Institut für Tierernährung und der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Vorkommen und Wirkung von östrogen aktiven Substanzen
im Futter von Schweinen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Dimitrij Koroljow aus Witebsk (Belarus)
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. Heinz Nau
Univ.-Prof. Dr. med. vet., Dipl. Ing. agr. Josef Kamphues Univ.-Prof. Dr. Karl-Heinz Waldmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. Heinz Nau 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Hassan Y. Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 16.05.2007
Gefördert durch den Deutschen Akademischen Austausch Dienst
Meiner Mutter und meiner Frau
1. Einleitung und Fragestellung der Arbeit……….. 15
2. Literatur………. 18
2.1. Endogene Hormone………..………... 18
2.1.1. Fruchtbarkeit beeinflussende Wirkstoffe……… 18
2.1.2. Endogene Hormone……….. 21
2.1.3. Östrogene und östrogenartig wirksame Substanzen.. 21
2.1.3.1. Östrogen-Rezeptoren α und β……….. 22
2.1.3.2. Physiologische Wirkungen von Östrogenen und östrogenartig wirksamen Substanzen………..….……. 24
2.1.3.2.1. Gewebeverteilung von ER α und β………. 26
2.1.3.2.2. Agonisten und Antagonisten……… 27
2.2. Xenohormone……….. 28
2.2.1. Synthetische Östrogene………... 28
2.2.2. Xenoöstrogene……….. 29
2.2.3. Fruchtbarkeitsstörungen bei Menschen………. 31
2.2.4. Fruchtbarkeitsstörungen bei Tieren……… 33
2.3. Östrogenaktive Substanzen als Futtermittelkomponente und deren Wirkungsmechanismus……….. 35
2.3.1. Mykotoxine……… 35
2.3.2. Sojabohnenpflanze……… 36
2.3.3. Phytoöstrogene……… 37
2.3.3.1. Vorkommen und Struktur……….. 37
2.3.3.2. Besonderheiten der Pharmakokinetik………. 42
2.3.3.3. Mechanismen der Phytoöstrogenwirkung……….. 44
2.3.3.4. Vergleichbare Wirksamkeit der Phytoöstrogene… 46 2.3.4. Hyperöstrogenismus………. 48
3. Analytische Testverfahren……….……. 60
3.1. Trennverfahren zur Bestimmung von Phyto- und Myko- östrogenen (Chromatographische Trennmethoden)………... 60
3.2. Bioanalytische Methoden……….. 61
3.2.1. In-vitro-Verfahren……….. 61
(E-Screen)………. 62
3.2.1.3. Vitellogonin-Synthese in Zellkulturen……….. 63
3.2.1.4. Zonagenese in Fischleberzellen……….. 63
3.2.1.5. Yest-Estrogen Screen Assay (YES-Assay) mit rekombinanten Hefezellen………..………. 63
3.2.1.6. Rezeptor-Bindungstests……… 64
3.2.1.7. Enzyme-Linked Receptor Assay (ELRA)……… 64
3.2.1.8. DNA-Bindungsassay……….. 66
3.2.1.9. Fluoreszenzpolarisation………. 66
3.2.1.10. Gesamtöstrogentest-EIA………... 67
3.2.1.11. Luziferase-Reporter-Gen-Assay... 67
3.2.2. In-vivo-Tests... 70
3.2.2.1. Allen-Doisy-Test……….. 70
3.2.2.2. Glykogen im Uterus……… 70
3.2.2.3. Ornithidindecarboxylase-Test……… 71
3.2.2.4. Oviduktgewichtstest………... 71
3.2.2.5. Geschlechtsdifferenzierung bei Reptilien………... 71
3.2.2.6. Geschlechtdifferenzierung bei Vögeln……… 72
3.2.2.7. Geschlechtsdifferenzierung bei Mäusen und Ratten… 72 3.2.2.8. Vitellogeninsynthese bei Fischen………. 72
3.2.2.9. Uterusgewichtstest………. 73
4. Material und Methoden………. 74
4.1. Material………... 74
4.1.1. Versuchsziel………... 74
4.1.2. Versuchsort……… 75
4.1.3. Versuchstiere………... 75
4.1.4. Versuchsfutter……… 76
4.2. Versuchsaufbau……… 82
4.2.1. Vorversuchs- und Versuchsdurchführung………. 82
4.2.2. Blindversuchdurchführung………... 83
4.2.3. Versuchsgruppen……….. 83
4.3.1.2. Klinisch-diagnostische Untersuchungen der Ferkel.…. 88 4.3.2. Anatomisch-pathologische und histologische
Untersuchungen………... 89
4.3.2.1. Auswahl des Materials………... 90
4.3.2.2. Probenentnahme……… 91
4.3.2.3. Anfertigung von Gewebeschnitten für die Histologie… 91 4.3.2.4. Histochemische Färbetechnik……….. 94
4.3.2.5. Auswertung der Schnitte………... 95
4.3.2.5.1. Anatomisch-pathologische Untersuchungsparameter……….. 95
4.3.2.5.2. Histologische Untersuchung der Veränderungen der Zielorgane……… 96
4.4. Statistik………...……… 102
5. Ergebnisse………...………… 103
5.1. Gesundheitszustand der Tiere……….. 103
5.2. Klinisch-diagnostische Untersuchungen………... 103
5.2.1. Klinisch-diagnostische Untersuchungen der Sauen in Versuchsdurchgängen 1 und 2………….………. 103
5.2.2. Klinisch-diagnostische Untersuchungen neugeborener Ferkel in Versuchsdurchgängen 1 und 2………. 106
5.2.3. Klinisch-diagnostische Untersuchungen der Sauen im Blindversuch……… 119
5.2.4. Klinisch-diagnostische Untersuchungen neugeborener Ferkel im Blindversuch……….………... 120
5.3. Anatomisch-pathologische und histologische Untersuchung………… 124
5.3.1. Anatomisch-pathologische Untersuchung der Genitalorgane neugeborener Ferkel im Blindversuch………... 124
5.3.2. Uterus- und Ovariengewicht……… 124
5.3.3. Histologische Untersuchung……… 126
6. Diskussion……….….. 132
6.1. Versuchsaufbau……… 132
6.2. Ergebnisse………. 137
6.2.1. Klinisch-diagnostische Untersuchungen……… 137
6.2.2. Anatomisch-pathologische und histologische Untersuchungen………... 142
6.3. Ausblick……….. 145
7. Zusammenfassung……… 146
8. Summary………..……..….. 148
9. Literaturverzeichnis……….. 150
10. Anhang………..…. 176
11. Danksagung………..…………. 204
ApnEO Alkylphenolpolyäthoxylaten
AS Aminosäuren
DES Diethystilbestrol
BHZP Bundeshybridzuchtprogramm
DMA O- Demythylangolensin
ELISA Enzymimmunoassay
ELRA Enzyme-Linked Receptor Assay
E2 17-β-Östraqdiol
EEQ Estradiol Equivalent
ER Östrogen-Rezeptoren
ERE Estrogen responsive elements FSH Follikelstimulierendes Hormon GnRH Ganadotropin-Realeasing-Hormon
GS-MS-Verfahren Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren
HVL Hypophysenvorderlappen
LC-MS Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie
LH Luteinisierendes Hormon
o,p΄-DDT Dichlordiphenyldichlorethan PCB Polychlorierte Biphenyle RPE Relative Proliferative Effect
Tab. Tabelle
UV Ultraviolett
ZNS Zentrales Nerven-System
ZON Zearalenon
Abb. 2.2.: Wichtige natürliche Östrogene
Abb. 2.3.: Struktur der wichtigen synthetischen Östrogene
Abb. 2.4.: Strukturelle Formeln der synthetischen Östrogene Bisphenol-A und p- tert-Octylphenol
Abb. 2.5.: Altersstandardisierte Erkrankungsrate an Hodenkrebs im Saarland 1970-1995
Abb. 2.6.: Chemische Strukturformel des Zearalenons Abb. 2.7.: Strukturformeln der wichtigsten Isoflavone Abb. 2.8.: Strukturformeln der pflanzlichen Lignane Abb. 2.9.: Strukturformeln der wichtigsten Coumestane
Abb. 2.10.: Symptomatik des Hyperöstrogenismus bei neugeborenen Ferkeln:
Rötung von Vulva und Zitzen, Spreizen und „Bärentatzigkeit“ als Ergebnis der Fütterungsversuche mit Zearalenon (STEIN 2004)
Abb. 3.1.: Schematische Darstellung des Testprinzips beim ELRA-Verfahren Abb. 3.2.: Schematische Darstellung des Testprinzips Luziferase-Reporter-Gen-
Assay
Abb. 3.3.: Reportengen-basierte Antwort auf Östrogene bei MVLN-Zellen (KHIM et al. 1999).
Abb. 4.1. : Skala der Farbindices
Abb. 5.1.: Schwellung der Gesäugeleiste neugeborener Ferkel (signifikante Differenzen p<0,05)
Abb. 5.2.: Index 1: geringgradige Schwellung Abb. 5.3.: Index 2: mittelgradige Schwellung Abb. 5.4.: Index 3: hochgradige Schwellung
Abb. 5.5.: Farbe der Gesäugeleiste neugeborener Ferkel (signifikante Differenzen p<0,05)
Abb. 5.6.: Index 1 der Farbe der Gesäugeleiste: blaß-rosa Abb. 5.7.: Index 2 der Farbe der Gesäugeleiste: rosa
Abb. 5.10.: Index 5 der Farbe der Gesäugeleiste: dunkelrot Abb. 5.11.: Index 1 der Farbe der Vulva: blaßrosa
Abb. 5.12.: Index 2 der Farbe der Vulva: rosa Abb. 5.13.: Index 3 der Farbe der Vulva: blaß-rot Abb. 5.14.: Index 4 der Farbe der Vulva: rot
Abb. 5.15.: Index 5 der Farbe der Vulva: dunkelrot
Abb. 5.16.: Schwellung der Gesäugeleiste neugeborener Ferkel aus dem Blindversuch (signifikante Differenzen p<0,05).
