Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover Institut für Physiologie, Biochemie und Hygiene der Tiere der Universität Bonn
Untersuchungen zur immunmodulativen Wirkung von ß-1,3/1,6-Glukanen
bei Schweinen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von SIMONE SCHMITZ
aus Bensberg Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Herr Prof. Dr. Gerhard Breves Frau Prof. Dr. Dr. Helga Sauerwein
1. Gutachter: Herr Prof. Dr. G. Breves 2. Gutachter: Herr Prof. Dr. W. Leibold
Tag der mündlichen Prüfung: 07.06.2004
1 Einleitung und Literaturübersicht 1
2 Material und Methoden 9
2.1 Versuchsdesigns zur Untersuchung der Wirkung einer 9 ß-Glukan-Supplementierung auf das Immunsystem
von Absetzferkeln mit laboranalytischen Untersuchungen von Blutproben
2.1.1 Versuch I: Einsatz einer bestimmungsgemäßen Dosierung 9 eines ß-Glukanpräparates
2.1.1.1 Tiere und Fütterung 9
2.1.1.2 Blutprobenentnahme 10
2.1.2 Versuch II: Einsatz einer provokativ hohen Dosierung 11 eines ß-Glukanpräparates
2.1.2.1 Tiere und Fütterung 11
2.1.2.2 Blutprobenentnahme 12
2.1.3 Geräte und Materialien 13
2.1.3.1 Geräte 13
2.1.3.2 Software 14
2.1.3.3 Klinikbedarf 14
2.1.3.4 Laborbedarf 15
2.1.3.5 Materialien für die Bestimmung der Phagozytoseaktivität und des 15
oxidativen Burst
2.1.3.6 Materialien für die Bestimmung der Haptoglobinkonzentration 16 2.1.3.7 Materialien für die Bestimmung der Immunglobulin G- 19 Konzentration
2.1.3.8 Materialien für die Bestimmung der Immunglobulin A- 20 Konzentration
2.1.3.9 Materialien für die Bestimmung von oxidativem Stress 21 2.1.3.10 Materialien zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität 21 2.1.3.11 Materialien für die Immunhistologie 22 2.1.3.12 Materialien für die histomorphometrischen Ausmessungen 24 2.1.4 Untersuchung von Parametern der unspezifischen Abwehr 24
in Probenmaterial aus den Versuchen I und II
2.1.4.1 Phagozytoseaktivität und oxidativer Burst 24
2.1.4.2 Haptoglobin 32
2.1.5 Untersuchung von Parametern der spezifischen Abwehr 34 in Probenmaterial aus den Versuchen I und II
2.1.5.1 Immunglobulin G (IgG) 34
2.1.5.2 Immunglobulin A (IgA) 35
2.1.6 Untersuchung von Parametern des oxidativen und antioxidativen 36 Status in Probenmaterial aus den Versuchen I und II
2.1.6.1 Oxidativer Stress 36
2.1.6.2 Antioxidative Kapazität 38
2.1.7 Großes Screening: Hämatologie und klinische Blutchemie 42 (Versuche I und II)
2.1.8 Erfassung der Leistungsparameter bei den Tieren aus den 45 Versuchen I und II
2.1.8.1 Futteraufnahme 45
2.1.8.2 Gewicht 46
2.1.9 Prüfparameter zur Beurteilung des Betriebsmanagements 46 (Versuche I und II)
2.2 Versuchsdesign zur Untersuchung der Wirkung einer 48 ß-Glukan-Supplementierung auf das intestinale Immunsystem bei Mastschweinen mit immunhistochemischen
Untersuchungen des Ileums (Versuch III)
2.2.1 Versuchsaufbau und -durchführung 48
2.2.1.1 Tiere und Fütterung 48
2.2.1.2 Entnahme der Proben (Darmgewebe) 48 2.2.2 Anfertigen von Gefrierschnitten 49
2.2.3 Immunhistochemie 49
2.2.4 Histomorphometrische Messungen 52
2.3 Statistische Auswertung und Darstellung 53 2.3.1 Parameter aus den Versuchen I und II 53
2.3.2 Parameter aus Versuch III 54
3 Ergebnisse 55
3.1 Versuch I: Einsatz einer bestimmungsgemäßen Dosierung 55 eines ß-Glukanpräparates bei Absetzferkeln
3.1.1 Gesundheitsstatus der Tiere 55
3.1.2 Blutparameter 55
3.1.2.1 Phagozytoseaktivität 55
3.1.2.2 Oxidativer Burst 56
3.1.2.3 Haptoglobin 57
3.1.2.4 Immunglobulin G 58
3.1.2.5 Immunglobulin A 59
3.1.2.6 Oxidativer Stress 61
3.1.2.7 Antioxidative Kapazität 62
3.1.2.8 Zusammenhänge zwischen den gemessenen Parametern 64 der spezifischen und unspezifischen Abwehr sowie des
oxidativen und antioxidativen Systems
3.1.2.9 Großes Screening: Hämatologie und klinische Blutchemie 68
3.1.3 Leistungsparameter 68
3.1.3.1 Futteraufnahme und Tageszunahme im Zeitraum der 68 Supplementierung mit ß-Glukanen
3.1.3.2 Gewichtsentwicklung während der gesamten Versuchsdauer 69 3.2 Versuch II: Einsatz einer provokativ hohen Dosierung 71
eines ß-Glukanpräparates bei Absetzferkeln
3.2.1 Gesundheitsstatus der Tiere 71
3.2.2 Blutparameter 72
3.2.2.1 Phagozytoseaktivität 72
3.2.2.2 Oxidativer Burst 74
3.2.2.3 Haptoglobin 75
3.2.2.4 Immunglobulin G 77
3.2.2.5 Immunglobulin A 79
3.2.2.6 Oxidativer Stress 81
3.2.2.7 Antioxidative Kapazität 82
3.2.2.8 Zusammenhänge zwischen den gemessenen Parametern 84 der spezifischen und unspezifischen Abwehr sowie des
oxidativen und antioxidativen Systems
3.2.2.9 Großes Screening: Hämatologie und klinische Blutchemie 88
3.2.3 Leistungsparameter 89
3.2.3.1 Futteraufnahme und Tageszunahme im Zeitraum der 89 Supplementierung mit ß-Glukanen
3.2.3.2 Gewichtsentwicklung während der gesamten Versuchsdauer 90 3.2.4 Prüfparameter zur Beurteilung des Betriebsmanagements 92
in den Versuchen I und II
3.3 Versuch III: Einsatz eines ß-Glukanpräparates bei 92 Mastschweinen
3.3.1 Intestinale Immunabwehr des Ileums 92
3.3.2 Histomorphometrie 96
4 Diskussion 100
5 Zusammenfassung 131
6 Summary 133
7 Literaturverzeichnis 135
8 Anhang 145
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ABTS 2,2'-Azinobis-(3-ethylenbenzothiazolin-6-sulfonat) ad lib. ad libitum
AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol
AIC Akaike`s Information Criterion AP Alkalische Phosphatase AST Aspartat-Amino-Transferase BG Behandlungsgruppe
BKZ Betriebskennziffer bzw. beziehungsweise ca. zirka
Carr. Units Carratelli Einheiten
CD cluster of differentiation (Differenzierungsantigene von Zellen) CK Kreatinkinase
d. h. das heißt
DL Deutsche Landrasse
DNA Desoxyribonucleinacid (Desoxyribonukleinsäure)
D-ROM derivatives of reactive oxygen metabolites (Derivate reaktiver Sauerstoffmetabolite)
E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay (Enzymimmunassay) FBG Fungale ß-Glucanase-Unit
Fc Fragment Crystalline (ein konstanter Teil der schweren Immunglobulinketten von Antikörpern)
FMLP Formylmethionyl-Leucylphenylalanin FTU Phytase-Unit
FXU Fungale Xylanase-Unit
GOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase
γ-GT γ-Glutamyl-Transferase
H• Wasserstoffradikal
HE Hämalaun-Eosin-Färbung HX - Fe3+ Metmyoglobin
IgA Immunglobulin A IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M i. m. intra muskulär i. p. intra peritoneal i. v. intra venös
KBE Kolonien-bildende Einheiten kDa Kilodalton
KG Kontrollgruppe
KNU Kilo Novo Amylase-Unit LDH Laktatdehydrogenase
mcg µg
MCH mean corpuscular hemoglobin (Mittlerer Hämoglobingehalt der Einzelerythrozyten)
MCHC mean corpuscular hemoglobin concentration (Mittlere Hämoglobinkonzentration der Erythrozyten)
MCV mean corpuscular volume (Mittleres Erythrozytenvolumen) Me1+, Me2+ Übergangsmetalle
mRNA messenger Ribonukleinsäure
M-Zellen Microfold/Membranous-Cells (immunologisch wichtige Darmzellen der stark gefältelten Oberflächenmembran) n Anzahl der Tiere
NADPH Nicotinamidadenindinucleotidphosphat NBT Nitroblue Tetrazolium
ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity (Messung der Redoxkapazität für Sauerstoffradikale)
PGG-Glukane Poly-(1-6)-ß-D-Glucopyranosyl-(1-3)-ß-D-Glucopyranose- Glukane
PBS Phosphate-buffered Saline Pi Pietrain
r Korrelationskoeffizient restrik. restriktiv
RO•, ROO• freie Radikale ROOH Peroxid
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
SEM Standard Error of Means (Standardfehler) Tab. Tabelle
TBKZ Teilbetriebskennziffer
TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity (Messung der Trolox- äquivalenten antioxidativen Kapazität)
u. a. unter anderem V I Versuch I V II Versuch II
arithmetischer Mittelwert z. B. zum Beispiel
z. T. zum Teil
1 Einleitung und Literaturübersicht
Bei antimikrobiellen Wachstumsförderern handelt es sich um Fütterungsantibiotika, die landwirtschaftlichen Nutztieren zur Verbesserung des Gesundheitsstatus, zur Steigerung der Wachstumsrate und damit allgemein für eine effektivere Produktions- leistung verabreicht werden bzw. wurden. Dabei sind die genauen Wirkungsmecha- nismen dieser Leistungsförderer noch nicht eindeutig geklärt. Bekannt ist, dass sie beim Schwein sowohl die gewöhnliche intestinale Flora, die mit dem Wirt in Konkurrenz um Nährstoffe steht, als auch die unerwünschten pathogenen Darmbakterien, die möglicherweise zu Erkrankungen führen können und dadurch die Leistung beeinträchtigen, reduzieren. Antimikrobielle Substanzen werden in
„subtherapeutischen“ Konzentrationen (= 1/100 der therapeutischen Dosierung) ein- gesetzt, wodurch bereits die im Gastrointestinaltrakt der Tiere empfänglichen Bakterien ausreichend gehemmt werden sowie die allgemeine Zusammensetzung der bakteriellen Darmflora deutlich beeinflusst wird (Übersichtsarbeit: WEGENER et al., 1999). Aufgrund der Unterdrückung pathogener Keime und der verminderten Bildung von Toxinen entstehen weniger Proteinabbauprodukte wie Ammoniak und biogene Amine, die den Organismus belasten. Dies führt zu einer verbesserten Energie- und Nährstoffverfügbarkeit, so dass dadurch sowohl die Wachstumsraten als auch die Futterverwertung gesteigert werden konnten, während die Morbiditäts- und Mortalitätsrate gesenkt wurde. Durch den Einsatz von Fütterungsantibiotika bei Absetzferkeln sollen Steigerungen der Wachstumsraten um 25 bis 30 % sowie der Futterverwertung um 12 bis 15 % erreichbar sein (Übersichtsarbeit: CROMWELL, 2002).
