Austausch der Nylonbeutel mit festem Panseninhalt gegen Nylonbeutel, die mit Grassilage befüllt waren). Für die in dieser Arbeit zu analysie-renden Parameter wurden 6 ml Fermenterflüssigkeit zur Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren sowie 10 ml Fermenterflüssigkeit zur Phenol- und o-Diphenolbestimmung entnommen. Hinzu kamen 10 ml Überstandflüssigkeit zur Bestimmung der Produkti-on der flüchtigen Fettsäuren (FlFS) und 20 ml Überstandsflüssigkeit zur Bestimmung der Phenol- und Diphenolgehalte.

Zusätzlich wurden aus den 6 Fermentern täglich weitere 26 ml Flüssigkeit entnom-men, die im Rahmen der Disserationen von GÖRES (2016), ILLE (2017), THOMSEN (in Vorbereitung), EBHARDT (in Vorbereitung) und SCHULTE (in Vorbe-reitung) analysiert wurden. Tabelle 9.3 gibt eine Übersicht der Parameterverteilung.

Eigene Untersuchungen

Tab. 3.2: Übersicht der täglichen Arbeitsschritte, modifiziert nach GAST (2010), LUMPP (2011) und GÖRES (2016)

Zeit (min) Arbeitsschritt

-40  Laborvorbereitung

 Filtrierung der BRADFORD-Lsg.

 Eichung des GC-8A

 Eichung der pH- und Ammoniakelektrode

0  Abschaltung des RUSITEC (Hubmotor, Pufferzufuhr)

1  Abkopplung der Gasbeutel

2-45  Entnahme des Fermenters aus dem Wasserbad

 Öffnen des Fermenters und Entnahme der Fermenterproben

 Entnahme des seit 48 h inkubierten Nylonbeutels und Einset-zen eines neu beladenen Beutels

 Entleerung und Spülung des herausgenommenen Nylonbeu-tels (mit 50 ml warmer Pufferlösung)

 Rückführung der Spülflüssigkeit in den Fermenter

 Fermenterschließung und Arretierung im Wasserbad

 Wiederholung dieser Schritte an den Fermentern 2-6

 Bestimmung des Überstandsvolumens und Entnahme der Überstandsproben

 Vorlegen von 40 ml halbkonzentrierter Salzsäure in die Über-standsgefäße

 Messung des Gasvolumens in den Gasbeuteln

 Entnahme von 1 ml Gasprobe zur Messung der Zusammen-setzung am GC-8A

45  Einschaltung der Pufferzufuhr

45-60  1 minütige CO2-Begasung der Fermenter mit direktem An-schluss eines leeren Gasbeutels

 Einschaltung Hubmotor

60-210  Probenaufbereitung, -analytik und –asservierung

 Vorbereitungen für den nächsten Versuchstag (Futtermittel und Bedarfsgegenstände)

 Reinigung des Arbeitsplatzes

Eigene Untersuchungen

44 3.2.1.4 Zusammensetzung der Pufferlösung

Die Pufferlösung, die dem Fermentationssystem zugeführt wurde, diente der Simula-tion des Speichelflusses sowie der Spülung der im Innenbehälter des Fermenters befindlichen futtergefüllten Nylonsäckchen. Der Puffer bestandt aus einer Lösung A (4950 ml), zu der langsam tropfend unter ständigem Rühren 50 ml von Lösung B hinzugegeben wurde. Die Zusammensetzung des Puffers entsprach der Vorgabe von McDOUGALL (1948, Tab. 3.3).

Tab. 3.3: Zusammensetzung der Pufferlösung nach McDOUGALL (1948) Zusammensetzung

Lösung A

49,0 g NaHCO3

(Fa. Grüssing, Filsum, Deutschland; Art.-Nr. 121435000) 46,5 g Na2HPO4 12 H2O

(Fa. VWR International, Hannover, Deutschland; Art.-Nr. 28020.361) Ad 4950 ml ionenfreies Wasser

(Seradest®)

Lösung B

47,0 g NaCl

(Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland; Art.-Nr. 106404) 57,0 g KCl

(Fa. Grüssing, Filsum, Deutschland; Art.-Nr. 12008) 12,8 g MgCl2 · 6 H2O

(Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland; Art.-Nr. 105833) 5,3 g CaCl2 · 2 H2O

(Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland; Art.-Nr. 102382) Ad 1000 ml ionenfreies Wasser

(Seradest®) 3.2.2 Spendertier 3.2.2.1 Identität

Der für die Inbetriebnahme des RUSITEC erforderliche Pansensaft und feste Pan-seninhalt stammte von einem pansenfistulierten Tier aus der Klinik für Rinder. Es handelte sich hierbei um ein weibliches Rind der Rasse Deutsch Holstein, dass 2003 geboren wurde. Zum Entnahmezeitpunkt wog das nicht laktierende Tier 650 kg.