Abb. 5.17.: Farbe der Gesäugeleiste neugeborener Ferkel aus dem Blindversuch (signifikante Differenzen p<0,05).
Tab. 2.2.: Qualitative Gewebeverteilung von ER α und β
Tab. 2.3.: Phytoöstrogengehalte in verschiedenen Nahrungsmitteln
Tab. 2.4.: Relative Wirkstärke einiger östrogen-aktiver Substanzen und Phytoöstrogene in vitro in MCF-7 Zellen (E-Screen)
Tab. 2.5.: Wirkstärke von Phytoöstrogenen in vivo im Maus-Bioassay bei oraler Gabe (nach STOB 1983)
Tab. 2.6.: Expositionssituation und Isoflavonspiegel beim Menschen
Tab. 2.7.: Wirkung der Isoflavonen auf die Entwicklung und Reproduktionsfunktion von Nagetieren
Tab. 2.8.: Zearalenonkonzentrationen im Futter, bei welchen Vergiftungserscheinungen beim Schwein beobachtet wurden (STEIN 2004)
Tab. 2.9.: Effekte der Wirkung der Phytoöstrogene und anderer östrogen aktiver Substanzen auf Nutztiere während der Fütterungsversuche
Tab. 4.1.: Zusammensetzung des Mischfutters im Vorversuch
Tab. 4.2.: Chemische Namen und Formeln der in NOVASOY® enthaltenen Isoflavonen
Tab. 4.3.: NOVASOY®-Komponenten (chemische Analyse)
Tab. 4.4.: Ergebnisse der mikrobiologischen Analyse von NOVASOY® Tab. 4.5.: Kalkulation des Isoflavonengehaltes im Versuchsfutter
Tab. 4.6.: Versuchs- und Kontrollfutterzusammensetzung (Versuchsdurchgänge 1 und 2)
Tab. 4.7.: Energie- und Nährstoffgehalte des Versuchs- und Kontrollfutters (Versuchsdurchgänge 1 und 2)
Tab. 4.8.: Energie- und Nährstoffgehalte des Futters im Blindversuch
Tab. 4.9.: Parameter klinisch-diagnostischer Untersuchungen der Sauen und Ferkel
Tab. 4.11.: Feststellung der MMA-Fälle und Anzahl der lebend, tot und mumifiziert geborenen Ferkel pro Wurf
Tab. 4.12.: Bedeutsame klinisch-diagnostische Untersuchungsparameter der Sauen: Vulva, Zervix und Gesäuge
Tab. 4.13.: Indices klinisch-diagnostischer Untersuchungsparameter der Sauen Tab. 4.14.: Allgemeine statistische und physiologische Angaben zu neugeborenen
Ferkeln
Tab. 4.15.: Klinisch-diagnostische Untersuchungsparameter neugeborener Ferkel Tab. 4.16.: Indices klinisch-diagnostischer Untersuchungsparameter neugeborener
Ferkel
Tab. 4.17.: Entparaffinierung der Gewebeschnitte
Tab. 4.18.: Anatomisch-pathologische Untersuchungsparameter der Ferkel der Gruppe A und der Gruppe B
Tab. 4.19.: Veränderungen im Uterus Tab. 4.20.: Veränderungen in der Vulva Tab. 4.21.: Veränderungen in der Milchdrüse Tab. 4.22.: Veränderungen in Eierstöcken Tab. 4.23.: Veränderungen in der Prostata
Tab. 5.1.: Ergebnisse klinisch-diagnostischer Untersuchungen der Sauen im 1. Versuchsdurchgang
Tab. 5.2.: Ergebnisse klinisch-diagnostischer Untersuchungen der Sauen im 2. Versuchsdurchgang
Tab. 5.3.: Ergebnisse klinisch-diagnostischer Untersuchungen der Ferkel aus dem 1. Versuchsdurchgang
Tab. 5.4.: Ergebnisse klinisch-diagnostischer Untersuchungen der Ferkel aus dem 2. Versuchsdurchgang
Tab. 5.5: Ergebnisse klinisch-diagnostischer Untersuchungen der Sauen aus dem Blindversuch
Tab. 5.7.: Ergebnisse anatomisch-pathologischer Untersuchung neugeborener Ferkel kontrollpositiver und kontrollnegativer Sauen aus dem Blindversuch
Tab. 5.8.: Ergebnisse anatomisch-pathologischer Untersuchungen der Uterus- und Ovariengewichte neugeborener Ferkel
Tab. 5.9.: Veränderungen im Uterus Tab. 5.10.: Veränderungen in der Vulva Tab. 5.11.: Veränderungen in der Milchdrüse Tab. 5.12.: Veränderungen an den Eierstöcken Tab. 5.13.: Veränderungen der Prostata
Tab. 6.1.: Phytoöstrogengehalte im Versuchs- und Kontrollfutter und im Supplement NOVASOY®
Tab. 6.2.: Beobachtete Symptome des Hyperöstrogenismus bei Sauen und neugeborenen Ferkeln als Folge der Fütterungsversuche an Zuchtsauen
Tab. 6.3.: Ergebnisse ermittelter Symptome des Hyperöstrogenismus als Folge der Fütterungsversuche mit Mykotoxinen und Phytoöstrogenen an Schweinen
1. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG DER ARBEIT
Endokrine Modulatoren bzw. "Umwelthormone" aus Lebensmitteln, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen finden seit einiger Zeit als potentielle Ursachen für bestimmte körperliche Fehlfunktionen wie Zyklusverschiebungen, Beeinträchtigung der Fertilität, vermehrte Inzidenz maligner Neoplasien in hormonabhängigem Gewebe bis hin zu Verhaltensänderungen bei in utero exponierten Individuen zunehmende öffentliche und wissenschaftliche Beachtung. Diese Chemikalien natürlicher oder synthetischer Herkunft wirken entweder wie körpereigene Hormone (agonistisch) oder schwächen deren Wirkung ab (antagonistisch). Diese Substanzen (endokrine Modulatoren) können über verschiedene Mechanismen auf das endokrine System einwirken: häufig sind Wechselwirkungen der Stoffe mit körpereigenen Hormonrezeptoren; auch Biosynthese, Transport und Abbau körpereigener Hormone können moduliert werden.
Es wurde schon in der Öffentlichkeit als auch in der Wissenschaft intensiv darüber diskutiert, inwieweit Chemikalien mit hormonartigen Wirkungen das Hormonsystem der Tiere und Menschen beeinflussen können. In der Diskussion um Umweltchemikalien mit endokriner Wirkung finden Substanzen mit östrogenen und mit antiandrogenen Eigenschaften besondere Aufmerksamkeit. Es ist unstrittig, dass solche Stoffe in hormonell gesteuerte Prozesse eingreifen können und prinzipiell die Möglichkeit besteht, dass Entwicklung und Reproduktion gestört werden oder dass eine Krebserkrankung gefördert wird (Gefährdungspotential).
In einzelnen, gut untersuchten Fällen waren unerwünschte Wirkungen hormonartig wirkender Chemikalien auf die Gesundheit der Menschen und der Lebewesen in der Umwelt nachweisbar. Viele dieser Befunde werden bis heute kontrovers diskutiert.
So haben in ihren Arbeiten CARLSEN et al. (1992) insgesamt 61 frühere Untersuchungen über die Spermienzahlen bei Männern mit Anzeichen von Fertilitätsstörungen ausgewertet. Laut ihren Publikationen war zwischen 1938 und
1990 eine Abnahme von 113 Millionen auf 66 Millionen Spermien pro Milliliter Samenflüssigkeit zu vermerken.
Die bereits genannten Entwicklungsstörungen und der Rückgang der Spermienzahlen könnten nach einer Hypothese von SHARPE und SKAKKEBAEK (1993) mit einer erhöhten Exposition in Gebärmutter gegenüber der Wirkung östrogenähnlicher Arzneimittel, pflanzlichen Östrogenen und Industriechemikalien mit östrogener Wirkung in der Umwelt zusammenhängen.
Solche Reproduktionsstörungen wurden eindeutig bei wildlebenden Tieren beobachtet. Als dessen Ursache werden in die Umwelt freigesetzte Chemikalien mit hormonähnlicher Wirkung angesehen.
Bereits im Jahr 1952 wurden Untersuchungen zu Störungen der Fortpflanzung von Weißkopfadlern in Florida angestellt (BROLEY 1958). Sie lieferten Hinweise auf eine Beeinflussung des Hormonsystems durch endokrin wirksame Umweltchemikalien. In den siebzigen Jahren zeigten Studien an Silbermöwen, dass es hier Anomalien in der Embryonalentwicklung gab, die Ähnlichkeiten zu hormonellen Störungen aufweisen, wie sie auch durch Dioxine ausgelöst werden (GILBERTSON et al. 1995).
Weitere Hinweise lieferte die untypische Produktion von Eidotterprotein (Vitellogenin) bei männlichen Fischen im Ausstromgebiet von Kläranlagen in Großbritannien.
Außer den Publikationen, die mit den Reproduktionsstörungen bei Menschen und Wildtieren durch Auswirkungen östrogenaktiver Substanzen beschäftigt sind, gibt es Studien über Futtermittel, die Inhaltsstoffe mit solcher Wirkung enthalten. Die Untersuchungen weiten sich auf den Nutztierbereich aus.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Wirkung von Phytoöstrogenen bzw.