Die Supplementierung mit antimikrobiellen Substanzen war in der Tierfütterung in den letzten 30 Jahren ein gängiges Verfahren. Dies führte jedoch bei den supplementierten Tieren zu Resistenzbildungen bestimmter Darmbakterien. So konnte z. B. nach jahrelangem Einsatz von Glykopeptiden als Fütterungsantibiotika (Avoparcin, 1974 in Europa zugelassen) ein großes Reservoir an resistenten Enterococcus faecium-Bakterien bei den zur Lebensmittelgewinnung dienenden Tieren nachgewiesen werden. Ein länderübergreifender Vergleich erbrachte den Nachweis, dass nach erlaubtem Einsatz dieses Leistungsförderers resistente Enterococcus faecium-Bakterien in hoher Frequenz isoliert werden konnten, während bei verbotenem Einsatz diese Resistenzen nicht auftraten (z. B. Schweden, USA).
Darüber hinaus wurden resistente Enterococcus faecium-Bakterien auch beim
Menschen nachgewiesen, wobei man davon ausging, dass Lebensmittel tierischer Herkunft hierfür das Hauptreservoir darstellten, so dass möglicherweise eine horizontale Übertragung der für die Resistenzbildung verantwortlichen Gene aus- schlaggebend war. In Folge dessen wurden Bedenken geäußert, dass es zu drastischen Einschränkungen bei der Wirksamkeit therapeutisch eingesetzter Antibiotika kommen könnte (Übersichtsarbeit: WEGENER et al., 1999). Es wurde zudem das Vorkommen resistenter E. coli- und Campylobacter jejuni-Bakterien sowie Salmonella Serovaren sowohl bei Tieren, die medikiertes Futter erhielten als auch beim Menschen nachgewiesen, so dass Resistenzen nicht nur bei Kommensalen, sondern auch bei pathogenen Erregern zu finden waren (Übersichtsarbeit: WITTE, 1998).
CORPET (1987) untersuchte den Zusammenhang zwischen antibiotischen Rück- ständen in Nahrungsmitteln und der Resistenzbildung von E. coli-Bakterien im Darm des Menschen. Hierzu wurde Ampicillin in einer geringen Dosierung von 1,5 mg pro Tag oral an Probanden verabreicht, wobei jedoch resultierend kein Effekt auf die Anzahl resistenter E. coli-Bakterien im Kot zu finden war. Dabei spiegeln die im Kot befindlichen Bakterien die Mikroflora des Kolons wieder. Obgleich im Versuch bereits eine niedrige Konzentration für die Medikation mit Ampicillin gewählt wurde, lag diese jedoch vergleichsweise höher als für in Fleisch gefundene antibiotische Rückstände.
Der Autor schloss aus seinen Ergebnissen, dass die aufgrund des therapeutischen Einsatzes oder nach prophylaktischer Verabreichung als Fütterungsantibiotika nachgewiesenen Rückstände in Nahrungsmitteln nicht für die Resistenzbildungen der Darmbakterien beim Menschen verantwortlich gemacht werden können.
Aufgrund der allgemeinen Problematik des Vorkommens resistenter Mikroorga- nismen bei Mensch und Tier wurde zunächst 1997 europaweit Avoparcin für den Einsatz als Leistungsförderer verboten, sowie nachfolgend 1999 die antibiotisch wirksamen Mittel Bacitracin, Spiramycin, Tylosin und Virginiamycin (CASEWELL et al., 2003). Es wurden generell Fütterungsantibiotika verboten, die ebenfalls als Therapeutika in der Humanmedizin eingesetzt werden bzw. eine bekannte Kreuzresistenz mit den im Humanbereich eingesetzten Antibiotika aufweisen. Die in Deutschland zur Zeit noch futtermittelrechtlich zugelassenen antibiotischen Leistungsförderer für Ferkel und Mastschweine sind Salinomycin-Natrium, Avilamycin sowie Flavophospholipol, wobei jedoch auch deren Einsatz im Jahre 2006 verboten wird (Übersichtsarbeit: PHILLIPS et al., 2004). AARESTRUP et al.
(2001) konnten durch Untersuchungen nachweisen, dass aufgrund des verminderten selektiven Drucks durch das Verbot der Leistungsförderer die Resistenzbildung bestimmter Mikroorganismen in Schweine- und Broilerbeständen in Dänemark zurückgegangen war. Auch wenn das Vorkommen antimikrobieller Resistenzen beim Menschen nach dem Verbot der Wachstumsförderer noch nicht einschlägig untersucht wurde, konnte dennoch in Deutschland zwischen den Jahren 1994 und 1997 für Glykopeptid-resistente Enterococcus faecium-Bakterien ein Rückgang bezüglich der Übertragung zwischen gesunden Individuen von 13 % auf 4 % festgestellt werden, nachdem 1996 der Einsatz von Avoparcin verboten worden war (KLARE et al., 1999). In der Übersichtsarbeit von WIERUP (2001) wird aufgrund des generellen Verbotes antibiotischer Leistungsförderer seit 1986 in Schweden eine Bilanz über die damit verbundenen Auswirkungen gezogen. Dabei mussten in der Ferkelproduktion zunächst in den ersten Jahren vermehrt klinische Erkrankungen verzeichnet werden, die einen erhöhten Einsatz von Antibiotika in therapeutischer Dosierung notwendig machten, so dass der Verbrauch dadurch in den Jahren 1988 um 5 % und 1989 um 6 % anstieg. Zudem wurde zusätzlich auch eine Erhöhung der Mortalitätsrate der Ferkel nach dem Absetzen festgestellt. In der darauf folgenden Zeit fiel dann u. a. aufgrund zunehmender Verbesserungen in den Management- systemen der Antibiotikaeinsatz insgesamt wieder rapide ab, so dass bei entsprechend guter Betriebsführung mit hohem hygienischem Standard im Vergleich zu einem weniger guten Management die eingesetzte Menge an Antibiotika um das drei- bis vierfache niedriger lag. Diese Beobachtungen machen deutlich, dass unter guten Produktionsbedingungen eine konkurrenzfähige Tiererzeugung und -aufzucht möglich ist, ohne den Einsatz von antimikrobiellen Leistungsförderern. Allerdings muss auch erwähnt werden, dass trotzdem das ursprüngliche Leistungsniveau in der Tierproduktion nach dem Verbot der Fütterungsantibiotika bislang noch nicht wieder erreicht werden konnte.
CASEWELL et al. (2003) verdeutlichen in ihrer Übersichtsarbeit, dass sich nach dem europaweiten Verbot antibiotischer Leistungsförderer insgesamt die gesundheitlichen Bedingungen für die Tiere verschlechtert haben. So waren z. B. in Dänemark und Spanien vermehrt Diarrhoe-Erkrankungen und chronische Infektionen, hervorgerufen durch Lawsonia intracellularis, sowie auch eine erhöhte Mortalitätsrate bei Ferkeln zu verzeichnen.
Dieses gehäufte Aufkommen an Infektionen führte europaweit zu einem deutlich erhöhten Einsatz therapeutischer Antibiotika, so dass zwischen 1999 und 2000 der Verbrauch um 14 % anstieg.