3.2.2.2 Haltung und Fütterung

Das Rind wurde zusammen mit zwei anderen Rindern in einer mit Stroh eingestreu-ten Laufbox gehaleingestreu-ten. Dem Spendertier wurde fünf Tage vor Versuchsbeginn zusätz-lich tägzusätz-lich die Kontrollsilage, die später auch im Versuch zum Einsatz kam, zum Fut-ter hinzugegeben. Am Tag der Beladung wurde es morgens und mittags außerdem mit 5 kg (uS) Kontrollsilage und 800 g (uS) Kraftfutter gefüttert. Die Beschaffenheit der Futterkomponenten kann dem Kapitel 3.2.3 entnommen werden.

Eigene Untersuchungen

45 3.2.2.3 Pansensaftentnahme

Am Tag der Inbetriebnahme des RUSITEC wurden der Pansensaft sowie der feste Panseninhalt drei Stunden nach Fütterung (morgens und mittags) entnommen und bis zum Gebrauch in Thermogefäßen temperiert gehalten. Die Entnahme über die Pansenfistel erfolgte nach der von HÖLTERSHINKEN (1990) beschriebenen Tech-nik.

3.2.3 Futterkomponenten

3.2.3.1 Herkunft und Beschaffenheit der Grassilagen

Die für die Versuchsdurchgänge verwendeten Grassilagen stammen von einem Milchviehbetrieb aus Niedersachsen. Die Proben für die Testfermenter entstammen jeweils vom 1. Schnitt aus 2014 und 2015 (Schadsilagen), für die Kontrollfermenter vom 3. Schnitt 2014 (Kontrollsilage). Alle drei Schnitte kamen von derselben Fläche.

Die Verfütterung der Silage vom 1. Schnitt 2014 führte zu einer Anhäufung von un-spezifischen Krankheiten (u.a. Reproduktionsstörungen, Klauenerkrankungen und Stoffwechselstörungen) in den Betrieben. Die Silage vom 1. Schnitt 2015 wurde im Betrieb mit Sojaextraktionsschrot supplementiert, ein vermehrtes Auftreten unspezifi-scher Krankheitssymptome blieb aus. Die Fütterung der Silage vom 3. Schnitt 2014 verursachte kein Krankheitsgeschehen.

Sensorisch wiesen die Silagen nach VDLUFA-Richtlinien keine Abweichungen auf.

Analysen ergaben, dass die Silagen vom jeweils 1. Schnitt einen Gehalt an Reinei-weiß (RE) am Rohprotein (RP) von unter 50 % aufwiesen (s. Kap. 3.2.3.1.2).

Die Silagen wurden für die Verwendung im RUSITEC-System auf eine Halmlänge von 2 cm gekürzt und bei -20 °C gelagert.

3.2.3.1.1 Kontrollsilage

Die Kontrollsilagen wurden definiert als Silagen, deren RE-Anteil am RP > 50 % ist (GAST 2010). Laut EICKEN (2005b, 2013) soll der RE-Anteil am RP größer als 50 % sein, damit sie als nicht beeinträchtigt eingestuft werden können. Für L35-42 (s. Tab. 3.1) wurde Kontrollsilage (K-32) vom 3. Schnitt 2014 eingesetzt. Zusammen-setzung der Nährstoffe, Analysen durch das Institut für Tierernährung, Stiftung Tier-ärztliche Hochschule Hannover, s. Tab. 3.4. Aminosäurenzusammensetzung und GABA-Gehalte, Analysen durch die Fa. EVONIK Industries^®, Essen, s. Kap. 9.12.

3.2.3.1.2 Schadsilage

Die Schadsilagen wurden definiert als Silagen, deren RE-Anteil am RP < 50 % ist (GAST 2010). Für L35-38 wurde Schadsilage (S-33) vom 1. Schnitt 2014 sowie für L39-42 Schadsilage (S-35) vom 1. Schnitt 2015 eingesetzt. Zusammensetzung der

Eigene Untersuchungen

Nährstoffe, Analysen durch das Institut für Tierernährung, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, s. Tab. 3.5. Aminosäurenzusammensetzung und GA-BA-Gehalte, Analysen durch die Fa. EVONIK Industries^®, Essen, s. Kap. 9.12.