östrogenaktiven Substanzen im Futter von Schweinen zu untersuchen und damit zu der wissenschaftlichen Diskussion beizutragen, wie die in Futtermischungen enthaltenen Phytoöstrogene bzw. östrogen aktiven Substanzen die Reproduktionsfunktion von Schweinen beeinflussen und ob sie die Fruchtbarkeitsstörungen verursachen können. Es sollte untersucht werden, ob es einen Zusammenhang zwischen der östrogenen Gesamtaktivität von
Phytoöstrogenen, die in Futtermitteln enthalten sind, und dem Auftreten der Hyperöstrogenismussymptomatik bei den Zuchtsauen und neugeborenen Ferkeln nach der Aufnahme von östrogenhaltigen Futtermischungen feststellen lässt. Dazu wurden Fütterungsversuche an Zuchtsauen und darauf folgende gynäkologische Untersuchungen der Sauen und neugeborener Ferkel und anatomisch-pathologische und histologische Untersuchungen neugeborener Ferkel durchgeführt.
2. LITERATUR
2.1. Endogene Hormone
2.1.1. Fruchtbarkeit beeinflussende Wirkstoffe
Laut DÖCKE (1994) erfolgt die Steuerung von Fortpflanzungsfunktionen über mehrere Komponenten, wie das Zentralnervensystem, endokrine Drüsen, Hormone sowie Erfolgsorgane, die miteinander zu einem Regelkreis verbunden sind.
Besonders der Hypothalamus spielt dabei eine wichtige Rolle (THIERY 1991). Da die nervalen Reize in hormonale Signale umgesetzt werden und der Informationseinstrom nicht nur neuronal erfolgt, sondern Veränderungen des inneren Milieus auch über das Blut registriert werden, ist der Hypothalamus auch ein wichtiges Integrationszentrum für homöostatische Prozesse, wie z.B. die des Herz- Kreislauf-Systems sowie des Sexualverhaltens.
Die zyklisch ablaufenden generativen und endokrinen Prozesse am Ovar mit dem Ziel, befruchtungsfähige Eizellen zur Verfügung zu stellen (Ovulation), unterliegen zentralen wie auch peripheren Kontrollmechanismen (CLARKE 1989). Das im Hypothalamus synthesierte Ganadotropin-Raeleasing-Hormon (GnRH) gelangt über das Portalgefäßsystem zum Hypophysenvorderlappen (HVL), wo es auf die gonadotropen Zellen einwirkt und die Sekretion der beiden Gonadotropine Follikelstimulierendes Hormon (FSH) und Luteinisierendes Hormon (LH) fördert.
Unter dem Einfluß von zunächst FSH und dann LH kommt es zu vermehrtem Follikelwachstum (Östrogen- und Inhibinproduktion) sowie zur Ovulation eines oder mehrerer Tertiärfollikel mit anschließender Gelbkörperbildung und Progesteronproduktion.
Die Schließung erfolgt nach dem Prinzip der Rückkopplung, d.h., die in die Blutbahn abgegebenen Ovarialhormone vermögen je nach ihrer Konzentration die Freisetzung der übergeordneten Hormone GnRH sowie FSH und LH entweder zu fördern oder zu
hemmen. Dabei ist generell die Sekretion des LH deutlich stärker vom GnRH abhängig als die des FSH (Abb. 2.1.).
Außer inneren neuroendokrinen Regulatoren können verschiedene
Umweltchemikalien ihren eigenen Einfluss auf die Reproduktion haben. Deswegen muss sich der Organismus zur Aufrechthaltung wichtiger Lebensfunktionen den Veränderungen der Außenwelt ständig anpassen (LADEWIG 1994).
Dies trifft für die Reproduktionsfunktion der Organismen zu, da sie als Potential für Fertilität gilt und durch eine Vielfalt von verschiedenen Substanzen beeinflusst wird.
Viele der Chemikalien und Stoffe, die der Mensch und die Nutztiere (z.B. Schweine) mit der Nahrung bzw. dem Futter aufnehmen, oder denen sie in ihrer Umwelt ausgesetzt sind, stehen im Verdacht, ein östrogenähnliches Wirkpotenzial zu besitzen. Bei diesen handelt es sich um Herbizide, Fungizide, Organchlor-Insektizide, Nematozide, Schwermetalle, polychlorierte Biphenyle und Phthalate (SCHÄFER et al. 1996).
In der Umwelt finden sich vier Hauptgruppen von Östrogenen und östrogenartig wirksamen Substanzen: die natürlichen und synthetischen Östrogene, zahlreiche weitere anthropogene Chemikalien (Xenoöstrogene) und Stoffe pflanzlicher bzw.
pilzlicher Herkunft - Phyto- und Mykoöstrogene (COLDHAM et al. 1998).
Verbindungen mit hormoneller Wirkung wurden und werden zurzeit noch als endokrine Disruptoren (engl.: endocrine disruptors) bezeichnet, da sie in das endokrine (hormonelle) System eingreifen (HOCK und SEIFERT 1998).
Abb. 2.1.: Hormonelle Regulation weiblichen Reproduktionssystems (nach PRYOR 2000)
GnRH Neuronen
Negative Reaktion (aber positive Reaktion der Östrogene auf LH- Secretion während des Zyklus)
Positive Stimulation
Gr.
Follikel
Corp.
luteum
Inhibin Progesterone Oestrogen FSH
LH
GnR
Ovar
Hypothalamus
2.1.2. Endogene Hormone
Endokrin wirkende Hormone sind Signalstoffe, die in den endokrinen Drüsen gebildet werden, über die Blutbahn an ihren Wirkungsort gelangen und dort bestimmte physiologische und biochemische Regulationsfunktionen ausüben.
Die mehr als 100 Hormone im menschlichen Organismus lassen sich in lipophile und hydrophile Hormone einteilen. Letztere leiten sich von Aminosäuren (AS) wie Histamin ab oder sind als Peptide oder Proteine aus AS aufgebaut wie beispielsweise Insulin. Zu den lipophilen Hormonen zählen neben der Retinsäure, den Eicosanoiden und dem Thyroxin vor allem die Steroidhormone, z.B. die Östrogene (KOOLMAN und RÖHM 1994).
Bei Wirbeltieren, bei denen das Geschlecht durch ein Geschlechtschromosom festgelegt ist, wird während der frühen Entwicklungsphase die Entwicklung der Geschlechtsorgane und spezifischer Zentren im Gehirn durch Geschlechtshormone gesteuert. Eine Störung dieser hochsensiblen Phase durch östrogenartig wirksame Stoffe kann daher zu bleibenden Defekten und Funktionsstörungen der Geschlechtsorgane führen bis hin zu einer Störung der Geschlechtdetermination. Im adulten Organismus stimulieren oder hemmen die Hormone Organfunktionen wie etwa die Regulation der Spermienbildung (FENT 2000).
2.1.3. Östrogene und östrogenartig wirksame Substanzen
Natürliche Östrogene
Die eigentlichen Östrogene (Follikelhormone) gehören zu den Steroidhormonen; sie besitzen eine gemeinsame chemische Grundstruktur (Abb. 2.2.) und werden beim Menschen in der Plazenta sowie in geringen Mengen in Nebennieren und Hoden gebildet. Während der Schwangerschaft produziert die Plazenta große Mengen an E2. Der Plasmaspiegel von E2 beträgt bei prämenopausalen, erwachsenen Frauen 20-60 pg/ml (max. 700 pg/ml während des Menstruationszyklus) und bei postmenopausalen Frauen unter 20 pg/ml. Bei Männern beträgt die Konzentration
von E2 etwa 20 pg/ml. Bei ihnen wird das Östrogen hauptsächlich durch Aromatisierung von Androstendion (über Östron) in peripheren Geweben gebildet.
Östron wird durch die 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase zu E2 metabolisiert (KNOBIL und NEILL 1994).
Als primäre weibliche Geschlechtshormone sind Östrogene für die Ausbildung der weiblichen Geschlechtsmerkmale verantwortlich; sie kommen jedoch auch beim Mann vor und können an der Entwicklung bestimmter Formen von Krebs, z.B.
Brustkrebs, beteiligt sein (HENDERSON et al. 1988). Für die Wirkung eines Hormons bzw. eines hormonell aktiven Stoffes kann der Zeitpunkt der Einwirkung entscheidend sein.
Abb. 2.2.: Wichtige natürliche Östrogene
2.1.3.1. Östrogen-Rezeptoren ααα und βα ββ β
Für östrogenvermittelte biologische Reaktionen ist eine Bindung der Östrogene an spezifische Bindungsstellen, so genannte Rezeptoren, erforderlich. Diese gehören zu den so genannten Steroid-Rezeptoren, die im Gegensatz zu anderen Hormonrezeptoren nicht zellmembrangebunden sind. Aufgrund zahlreicher Experimente (SAVOURET et al. 1991) geht man heute davon aus, dass der Zellkern
die bevorzugte Lokalisation des Rezeptors ist. Bis jetzt werden zwei Formen von Östrogenrezeptoren (ER) beschrieben: ERα und ERβ. Der humane ERα wurde erstmals 1986 kloniert (GREEN et al. 1986).
ERα und ERβ haben eine hohe sequenzielle Homologie (>90%). Der humane ERα ist ein aus 595 Aminosäuren bestehendes Protein mit einer hohen Interspezies- Homologie (88% zum ERα der Maus) (WHITE et al. 1987). Der ERβ kommt in zwei Varianten vor, eine „kurze“ Variante, bestehend aus 485 Aminosäuren (ENMARK et al. 1997) und eine „lange“ Variante, bestehend aus 530 Aminosäuren. Physiologisch kommt die „lange“ Variante häufiger vor, allerdings scheint es keine entscheidenden funktionellen Unterschiede zu geben (MÜLLER et al. 2001).
