Geräte und Materialien - Untersuchungen zur immunmodulativen Wirkung von [beta]-1,3/1,6-Glukane

Folgende Geräte und Materialien wurden zur Durchführung der Studie verwendet:

Reinstwasser = Leitungswasser, aufbereitet über zweistufige Umkehrosmose (s. Pkt.

2.1.3.1) wird im Folgenden als Wasser bezeichnet.

2.1.3.1 Geräte

Absaugpumpe SMT Servox Medizintechnik, Köln Modell Miniport plus

Aufbereitungssystem für Reinstwasser Elga, Vivendi Water Systems, Typ Elgastat Maxima Bucks, UK Eismaschine, Typ AF 80 Scotsman, Milan, Italien

Finnpipetten 0,2-2 µl, 2-20 µl, Labsystems, Helsinki, Finland 20-200 µl, 200-1000 µl, Multistepper

Fluoreszenz Durchflusszytometer Becton Dickinson, Heidelberg Modell FACSan^

Gefriermikrotom (Kryostat) Reichert-Jung, Nussloch Kamera, Typ Varioscop 60/8647 Agfa, Mortsel, Belgien

Kühlzentrifuge, Typ GPKR 330127 Beckmann Coulter, Krefeld Laborwaage, Typ PG 5002-S Mettler Toledo, Giessen Magnetrührer mit Heizplatte, Heidolph, Kelheim

Typ MR 3000

Mikrometerokular, periplan 10x Leitz GmbH, Wetzlar

Mikroskop für die Auswertung der Leica Microsystems, Wetzlar Immunhistochemie

Typ Leica DM L 307-072.057 Okular: HC Plan, 10x/22

Objektiv: N Plan 20x/0,40

Mikroskop für die Auswertung der Olympus, Tokyo, Japan Histomorphometrie

Typ 233792

Objektive: Plan 20x/0,40 Plan 40x/0,75

Mikrotiterplatten-Autowasher Bio-Tek Instruments, Vermont, USA Typ: EL 404

Mikrotiterplatten-Reader Bio-Tek Instruments, Vermont, USA Modell: ELX 800

Objektivmikrometer, 2 mm lang, Leitz, Wetzlar geteilt in 200 Teile

Photometer (zur Messung des oxidativen Callegari, Parma, Italien Stress, D-ROM^®) mit einer

Aluminiummesszelle

Photometer (zur Messung der antioxidativen Jouan, Unterhaching Kapazität), Modell Hitachi U-2000

121-0005

Rüttler für Mikrotiterplatten, Typ MTS 4 Ika-Labortechnik, Staufen Tischzentrifuge, Typ 6000, 01/1026 Callegari, Parma, Italien

Wasserbad mit Temperaturregulierung Gesellschaft für Labortechnik, und Schüttelvorrichtung, Typ GFL 1983 Burgwedel

Vortexer, Typ Vortex-Genie 2 Scientific Industries Inc., Bohemia, NY, USA

2.1.3.2 Software

CellQuest^, Version 3.3 Becton Dickinson, Heidelberg

Image Pro Plus Image Analysis, Media Cybernetics^®

Maryland, USA

MikroWin, Version 3.0 Mikrotek Laborsysteme, Overath SAS^®System 8e SAS, Cary, NC, USA

SPSS 11.0 SPSS, Chicago, Illinois, USA

WinMDI 2.7^ J. Trotter, The Scripps

Research Institute, La Jolla, CA, USA

2.1.3.3 Klinikbedarf

Kanülen, 1,2 x 40 mm Heiland, Hamburg (Nr. 370218) (Terumo Corporation, Leuven,

Belgien)

Monovetten Sarstedt, Nümbrecht Lithium-Heparin , 9 ml (Nr. 371269) Serum, 4,5 ml (Nr. 371390) EDTA, 2,7 ml (Nr. 503397) 2.1.3.4 Laborbedarf

Finntip Stepper, 5 ml Labsystems, Helsinki, Finnland (Nr. 9404200)

Küvetten, Halb-Mikro, 10x10x45 Greiner, Frickenhausen (Nr. 613101) 1,5 ml

Objektträger, Typ SuperFrost ^®Plus Menzel-Gläser, Braunschweig

(Nr. J1800 AMNZ)