Eigene Untersuchungen

Tab. 3.4: Analyse der Nährstoffzusammensetzung der verwendeten Kontrollsila-gen K-32 durch das Institut für Tierernährung, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Kontrollsilage K-32

Bezeichnung Dimension Gehalt

K-32

TS g/kg uS 525

Ra g/kg TS 80,6

Rp g/kg TS 152

RE g/kg TS 90,4

RE % vom RP % 59,5

Rfe g/kg TS 27,7

Rfa g/kg TS 279

NfE¹ g/kg TS 461

NDF g/kg TS 623

ADF g/kg TS 320

ME² MJ/kg TS 9,91

NEL MJ/kg TS 6,16

pH-Wert 4,45

Tab. 3.5: Analyse der Nährstoffzusammensetzung der verwendeten Schadsila-gen S-33 und S-35 durch das Institut für Tierernährung, Stiftung Tier-ärztliche Hochschule Hannover

Schadsilage S-33 und S-35

Bezeichnung Dimension Gehalt

S-33 S-35

TS g/kg uS 253 273

Ra g/kg TS 84,7 65,4

Rp g/kg TS 213 220

RE g/kg TS 85,8 95,3

RE % vom RP % 40,3 43,3

Rfe g/kg TS 37,7 41,4

Rfa g/kg TS 281 229

NfE¹ g/kg TS 384 444

NDF g/kg TS 569 460

ADF g/kg TS 301 262

ME² MJ/kg TS 10,48 11,4

NEL MJ/kg TS 6,26 6,86

pH-Wert 3,99 4,09

1 Rechenwert; ²Rechenwert (Regressionsgleichung s. KAMPHUES et al. 2014)

Eigene Untersuchungen

3.2.3.2 Herkunft und Beschaffenheit der Maisstärke

Während der Versuchsphasen wurden den Futterbeuteln täglich 2,6 g uS Maisstärke, Fa. Cerestar Deutschland GmbH, Krefeld, Deutschland, Art.-Nr. 03402 hinzugege-ben. Diese Menge hatte sich in vorherigen Versuchen als günstig erwiesen (GÖRES 2016).

3.2.3.3 Herkunft und Beschaffenheit des Sojaproteins

Um die während der Zulagephase gefütterteten Schadsilagen mit einem zu niedrigen Reineiweißgehalt am Rohprotein auf den benötigten RE-Gehalt von 55 % anzuhe-ben, wurde den Testfermentern TF-33mS und TF-35mS zusätzlich 0,33 g uS (0,31 g TS) isoliertes Sojaprotein SUPRO® 670 IP der Firma Danisco, Niebüll, Deutschland hinzugeben. Die Nährstoffangaben können der Tabelle 3.6 entnommen werden.

Tab. 3.6: Nährstoffangaben Sojaprotein SUPRO® 670 IP (Herstellerangaben)

Bezeichnung Dimension Gehalt

TS g/kg uS ≥ 945

Ra % 3,90

Rp % 87,0

Rfe % 4,60

Rfa % k. A.

Kalzium % 0,20

Phosphor % 0,80

Natrium % 1,40

Brennwert MJ/kg 15,8

pH-Wert 7,3–7,7

ME MJ/KG uS 16,7¹

1 KAMPHUES et al. 2014

3.2.3.4 Herkunft und Beschaffenheit des Kraftfutters

Die Nährstoffgehalte des Kraftfutters Prima 18 III pe, Milchleistungsfutter II (Ergän-zungsfuttermittel für Milchkühe der Firma ForFarmers Langförden GmbH, Vechta-Langförden, Deutschland, Art.-Nr. 810066), mit dem das Spendertier täglich gefüttert wurde, werden in Tabelle 3.7 dargestellt (Herstellerangaben).

Eigene Untersuchungen

Tab. 3.7: Nährstoffangaben Kraftfutter Prima 18 III pe, Milchleistungsfutter II

Bezeichnung Dimension Gehalt

Ra % 6,0

Rp % 18,0

Rfe % 4,0

Rfa % 10,5

Kalzium % 0,8

Phosphor % 0,55

Natrium % 0,25

NEL MJ/kg 6,7

Vitamin A I.E./kg 8750

Vitamin D3 I.E./kg 875

Vitamin E mg/kg 13,0

Jod als Kalziumjodat mg/kg 0,7

Mangan(II)-oxid mg/kg 26,0

Zinkoxid mg/kg 35,0

Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat mg/kg 9,0

Cobalt(II)-carbonathydroxid mg/kg 0,28

Natriumselenit mg/kg 0,35

3.2.4 Versuchsdurchführung

In acht Versuchsdurchgängen wurde der Einfluss von zwei Schadsilagen und einer Kontrollsilage auf den Pansenstoffwechsel in vitro getestet. Eine Versuchsphase be-gann mit dem Tag der Beladung (Tag 0), dem sich 28 Versuchstage anschlossen.

Jeder Versuchsdurchgang war unterteilt in Beladungsphase (Tag 0), Einlaufphase (Tag 1-6, um stabile Fermentationsbedingungen zu erhalten), Kontrollphase (Tag 7-8, steady state nach CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977), Zulagephase (Tag 9-18, Schadsilagen + ggf. Sojaprotein) und Erholungsphase (Tag 19-28, um eine Regeneration des Fermentationssystems zu erzielen).