Normale und neoplastische östrogene Zielgewebe exprimieren nicht nur den ERα und/oder ERβ, sondern auch eine Vielzahl verschiedener mutierter Formen des Rezeptors (FUQUA et al. 1993).
Es handelt sich dabei um Punktmutationen, Kürzungen und Insertionen im Rezeptormolekül.
Manche dieser mutierten Formen werden in vivo stabil exprimiert, wodurch eine Relevanz im östrogenen Signalweg vermutet wird. So konnte in nicht-östrogen- responsiven Brusttumoren eine verkürzte Form des Rezeptors nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass ein in dieser Art mutierter Rezeptor eine erhöhte Aktivität ohne Ligandenbindung zeigt und daher verantwortlich für das östrogen- unabhängige Wachstum von Brusttumoren sein könnte (MURPHY et al. 1997).
Anderseits konnte auch nachgewiesen werden, dass mutierte Formen des ER eine erhöhte ligandenabhängige Aktivität besitzen können (CATHERINO und JORDAN 1995). Aufgrund dieser verschiedenen Wirkungen scheinen auch mutierte Formen des ER bei der Entwicklung und der Progression von Tumoren eine entscheidende Rolle zu spielen.
Deswegen löst die Wechselwirkung des Östrogens mit dem Rezeptor eine ganze Folge von Ereignissen aus.
Xeno- und Phytoöstrogene z.B. können sich bei der Synthese, der Ausschüttung, dem Transport, der Wirkung und dem Metabolismus sowie bei der Ausscheidung von Hormonen bemerkbar machen (FENT 1995). Auch andere Stoffe sind in der
Lage, sich an den Östrogenrezeptor zu binden. Dazu gehören Phytoöstrogene wie Coumesterol oder Genistein, Arzneimittel wie Diethylstilbestrol, Äthinylöstrodiol oder Tamoxifen und Industriechemikalien wie Bisphenol A und 4-Nonylphenol.
Stoffe, die natürliche Östrogenwirkungen hervorrufen, werden als Agonisten bezeichnet. Antagonisten dagegen sind Substanzen, die an den Rezeptor binden und damit die Bindung natürlicher Östrogene verhindern. Eine dritte Gruppe von Stoffen, zu der z.B. o,p΄-DDT gehört, wirkt durch Blockierung der Androgen- Rezeptoren, d.h. der Rezeptoren für das männliche Testosteron (BITMAN et al.
1978).
2.1.3.2. Physiologische Wirkungen von Östrogenen und östrogenartig wirksamen Substanzen
Bei den natürlichen Östrogenen, den typisch weiblichen Sexualhormonen, handelt es sich um körpereigene Überträgerstoffe, die der Informationsübertragung bei der Regelung von Organfunktionen und Stoffwechselvorgängen dienen. Sie werden in so genannten endokrinen Drüsen gebildet .
Z.B. werden natürliche Östrogene überwiegend in den Granulosa- und Theka-Zellen der Ovarien zusammen mit den Gestagenen (Progesteron) aus dem männlichen Geschlechtshormon Testosteron über eine Aromatisierung des Ringes A unter oxidativer Entfernung der C-19-Methylgruppe durch das Enzym Aromatase gebildet.
Alternativ kommt auch die Synthese über Androstendion und Östron in Frage (MUTSCHLER et al. 2001).
In der Tabelle 2.1. werden klassische und nicht klassische östrogensensitive Gewebe und Zellen aufgeführt.
Die klassischen Wirkungen der Östrogene sind deren Einfluss auf das Wachstum der weiblichen Geschlechtsorgane und die Kontrolle des monatlichen Menstruationszyklus mit der Eireifung und der Zellproliferation im Uterus.
Diese klassisch östrogenregulierten Prozesse erfolgen meist im Zusammenspiel mit den Gestagenen und sind die Folge einer Interaktion des Hormons mit dem
Östrogenrezeptor, der in entsprechend großen Mengen in den Zielorganen wie z. B.
Uterus, Ovarien, Vagina und Milchdrüse exprimiert wird.
In den erwähnten Geweben kommt es dabei durch Östrogene u. a. zu einer Zellvergrößerung bzw. Zellvermehrung, die entweder durch eine Steigerung der Replikationsrate und/oder durch eine Senkung der Absterberate zustande kommt.
Darüber hinaus wird die Biosynthese des Progesteronrezeptors induziert (HORWITZ et al. 1978).
Jedoch sind auch Östrogenwirkungen in nicht klassischen Zielorganen festzustellen.
Beispiele hierfür sind das Gehirn, die Knochen, das kardiovaskuläre System, das Immunsystem und die Leber. Aus diesen Gründen werden verschiedene pathologische Prozesse wie degenerative Veränderungen im ZNS (FILLIT et al.
1986), Osteoporose oder Arteriosklerose (HENDERSON et al. 1988) häufig mit einem Östrogenmangel in Verbindung gebracht, z.B. in Folge des Klimakteriums.
Tab. 2.1: Östrogensensitive Gewebe und Zellen (nach JIRECEK et al. 1999)
Klassische Zielorgane Nicht klassische Zielorgane Eierstöcke
Vagina Gebärmutter Brustdrüse Nebenniere Hypophyse Hypothalamus Leydig-Zellen
Niere
Langerhans-Inseln Leber
Knochen
Kardiovaskuläres System Makrophagen
Thymozyten Lymphozyten Endothelzellen
Gliazellen bzw. Schwann-Zellen
2.1.3.2.1. Gewebeverteilung von ER αααα und ββββ
Östrogene Zielgewebe sind dadurch definiert, dass sie funktionelle ER exprimieren und unterschiedliche Reaktionen nach dem Einfluss von Östrogenen zeigen.
Die Gewebeverteilung der ER charakterisiert das potenzielle Ziel von Verbindungen, Agonisten und/oder Antagonisten, die über den ER wirken.
Die Tabelle 2.2. stellt die qualitative Gewebeverteilung von ERα und ERβ dar.
Zusammengefasst sind bekannte Daten aus Zellen und Geweben von Menschen, Mäusen und Ratten (MÜLLER und KORACH 2001).
Tab. 2.2.: Qualitative Gewebeverteilung von ER α und β (nach MÜLLER und KORACH 2001)
Gewebe ERααα α ERββββ
Hypothalamus ++ +
Hypophyse +++ +
Thymus ++ ++
Herz-Kreislaufsystem ++ +
Lunge + +++
Milchdrüse ++++ +
Leber ++ -
Niere +++ +
Blase + +++
Uterus ++++ +
Hoden +++ ++
Eierstöcke ++++ ++++
Prostata ++ ++++
Knochen ++ ++
Der ERα wird besonders im Brustdrüsengewebe, im Uterus und in den Eierstöcken exprimiert, während der ERβ vorwiegend in den Eierstöcken und der Prostata vorkommt. In etwas geringeren Mengen kommt der ERα im Hypophyse, der Niere und den Hoden, der ERβ in der Lunge und in der Blase vor.
2.1.3.2.2. Agonisten und Antagonisten
Substanzen, die an den ER binden und eine ER-vermittelte Antwort bewirken, werden Östrogene/Agonisten genannt. Klassisch sind ER-Antagonisten oder Antiöstrogene Substanzen, welche die ER-Wirkung hemmen oder verhindern. Die östrogene Wirkung ist aber nicht nur abhängig vom Liganden, sondern auch vom zellulären und genetischen Kontext.
So wirkt z.B. das Tamoxifen (für die Behandlung von Brustkrebs) im Uterus und im Knochen als Agonist, während es im Brustgewebe antagonistisch wirkt.
An industriellen Chemikalien gibt es eine Reihe von Beispielen, die sowohl in vitro als auch in vivo östrogene oder antiöstrogene Wirkung zeigen, z.B. phenolische Verbindungen (JIRECEK et al. 1999).
Meist wird von einer Verbindung nur eine bestimmte Wirkung (z.B. Zellproliferation oder die Bindung an den Rezeptor) gemessen. Es muss zusätzlich berücksichtigt werden, dass es durch den Metabolismus zu einer Aktivierung oder Deaktivierung der Wirkung kommen kann (JORDAN und ROBINSON 1987).
Eine weitere in Verbindung mit der Bewertung von östrogen-aktiven Substanzen intensiv diskutierte Frage ist die nach überadditiven, synergistischen Effekten bei Mischexpositionen.
2.2. Xenohormone
2.2.1. Synthetische Östrogene
Synthetische Östrogene, die als Wirksubstanzen in Kontrazeptiva (Mittel zur Empfängnisverhütung) enthalten sind, besitzen wie die natürlichen Östrogene eine steroidale Struktur (Abb. 2.3.).
Abb. 2.3.: Struktur der wichtigen synthetischen Östrogene
Die Ethinylgruppe von 17α-Äthinylöstradiol, das Addition von Äthinylmagnesiumbromid an die Carbonylgruppe des natürlichen Östrons hergestellt wird, macht diesen Steroidkörper deutlich schwieriger abbaubar als 17β-Östradiol und ermöglicht so die orale Applikation als Kontrazeptivum. Mestranol, ein weiteres synthetisches Östrogen, das Anwendung in Kontrazeptiva findet, wird durch Spaltung der Methylätherfunktion in Kläranlagen in 17α-Äthinylöstradiol umgewandelt. Auch diese synthetischen Östrogene werden in Form von Konjugaten (Glucuronide, Sulfate) mit dem Urin ausgeschieden und spätestens bei der Abwasseraufbereitung durch mikrobielle Dekonjugation mit Glucuronidasen oder Sulfatasen in ihre aktive Form zurückgeführt (GUENDRICH 1990).