Aufgrund der geschilderten Problematik, die mit dem eingeschränkten Einsatz bzw.
dem generellen Verbot von antimikrobiellen Leistungsförderern einhergeht, wurden Untersuchungen über mögliche Alternativen mit adäquater Wirkung notwendig. Eine voraussetzende Basis für eine optimale Tiergesundheit stellt dabei nach wie vor ein gutes und tiergerechtes Hygienemanagement dar, dessen Ziel es sein muss, die mikrobielle Belastung so gering zu halten, dass ein infektiöses Niveau nicht erreicht werden kann bzw. das Immunsystem zu aktivieren, ohne jedoch eine klinisch manifeste Erkrankung hervorzurufen. Zusätzlich sind jedoch weitere Maßnahmen nötig, um vor allem die Immunabwehr in kritischen Phasen, wie z. B. bei Ferkeln um den Zeitpunkt des Absetzens, zu unterstützen. Deshalb werden bereits verschiedene Futterzusätze als alternative Möglichkeiten diskutiert. Hierzu zählen Mikroorga- nismen, wie Hefen, Milchsäurebakterien und Sporenbildner (Probiotika), Frukto- und Galakto-Oligosaccharide (Präbiotika), organische Säuren sowie Kräuter-, Pflanzen-, Algen- oder Hefezellextrakte. Die Wirksamkeit der einzelnen Futterzusatzstoffe wurde in diversen Untersuchungen bereits getestet. So konnten SHU et al. (2001) nach Verabreichung von Bifidobacterium lactis über eine Magensonde bei drei Wochen alten Ferkeln einen begünstigenden Effekt sowohl auf den Schweregrad an auftretenden Diarrhoen, die Futterverwertung als auch auf diverse Parameter der unspezifischen und spezifischen Immunabwehr erzielen. Diese positive Wirkung stand in Zusammenhang mit niedrigeren Konzentrationen an E. coli-Bakterien sowie Rotaviren im Darmtrakt der Tiere. Auch ALEXOPOULOS et al. (2001) setzten bei Ferkeln Probiotika (Paciflor, enthält Bacillus cereus-Sporen) ein, die zu einer geringeren Morbiditäts- und Mortalitätsrate sowie einer verbesserten Futterverwertung führten. Die Autoren begründeten die gesteigerten Konditionen hinsichtlich der Überlebensrate und der Wachstumsleistung mit einer Optimierung der kommensalen Darmflora. Diesen günstigen Wirkungen der Probiotika stehen die noch unklaren, eher marginalen Effekte verschiedener Pflanzen- oder Algenextrakte gegenüber. TURNER et al. (2002a und b) verfütterten ein Seifenrindenbaum-Extrakt (Quillaja saponaria) bzw. ein Algenextrakt (Knotentang, Ascophyllum nodosum) jeweils in verschiedenen Konzentrationen an Schweine und infizierten die Tiere dann
nach einer Fütterungsperiode von insgesamt 14 Tagen mit Salmonella typhimurium.
Es konnten abschließend nur vereinzelt nützliche Effekte auf die Wachstumsleistung sowie auf immunologische Faktoren sowohl vor als auch nach der experimentellen Infektion aufgezeigt werden. Auch FRANK et al. (2003) konnten in einem in vitro Experiment mit Phagozyten aus humanem Blut nach Verwendung eines Mistel- Extraktes (Viscum album) auf die Zellen der unspezifischen Immunabwehr lediglich marginale Effekte verzeichnen. Demgegenüber konnten BIN-HAFEEZ et al. (2003) durch die orale Anwendung eines Bockshornklee-Extraktes (Trigonella foenum graecum L.) in unterschiedlichen Konzentrationen bei Mäusen immunstimulatorische Effekte nachweisen. WHITE et al. (2002) konnten mit der Fütterung von Bierhefe, die einen hohen Anteil an Mannan-Oligosacchariden enthält, bei Absetzferkeln eine verminderte Futteraufnahme und darüber hinaus eine reduzierte Wachstumsleistung feststellen, während ein positiver Effekt auf den Gehalt an Immunglobulin G im Serum der Tiere im Sinne eines Anstieges zu verzeichnen war.
Damit zeigen die einzelnen Futterzusatzstoffe im Vergleich untereinander recht unterschiedliche Ergebnisse, was auf weitere notwendige Untersuchungen hinweist, damit ein gezielter Einsatz dieser Komponenten für landwirtschaftlich genutzte Tiere möglich wird. Insbesondere besteht Klärungsbedarf hinsichtlich einer tatsächlich günstigen Wirkung dieser Substanzen auf immunologische Parameter bzw.
Leistungsparameter sowie die damit verbundenen Wirkungsmechanismen.
In den eigenen Versuchen wurden die zu den Hefezellextrakten gezählten ß-1,3/1,6- Glukane aus Saccharomyces cerevisiae als Futterzusatzstoff bei Absetzferkeln und Mastschweinen eingesetzt. Bei den verwendeten ß-1,3/1,6-Glukanen handelt es sich um Polymere, in deren Grundgerüst Glukosemoleküle ß-1,3 miteinander verknüpft sind und ß-1,3 oder ß-1,6-verknüpfte Seitenketten angelagert werden, wobei diese mit dem Grundgerüst in ß-1,6-Stellung verbunden sind.
Generell konnten ß-Glukane bislang in der Zellwand von Pilzen, Bakterien und Pflanzen nachgewiesen werden, wobei die ß-verknüpfte Form in Pilzen vorherrschend ist. Sie sind dort mit Proteinen, Lipiden sowie anderen Kohlenhydraten eng verbunden. Glukanpolymere können allgemein mit helikaler Konformation (Single Helix) oder in Gestalt eines stabilen Komplexes, bestehend aus drei Polymersträngen (Triple Helix), vorkommen, wobei letzterer die deutlich bevorzugte Form darstellt. Die genaue Bedeutung der ß-Glukane in der Physiologie
der Pilze ist nicht bekannt, wobei jedoch von einer strukturellen Funktion ausge- gangen wird (Übersichtsarbeit: WILLIAMS, 1997).
Immunstimulative Eigenschaften der ß-Glukane, gewonnen aus Pilzen, wurden bereits in den 60er Jahren entdeckt, als ihre Wirkung gegen Tumorzellen von Mäusen aufgezeigt werden konnte. Später wurde dann durch ihren Einsatz bei Säugern eine Resistenzerhöhung gegen Infektionen mit verschiedenen bakteriellen, mykotischen oder viralen Antigenen nachgewiesen (Übersichtsarbeit: ROBERTSEN et al., 1994).
ß-Glukane sind in der Lage, über spezifische Rezeptoren an phagozytierende Zellen zu binden und dadurch die Zytokinexpression zu beeinflussen (Übersichtsarbeit:
WILLIAMS, 1997). Die bislang ermittelten Daten über die Rezeptorbindung basieren ausschließlich auf in vitro Versuchen, so dass eine Verallgemeinerung auf die Wirkungsweise der ß-Glukane in vivo mit Vorsicht zu betrachten ist. Zudem wurden in den Untersuchungen Zellen verwendet, die aus Fischen oder aus humanem Blut gewonnen wurden; eine Übertragung auf die eigenen Versuche am Schwein ist nur indirekt möglich. So konnten CZOP und AUSTEN (1985) durch die Verwendung verschiedener Glukane, die sich in ihrer chemischen Zusammensetzung unter- schieden, auf humanen Monozyten einen Rezeptor mit einer Ligandenspezifität für ß- Glukane nachweisen. Dabei konnte mittels partikulärer ß-Glukane der alternative Komplementweg aktiviert werden, während Glukane in gelöster Form keine Wirkung auf die Zellaktivität ausübten. CZOP und KAY (1991) verwendeten in ihren Unter- suchungen Zellen einer myelomonozytären Zelllinie, deren ß-Glukanrezeptor hinsichtlich seiner Zusammensetzung in hohem Maße mit dem der Monozyten übereinstimmte. Die Autoren konnten eine Zusammensetzung dieses Rezeptors aus verschiedenen Molekülen nachweisen, die sich wiederum jeweils aus mehreren Polypeptiden zusammensetzten. Dabei wurde ein 20 kDa Polypeptid als haupt- sächlicher immunreaktiver Teil identifiziert. Weiterführend konnten dann ABEL und CZOP (1992) nachweisen, dass nach der Inkubation von humanen Monozyten mit partikulären ß-Glukanen aus Saccharomyces cerevisiae eine Stimulation der Zytokine Interleukin-1β und Tumornekrosefaktor-α sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Proteinebene induziert werden konnte. Dabei war das Ausmaß dieser Stimulation dosis- und zeitabhängig. Ein Zusammenhang zwischen ß-Glukanen und der Zytokinsynthese humaner mononukleärer Zellen wurde ebenfalls von POUTSIAKA et al. (1993) dargestellt. Hierbei zeigte sich, dass partikuläres ß-Glukan (Zymocel),
gewonnen aus der Zellwand von Saccharomyces cerevisiae, vor allem zu einer vermehrten Produktion des Interleukin-1-Rezeptorantagonisten führte, während der Gehalt an Interleukin-1 erst durch sehr hohe ß-Glukankonzentrationen anstieg. Auch in diesem Experiment konnte dieser Effekt nicht mit löslichen ß-Glukanen (Betafectin®) erzielt werden, was darauf hinweist, dass für eine ß-Glukanwirkung eine bestimmte Konfiguration sowie eine notwendige Anzahl an Verzweigungen erforder- lich ist. Auch ENGSTAD und ROBERTSEN (1995) konnten mittels Makrophagen, isoliert aus Lachsen (Salmo salar L.), aufzeigen, dass die strukturelle Beschaffenheit der ß-Glukane für das immunstimulative Potential von entscheidender Wichtigkeit ist.
Dabei konnte für Hefezellpartikel aus Saccharomyces cerevisiae (MacroGard-S), möglicherweise aufgrund der hohen Anzahl an Seitenketten und deren überwiegenden 1,3-Verknüpfungen, im Vergleich zu anderen Verbindungen effektivere Effekte erzielt werden.
Ein nachgewiesener ß-Glukanrezeptor ist der sogenannte CR3-Rezeptor (Komplementrezeptor), der im allgemeinen nach Bindung von opsonisierten Mikro- organismen oder Immunkomplexen die Phagozytoserate und Degranulation von Phagozyten stimuliert. Dieser Rezeptor besitzt zwei für die Bindung von Pathogenen benötigte Domänen, von denen die Lektin-Domäne speziell ß-Glukane bindet.
Partikuläre ß-Glukane sind in der Lage, ohne Opsonisierung, neutrophile Granulo- zyten und Monozyten des Menschen zu aktivieren (VETVICKA et al., 1996; Über- sichtsarbeit: ROSS et al., 1999).
WAKSHULL et al. (1999) konnten das Glykosphingolipid Laktosylceramid an der Zelloberfläche humaner neutrophiler Granulozyten als verantwortliches Bindeglied in der Interaktion mit ß-Glukanen ausfindig machen.
TAYLOR et al. (2002) führten Untersuchungen über einen weiteren potentiellen ß- Glukanrezeptor an murinen phagozytierenden Zellen durch. Hierbei handelte es sich um den Dectin-1-Rezeptor, der mit hoher Oberflächenexpression auf der Monozyten/Makrophagen-Gruppe sowie auf neutrophilen Granulozyten gefunden wurde. Laut TAYLOR et al. (2002) konnten bislang vier verschiedene ß- Glukanrezeptoren, namentlich Komplementrezeptor (CR 3), Dectin-1, Laktosyl- ceramid sowie ein selektiver „Scavenger-Rezeptor“ identifiziert werden.