Die Inbetriebnahme sowie die Beladung während des Dauerbetriebs kann Tabel-le 3.8 entnommen werden.

Die Probenentnahme (s. Kap. 3.2.1.3) erfolgte vor der Neubeladung eines jeden Fermenters, sodass das Probenmaterial bereits 24 Stunden fermentiert wurde, bevor ein Effekt einer Futterumstellung zu analysieren war. Ein vollständiger Effekt der Fut-terumstellung konnte erst 48 Stunden später gemessen werden, da an jedem Tag nur ein Futtersäckchen getauscht wurde (tabellarische Übersicht der Verschiebung des messbaren Zulageeffekts durch den Probenentnahmezeitpunkt aus GÖRES (2016), modifiziert nach LUMPP (2011), s. Tab. 3.9).

Eigene Untersuchungen

Tab. 3.8: Übersicht Fermenterbeladung während der einzelnen Versuchsphasen, nach GÖRES (2016) und ILLE (2017)

Futterzulage KF 1+2 TF 3+4 TFmS 5+6

Beladung (Tag 0)

500 ml flüssiger Panseninhalt + 200 ml RUSITEC-Puffer + 100 ml ionenfreies Wasser (Seradest^®)

Futterbeutel 1: 80 g (uS) fester Panseninhalt + 2,6 g (uS) Stärke

Futterbeutel 2: 10,5 g (TS) Kontrollsilage (K-32) + 2,6 g (uS) Stärke

Einlaufphase

(Tag 1-6) 10,5 g (TS) Kontrollsilage (K-32) + 2,6 g (uS) Stärke Kontrollphase

(Tag 7-8) 10,5 g (TS) Kontrollsilage (K-32) + 2,6 g (uS) Stärke

Zulagephase (Tag 9-18)

10,5 g (TS) Kon-trollsilage

(K-32)

+ 2,6 g (uS) Stärke

10,5 g (TS) Schadsilage

(S-33/-35) + 2,6 g (uS) Stärke

10,5 g (TS) Schadsilage

(S-33/-35) + 2,6 g (uS) Stärke

+ 0,33 g (uS) So-japrotein Erholungsphase

(Tag 19-28) 10,5 g (TS) Kontrollsilage (K-32) + 2,6 g (uS) Stärke

Eigene Untersuchungen

Tab. 3.9: Verschiebung des messbaren Zulageeffekts in Abhängigkeit des Zeitpunkts der Probenentnahme, aus GÖRES (2016), Pfeil: Verschiebung des messbaren Einflusses einer Zulage auf den Folgetag

Versuchsabschnitt Inhalt der

Futterbeutel nach der täglichen Beladung

Beutel B Einlaufphase KP Zulagephase Erholungsphase

1 K K K K K K K K K Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z K K K K K K K K K K 2 PI K K K K K K K K K Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z K K K K K K K K K Versuchstag 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Messergebnis - PI

K K K K K K K K K K

Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z

K K K K K K K K K B: Beladungstag; K: Kontrollsilage + Stärke; KP: Kontrollphase; PI: fester Panseninhalt vom Spendertier;

Z: Kontrollsilage + Stärke (KF-30/-32), Schadsilage + Stärke (TF-31/-33/-35) bzw. Schadsilage + Stärke + Sojaprotein (TF-31mS/-33mS/-35mS)

Eigene Untersuchungen

52 3.3 Analytik

Die in dieser Arbeit analysierten Parameter sind als Teil eines Gesamtprojekts zu sehen. Das durch Langzeitinkubation entstandene Probenmaterial wurde auch in anderen Dissertationen untersucht (s. Tab. 9.1). In Tabelle 3.10 sind die in dieser Arbeit analysierten Parameter aufgeführt.

Tab. 3.10: Parameterübersicht mit jeweils durchgeführtem Messverfahren und Va-riationskoeffizient (Messung in Serie, n=10 Standards)

Parameter Messverfahren Einheit Literatur VK (in%) 1* 2* Phenole photometrisch mmol/l

HOLLOWAY et al.

(1979) GÖRES (2016)

0,86 1,46 o-Diphenole photometrisch mg/ml ARNOW (1937)

GÖRES (2016) 3,18 2,73 1*: In der Fermenterflüssigkeit

2*: In der Überstandsflüssigkeit

3.3.1 Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren

Aus den Fermentern und Überstandsgefäßen wurden täglich je 10 ml Probe zur Be-stimmung der Konzentrationen und Produktionen der FlFS entnommen. Zur Analyse wurde ein Zweikanalgaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor, Typ GC-9AM der Firma Shimadzu, Kyoto, Japan (Analysebedingungen Tab. 3.11), ein Autosampler der Firma Shimadzu Typ AOC-9, Kyoto, Japan und ein Integrator Firma Shimadzu Typ C-R 4A, Kyoto, Japan, genutzt. Vorher wurden die Proben schrittwei-se, nach dem in Abbildung 3.1 dargestellten Schema, aufbereitet (LUMPP 2011, s. Kap. 3.4.4). Aus den Analyseergebnissen ergab sich die Konzentration der FlFS.