2.2.2. Xenoöstrogene
Während die östrogene Wirkung von 17α- Äthinylöstradiol ein primäres Syntheseziel war, wurde die östrogenartige Wirksamkeit von bestimmten Pflanzenschutzmitteln, Industriechemikalien und deren Abbauprodukten in den letzten 40 Jahren oft zufällig und lange nach Inverkehrbringen der Substanzen bekannt (SUMPTER 1998). Diese strukturell sehr unterschiedlichen synthetischen Verbindungen ahmen das Verhalten von natürlichen Östrogenen nach (LINDHOLST et al. 2000).
Als Gegenstand intensiver Diskussion treten tierexperimentelle und epidemiologische Untersuchungen von potenziell reproduktionstoxikologisch relevanten Chemikalien mit östrogener Aktivität (so genannte Xenoöstrogene) auf. In der Abbildung 2.4. sind beispielhaft die Strukturen einiger synthetischer Östrogene dargestellt.
Bisphenol-A p-tert-Octylphenol
Abb. 2.4.: Strukturelle Formeln der synthetischen Östrogene Bisphenol-A und p-tert- Octylphenol
Von SONNENSCHEIN u. SOTO (1998) wurden 45 Chemikalien zusammengestellt, denen ein Einfluss auf das Reproduktionssystem des Menschen und der Tiere zugeschrieben wird, darunter die polychlorierten Biphenyle, Dibenzodioxine, Dibenzofurane und das DDT.
In einer Studie von GÜLDEN et al. (1997) werden ca. 180 synthetische Chemikalien mit einer östrogenen Aktivität aufgeführt. Die Anzahl der Chemikalien mit bekanntem
östrogenen Wirkpotential wird mit mehreren Hunderten angegeben. Meist handelt es sich um Phenole und Biphenole.
Einige nicht-phenolische aromatische Verbindungen entfalten östrogenähnliche Aktivität nach der Metabolisierung zu Phenolen (z.B. Methoxichlor, PAK, PCB) oder sind auch ohne Metabolisierung aktiv (z.B.o,p΄´-DDT). Einige andere Stoffe haben keine aromatische Struktur (Endosulfan, Dieldrin, Kepon, Toxaphen). Unter den in der Umwelt vorkommenden Stoffen sind neben den Pflanzenschutzmitteln insbesondere die antiöstrogenen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK), z.B. aus der unvollständigen Verbrennung fossiler Energieträger, von Bedeutung (COLBRON et al.1993).
Die Erkenntnis, dass umweltbedingte Einflüsse die Reproduktionsfähigkeit bei bedrohten Tierarten einschränken, hat in den letzten Jahren dazu geführt, dass der kausalen Verknüpfung von Umwelteinflüssen und Unfruchtbarkeit vermehrt Aufmerksamkeit entgegengebracht wird. Insbesondere retrospektive, epidemiologische Untersuchungen beim Menschen werden in den Medien äußerst plakativ dargestellt und in vielen Fällen auch kontrovers diskutiert (TURNER et al.1997).
Prävention und kausale Therapie umweltbedingter Fertilitätsstörungen erfordern das Wissen um potenzielle Störfaktoren. Eine Reihe von epidemiologisch ausgerichteten Publikationen weisen auf mögliche kausale Zusammenhänge von Umwelteinflüssen und Infertilität beim Tier (ARAI et al. 1983).
Die Nachweise, dass diese Umweltchemikalien Wirkungen entfalten können, die zumindest teilweise denen natürlicher Östrogene entsprechen, ist schon seit den 60er Jahren bekannt (TULLNER 1961).
Neuere Beobachtungen zur Geschlechtsdifferenzierung und Reproduktion von Wildtieren geben Anlass zu der Annahme, dass in der Umwelt weit verbreitete Xenoöstrogene von reproduktionstoxikologischer Relevanz sein könnten (GUILLETTE et al. 1994). Grundlage für diese Hypothese waren Studien, welche die Wirkung von synthetischen Östrogenen in Tierversuchen beschrieben.
2.2.3. Fruchtbarkeitsstörungen bei Menschen
Die Beobachtung des Anstiegs von Unfruchtbarkeit bei Menschen und die zunehmende Belastung unserer Umwelt haben in den letzten Jahren dazu geführt, dass eingeschränkte Fruchtbarkeit und negative Umwelteinflüsse kausal miteinander verbunden werden (LERCHL et al. 1996).
Eine Reihe von im Wesentlichen epidemiologischen Publikationen weist auf den Zusammenhang von Umwelteinflüssen und Beeinträchtigung männlicher Infertilität hin (MORTIMER 1997; EUSTACHE et al. 1999).
In der aktuellen Forschung stehen endokrine Wirkungen von Mykotoxinen, Phytoöstrogenen und Xenobiotika (östrogene bzw. androgenartige Wirkungen) auf die Gametenreifung im Vordergrund.
Die altersstandardisierte Erkrankungsrate an Hodenkrebs nimmt offensichtlich weiter stetig zu (RÖSCH et al.1999).
In Dänemark nahm z. B. die Inzidenz von Hodenkrebsfällen zwischen 1943 und 1996 um ca. 2,6% pro Jahr zu. Die Entwicklung der Geschlechtsorgane ist hormonabhängig. Deshalb ist es vorstellbar, dass Effekte von verschiedenen Xenohormonen auf die Entwicklung und auf die Entstehung des Hodenkrebses Auswirkungen haben können.
Experimentelle Belege liegen bisher nicht vor, da es für die häufigste Hodenkrebsform beim Menschen (Seminom) kein geeignetes Tiermodell gibt. Auf der Basis einer Studie von TOPARI et al. (1995), die eine pränatale Exposition gegenüber eine therapeutischen Dosen von Diäthystilbestrol (DES) durchgeführt haben, wurde ein signifikanter Risikofaktor für Hodenkrebs festgestellt. Das Risiko, an Hodenkrebs zu erkranken, lag für die Söhne DES-behandelter Mütter um den Faktor 2,6 höher als in der Allgemeinbevölkerung. Die Abbildung 2.5. zeigt z.B. eine altersstandardisierte Inzidenz von Hodenkrebs im Saarland 1970-1995.
Abb. 2.5.: Altersstandardisierte Erkrankungsrate an Hodenkrebs im Saarland 1970- 1995
Bei Frauen ist der Brustkrebs die am häufigsten auftretende Krebsform. Exposition gegenüber Östrogenen ist einer der Risikofaktoren für das Auftreten dieser Krankheit.
Dabei ist zu beachten, dass Tumore der Brust in östrogen-empfindliche und solche, die nicht östrogen-sensibel sind, eingeteilt werden können.
Nach KRIEGER et al. (1999) stieg die Inzidenz der östrogen-sensiblen Tumoren in den letzten Jahrzehnten deutlich stärker an als die der übrigen Brustkrebsarten (HUANG et al. 1997).
Seit der Veröffentlichung der Studie von WOLFF (1993), die die Körpergehalte von DDT und seiner Metaboliten mit der Häufigkeit des Auftretens von Brustkrebs assoziiert hat, gibt es eine Diskussion um die Bedeutung von Xenoöstrogenen bei der Entstehung vom Brustkrebs.
Uterus und Ovar sind ebenfalls wichtige Zielorgane für endokrinwirkende Umweltchemikalien. Über die innere Exposition dieser Fortpflanzungsorgane mit hormonell wirksamen Stoffen liegen bisher nur wenige Daten vor (LASKEY et al.
1993). Für eine fundierte Risikoabschätzung müssen neben synthetischen
Chemikalien auch endokrin wirksame Naturstoffe (z.B. Phytoöstrogene, Mykotoxine) bilanziert werden.
Im Rahmen von Untersuchungen von (SCHÄFER et al. 1996) wurden auf die bisher bekannten östrogen-wirksamen Stoffe aus der Umwelt hin Endometriumsproben von Frauen untersucht. In einer von 6 Proben wurde ferner als Einzelbefund Genistein mit einer Konzentration von 20 ppb gefunden. Von den im Endometrium und Fettgewebe sicher nachgewiesenen endokrin wirksamen Stoffen trat der antiandrogene DDT-Metabolit p,p´- DDE in den höchsten Konzentrationen auf.
Bei Frauen trat auch eine Reproduktionsstörung durch die Folgen der zwischen 1945 und 1970 durchgeführten Behandlung Schwangerer bei drohender Fehlgeburt (insgesamt 4-6 Millionen Frauen) mit dem synthetischen Östrogen Diäthylstilbestrol (DES) in hohen Dosen auf. DES weist eine höhere östrogene Potenz auf als das endogene Östrogen 17β-Östrodiol (GOLDEN et al. 1998; HERBST et al. 1971) fanden heraus, dass es bei den Töchtern dieser Frauen zu einem vermehrten Auftreten einer ansonsten seltenen Form von Vaginalkrebs kam.
2.2.4. Fruchtbarkeitsstörungen bei Tieren
Bereits seit den sechziger Jahren ist aus Tierexperimenten bekannt, dass nicht nur natürliche Hormone, sondern Chemikalien und auch pflanzliche Stoffe bei verschiedenen Tierarten Störungen der Keimdrüsen-, Schilddrüsen- und Nebennierenhormonproduktion verursachen können (COLBRON et al. 1996). Dies kann u. a. bei Fischen, Reptilien und Vögeln eine Verringerung der Fruchtbarkeit hervorrufen.
Die im Tierreich nachgewiesenen Veränderungen sind weitgehend unbestritten. Ein Zusammenhang mit den gleichzeitig festgestellten, teilweise sehr hohen Schadstoffbelastungen liegt nahe.