Das Ziel dieser eigenen Arbeit war es, die immunmodulatorische Wirkung von ß- 1,3/1,6-Glukanen auf Parameter der systemischen unspezifischen und spezifischen Immunabwehr sowie des oxidativen und antioxidativen Status bei Absetzferkeln zu erfassen. Darüber hinaus sollte der ß-Glukaneffekt auf Leistungsparameter beurteilt werden. Dazu wurde der Immunmodulator in zwei verschiedenen Konzentrationen (0,03 % und 0,3 %) über das Futter verabreicht. Während die niedrige Dosierung in Versuch I der Empfehlung des Herstellers entsprach, wurde im zweiten Versuch die Konzentration provokativ erhöht. Dadurch sollte der immunmodulatorische Effekt sowohl im Sinne einer Stimulation (0,03 %) als auch einer Depression (0,3 %) abgeklärt werden. Da sich bisherige Untersuchungen über die Wirkung von ß- Glukanen bei Schweinen vorwiegend auf Leistungsparameter konzentrierten und nur marginal immunologische Parameter erfasst wurden, sollte mit dieser Arbeit ein übergreifender Zusammenhang dargestellt werden.
In einem weiteren dritten Versuch wurde zudem der ß-Glukaneffekt auf das lokale intestinale Immunsystem bei Mastschweinen untersucht, um zusätzlich eventuelle Interaktionen mit den im Darm befindlichen Zellen der immunologischen Abwehr aufzudecken.
2 Material und Methoden
2.1 Versuchsdesigns zur Untersuchung der Wirkung einer ß-Glukan- Supplementierung auf das Immunsystem von Absetzferkeln mit laboranalytischen Untersuchungen von Blutproben
2.1.1 Versuch I: Einsatz einer bestimmungsgemäßen Dosierung eines ß- Glukanpräparates
2.1.1.1 Tiere und Fütterung
Der Versuch wurde auf dem Versuchsgut Frankenforst des Institutes für Tierzuchtwissenschaften der Universität Bonn durchgeführt.
Es standen 3 Würfe der Kreuzung Pietrain x Deutsche Landrasse (Pi x DL) zur Verfügung. Diese wurden drei verschiedenen Versuchsgruppen zugeordnet. Dabei wurde darauf geachtet, die Würfe möglichst in ihrer natürlichen Zusammensetzung zu belassen. Da jedoch im Gesamtvergleich teilweise in den einzelnen Würfen deutlich schwächer entwickelte Ferkel vorhanden waren, wurden diese durch Ersatztiere aus zusätzlichen Würfen ausgewechselt. Diese Ersatztiere stimmten in Bezug auf das Alter und die Rassenkreuzung mit den übrigen Ferkeln überein.
Dadurch konnten hinsichtlich der Entwicklung und Kondition der Tiere gut vergleichbare Gruppen gebildet werden. Der Geburtstermin der Tiere variierte um maximal drei Tage. Um eine Beeinflussung der Versuchsergebnisse so gering wie möglich zu halten, wurden keine Impfungen der Ferkel vorgenommen. Am ersten Lebenstag erhielten die Tiere eine Injektion des Macrolid-Antibiotikums Tylosin (Tylan®, Elanco Animal Health, Indianapolis, USA) von jeweils 30 mg pro kg Körpergewicht, sowie am 3. Lebenstag eine Injektion des Eisenpräparates Medifer® (Eisen-(III)-hydroxid-Dextran-Komplex, Medistar Arzneimittel-Vertrieb GmbH, Holzwickede) von jeweils 370 mg pro kg Körpergewicht. Die Saugferkel erhielten ab dem 7. Lebenstag bis zum Umstallen ein konventionell erhältliches Alleinfuttermittel (Super-Früh, Art. Nr.: 211 013, UNA-HAKRA, Hamburg). Eine Übersicht über die Inhaltsstoffe und Zusatzstoffe des Futters ist in Tabelle 1 im Anhang dargestellt.
Beim Absetzen wiesen die Ferkel ein Alter zwischen 25 und 28 Tagen auf. Am Tag des Absetzens wurden die drei Würfe, ihrer Einteilung in eine Kontrollgruppe (KG) und zwei Behandlungsgruppen (BG1 und BG2) entsprechend, in Buchten mit Teilspaltenboden aufgestallt. Dabei blieb der Wurf, der Behandlungsgruppe 1 darstellte, komplett in seiner natürlichen Zusammensetzung bestehen, während in der Kontrollgruppe sowie Behandlungsgruppe 2 jeweils schwache Tiere durch die
zuvor erwähnten Ersatztiere ausgetauscht wurden. Jede Versuchsgruppe bestand aus 10 Tieren.
Am Tag des Umstallens begann der Fütterungsversuch, wobei die Tiere der Kontrollgruppe über den gesamten Versuchszeitraum ein Ferkelaufzuchtfutter erhielten, das sich aus einem herkömmlich erhältlichen Konzentrat (TRUMPF Solo F, UNA-HAKRA, Hamburg) und hofeigenem Getreide zusammensetzte. Es wurde ad libitum angeboten. Inhaltsstoffe und Zusatzstoffe des Konzentrats sind der Tabelle 2 im Anhang zu entnehmen. Beide Behandlungsgruppen erhielten das gleiche Futtergemisch, jedoch mit einem 0,03%igen Zusatz eines ß-1,3/1,6-Glukan- Präparates ("Antaferm-MG", Dr. Eckel GmbH, Niederzissen). Eine Produkt- beschreibung ist dem Datenblatt der Tab. 3 im Anhang zu entnehmen.
Behandlungsgruppe 1 wurde ebenfalls ad libitum gefüttert, während Behandlungs- gruppe 2 restriktiv versorgt wurde. Die der Behandlungsgruppe 2 angebotene Futtermenge orientierte sich am aufgenommenen Futter der Kontrollgruppe in den vorangegangenen 24 Stunden. Dieses Fütterungsregime wurde gewählt, da in vorausgegangenen Versuchen Hinweise auf eine erhöhte Futteraufnahme und einer damit verbundenen gesteigerten Wachstumsleistung nach einer ß-Glukansupple- mentierung zu erkennen waren (DRITZ et al., 1995; HISS und SAUERWEIN, 2003).
Damit sollte in den eigenen Versuchen eine tatsächliche ß-Glukanwirkung aufgedeckt werden. Eine Überprüfung der aufgenommenen Futtermenge wurde durch tägliches Rückwiegen der Futtertröge gewährleistet. Die Verabreichung von ß- Glukan-haltigem Futter erstreckte sich über einen Zeitraum von insgesamt vier Wochen. Im Anschluss daran wurden alle drei Gruppen mit dem herkömmlichem Futter ohne jeglichen Zusatz weiterversorgt.
2.1.1.2 Blutprobenentnahme
Die Blutentnahme wurde aus der Vena cava cranialis oder der Vena jugularis externa mit Hilfe von 1,2 x 40 mm Kanülen (s. Pkt. 2.1.3.3) vorgenommen. In Abhängigkeit der zu bestimmenden Parameter wurden 9 ml Lithium-Heparin- Monovetten (s. Pkt. 2.1.3.3), 4,5 ml Serum-Monovetten (s. Pkt. 2.1.3.3) sowie 2,7 ml EDTA-Monovetten (s. Pkt. 2.1.3.3) eingesetzt.
Der zeitliche Ablauf der Probenentnahme ist in Abb. 1 dargestellt.
Die erste Blutentnahme erfolgte vor Beginn der Fütterung mit ß-Glukan-haltigem Futter, um Basiswerte erstellen zu können. Die Tiere wiesen zu diesem Zeitpunkt ein
Alter von durchschnittlich 19 Tagen auf. Die nachfolgenden Probenentnahmen fanden in wöchentlichem Abstand während der Füttterungsphase statt. Die letzte Blutprobe wurde ca. 2 Wochen nach Fütterungsende entnommen, wobei sich die Tiere zu dieser Zeit in einem mittleren Alter von 68 Tagen befanden.
Für spätere Untersuchungen verschiedener Parameter wurden die heparinisierten Blutproben 20 Minuten bei 1.800 g und einer Temperatur von 8 °C zentrifugiert (Heraeus Christ GmbH, Osterode/Harz, Typ 5917), anschließend aliquotiert und bei -20 °C eingefroren.
Abb. 1: Zeitlicher Ablauf der Blutprobenentnahme (Versuch I)
Es werden die Zeitpunkte der Blutentnahmen (s. Pkt. 2.1.1.2) mit dem dazugehörigen Alter (in Tagen) der Ferkel aus Versuch I (s. Pkt. 2.1.1.1) angegeben. Zudem ist der zeitliche Bereich der ß- Glukanfütterung (s. Pkt. 2.1.1.1) hervorgehoben.
2.1.2 Versuch II: Einsatz einer provokativ hohen Dosierung eines ß-Glukan- präparates
2.1.2.1 Tiere und Fütterung
Versuchsbetrieb, -aufbau und -durchführung entsprechen dem unter Punkt 2.1.1.1 beschriebenen Versuch I.
Die Geburtstermine der in diesem Versuch verwendeten Tiere unterschieden sich um maximal zwei Tage. Am Tag des Absetzens wiesen die Tiere ein Alter zwischen 29 und 31 Tagen auf. Nach dem Absetzen wurden schwache Tiere der Würfe, die die Kontrollgruppe sowie Behandlungsgruppe 1 darstellten, jeweils gegen besser entwickelte Ferkel ausgetauscht, während der Wurf der Behandlungsgruppe 2 in seiner ursprünglichen Beschaffenheit beibehalten wurde. Dadurch konnten bezüglich der Entwicklung und Größe der Tiere vergleichbare Gruppen zusammengestellt werden.