Die Produktion (in 24 Std.) errechnete sich aus der Konzentration und dem Volumen im Überstand. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Ergebnisse der Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, n-Valeriansäure, Hexansäure sowie der Summe der flüchtigen Fettsäuren. Die Ergebnisse der i-Buttersäure sowie der i-Valeriansäure sind in der Dissertation von SCHULTE (in Vorbereitung) zu finden, da diese den N-Stoffwechsel betreffen.

Eigene Untersuchungen

Tab. 3.11: Analysebedingungen Zweikanalgaschromatograph mit Flammen-ionisationsdetektor, Typ GC 9AM

Injektionstemperatur 170°C

Detektortemperatur 220°C

Detektorart Flammenionisationsdetektor

Säulenofentemperatur 110°C

Trägergas Stickstoff

Trägergasfluss 55 ml/min

Synthetische Luft 0,4 kg/cm²

Wasserstoff 0,5 kg/cm²

Probenvolumen 1 µl

Autosampler Typ AOC-9

Integrator Typ C-R4A

Eigene Untersuchungen

54 6 ml Fermenterflüssigkeit

Bodensatz verwerfen

Zentrifugation¹ 20 Min, 1.750 xg

4 ml Überstand abnehmen und 400 µl internen Standard²hinzufügen

1,7 ml Überstand in Autosampler-Fläschchen³ abfüllen, Lagerung im Kühlschrank (+4 °C);

1,7 ml Überstand (Doppelprobe) in

Reagiergefäß⁴abfüllen und tiefgefrieren (-20 °C)

10 ml Überstandsflüssigkeit

Zentrifugation¹ 20 Min, 1.750 xg

Bodensatz verwerfen

Abb. 3.1: Schematische Darstellung der Probenaufbereitung zur Messung der FlFS (LUMPP 2011)

1 Tischzentrifuge‚ Hettich Universal Typ 1200 (Fa. Hettich, Tuttlingen, Deutschland)

2 100 ml konzentrierte Ameisensäure 98-100 % (Fa. MERCK, Darmstadt, Deutsch-land, Art.-Nr. 1.00264.2500) und 1 ml 4-Methyl-Valeriansäure (Isocapronsäure) (Fa. MERCK, Darmstadt, Deutschland, Art.-Nr. 806088) (LUMPP 2011)

3 Autosampler-Vials 32 × 12 mm (Fa. LAT GmbH, Garbsen, Deutschland, Art.-Nr. 27200) mit Schraubverschluss und Septum (Fa. LAT GmbH, Garbsen, Deutschland, Art.-Nr. 70666)

4 Reagiergefäß 2 ml (Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland)

Eigene Untersuchungen

3.3.2 Enzymatische Bestimmung des Phenolgehalts in der Fermenterflüs-sigkeit sowie nach Fermentation in der ÜberstandsflüsFermenterflüs-sigkeit

Es wurde der Gesamtphenolgehalt sowie der o-Diphenolgehalt enzymatisch be-stimmt. Als Gesamtphenole werden nach HOLLOWAY et al. (1979) die Aminosäure Tyrosin, freie Phenole, Phenolsäuren und Phenolamine bezeichnet. O-Diphenole sind Substanzen mit zwei (oder mehr) OH-Gruppen, die schnell mit anderen Stoffen reagieren (ARNOW 1937).

Um die Vergleichbarkeit der ermittelten Gehalte mit der Dissertation von GÖ-RES (2016) zu wahren, wurde an der Konzentrationseinheit [mg/ml] für die o-Diphenole festgehalten.

Die Proben wurden zum einen aus der Fermenterflüssigkeit, zum anderen aus der Überstandsflüssigkeit nach Fermentation (überständiges Fermentervolumen inner-halb von 24 Stunden, versetzt mit 40 ml inner-halbkonzentrierter Salzsäure und Inkubation mit dem Verdauungsenzym Pepsin, Kap. 3.3.2.4) gewonnen. Ziel war, einen Einfluss der unterschiedlichen Silagen und Sojazulage auf die Fermentation der phenolischen Substanzen (Kap. 2.1), zu verschiedenen Verdauungszeitpunkten, darzustellen.

Die Aufbereitung der Proben zur Phenolbestimmung im flüssigen Fermenterinhalt wurde nach dem von GÖRES (2016) angewandten Schema durchgeführt, da auf Grund einer identischen Durchführung eine Vergleichbarkeit verschiedener Silagen möglich ist.