Anhand einiger Beispiele aus zahlreichen Beobachtungen an Tieren, die in Zusammenhang mit der Wirkung von Umweltchemikalien gebracht werden, (KARLAGANES et al. 1996) in Großbritannien, wurde festgestellt, dass in der Nähe von Kläranlagen Männchen der Regenbogenforelle die Ausgangsstoffe für die
Eidotterproduktion produzieren. Normalerweise wird das Dottereiweiß jedoch nur von Weibchen synthesiert und durch Östrogen stimuliert. Als Ursache wurde die Belastung des Kläranlageauslaufs mit östrogenartigen Chemikalien diskutiert.
Die Fortpflanzstörungen von Alligatoren am Apopka-See in Florida werden auf die starke Belastung des Sees mit Pflanzschutzmitteln zurückgeführt. Man vermutete einen Verweiblichungseffekt der Alligatormännchen durch DDT. Diese Verweiblichung führte zu Unfruchtbarkeit und zur Abnahme der Alligatorpopulation.
In der modernen Forschung im Bereich der Östrogene und östrogen wirkender Substanzen werden die zahlreichen von Pflanzen und Pilzen gebildeten Stoffe, nämlich Phytoöstrogene und Mykotoxine (SEIBERT 1996) als Endokrindisruptoren bei Tieren erforscht. Phytoöstrogene und Mykotoxine sind Substanzen mit einer erstaunlichen strukturellen Vielfalt, die besondere östrogenartige Effekte besitzen.
2.3. Östrogenaktive Substanzen als Futtermittelkomponente und deren Wirkungsmechanismus
2.3.1. Mykotoxine
Mykotoxine sind Stoffwechselprodukte von Pilzen. Pilze entwickeln sich gut bei feuchtwarmem Wetter an der Frucht oder am Halm von Getreide. Hier wachsen vor allem Schimmelpilze der Gattung Fusarium, deren Stoffwechselprodukte eine östrogen ähnliche Wirkung haben (EDWARDS et al. 1987).
Die Fusarienpilze können verschiedene Mykotoxine bilden - am häufigsten Deoxynilvalenol und Zearalenon. Die chemische Strukturformel des Zearalenons, ist der Abbildung 2.6. zu entnehmen.
Abb. 2.6.: Chemische Strukturformel des Zearalenons
In der Schweineproduktion ist die Gruppe des Zearalenon (ZON) von Bedeutung.
Diese kommen in Mais, Weizen, Hafer, Gerste und auch im Stroh vor. Da der Abbau dieser Toxine durch den Gärprozess nur gering ist, sind auch Maissilagen und CCM betroffen (DÄNICKE und OLDENBURG 2000).
Zearalenon (ZON) wirkt östrogen und anabol als Antagonist des Östrogenrezeptors α und als gemischter Agonist-Antagonist des Östrogenrezeptors β. Bei Versuchstieren konnten nach Gabe hoher Dosen von Zearalenon zahlreiche immunologische Veränderungen beobachtet werden. Zearalenon (ZON) wird im Körper relativ schnell absorbiert und zu α- und β Zearalenol und zum Teil α- und β Zearalenal metabolisiert, die dann glucuronidiert werden. Die Metaboliten werden über Galle,
Faeces und Urin ausgeschieden. Bei Schweinen dominierten ZON – Glucuronsäure - Konjugate und α ZON im Urin (BAUER und BINDER 1993).
Beim Schwein besteht eine hohe Affinität von α Zearalenon zu den Östrogenrezeptoren (COULOMBE 1993). Im Zusammenhang mit der Verfütterung von verschimmeltem Mais an Schweine wurde in einer epidemiologischen Erhebung von Hyperöstrogenismus bei weiblichen und männlichen Schweinen berichtet (BIEHL et al.1993).
Bei der Sau ist dies durch eine Schwellung des Gesäuges, Schwellung und Rötung der Vulva mit Fruchtbarkeitsstörungen bzw. Unfruchtbarkeit charakterisiert. Eine Mykotoxikose neugeborener Ferkel wird von DIEHL (1984) mit einer Schwellung und Rötung der Vulva, Rötung und Nekrose des Schwanzes, sowie einer kongenitalen Läsion der äußeren Genitalien beschrieben.
Auch beim Wiederkäuer kann die Aufnahme von Zearalenon (z.B. verschimmeltes Heu) Symptome eines Hyperöstrogenismus verursachen. Die auslösende Konzentration ist vom Alter der Tiere, von der Aktivität der Pansenflora, sowie von den Absorptionsverhältnissen abhängig. Die Tiere zeigen eine reduzierte Milchleistung, Unfruchtbarkeit, Libidoveränderungen, Pseudogravidität, Aborte, Euteranbildung und Durchfall (ROTH et al. 1990).
2.3.2. Sojabohnenpflanze
Verschiedene Kulturpflanzen können Inhaltsstoffe enthalten, die eine hormonähnliche, östrogene Wirkung im tierischen Organismus haben. Diese Pflanzenöstrogene, auch Phytoöstrogene (Phytohormone) genannt, sind als das Pflanzenwachstum beeinflussende Stoffe normale Bestandteile von Futterpflanzen.
Ein hoher Gehalt von Phytoöstrogenen kann sich jedoch auf die Fruchtbarkeit auswirken (KÖRNER 2000).
Sojabohnen enthalten bestimmte pflanzliche Inhaltsstoffe mit östrogen-ähnlichen Wirkungen. Diese heterogene Stoffgruppe (Coumestane, Lignane, Isoflavone) wird ebenfalls zu dem Phytoöstrogenen gezählt (SHUTT 1976).
Heutzutage wird die Sojabohne jedoch in subtropischen Gebieten Ostasiens, Nordamerikas, Brasiliens, Osteuropas und Südafrika kultiviert (VON BRUCHHAUSEN 1993). Schon WALZ (1931) beschrieb einige dieser Isoflavone als Hauptvertreter der Phytoöstrogene in der Sojabohne „Soja hispida“.
Die Sojabohnen sind eine besonders reichhaltige Quelle an Isoflavonen. Zu den bedeutendsten Vertretern gehören Genistein und Daidzein. Der Gesamtgehalt an Isoflavonen in Sojabohnen weist je nach Varietät Schwankungen zwischen ca. 120 bis 300mg/100g auf. Die Isoflavone der Sojabohnen befinden sich insbesondere in der Proteinfraktion (MURPHY 1982).
Vor allem die Isoflavone stehen als mögliche bioaktive Inhaltsstoffe der Sojabohnen seit einiger Zeit im Vordergrund wissenschaftlichen Interesses. In Lebensmitteln liegen die Isoflavone überwiegend als Glykosidderivate (z.B. Genistein und Daidzein) vor (PETTERSSON et al.1996).
2.3.3. Phytoöstrogene
2.3.3.1. Vorkommen und Struktur
Phytoöstrogene gehören aus chemischer Sicht zu den Polyphenolen und sind im Wesentlichen drei Strukturklassen zuzuordnen:
1) Isoflavone (Genistein, Daidzein);
Vorkommen: Soja (die höchste Konzentration enthalten die Sojabohnen, Sojaprodukte, schwarze Bohnen, Rotklee), Bohnen, Obst, Gemüse.
2) Lignane (Enteralakton, Enterodiol);
Vorkommen: Beeren, Vollkorngetreide, Leinsamen.
3) Coumestane (Coumesterol);
Vorkommen: Luzernesprossen.
Eine gemeinsame biologische Eigenschaft aller Phytoöstrogene ist ihre östrogene Aktivität, die auch zur Namensgebung geführt hat. Phytoöstrogene wirken somit im Körper ähnlich wie das weibliche Sexualhormon 17ß-Östradiol. Durch Interaktion mit
den Östrogenrezeptoren (ER) können sie die physiologische Wirkung dieses endogenen Steroidhormons nachmachen oder blockieren. Verglichen mit 17ß- Östradiol ist ihre östrogene Wirkung aber mindestens um den Faktor 100, meist sogar um den Faktor 1000 bis 10000 geringer.
Anderseits können Phytoöstrogene im Körper in einer 100- bis 10000 -fach höheren Konzentration als die endogenen Östrogene vorliegen. In Abhängigkeit von der Höhe des endogenen Östradiolspiegels können deshalb Phytoöstrogene sowohl eine östrogene als auch eine antiöstrogene Wirkung ausüben (KIM et al. 1998).
Isoflavone unterscheiden sich als 3-Phenylchromonderivate von den in der Pflanzenwelt weit verbreiteten Flavonen nur durch die Position der Verknüpfung von Chromon- und Phenylring.
Sie kommen überwiegend in der Familie der Schmetterlingsblütler (Fabeaceae) und hier vor allem bei den Hülsenfruchtartigen (Leguminosen) vor. Wichtigste Nahrungsquelle ist die Sojabohne, welche drei Isoflavone Genistein, Daidzein und Glycetein etwa im Verhältnis 10:8:1 enthält. Zwei weitere, vereinzelt in Lebensmitteln vorkommende Isoflavone sind Formononetin und Biochanin A, die 4´-Methyläther von Daidzein und Genistein. Beide Verbindungen sind v.a. in Rotklee, Klee- und Luzernesprossen zu finden.
In biologischer Hinsicht besitzen Daidzein und Genistein für die Pflanze eine antibakterielle, virostatische und fungistatische Wirkung besitzen.
Zusätzlich ist eine Wirkung als Signalsubstanz bei der Wurzelknöllchenbildung und als Zwischenprodukt des Phytoalexin-Metabolismus bekannt (MIKSICEK 1995).