19 27 32 39 46 53 56 68 mittleres Alter der Tiere in Tagen Fütterungsbeginn Fütterungsende
Absetzen
Fütterungszeitraum
Blutentnahme 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Das Fütterungsregime stimmt mit dem in Versuch I beschriebenen (s. Pkt. 2.1.1.1) überein, jedoch wurde hierbei eine provokative ß-Glukankonzentration von 0,3 % gewählt. Die Tiere beider Behandlungsgruppen erhielten über insgesamt 3,5 Wochen das glukanhaltige Futter.
2.1.2.2 Blutprobenentnahme
Die Entnahme der Blutproben entspricht der obigen Beschreibung für den Versuch mit niedriger ß-Glukankonzentration (s. Pkt. 2.1.1.2).
Der zeitliche Ablauf der Probenentnahme ist in Abb. 2 dargestellt.
Zum Zeitpunkt der ersten Probenentnahme hatten die Tiere ein mittleres Alter von 23 Tagen. Während der Fütterungsperiode wurden die Proben wöchentlich entnommen.
Nach Ende der Fütterung erfolgte eine zweimalige Entnahme von Blutproben, wobei die letzte Entnahme ca. 2,5 Wochen nach Abschluss des Fütterungsversuchs lag.
Die Tiere waren zu dieser Zeit im Durchschnitt 71 Tage alt.
Für nachfolgende Analysen verschiedener Parameter wurden die heparinisierten Blutproben wie bereits beschrieben (s. Pkt. 2.1.1.2) zentrifugiert, aliquotiert und bei -20 °C eingefroren.
Abb. 2: Zeitlicher Ablauf der Blutprobenentnahme (Versuch II)
Es werden die Zeitpunkte der Blutentnahmen (s. Pkt. 2.1.2.2) mit dem dazugehörigen Alter (in Tagen) der Ferkel aus Versuch I (s. Pkt. 2.1.2.1) angegeben. Zudem ist der zeitliche Bereich der ß- Glukanfütterung (s. Pkt. 2.1.2.1) hervorgehoben.
23 30 35 42 50 56 57 63 71 mittleres Alter der Tiere in Tagen Fütterungsbeginn Fütterungsende
Absetzen
Blutentnahme 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Fütterungszeitraum
2.1.3 Geräte und Materialien
Folgende Geräte und Materialien wurden zur Durchführung der Studie verwendet:
Reinstwasser = Leitungswasser, aufbereitet über zweistufige Umkehrosmose (s. Pkt.
2.1.3.1) wird im Folgenden als Wasser bezeichnet.
2.1.3.1 Geräte
Absaugpumpe SMT Servox Medizintechnik, Köln Modell Miniport plus
Aufbereitungssystem für Reinstwasser Elga, Vivendi Water Systems, Typ Elgastat Maxima Bucks, UK Eismaschine, Typ AF 80 Scotsman, Milan, Italien
Finnpipetten 0,2-2 µl, 2-20 µl, Labsystems, Helsinki, Finland 20-200 µl, 200-1000 µl, Multistepper
Fluoreszenz Durchflusszytometer Becton Dickinson, Heidelberg Modell FACSan
Gefriermikrotom (Kryostat) Reichert-Jung, Nussloch Kamera, Typ Varioscop 60/8647 Agfa, Mortsel, Belgien
Kühlzentrifuge, Typ GPKR 330127 Beckmann Coulter, Krefeld Laborwaage, Typ PG 5002-S Mettler Toledo, Giessen Magnetrührer mit Heizplatte, Heidolph, Kelheim
Typ MR 3000
Mikrometerokular, periplan 10x Leitz GmbH, Wetzlar
Mikroskop für die Auswertung der Leica Microsystems, Wetzlar Immunhistochemie
Typ Leica DM L 307-072.057 Okular: HC Plan, 10x/22
Objektiv: N Plan 20x/0,40
Mikroskop für die Auswertung der Olympus, Tokyo, Japan Histomorphometrie
Typ 233792
Objektive: Plan 20x/0,40 Plan 40x/0,75
Mikrotiterplatten-Autowasher Bio-Tek Instruments, Vermont, USA Typ: EL 404
Mikrotiterplatten-Reader Bio-Tek Instruments, Vermont, USA Modell: ELX 800
Objektivmikrometer, 2 mm lang, Leitz, Wetzlar geteilt in 200 Teile
Photometer (zur Messung des oxidativen Callegari, Parma, Italien Stress, D-ROM®) mit einer
Aluminiummesszelle
Photometer (zur Messung der antioxidativen Jouan, Unterhaching Kapazität), Modell Hitachi U-2000
121-0005
Rüttler für Mikrotiterplatten, Typ MTS 4 Ika-Labortechnik, Staufen Tischzentrifuge, Typ 6000, 01/1026 Callegari, Parma, Italien
Wasserbad mit Temperaturregulierung Gesellschaft für Labortechnik, und Schüttelvorrichtung, Typ GFL 1983 Burgwedel
Vortexer, Typ Vortex-Genie 2 Scientific Industries Inc., Bohemia, NY, USA
2.1.3.2 Software
CellQuest, Version 3.3 Becton Dickinson, Heidelberg
Image Pro Plus Image Analysis, Media Cybernetics®
Maryland, USA
MikroWin, Version 3.0 Mikrotek Laborsysteme, Overath SAS®System 8e SAS, Cary, NC, USA
SPSS 11.0 SPSS, Chicago, Illinois, USA
WinMDI 2.7 J. Trotter, The Scripps
Research Institute, La Jolla, CA, USA
2.1.3.3 Klinikbedarf
Kanülen, 1,2 x 40 mm Heiland, Hamburg (Nr. 370218) (Terumo Corporation, Leuven,
Belgien)
Monovetten Sarstedt, Nümbrecht Lithium-Heparin , 9 ml (Nr. 371269) Serum, 4,5 ml (Nr. 371390) EDTA, 2,7 ml (Nr. 503397) 2.1.3.4 Laborbedarf
Finntip Stepper, 5 ml Labsystems, Helsinki, Finnland (Nr. 9404200)
Küvetten, Halb-Mikro, 10x10x45 Greiner, Frickenhausen (Nr. 613101) 1,5 ml
Objektträger, Typ SuperFrost ®Plus Menzel-Gläser, Braunschweig
(Nr. J1800 AMNZ)
Pipettenspitzen 2-200 µl Sarstedt, Nümbrecht (Nr. 70760002) 200-1000 µl Biozym, Hess. Oldendorf
(Nr. 721020)
Reaktionsgefäße Sarstedt, Nümbrecht 0,5 ml (Nr. 72.699)
1,5 ml (Nr. 72.690) 2,0 ml (Nr. 72.659)
Rührspatel Merck, Darmstadt (Nr. 231F2431) Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung Costar, Corning, NY, USA
96 Vertiefungen , Typ: EIA plate, 9018 (Nr. 25503014) Rundbodenröhrchen für die Durchfluss- Becton Dickinson, Heidelberg zytometrie (5 ml), Modell Falcon Tubes (Nr. 352052)
2.1.3.5 Materialien für die Bestimmung der Phagozytoseaktivität und des oxidativen Burst
Phagotest Orpegen Pharma, Heidelberg
(Nr. 340330 + 340331)
Bursttest (Phagoburst) Orpegen Pharma, Heidelberg
(Nr. 340332 + 340333)
FACSFlow Becton Dickinson, Heidelberg
(Nr. 349202)
FACSRinse Becton Dickinson, Heidelberg
(Nr. 340346)
Natriumhypochlorit-Lösung Fluka, Sigma-Aldrich, Taufkirchen (Nr. 71696) 2.1.3.6 Materialien für die Bestimmung der Haptoglobinkonzentration Polyklonaler Beschichtungsantikörper
Zur Bestimmung der Haptoglobinplasmakonzentrationen (s. Pkt. 2.1.4.2) waren die Mikrotiterplatten mit polyklonalen, affinitätschromatographisch gereinigten Schaf-anti- Kaninchen IgG (Fc-Fragment) Antikörpern beschichtet (100 µl pro Vertiefung, hergestellt im Institut für Physiologie, Biochemie und Hygiene der Tiere der Uni- versität Bonn, HISS, 2001). Zur Verdünnung des Antikörpers wurde Beschichtungs- puffer verwendet. Die Konzen-tration des Beschichtungsantikörpers lag bei 1,5 µg/ml Beschichtungspuffer.
Beschichtungspuffer
0,05 M NaHCO3 Roth, Karlsruhe (Nr. 6885.1) 200 µl/l Proteaseninhibitor (Complete ), Roche, Mannheim
(Nr. 1697498) 20 ml/l ProClin 150 Sigma, Deisenhofen pH 9,6 (Nr. 4-8123) Proteinaseinhibitor wurde zur Stabilisierung der Lösung hinzugegeben.
ProClin 150 dient der Desinfektion und enthält folgende Inhaltstoffe: 2-methyl-4- isothiazolin-3, 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3, Magnesiumchlorid, Magnesium- nitrat
Caseinlösung
0,05 M NaOH AppliChem, Darmstadt (Nr. A 3910)
2,5 % Casein Sigma, Deisenhofen (Nr. C-7078) 1,5 mM EDTA Dinatriumsalz Dihydrat Roth,
Karlsruhe (Nr. 8043.1)
200 µl/l Proteinaseinhibitor (Complete ), Roche, Mannheim (Nr. 1697498)
20 ml/l ProClin 150 Sigma, Deisenhofen pH 7,2 (Nr. 4-8123)
Testpuffer
0,12 M NaCl Roth, Karlsruhe (Nr. A 1149) 0,02 M Na2HPO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. 6580) 0,01 M EDTA Dinatriumsalz Dihydrat Roth,
Karlsruhe (Nr. 8043.1)
0,005 % Chlorhexidin Sigma, Deisenhofen (Nr. C-9394) 0,01 M Gelatine (Gelatin Hydrolysate), Sigma,
Deisenhofen (Nr. G-0262)
0,05 % Tween 20 AppliChem, Darmstadt (Nr. A 1389) 0,002 % Phenolrot Sigma, (Nr. P-2167)
200 µl/l Proteaseninhibitor (Complete ), Roche, Mannheim (Nr. 1697498)
20 ml/l ProClin 150 Sigma, Deisenhofen
pH 7,2 (Nr. 4-8123)
Biotin-markiertes Haptoglobin
Zum Nachweis der Haptoglobinkonzentrationen in den Blutproben mit Hilfe eines kompetitiven Verdrängungsverfahrens wurde biotinyliertes (Biotinamidocaproate-N- Hydroxysuccinimidester (BXNHS), Sigma, Deisenhofen) porcines Haptoglobin eingesetzt (hergestellt im Institut für Physiologie, Biochemie und Hygiene der Tiere der Universität Bonn, HISS, 2001). Biotin war hierzu in 30-fachem molaren Überschuss dem affinitätschromatographisch gereinigten Haptoglobin zugesetzt worden (HISS, 2001). Das Endprodukt wurde mit einem gleichen Volumen an Glycerin versetzt und bei –20 °C aufbewahrt.