Die Proben der Überstandsflüssigkeiten wurden zuerst einem enzymatischen Verdau unterzogen, um in vitro mit labmagenähnlichen Verhältnissen den Gehalt an phenoli-schen Substanzen mit den von GÖRES (2016) durchgeführten Methoden zu be-stimmen.

3.3.2.1 Bestimmung des Gesamtphenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit Grundlage dieser Methode sind die Gesamtphenolbestimmungen im Serum nach HOLLOWAY et al. (1979) und MENGISTU (1990), die von GÖRES (2016) zur kolo-rimetrischen Messung der phenolischen Substanzen im Pansensaft modifiziert wur-de. Das Probenvolumen von 250 µl verdünnt mit Aqua bidestillata im Verhältnis 1:1 wurde in Anlehnung an MENGISTU (1990) gewählt. Die einzelnen Schritte der Auf-bereitung der Proben können der Abbildung 3.2 entnommen werden (aus GÖRES 2016). Wichtig ist die Anwendung der 70 %igen Perchlorsäure zur Protein-präzipitation, da Proteine durch Anfärbung mittels Folin-Ciocalteau-Reagenz zu ei-nem falschen Messergebnis führen könnten (GÖRES 2016). Die Färbung mittels Fo-lin-Ciocalteau-Reagenz ist nicht spezifisch, um nur phenolische Substanzen anzufär-ben (MENGISTU 1990). Die Aufbereitung der Blindprobe wurde auch, wie bei GÖRES (2016) beschrieben, abweichend von der Methode nach HOLLOWAY et al. (1979) angefertigt. Da hier besonders die Eigenextinktion des Probenmaterials mit in Betracht gezogen werden sollte, wurde auf die Zugabe des

Eigene Untersuchungen

Folin-Ciocalteau-Reagenz verzichtet und stattdessen Aqua bidestillata verwendet (GÖRES 2016). Nach Aufbereitung wurden die Proben für 60 Minuten bei Raumtem-peratur inkubiert und anschließend photometrisch bei 578 nm in Halbmikroküvetten (Fa. Sarstedt AG & Co., Größe 10x4,45 mm) dreifach gemessen und ein arithmeti-scher Mittelwert gebildet (HOLLOWAY et al. 1979). Hierzu wurde ein Photometer prietest ECO der Firma QM Lab, Steinfurt, Deutschland genutzt. Die für die Messung erforderlichen Reagenzien werden in Tab. 3.12 aufgelistet.

Eigene Untersuchungen

vortexen⁴ 3 ml Fermenterflüssigkeit

Zentrifugation¹ 15 Min, 20.000 xg

Bodensatz verwerfen

Zentrifugation⁵ 10 Min, 1.750 xg

jeweils 250 µl Überstand

in 2 Reagiergefäße²überführen (Mess-und Blindprobe);

Doppelprobe: 1,5 ml in Reagiergefäß² tiefgefrieren (-20°C)

jeweils 250 µl Aqua bidest. und 50 µl Perchlorsäure 70%ig³zugeben

Probe:

100 µl Folin-Ciocalteau-Reagenz⁶ zugeben

jeweils 250 µl Überstand in Reagenzglas vorlegen und 1000 µl Aqua bidest.

zugeben Bodensatz verwerfen

Blindwert:

100 µl Aqua bidest. zugeben

jeweils 1000 µl Natriumcarbonat-Lösung 10%ig⁷zugeben

60 Min bei Raumtemperatur inkubieren

Vermessung bei 578 nm am Photometer^{8, 9}

vortexen⁴ vortexen⁴

vortexen⁴

Abb. 3.2: Probenaufbereitung und modifizierte Phenolbestimmung nach HOLLOWAY et al. (1979, aus GÖRES 2016)

Zentrifugation¹ 20 Min, 20.000 xg

Eigene Untersuchungen

58 Erläuterungen zur Abb. 3.2:

1 Kühlzentrifuge Typ RC-5C PLUS mit Winkelkopfrotor A 2424 (Fa. Du Pont, Newtown, USA)

2 Reagiergefäß 2 ml (Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland)

3 s. Tab. 3.12

4 Vortex-Mischer Typ Vortex-Genie (Fa. Scientific Industries, Bohemia, USA)

5 Tischzentrifuge‚ Hettich Universal Typ 1200 (Fa. Hettich, Tuttlingen, Deutschland)

6 s. Tab. 3.12

7 s. Tab. 3.12

8 Photometer prietest ECO (Fa. QMLab, Steinfurt, Deutschland)

9 Halbmikroküvetten 10 × 4 × 45 mm (Fa. Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutsch-land, Art.-Nr. 81970)

Die Extinktion wurde in den Gesamtphenolgehalt [mmol/l] per Kalibrationskurve um-gerechnet (HÖLTING 1993). Zur Ermittlung des Gesamtphenolgehaltes in den Fer-mentern wurde die von GÖRES (2016) erstellte Kurve, Fünffachmessung von zehn Kalibrierlevel der Referenzsubstanz 4-Hydroxyphenylessigsäure, genutzt, da die gleiche Methode zur Analyse des Gesamtphenolgehalts im fortlaufenden System durchgeführt wurde.