Isoflavone liegen in der Pflanze meist als Zuckerkonjugate vor. In der Sojabohne dominieren z.B. die 6”-O-Malonyl-7-β-Glucoside.
Isoflavone sind in der Sojabohne unterschiedlich verteilt. In der Samenschale liegen sie in einer 5- bis 6-fach höheren Konzentration vor als im Kotyledon. Darüber hinaus ist der Anteil an Glycitein und Daidzein im Vergleich zu Genistein erhöht.
Strukturformeln der wichtigsten Isoflavonen sind in der Abbildung 2.7. dargestellt.
Abb. 2.7.: Strukturformeln der wichtigsten Isoflavone
Lignane bestehen aus zwei Phenyl-Propan-Einheiten, die 8,8‘-verknüpft sind (Abb.
2.8.).
Abb. 2.8.: Strukturformeln der pflanzlichen Lignane
Durch zusätzliche Brücken über Sauerstoffatome oder Kohlenstoff-Bindungen weisen sie eine große strukturelle Vielfalt auf.
Im Gegensatz zu den Isoflavonen Coumestanen und Lignane sind in pflanzlichen Lebensmitteln weit verbreitet, wobei Vollkorn und Ölsaaten die Hauptquelle darstellen. Die mit Abstand höchste Konzentration enthält Leinsamen. Wichtige Vertreter sind Secoisolariciresinol und Matairesinol. Daneben wurden inzwischen einige weitere Lignane wie Pinoresinol, Laraciresinol beschrieben, die in geringeren Mengen in Leinsamen, Roggenvolkorn und Kürbiskernen enthalten sind.
Coumestane sind in der Ernährung des Menschen von untergeordneter Bedeutung, da sie nur in sehr wenigen pflanzlichen Lebensmitteln, z.B. in Alfalfa, Klee und Sojasprossen, enthalten sind. Ihr wichtigster Vertreter ist Coumestrol, das von allen bisher bekannten Phytoöstrogenen die höchste östrogene Aktivität besitzt.
Die Strukturformeln der wichtigsten Coumestane sind der Abbildung 2.9. zu entnehmen.
Abb. 2.9.: Strukturformeln der wichtigsten Coumestane
Phytoöstrogene kommen in zahlreichen einheimischen Pflanzen, in Körnern und Getreide, Leinsamen, Gemüse und Früchten, Kräutern und Hülsenfrüchten, Granatäpfeln und Wurzelgemüse, vor. Als Isoflavone sind sie in Rotklee, Brokkoli, Weißkohl, u. a., als Lignane in Beeren, Leinsamen und verschiedenen weiteren Gemüsesorten vorhanden.
Phytoöstrogengehalte in mg/kg verschiedener Nahrungsmittel sind in der Tabelle 2.3.
zusammengefasst.
Tab. 2.3.: Phytoöstrogengehalte in verschiedenen Nahrungsmitteln
Isoflavon, gesamt (mg/kg)
Lignan, gesamt (mg/kg)
Genistein (mg/kg)
Daidzein (mg/kg)
Literatur
Sojabohne
Sojaextraktionsschrott Sojamehl
Sojamilch
Sojaprotein- Konzentrat Sojapaste
Sojapulver für Säuglingsnahrung Muttermilch, nach Verzehr von 20 g. Soja Weizen
Leinsamen Leinsamenmehl Rotklee
1140 500 1750 20-40 252
159 433
300
6-7 750 530 17
1160
140
91 234
201
13,5µg/L
115µg/g
580
112
68 199
87
25 µg/L
CASSIDY 1998 CASSIDY 1998 COWARD et al.1998 CASSIDY 1998 COWARD et al.1998
COWARD et al.1998 COWARD et al.1998 SETCHELL 1999
FRANKE et al. 1996 CASSIDY 1998 CASSIDY 1998 CASSIDY 1998 CASSIDY 1998 CASSIDY 1998
2.3.3.2. Besonderheiten der Pharmakokinetik
Phytoöstrogene sind Pflanzeninhaltsstoffe, die sehr verschiedenartige Funktionen haben. In den letzten 10 Jahren zielten verschiedene Arbeiten darauf ab, solche Phytoöstrogene zu ermitteln, die in der menschlichen Nahrung eine Rolle spielen (BAKER 1995).
Den bekanntesten Vertretern von Phytoöstrogenen, den Isoflavonen (Daidzein und Genistein) wird in der Forschung eine besondere Aufmerksamkeit geschenkt, weil sie in den höchsten Konzentrationen in Soja und Sojaprodukten vorkommen. Soja und Sojaprodukte gehören, wie bekannt, zu den heutzutage immer populärer werdenden Supplementen in der Nahrung der Menschen.
Isoflavone sind in Lebensmitteln hauptsächlich als Glykoside vorhanden, die in dieser Form nicht resorbiert werden können. Ein Großteil davon kann durch β- Glykosidasen der Dünndarmschleimhaut und durch Enzyme der intestinalen Mikroflora (Lactobacili, Bifidobacteria und Bacteroides) hydrolysiert werden (ALLRED et al. 2001).
Vor der Absorption können Isoflavone von der bakteriellen Mikroflora weiter metabolisiert werden, wobei Genistein zu p-Äthyl-Phenol und Daidzein größtenteils zu dem östrogen stark aktiven Equol und dem nichtöstrogenen O- Demythylangolensin (DMA) reduziert werden.
Daidzein wird durch Darmbakterienenzyme zu Equol umgewandelt. Dabei wird Daidzein zunächst zu Dehydrodaidzein reduziert, welches entweder durch Spaltung des C-Ringes zu O- Demethyl- Angolensin oder unter Erhalt des C-Ringes zu dem Isoflavan Equol verstoffwechselt werden kann.
Die Bildung von Equol ist starken interindividuellen Unterschieden unterworfen und vor allem von der Zusammensetzung der Darmflora abhängig. Etwa ein Drittel der Menschen sind nicht in der Lage, Equol aus Daidzein zu bilden. Auch eine hohe Aufnahme an Fett, wie sie in westlichen Ländern im Vergleich zu asiatischen Ländern der Fall ist, wirkt sich negativ auf die Equolbildung aus (KULLING et al.
2002).
Die weitere Metabolisierung der unkonjugierten Isoflavone (Aglukone) findet in der Leber und durch intestinale Mikroflora statt, hauptsächlich Hydroxylierung der Ausgangsverbindungen durch P450-Cytochrome, Enzyme CYP1A1, A2, 1B1 Isoenzyme, CYP3A4 (JOANNOU et al. 1995).
Die Methylierung und die Sulfatesterbildung von Genistein wurden in kultivierten Brustkrebszellen nachgewiesen (PETERSON et al. 1998).
Nach Absorption werden die phytoöstrogenen Verbindungen schnell und ergiebig mit Glukuronsäure, aber auch mit Sulfat rekonjugiert und mit Galle oder Urin ausgeschieden, wobei die Gallenverbindungen einem enterohepatischen Kreislauf unterliegen.
Lignane und Isoflavone (Genistein, Daidzein, Glycitein) sind die Phytoöstrogene, die nach derzeitigem Wissensstand die größte Bedeutung für den menschlichen Stoffwechsel haben. Diese pflanzlichen Substanzen werden von Enzymen der Darmflora abgebaut, wodurch sie von unseren Verdauungsorganen aufgenommen werden können und in Blut, Urin, Stuhl und Galle gelangen. Voraussetzung dafür ist allerdings, dass die Darmflora aktiv ist. Bei Versuchspersonen, die Antibiotika bekamen, verschlechterte sich der enzymatische Umbau im Darm, und sie schieden signifikant weniger Lignane im Urin aus.
Lignane werden durch die Darmflora hauptsächlich zu Enterolakton und Enterodiol abgebaut (AXELSON et al. 1982).
Bei der Metabolisierung von Isoflavonen, wie es schon oben erwähnt wurde, werden die Glykoside durch die Darmflora in die östrogen-aktiven Aglykone und die entsprechenden Zuckerreste gespalten.
Die Spaltung dieser Substanzen erfolgt in Abhängigkeit von der Darmflora, die durch Faktoren wie Ernährungsgewohnheiten (weniger Fett, mehr Kohlenhydrate), Antibiotikagebrauch, Krankheit und Stress (Magen pH, Darmmotilität), das Alter, der individuelle Enzympolymorphismus und das Geschlecht beeinflusst ist (ROWLAND et al. 1999).
Die durch Resorption erreichbaren Plasmakonzentrationen von Isoflavonen variieren stark in Abhängigkeit von der zugeführten Nahrung.
Z.B. haben die durchgeführten Studien gezeigt, dass bei japanischen Männern eine bis zu 110-fach höhere Plasmakonzentration von Isoflavonen gemessen wurde als in einer entsprechend ausgewählten Gruppe finnischer Männer. Sie erreichte in Einzelfällen Konzentrationen von 2,4 µM (600 ng/ml). Höchste Plasmakonzentrationen von Phytoöstrogenen konnten 4-8 Stunden nach der Nahrungsaufnahme beobachtet werden (ADLERCREUTZ 1998).
2.3.3.3. Mechanismen der Phytoöstrogenwirkung
Zur Prüfung von Stoffen auf östrogene oder antiöstrogene Aktivität können verschiedene In-vitro und In-vivo Methoden herangezogen werden. Sie sind unterschiedlich aufwendig und besitzen verschiedene Empfindlichkeit und Aussagekraft (O´CONNOR et al. 1996).