Waschpuffer (PBS)
1,36 M NaCl Roth, Karlsruhe (Nr. A 1149) 81 mM Na2HPO4 AppliChem, Darmstadt (Nr. 1046) 27 mM KCl Roth, Karlsruhe (Nr. 6783)
15 mM KH2PO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. P 5379) 55 g/l Tween 20 AppliChem, Darmstadt (Nr. A 1389)
20 ml/l ProClin 150 Sigma, Deisenhofen (Nr. 4-8123) Von diesem Waschpufferkonzentrat wurden zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung 10 ml auf 1 l H2O aufgefüllt (pH 7,3).
Antiserum
Zur Quantifizierung der Haptoglobinkonzentration wurde ein Kaninchen-Antiserum (hergestellt im Institut für Physiologie, Biochemie und Hygiene der Tiere der Uni- versität Bonn, HISS, 2001) verwendet, dass durch aktive Immunisierung mit porcinem, bovinem, caninem, equinem und humanem Haptoglobin gewonnen wurde.
Das Serum wurde aliquotiert bei –20 °C gelagert.
Streptavidin-Peroxidase
Im ELISA zum Nachweis von Haptoglobin wurde Streptavidin-Peroxidase (Sigma, Deisenhofen, Nr. S 5512) als Enzymsystem eingesetzt.
Substratlösung
Substratpuffer
0,05 M Zitronensäure Roth, Karlsruhe (Nr. 6490.1) 0,055 M Na2HPO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. 6580) 0,05 % Harnstoffperoxid Roth, Karlsruhe (Nr. 2317.1)
20 ml/l ProClin 150 Sigma, Deisenhofen (Nr. 4-8123) pH 4,05
TMB-Stammlösung
12,5 mg TMB (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin) AppliChem, Darmstadt
(Nr. A 3840)
1 ml DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma, Deisenhofen (Nr. D 5879) Die Substratlösung ergibt sich aus 17 ml Substratpuffer und 340 µl TMB.
Stoppreagenz
Zum Abstoppen der Enzym-Substrat-Reaktion wurde 1 M Oxalsäure (Roth, Karlsruhe Nr. 8879.1) eingesetzt.
2.1.3.7 Materialien für die Bestimmung der Immunglobulin G-Konzentration
Alle aufgeführten Materialien, hergestellt von der Firma Bethyl, Montgomery, USA, wurden kommerziell bei der Firma NatuTec, Frankfurt als komplette ELISA-Testkits (Nr. E100-104 + E101) für porcines IgG (s. Pkt. 2.1.5.1) bezogen.
Polyklonaler Primärantikörper
Zur Bestimmung der IgG-Konzentration wurde ein affinitäts-chromatographisch gereinigter, polyklonaler Ziege-anti-Schwein IgG (Fc-Fragment) Antikörper mit einer Ausgangskonzentration von 10 µg/ml verwendet.
Beschichtungspuffer:
Eine Carbonat-Bicarbonat Kapsel wurde in 100 ml Wasser gelöst. Daraus ergab sich eine 0,05 M Lösung mit einem pH-Wert von 9,6. Der Puffer wurde bei 4 °C aufbewahrt.
Waschpuffer 50 mM Tris/NaCl 0,05 % Tween 20 pH 8,0
Lösung zur Absättigung („Postcoat-Lösung“) 50 mM Tris/NaCl
1 % BSA pH 8,0
Testpuffer 10 % Tween 20
0,5 ml wurden zu 100 ml der „Postcoat-Lösung“ gegeben.
Referenzserum
Zur Anfertigung der Standardverdünnungsreihe wurde ein porcines Referenzserum mit einer IgG-Konzentration von 18,2 mg/ml eingesetzt.
Polyklonaler Sekundärantikörper
Als Detektionsantikörper wurde ein Ziege-anti-Schwein IgG (Fc-Fragment) polyklonaler Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, verwendet.
Stoppreagenz
Zum Abstoppen der Enzym-Substrat-Reaktion wurde 1 M Oxalsäure (Roth, Karlsruhe Nr. 8879.1) eingesetzt.
2.1.3.8 Materialien für die Bestimmung der Immunglobulin A-Konzentration
Alle aufgeführten Materialien der Herstellerfirma Bethyl, Montgomery, USA wurden kommerziell bei der Firma NatuTec, Frankfurt als vollständige ELISA-Testkits (Nr.
E100-102 + E101) zum Nachweis von porcinem IgA (s. Pkt. 2.1.5.2) bezogen.
Polyklonaler Primärantikörper
Es wurde ein durch Affinitätschromatographie gereinigter, polyklonaler Ziege-anti- Schwein IgA Antikörper als Primärantikörper mit einer Ausgangskonzentration von 10 µg/ml eingesetzt, um die IgA-Plasmakonzentrationen zu ermitteln.
Beschichtungspuffer:
Eine Carbonat-Bicarbonat Kapsel wurde in 100 ml Wasser gelöst. Daraus ergab sich eine 0,05 M Lösung mit einem pH-Wert von 9,6. Der Puffer wurde bei 4 °C aufbewahrt.
Waschpuffer 50mM Tris/NaCl 0,05 % Tween 20 pH 8,0
Lösung zur Absättigung („Postcoat-Lösung“) 50 mM Tris/NaCl
1 % BSA pH 8,0
Testpuffer 10 % Tween 20
0,5 ml wurden mit 100 ml der „Postcoat-Lösung“ vermischt.
Referenzserum
Zur Anfertigung der Standardverdünnungsreihe für den Nachweis der IgA- Konzentrationen wurde ein porcines Referenzserum mit einer IgA-Konzentration von 3,0 mg/ml eingesetzt.
Polyklonaler Sekundärantikörper
Es wurde ein Ziege-anti-Schwein IgA polyklonaler Antikörper als Sekundärantikörper verwendet, der Peroxidase-konjugiert war.
Stoppreagenz
Zum Abstoppen der Enzym-Substrat-Reaktion wurde 1 M Oxalsäure (Roth, Karlsruhe Nr. 8879.1) eingesetzt.
2.1.3.9 Materialien für die Bestimmung von oxidativem Stress
Für die Messung von oxidativem Stress (s. Pkt. 2.1.6.1) wurden Testkits der Firma Callegari, Parma, Italien verwendet, die über MicroMedical, Königstein/Taunus, bezogen wurden.
Diese enthielten alle notwendigen Reagenzien und Materialien:
Kapillaren (20 µl)
Reaktionsgefäße mit Deckel, gefüllt mit 1 ml eines Puffergemisches (pH 4,8) Küvetten (12,75 x 12,40 mm) mit Deckel
Chromogengemisch mit N,N,diethyl-para-phenylendiamin
2.1.3.10 Materialien zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität 2,2’-Azinobis-(3-ethylenbenzothiazolin-
6-sulfonat) = ABTS Aldrich, Deisenhofen (Nr. A-1888) Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-
2-carboxylsäure) Aldrich, Deisenhofen (Nr. 23,881-3) Myoglobin (equines Herzmyoglobin) Sigma, Deisenhofen (Nr. M-1882) Kaliumhexacyanoferrat (III), (K3[Fe(CN)6]) Sigma, Deisenhofen (Nr. P-8131)
Sephadex G-15 Sigma, Deisenhofen (Nr. G-15-120) Natriumazid (NaN3) Sigma, Deisenhofen (Nr. S-2002) Ethanol Roth, Karlsruhe (Nr. K 928.1) Salzsäure (Chlorwasserstoffsäure, HCl, 37 %) Roth, Karlsruhe (Nr. 9277)
Wasserstoffperoxid (H2O2, 30 %ig) Sigma, Deisenhofen (Nr. H-1009)
Puffer (PBS)
1,36 M NaCl Roth, Karlsruhe (Nr. A 1149) 81 mM Na2HPO4 AppliChem, Darmstadt (Nr. 1046) 27 mM KCl Roth, Karlsruhe (Nr. 6783)
15 mM KH2PO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. P 5379) Von diesem Pufferkonzentrat wurden zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung 10 ml auf 1 l H2O aufgefüllt (pH 7,3).
2.1.3.11 Materialien für die Immunhistochemie
Isotone Kochsalz-Lösung (0,9 %) Braun, Melsungen (Nr. 3200950)
Tissue-Tek, O.C.T. Compound Vogel, Medizinische Technik und Elektronik (Nr.SA-4583) Methanol Roth, Karlsruhe
Aceton Aldrich Chemical CO., Milwaukee, WI, USA
Wasserstoffperoxid (H2O2, 30 %ig) Sigma, Deisenhofen (Nr. H-1009) 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) DakoCytomation, Hamburg
(Nr. K 346911)
Glycerin (Kaisers Glycerin-Gelatine) Merck, Darmstadt (Nr. 1.09242)
Monoklonale Primärantikörper
Für den immunhistochemischen Nachweis der Gewebeantigene IgA, IgM sowie der CD4+- und CD8+-markierten T-Lymphozyten (s. Pkt. 2.2.3) wurden folgende monoklonale, unkonjugierte Primärantikörper eingesetzt:
Maus-anti-Schwein-IgA : Isotyp: IgG1 (Maus)
keine Kreuzreaktivität mit porcinem IgM und IgG Gebrauchsverdünnung: 1:500
(Biozol, Eching, Nr. BZL03353) Maus-anti-Schwein-IgM: Isotyp: IgG1 (Maus)
keine Kreuzreaktivität mit porcinem IgA und IgG Gebrauchsverdünnung: 1:200
(Biozol, Eching, Nr. BZL03352) Maus-anti-Schwein-CD8: Isotyp: IgG2a (Maus)
Gebrauchsverdünnung: 1:800 (Biozol, Eching, Nr. BZL01432) Maus-anti-Schwein CD4a: Isotyp: IgG2b
Gebrauchsverdünnung: 1:500
(SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA, Nr. 4515-01), Die Verdünnungen der Antikörper wurden mit PBS vorgenommen.