Tab. 3.12: Reagenzien zur Gesamtphenolmessung

Reagenzien Zusammensetzung

Perchlorsäure 70 % ig

Perchloric acid 70 %

(Fa. Fisher Scientific UK, Loughborough, UK, Art.-Nr. P/1280/PB17)

Folin-Ciocalteau-Reagenz

Folin & Ciocalteau’s phenol reagent (Fa. Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, Art.-Nr. 47641)

Natriumcarbonat-Lösung 10 % ig

10 g Natriumcarbonat

(Fa. AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland, Art.- Nr. A1352.1000) 100 ml Aqua bidestillata

3.3.2.2 Bestimmung des o-Diphenolgehalts in der Fermenterflüssigkeit Das zur Bestimmung des o-Diphenolgehalts erforderliche Probenmaterial entstamm-te dem flüssigen Fermenentstamm-terinhalt des Langzeitinkubationssysentstamm-tems. Die Aufbereitung der Proben begann mit einer nach GÖRES (2016) modifizierten Extraktion von FRAISSE et al. (2011), in dem die Proben nicht wie beschrieben für eine Minute bei 80 °C im Wasserbad erhitzt wurden, sondern zur Vereinfachung des Arbeitsschrittes im Heizblock, vorgeheizt auf 100 °C, für 8 Minuten standen und somit ungefähr eine Temperatur von 80°C erreichten (GÖRES 2016). Die einzelnen Schritte der Extrakti-on zeigt Abbildung 3.3 (aus GÖRES 2016). Das Schema ist sowohl für die ExtraktiExtrakti-on

Eigene Untersuchungen

von Pflanzenmaterial wie auch von flüssigem Fermenterinhalt erarbeitet worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nur flüssiger Fermenterinhalt bearbeitet, deshalb entfiel die aufgeführte 15 minütige Zentrifugation nach dem Plattformschüttler.

Eigene Untersuchungen

3 ml Fermenterflüssigkeit

Zentrifugation¹ 15 Min, 20.000 xg

Bodensatz verwerfen

Zentrifugation¹ 15 Min, 20.000 xg*

1000 µl Überstand + 5 ml EtOH 50%ig² in Kulturröhrchen³überführen;

Doppelprobe: 1,5 ml in Reagiergefäß⁴ tiefgefrieren (-20°C)

8 Min erhitzen im Thermoblock⁵bei 100 °C

Überstand

o-Diphenolbestimmung Bodensatz verwerfen

50 Min mischen auf dem Plattformschüttler⁶

Abb. 3.3: Probengewinnung und modifizierte Extraktion nach FRAISSE et al. (2011, aus GÖRES 2016)

1 Kühlzentrifuge Typ RC-5C PLUS mit Winkelkopfrotor A 2424 (Fa. Du Pont, Newtown, USA)

2 s. Tab. 3.14

3 Einmal-Kulturröhrchen, 16 × 160 mm mit Schraubkappen (Fa. LAT GmbH, Garb-sen, Deutschland, Art.-Nr. 192317521) und passenden Tefloninletts (Fa. LAT GmbH, Garbsen, Deutschland, Art.-Nr. 132924811)

4 Reagiergefäß 2 ml (Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland, Art.-Nr. 72.689.003)

5 Metallblockthermostat Typ EC 2 (Fa. VLM GmbH, Bielefeld, Deutschland), Tempe-raturbereich 0 – 210 °C, Durchmesser des Stahl-Reagenzglaseinsatzes: 17,2 mm

6 Plattformschüttler Typ 3016 (Fa. GFL, Burgwedel, Deutschland)

* Die zusätzliche Zentrifugation ist nur bei der Extraktion von Pflanzenmaterial not-wendig

Zentrifugation¹ 20 Min, 20.000 xg

Eigene Untersuchungen

Nach der Extraktion wurden die Proben mit der von GÖRES (2016) zur o-Diphenolbestimmung modifizierten Methode nach ARNOW (1937) aufbereitet (Tab. 3.13). Die Modifizierung von GÖRES (2016) lag in der Benutzung von halbkon-zentrierter Salzsäure, anstatt 0,5 molarer Salzsäure wie bei ARNOW (1937) be-schrieben, um die Nachweisgrenze im Testverfahren zu senken. Anschließend wur-den die Proben 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, danach photometrisch dreifach gemessen (405 nm) und ein arithmetischer Mittelwert gebildet. Die zur Be-stimmung erforderlichen Reagenzien werden in Tabelle 3.14 aufgelistet.