In vitro Assays sind vor allem für ein Screening verdächtiger Stoffe und für Untersuchungen zu deren Wirkungsmechanismus von Bedeutung. Für die Ermittlung der Wirkungsstärke sind Befunde aus In-vivo-Tests unverzichtbar, denn alle In-vitro- Testsysteme sind dahingehend limitiert, dass Fragen zur Toxikokinetik einer Substanz unbeantwortet bleiben. Zudem lassen sich in vivo auch andere, nicht direkt hormonrezeptorvermittelte endokrine Wirkungen und gewebespezifische hormonelle Aktivitäten erfassen (REEL et al. 1996).
In-vitro-Tests:
Für die Wirkung hormonell aktiver Stoffe ist deren Interaktion mit zellulären Rezeptoren von zentraler Bedeutung. Hierfür stehen zwei ER, die als ERα und ERβ bezeichnet werden, zur Verfügung. Phytoöstrogene, insbesondere Genistein und Coumestrol, besitzen eine wesentlich höhere Bindungsaffinität zu ERβ als zu ERα, was eine gewebespezifische Wirkung einiger Phytoöstrogene erklären könnte.
Allerdings ist die Stärke der Interaktion sehr unterschiedlich: Phytoöstrogene wie Coumestrol, Daidzein und Genistein binden z.B. etwa 100 bis 1000 Mal schwächer an den Östrogenrezeptor als das körpereigene Hormon Östradiol (ZACHAREWSKI 1997).
Mit dem als sehr sensitiv geltenden „E-Screen“ sind z.B. etliche in der Umwelt vorkommende Chemikalien untersucht worden. In diesem Test wurde ihre proliferationsfördernde Wirkung in der östrogensensitiven Brustkrebszelllinie (MCF-7) mit der von Östradiol (E2) verglichen. Die synthetischen Stoffe waren alle deutlich schwächer wirksam als Phytoöstrogene und um Größenordnungen (4-6 Zehnerpotenzen) schwächer wirksam als Östradiol (Tab. 2.4.).
Tab. 2.4.: Relative Wirkstärke einiger östrogen-aktiver Substanzen und Phytoöstrogene in vitro in MCF-7 Zellen (E-Screen)
Substanz Studie A nach SOHNENSCHEIN
und SOTO 1995
Studie B nach GREIM 1998
Studie C und D nach SOTO et al. 1992
Östradiol 1,0 1,0 1,0
DES - 0,7 10
Zearalenon 0,04 0,0086 0,01
Coumestrol - 0.4786 0,01
Daidzein 0,0003 0.00111 0.00001
Genistein 0,0001 0.00080
Biochanin A 0,00002 0.000007
o,p´ -DDT 0,000012 0.000048
Kepon - - 0.000001
NP (techn.) - - 0.000001
4-t-Butylphenol - - 0.000003
In-vivo-Tests
Für die Studien über Phytoöstrogene liegen einige Daten aus einem Uterusgewichtstest an Mäusen vor (Tab. 2.5.). Die für Zearalenon, Coumestrol und Genistein ermittelten Aktivitäten lagen weit (4 bis 6 Zehnerpotenzen) unten denen von DES (Diethylstilbestrol). Auch wenn man berücksichtigt, dass DES bei oraler Gabe viel wirksamer ist als Östradiol, ist die ermittelte Wirkstärke der Phytoöstrogene im Vergleich zu körpereigenen Hormonen deutlich geringer (STOB 1983).
Tab. 2.5.: Wirkstärke von Phytoöstrogenen in vivo im Maus-Bioassay bei oraler Gabe (nach STOB 1983)
Substanz Dosis, die eine Erhöhung des Uterusgewichts von 25 mg erzeugt
Relative Potenz
DES 0.083 µg 100000
Östron 1.2 µg 6900
Coumestrol 240 µg 35
Genistein 8 mg 1,0
Daidzein 11 mg 0,75
Biochanin A 18 mg 0,46
Formononetin 32 mg 0,26
2.3.3.4. Vergleichbare Wirksamkeit der Phytoöstrogene
Zum Vergleich des geschätzten Verzehrs von Nahrungsöstrogenen wurden experimentelle Studien mit Frauen und Männern durchgeführt. Es wurde angenommen, dass ein physiologischer Effekt von phytoöstrogenreicher Nahrung sich in Form einer Verlängerung der follikulären Zyklusphase und als Vorbeugungsfaktor zum Risiko einer hormonabhängigen Krebserkrankung, einer
kardiovaskulären Erkrankung oder Osteoporose ausdrücken könnte (SCHWARTZ et al. 1996).
Zusätzlich beobachtete man, dass insbesondere japanische Frauen weniger unter den so genannten „Wechseljahrsbeschwerden“ litten als ihre westeuropäischen oder nordamerikanischen Altersgenossinnen (LOCK 1986). Gleiche Ergebnisse fand man auch für die Osteoporose, die in Japan eine deutlich geringere Inzidenz aufweist.
Wanderten japanische Frauen nach Nordamerika oder Europa aus, so änderte sich ihr Risiko, eine hormonabhängige maligne Krankheit zu erleiden, nicht signifikant.
Dies wurde mit der Weiterführung ihrer traditionell sojareichen Ernährung erklärt, denn sie verzehren ca. 30- bis 50-mal mehr Sojaprodukte als amerikanische oder europäische Frauen (SHIMIZU et al. 1991).
Die auf der Basis von Food Frequency Questionnaires geschätzten Phytoöstrogenaufnahmen (z.B. Isoflavonen) in Europa liegen sehr niedrig (0,5 -1 mg/Tag). Populationen, in denen Soja wie in Japan integraler Teil der Ernährung ist, nehmen an Phytoöstrogenen laut ARAI et al. (2000) ca. 25-100mg /Tag auf.
Die Tabelle 2.6. stellt beispielhaft anhand der durchgeführten Studien die geschätzte mittlere Tagesaufnahme von Isoflavonen bei verschiedenen Populationen und Plasmaspiegel bei den Menschen, deren Nahrung über verschiedene Phytoöstrogengehalte verfügt, dar.
Tab. 2.6.: Expositionssituation und Isoflavonspiegel beim Menschen
Geschätzte mittlere Tagesaufnahme von Isoflavonen bei verschiedenen Populationen (nach CASSIDY 1998)
(mg/Tag)
UK <1
USA 1-3
Ostasiatische Bevölkerung 50-100
Equolausscheidung im Urin (nach ADLERCREUTZ 1995)
Japan 20fach höher im Vergleich zu
westlichen Ländern Plasmaspiegel (Summe aus Daidzein und Genistein)
(nach KURZER und XU 1997)
(ng/ml)
Japaner 40-240
Vegetarier 28-100
Säugling, ernährt auf der sojabasierten Babynahrung
980 Säugling, ernährt auf der Basis der
konventionellen Babynahrung auf Kuhmilchbasis oder Muttermilch
5
2.3.4. Hyperöstrogenismus
In der wissenschaftlichen Diskussion wird angenommen, dass die Zearalenonkontamination des Futters und die Pflanzinhaltsstoffe (Phytoöstrogene), die verschiedene Futtermittel enthalten können, die möglichen Ursachen für Hyperöstrogenismus mit Fruchtbarkeitsstörungen, Totgeburten, Aborten und Missbildungen sind.
Einige dieser Phytoöstrogene ähneln strukturell den natürlichen Östrogenen von Nutztieren (HARBRONE 1995). Neuere Erkenntnisse zeigen, dass die Phytoöstrogene bei Haustieren, als Fütterungsbestandteil (z. B. sojahaltige
Fütterung) verzehrt, sowohl als Östrogenagonisten als auch Östrogenantagonisten wirken können (BARRET 1996).
In der Literatur wird in etlichen Untersuchungen bei verschiedenen Tierarten zur Wirkung von Phytoöstrogenen, die in Futtermitteln enthalten sind, erörtert, dass sie die Fertilität beeinträchtigen und Entwicklungsstörungen verursachen (MIGLIACCIO et al. 1995).
So gibt es eine Reihe von Studien bei Nagern zur Untersuchung der Wirkung von Phytoöstrogenen auf deren Reproduktionssystem. Die Fütterungsversuche bei den Nagern wurden während verschiedener Perioden ihrer Entwicklung durchgeführt, weil es einige Phasen der Organogenese gibt, die sehr empfindlich auf Phytoöstrogene reagieren (PRYOR et al. 2000). Fütterungsversuche fanden während der pränatalen, perinatalen, neonatalen Perioden der Entwicklung statt.
Von LEVY et al. (1995) wurde die Wirkung von Phytoöstrogenen auf die pränatale Entwicklung (in utero exposure) der Ratten ermittelt. Trächtige Muttertiere erhielten Genistein in der Dosis von 0,5 bis 25 mg/Tag s.c. ab dem 16. bis zum 20. Tag der Trächtigkeit. Die Forscher stellten bei neugeborenen Ratten ein verringertes Körpergewicht und eine Verzögerung in der sexuellen Entwicklung fest.
In Fütterungsversuchen wurden Untersuchungen des Uterusparameters der Ratten (uterotrophic assay), wie Uterusgewicht im Verhältnis zur Körpermasse, Durchmesser des Eileiters, Anzahl der Uterusdrüsen, durchgeführt. KANG et al.
(2002) fütterten die Versuchsratten mit Futter, das 100 mg/kg/Tag der Phytoöstrogene Daidzein und Genistein enthielt. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten eine Vergrößerung des Uterusgewichtes und die Proliferation des vaginalen Epithels.
Eine Übertragung der Wirkung von östrogenaktiven Substanzen durch die Plazenta wurde durch Fütterungsversuche mit Ratten bestätigt (DOERGE et al. 2001). Das an die Muttertiere oral verabreichte Genistein wurde sowohl über die Plazenta als auch über die Milch ausgeschieden. Aktives Genistein wurde in fetalem Serum und im