Polyklonaler Sekundärantikörper
Für die immunhistochemischen Untersuchungen (s. Pkt. 2.2.3) wurde als Sekundärantikörper ein polyklonaler Ziege-anti-Maus-Antikörper (affinitätsgereinigt, Peroxidase-konjugiert, DakoCytomation, Hamburg, Nr.: P 0447) mit einer Spezifität für alle murinen IgG Subklassen sowie murines IgA und IgM verwendet und in einer Verdünnung von 1:100 in PBS eingesetzt. Die Kreuzreaktivität mit porcinen Immunglobulinen lag bei ca. 4 %.
Waschpuffer (PBS)
1,36 M NaCl Roth, Karlsruhe (Nr. A 1149) 81 mM Na2HPO4 AppliChem, Darmstadt (Nr. 1046) 27 mM KCl Roth, Karlsruhe (Nr. 6783)
15 mM KH2PO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. P 5379) Von diesem Waschpufferkonzentrat wurden zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung 10 ml auf 1 l H2O aufgefüllt (pH 7,3).
2.1.3.12 Materialien für die histomorphometrischen Ausmessungen Übersichtsfärbung mit HE (s. Pkt. 2.2.4)
Formaldehydlösung, Roti®-Histofix, 4 % Roth, Karlsruhe (Nr. P087.3) Mayers Hämalaunlösung Merck, Darmstadt (Nr. 1.09249) May-Grünwalds Eosin-Methylblau Merck, Darmstadt (Nr. 1.01424) Isopropanol Roth, Karlsruhe (Nr. 9866)
Rotihistol Roth, Karlsruhe (Nr. 6640) Entellan Merck, Darmstadt (Nr. 1.07961)
2.1.4 Untersuchung von Parametern der unspezifischen Abwehr in Proben- material aus den Versuchen I und II (s. Pkt. 2.1.1.2 und 2.1.2.2)
2.1.4.1 Phagozytoseaktivität und oxidativer Burst Testprinzip und -durchführung
Die Eliminierung von Fremdpartikeln durch Phagozytose und anschließender Bildung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten der neutrophilen Granulozyten und Monozyten ist ein entscheidender Mechanismus in der Immunabwehr bei bakteriellen und mykotischen Infektionen. Phagozytierende Zellen setzen mit Hilfe einer membranständigen NADPH-Oxidase Superoxidanionen frei, welche zu Wasserstoff- peroxid dismutieren. H2O2 kann in einer Myleoperoxidase-katalysierten Reaktion die aufgenommenen Mikroorganismen oxidativ inaktivieren.
In den eigenen Untersuchungen wurde die Phagozytoseaktivität sowie der oxidative Burst der neutrophilen Granulozyten aus heparinisiertem Vollblut aufgrund des Testumfangs dreimalig gemessen: vor, während und nach der Fütterung mit ß- Glukan-haltigem Futter. Eine Übersicht ist in Abb. 7 gezeigt. Aus technischen Gründen umfassten die Untersuchungen jeweils drei aufeinander folgende Tage, wobei aufgrund des Messumfangs pro Tag drei Tiere einer jeden Gruppe beprobt wurden. Damit wurden insgesamt neun Tiere jeder Gruppe in diese Messungen miteinbezogen. Für die Untersuchungen wurden die kommerziell erhältlichen Testkits Phagotest und Bursttest (Phagoburst, s. Pkt. 2.1.3.5) eingesetzt. Die Methode ist für eine in vitro Diagnostik im Humanbereich etabliert, sie ist jedoch mit Blut von Tierspezies kompatibel. Die Durchführung orientierte sich an den Arbeitsanweisungen des Herstellers (s. Pkt. 2.1.3.5).
Vor Beginn der Testdurchführung wurden die einzelnen Lösungen gemäß den Herstellerangaben folgendermaßen gelöst bzw. verdünnt: durch Auflösung von
Salzen in 1000 ml Wasser wurde eine gebrauchsfertige Waschlösung hergestellt;
eine Stammlösung (20 ml) der „Lysing Solution“, die nach der stimulierten Pagozytose zur Lyse der Erythrozyten und gleichzeitigen Fixierung der Leukozyten führt, wurde mit Wasser in einem Verhältnis von 1:10 verdünnt und anschließend auf Raumtemperatur erwärmt; eine Substratlösung wurde durch Auflösen einer Substrattablette in 1 ml der zuvor erwähnten Waschlösung rekonstituiert und bis zur weiteren Verwendung vor Lichteinfluss geschützt aufbewahrt.
Aus den heparinisierten Vollblutproben (s. Pkt. 2.1.1.2 und 2.1.2.2) wurden jeweils 100 µl entnommen und in 5 ml Rundbodenröhrchen (s. Pkt. 2.1.3.4) überführt. Ein Anhaften von Blut an den Röhrchenwänden wurde dabei vermieden. Sowohl die Messung der Phagozytose-aktivität als auch die des oxidativen Burst wurde in Doppelbestimmungen vorgenommen und es wurden jeweils Kontrollen, ebenfalls zweifach angesetzt, mitgeführt. Die Röhrchen wurden zunächst für 10 Minuten auf Eis gestellt, um die Proben auf 0 °C zu kühlen.
Die nachfolgenden Arbeitsschritte werden für den Phagotest und Bursttest (Phagoburst) getrennt dargestellt:
Zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität wurde allen vier Ansätzen eine, mittels Waschlösung, 1:2 (v/v) verdünnte Bakterien-Suspension (Orpegen Pharma, 50 x 107 Bakterien/ml) von stabilisierten, mit Antikörpern und Komplement aus gepooltem Serum opsonisierten und mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC)-markierten Escherichia coli-Bakterien in einer Menge von 20 µl zugegeben. Mischvorgänge, auch die im Folgenden genannten, wurden mit Hilfe eines Vortex-Mischers (s. Pkt. 2.1.3.1) vorgenommen. Die gewählte Verdünnungsstufe der Bakterien wurde in einem vorab durchgeführten Testversuch ermittelt, wobei sich hierbei 53 % - 61 % der gemessen- en neutrophilen Granulozyten phagozytoseaktiv zeigten. Damit konnte ein Freiraum für die Messung einer möglichen Stimulation oder Suppression aufgrund der ß- Glukan-Supplementierung gewährleistet werden. Bei unverdünntem Bakterieneinsatz (1 x 109 Bakterien/ml) lag dagegen der prozentuale Anteil phagozytoseaktiver neutrophiler Granulozyten zwischen 85 % und 90 %. Die Bakterien wurden aliquotiert bei –20 °C aufbewahrt.
Nach Zugabe der Bakteriensuspension inkubierten die Testansätze für 10 min bei 37
°C in einem geschlossenen Schüttelwasserbad (s. Pkt. 2.1.3.1), um die Zellen zur Phagozytose der angebotenen Bakterien zu stimulieren. Da die Aufnahme der Bakterien über die Zellmembran temperaturabhängig ist, wurden die Kontrollen für
diesen Zeitraum auf Eis gestellt. Mit Hilfe der Kontrollansätze konnten eine Autofluoreszenz sowie der Anteil an spontan phagozytierenden Zellen ermittelt werden. Anschließend wurden allen Proben 100 µl der gebrauchsfertigen eiskalten
„Quenchlösung“ zugegeben, um die Fluoreszenz von adhärenten, nicht aufgenommenen Bakterien zu unterdrücken. Es folgten zwei Waschvorgänge, indem jeweils 3 ml der Waschlösung jedem Ansatz zugefügt wurden und nach anschließender Zentrifugation (5 min, 250 x g, 4 °C, s. Pkt. 2.1.3.1) der Überstand abgesaugt wurde (s. Pkt. 2.1.3.1). Zur Lyse der Erythrozyten sowie zur Fixierung der Leukozyten wurden allen Vollblutproben jeweils 2 ml der auf Zimmertemperatur vorgewärmten „Lysing Solution“ zugegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend folgte wiederum eine Zentrifugation (5 min, 250 x g, 4 °C) mit Dekantierung des Überstandes. Nach Zugabe von 3 ml Waschlösung wurde dieser Vorgang wiederholt und abschließend inkubierten die Proben mit jeweils 200 µl der DNA-Färbelösung (Propidiumiodid, 40 µg/ml) lichtgeschützt für 10 min auf Eis. Die Anfärbung der DNA lässt eine Unterscheidungsmöglichkeit zwischen Leukozyten, nicht lysierten Erythrozyten, Thrombozytenaggregaten sowie Bakterienartefakten zu.
Zur Stimulation des oxidativen Bursts wurden den Vollblutproben der Positivansätze jeweils 20 µl einer unverdünnten E. coli-Suspension (Orpegen Pharma, 1 x 109 Bakterien/ml) zugeführt. Hierbei handelte es sich um stabilisierte, opsonisierte, nicht Fluoreszenz-markierte Bakterien. Die Bakterien wurden vorab aliquotiert und bei –20 °C gelagert. In einem Vorversuch wurde die geeignete Bakterienkonzentration ermittelt, wobei ein unverdünnter Einsatz von Bakterien eine messbare Burstaktivität bei 57 % - 61 % der neutrophilen Granulozyten ergab. Damit war die Möglichkeit gegeben, sowohl eine Stimulation als auch Suppression feststellen zu können. Den Blutproben der Kontrollansätze wurden anstelle der E.
coli-Suspension 20 µl der Waschlösung beigemischt. Alle Ansätze inkubierten über 10 min bei 37 °C im geschlossenen Schüttelwasserbad (s. Pkt. 2.1.3.1).