Tab. 3.13: Übersicht Erstellung Mess- und Blindprobe (Probe aus Überstand, Ex-traktion modifiziert nach FRAISSE et al. 2011)

Reagenzien Messprobe Reagenzien Blindprobe

Extrakt (Probe) 250 µl Extrakt (Probe) 250 µl HCl (halbkonz.) 500 µl HCl (halbkonz.) 500 µl

ARNOW-Reagenz 500 µl ARNOW-Reagenz -

NaOH 2,125 mol/l 500 µl NaOH 2,125 mol/l 500 µl

Aqua bidest. 750 µl A. bidest. 1250 µl

Tab. 3.14: Reagenzien zur o-Diphenolbestimmung

Reagenzien Zusammensetzung

Ethanol 50 % ig 100 ml

100 ml Ethanol 99,5 % vergällt mit MEK (Fa. LAT GmbH, Garbsen, Deutschland, Art.-Nr. 10576)

100 ml Aqua bidestillata Salzsäure,

halbkonzentriert

100 ml Salzsäure 37 % (Fa. Grüssing GmbH, Filsum, Deutsch-land, Art.-Nr. 130682500)

100 ml Aqua bidestillata

ARNOW-Reagenz

100 ml Aqua bidestillata Natronlauge 2,125 mol/l

8,5 g Natriumhydroxid 97 % (Fa. Grüssing GmbH, Filsum, Deutsch-land, Art.-Nr. 12158)

100 ml Aqua bidestillata

Eigene Untersuchungen

Die Extinktion wurde zur Bestimmung des o-Diphenolgehalts [mg/ml] mit Hilfe einer Kalibrationskurve umgerechnet (HÖLTING 1993). Zur Ermittlung des o-Diphenolgehaltes in den Fermentern wurde die von GÖRES (2016) erstellte Kalib-rationskurve genutzt, da die angewandte Methode identisch war.

3.3.2.3 Bezeichnung der drei Testgruppen der Überstandsgefäße Überstandsgefäß 1+2: KF-32-Ü

Überstandsgefäß 3+4: TF-33-Ü bzw. TF-35-Ü

Überstandsgefäß 5+6: TF-33mS-Ü bzw. TF-35mS-Ü

3.3.2.4 Enzymatischer Verdau der Überstandsflüssigkeit: Einfluss von Pep-sin auf den Gehalt an phenolischen Substanzen

In Vorversuchen wurde der Gehalt an phenolischen Substanzen in der Überstands-flüssigkeit mit den beschriebenen Methoden zur Gesamt- und o-Diphenolmessung mit und ohne Pepsinzugabe getestet (s. Kap. 9.4). Phenolische Substanzen und Pro-teine können sich zu Komplexen verbinden (s. Kap. 2.3.3). Verschiedene Faktoren, wie der pH-Wert, die Proteinstruktur, aber auch Enzyme, haben einen Einfluss auf die Komplexbildung (s. Tab. 2.7). Diese Komplexe können unter bestimmten Bedin-gungen gespalten werden (s. Kap. 2.3.6). CUI et al. (2013) beschreiben, dass eine alleinige Proteinentfaltung und –zerlegung von Proteinen durch einen niedrigen pH-Wert nicht ausreichend ist. Eine enzymatische Reaktion ist notwendig, um Pro-teinstrukturen zu zerlegen. HASLAM u. LILLEY (1988) sowie MARTINEZ-GONZALEZ et al. (2017) beschreiben jedoch eine Enzymhemmung durch phenoli-sche Substanzen. Um dieses zu testen, wurden sowohl der Gesamtphenolgehalt als auch der o-Diphenolgehalt in den Kontrollgruppen, Testgruppen mit Schadsilage und mit Schadsilage und Sojaprotein (s. Kap. 3.3.2.5) in der Zulagephase mit und ohne Pepsin bestimmt. Es zeigte sich ein geringgradiger Anstieg des o-Diphenolgehaltes nach enzymatischer Verdauung durch Pepsin, sowohl in der Kontroll- als auch in den Testgruppen. Somit ist ein alleiniger Pepsineinfluss bis maximal 40 % zu erwarten.

Der hochgradige Anstieg des Gesamtphenolgehaltes nach enzymatischer Verdau-ung durch Pepsin entstand durch die nicht zu erklärenden niedrigen Gesamtphenol-gehalte ohne Pepsinverdau (s. Abb. 9.1).

Eigene Untersuchungen

3.3.2.5 Bestimmung des Gesamtphenolgehalts in der Überstandsflüssigkeit Die Proben zur Bestimmung des Gesamtphenolgehalts wurden ab Tag 7 täglich aus

Im Dokument In vitro Verdauungsstudien im RUSITEC mit Pansensaft vom Rind zum Vorkommen von phenolhaltigen Substanzen aus Grassilagen sowie deren Bindungsverhalten mit Eiweißen (Seite 52-0)