Anschließend wurden allen Proben 20 µl des nicht fluorogenen Substrats Dihydrorhodamin 123 (DHR 123, 25 µg/ml) zugegeben. Diese Reagenz dient als Burst-Indikator, weil durch intrazelluläres H2O2 mittels Oxidation die Bildung des Fluorochroms Rhodamin 123 (R 123) induziert wird. Mit Hilfe der nichtstimulierten Kontrollansätze konnten die Autofluoreszenz sowie der Anteil an Rhodamin 123- positiven Leukozyten ermittelt werden, die burstunabhängig reaktive
Sauerstoffspezies gebildet hatten. Diese Zellen werden später bei der Messauswertung berücksichtigt, indem sie von der Anzahl der burstaktiven Zellen subtrahiert werden. Nach Zugabe des Substrats wurden alle Röhrchen für weitere 10 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Durch nachfolgende Zugabe der „Lysing Solution“ wurden, während einer Inkubationszeit von 20 min bei Raumtemperatur, die Erythrozyten lysiert sowie die Leukozyten fixiert. Im Anschluss folgte eine Zentrifugation (5 min, 250 xg, 4 °C, s. Pkt. 2.1.3.1), der Überstand wurde durch Absaugen entfernt. Dieser Waschvorgang wurde nach Zugabe von 3 ml Waschlösung wiederholt. Es folgte die DNA-Färbung mittels Propidiumiodid (200 µl pro Ansatz, Konzentration: 40 µg/ml) unter lichtgeschützter Inkubation auf Eis (10 min).
Auswertung mittels Durchflusszytometrie
Die Zellen zur Erfassung des oxidativen Burst wurden innerhalb von 30 Minuten, die Zellen zur Ermittlung der Phagozytoseaktivität innerhalb von 60 Minuten nach Abschluss der Testdurchführung gemessen. Dabei wurden pro Ansatz 15.000 Zellen erfasst. Die Messung erfolgte mit Hilfe des FACScan™ (s. Pkt. 2.1.3.1) mit Argonlaser (Lichtquelle mit einem Exzitationsbereich von 488 nm) sowie des Messprogramms CellQuest™ (s. Pkt. 2.1.3.2).
Mit Hilfe eines Durchflusszytometers können Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner in einem Flüssigkeitsstrom fokussierter Partikel analysiert werden. Dabei werden gleichzeitig mehrere physikalische und biochemische Parameter von jeweils einer einzelnen Zelle erfasst. Die Lichtstreuung ist am größten im Kleinwinkelbereich (0-10°) des einfallenden Lichtstrahls (Vorwärtsstreulicht = Forward Angle Light Scatter, FSC). Dieses Vorwärtsstreulicht ist charakteristisch für die Zellgröße. Ein geringerer Anteil des Lichts streut seitwärts (90°) zum einfallenden Lichtstrahl (Seitwärtsstreulicht = Side Scatter, SSC) und gibt Informationen über die Granularität, die Membranfältelung und die äußere Form der Zellen. Mittels beider Lichtstreuparameter lassen sich Lymphozyten, Monozyten und neutrophile Granulozyten voneinander unterscheiden.
Die Auswertung wurde mit dem Softwareprogramm Win MDI 2.7 (s Pkt. 2.1.3.2) vorgenommen, wodurch eine quantitative Bestimmung der Phagozytose sowie des oxidativen Burst neutrophiler Granulozyten möglich war. Dazu wurde die korrelierte Zweiparameterdarstellung gewählt. Zunächst wurden aufgrund der Korrelation von
FSC und SSC die Lymphozyten, Monozyten und neutrophilen Granulozyten einer Probe dargestellt, wobei jede Leukozytensubpopulation ihr eigenes, charakteristisches Muster aufwies. Die graphische Darstellung erfolgte als Histogramm (Density plot, Abb. 3 und 4). Bei einem Density plot wird eine dreidimensionale Darstellung der Ereignisse simuliert, wobei die Anzahl der Ereignisse den „dritten“ Parameter darstellt. Zunächst wurde die vermutete Population der neutrophilen Granulozyten eingegrenzt.
Abb. 3: Auswertung der Messungen der Phagozytoseaktivität von neutrophilen Granulozyten im Kontrollansatz (a) und Testansatz (b) mittels Streulichtdiagramm Mittels Durchflusszytometrie wurden Leukozytensubpopulationen (Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten) anhand ihrer charakteristischen Streulichteigenschaften gemessen. Dabei wird das Vorwärtsstreulicht (FSC) durch die Zellgröße und das Seitwärtsstreulicht (SSC) durch die Granularität, die Membranfältelung sowie die äußere Form der Zellen beeinflusst. Im eingegrenzten Bereich befindet sich die vermutete Population neutrophiler Granulozyten. Abb. 3a zeigt den Kontrollansatz, d.
h. die Zellen wurden nicht zur Phagozytose stimuliert; in Abb. 3b fand eine temperaturabhängige Stimulation statt. Als Darstellungsweise wurde der Density plot gewählt.
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Abb. 4: Auswertung der Messungen des oxidativen Burst von neutrophilen Granulozyten im Kontrollansatz (a) und Testansatz (b) mittels Streulichtdiagramm
Mittels Durchflusszytometrie wurden Leukozytensubpopulationen (Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten) anhand ihrer charakteristischen Streulichteigenschaften gemessen. Dabei wird das Vorwärtsstreulicht (FSC) durch die Zellgröße und das Seitwärtsstreulicht (SSC) durch die Granularität, die Membranfältelung sowie die äußere Form der Zellen beeinflusst. Im eingegrenzten Bereich befindet sich die vermutete Population neutrophiler Granulozyten. Abb. 4a zeigt den Kontrollansatz, d.
h. den Zellen wurden keine Bakterien angeboten und sie produzierten somit keine phagozytose- abhängigen Sauerstoffspezies; in Abb. 4b fand eine Inkubation mit Bakterien statt. Als Darstellungsweise wurde der Density plot gewählt.
Bei der weiterführenden Quadrantenanalyse (Abb. 5 und 6) fanden nur solche Ereignisse Berücksichtigung, die innerhalb des eingegrenzten Bereichs (Abb. 3 und 4) lagen. Durch die Verwendung zweier Fluorochrome für die Messung der Phagozytoseaktivität (FITC und Propidiumiodid) bzw. des oxidativen Burst (Rhodamin 123 und Propidiumiodid) wurde eine Zweifarbenfluoreszenzanalyse vorgenommen, wobei jeweils beide Farbstoffe eine unterschiedliche Fluoreszenz- farbe aufweisen; die Fluoreszenz jedoch mit derselben Wellenlänge angeregt werden kann.
In der graphischen Darstellung (Abb. 5 und 6) enthalten die unteren Quadranten Bakterien und Debris. Phagozytierende Granulozyten befinden sich im oberen rechten, nicht phagozytierende Zellen im oberen linken Quadranten. Der Anteil an phagozytierenden Zellen wurde aus der Anzahl der Ereignisse im oberen rechten Quadranten, bezogen auf die Summe der Ereignisse aus den beiden oberen
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Quadranten berechnet. Aus den beiden Test- und Kontrollansätzen wurde der Anteil an phagozytierenden bzw. R 123-positiven Zellen als arithmetisches Mittel bestimmt.
Der Anteil phagozytierender bzw. R 123-positiver Granulozyten in den beiden Kontrollansätzen wurde von dem Anteil in den Testansätzen subtrahiert. Die errechnete Differenz spiegelt den Anteil der phagozytose- bzw. burstaktiven Zellen wieder.
Abb. 5: Auswertung der Messungen der Phagozytoseaktivität von neutrophilen Granulozyten im Kontrollansatz (a) und Testansatz (b) mittels Quadrantenanalyse Mittels Quadrantenanalyse wurden die Zellen anhand ihrer Fluoreszenzsignale unterteilt. Als Fluorochrome wurden Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) als Marker der phagozytoseaktiven Zellen und Propidiumiodid als DNA-Färbemittel zum Ausschluss von Bakterien und Zellaggregationsartefakten verwendet. Während die beiden unteren Quadranten Bakterien und Debris enthalten, können die phagozytierenden Zellen im oberen rechten und die nicht phagozytierenden Zellen im oberen linken Quadranten ermittelt werden. Abb. 5a zeigt den Kontrollansatz, d. h. die Zellen wurden nicht zur Phagozytose stimuliert; in Abb. 5b fand eine temperaturabhängige Stimulation statt. Der Anteil an phagozytierenden Zellen wurde aus der Anzahl der Ereignisse im oberen rechten Quadranten, bezogen auf die Summe der Ereignisse aus beiden oberen Quadranten berechnet. Als Darstellungsweise wurde der Density plot gewählt.
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Abb. 6: Auswertung der Messungen des oxidativen Burst von neutrophilen Granulozyten im Kontrollansatz (a) und Testansatz (b) mittels Quadrantenanalyse
Mittels Quadrantenanalyse wurden die Zellen anhand ihrer Fluoreszenzsignale unterteilt. Als Fluorochrome wurden Rhodamin 123 als Marker der burstaktiven Zellen und Propidiumiodid als DNA- Färbemittel zum Ausschluss von Bakterien und Zellaggregationsartefakten verwendet. Während die beiden unteren Quadranten Bakterien und Debris enthalten, können die burstpositiven Zellen im oberen rechten und die burstnegativen Zellen im oberen linken Quadranten ermittelt werden. Abb. 6a zeigt den Kontrollansatz, d. h. den Zellen wurden keine Bakterien angeboten und sie produzierten somit keine phagozytoseabhängigen Sauerstoffspezies; in Abb. 6b fand eine Inkubation der Zellen mit Bakterien statt. Der Anteil an R 123-positiven Granulozyten berechnet sich aus der Anzahl der Ereignisse im oberen rechten Quadranten, bezogen auf die Gesamtzahl der Propidiumiodid-positiver Ereignisse (Summe aus beiden oberen Quadranten). Als Darstellungsweise wurde der Density plot gewählt.
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