Pipettenspitzen 2-200 µl Sarstedt, Nümbrecht (Nr. 70760002) 200-1000 µl Biozym, Hess. Oldendorf

(Nr. 721020)

Reaktionsgefäße Sarstedt, Nümbrecht 0,5 ml (Nr. 72.699)

1,5 ml (Nr. 72.690) 2,0 ml (Nr. 72.659)

Rührspatel Merck, Darmstadt (Nr. 231F2431) Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung Costar, Corning, NY, USA

96 Vertiefungen , Typ: EIA plate, 9018 (Nr. 25503014) Rundbodenröhrchen für die Durchfluss- Becton Dickinson, Heidelberg zytometrie (5 ml), Modell Falcon^Tubes (Nr. 352052)

2.1.3.5 Materialien für die Bestimmung der Phagozytoseaktivität und des oxidativen Burst

Phagotest^ Orpegen Pharma, Heidelberg

(Nr. 340330 + 340331)

Bursttest (Phagoburst^) Orpegen Pharma, Heidelberg

(Nr. 340332 + 340333)

FACSFlow ^ Becton Dickinson, Heidelberg

(Nr. 349202)

FACSRinse Becton Dickinson, Heidelberg

(Nr. 340346)

Natriumhypochlorit-Lösung Fluka^, Sigma-Aldrich, Taufkirchen (Nr. 71696) 2.1.3.6 Materialien für die Bestimmung der Haptoglobinkonzentration Polyklonaler Beschichtungsantikörper

Zur Bestimmung der Haptoglobinplasmakonzentrationen (s. Pkt. 2.1.4.2) waren die Mikrotiterplatten mit polyklonalen, affinitätschromatographisch gereinigten Schaf-anti-Kaninchen IgG (Fc-Fragment) Antikörpern beschichtet (100 µl pro Vertiefung, hergestellt im Institut für Physiologie, Biochemie und Hygiene der Tiere der Uni-versität Bonn, HISS, 2001). Zur Verdünnung des Antikörpers wurde Beschichtungs-puffer verwendet. Die Konzen-tration des Beschichtungsantikörpers lag bei 1,5 µg/ml Beschichtungspuffer.

Beschichtungspuffer

0,05 M NaHCO3 Roth, Karlsruhe (Nr. 6885.1) 200 µl/l Proteaseninhibitor (Complete ), Roche, Mannheim

(Nr. 1697498) 20 ml/l ProClin 150^ Sigma, Deisenhofen pH 9,6 (Nr. 4-8123) Proteinaseinhibitor wurde zur Stabilisierung der Lösung hinzugegeben.

ProClin 150^ dient der Desinfektion und enthält folgende Inhaltstoffe: 2-methyl-4-isothiazolin-3, 5-chloro-2-methyl-4-2-methyl-4-isothiazolin-3, Magnesiumchlorid, Magnesium-nitrat

Caseinlösung

0,05 M NaOH AppliChem, Darmstadt (Nr. A 3910)

2,5 % Casein Sigma, Deisenhofen (Nr. C-7078) 1,5 mM EDTA Dinatriumsalz Dihydrat Roth,

Karlsruhe (Nr. 8043.1)

200 µl/l Proteinaseinhibitor (Complete ), Roche, Mannheim (Nr. 1697498)

20 ml/l ProClin 150^ Sigma, Deisenhofen pH 7,2 (Nr. 4-8123)

Testpuffer

0,12 M NaCl Roth, Karlsruhe (Nr. A 1149) 0,02 M Na2HPO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. 6580) 0,01 M EDTA Dinatriumsalz Dihydrat Roth,

Karlsruhe (Nr. 8043.1)

0,005 % Chlorhexidin Sigma, Deisenhofen (Nr. C-9394) 0,01 M Gelatine (Gelatin Hydrolysate), Sigma,

Deisenhofen (Nr. G-0262)

0,05 % Tween^20 AppliChem, Darmstadt (Nr. A 1389) 0,002 % Phenolrot Sigma, (Nr. P-2167)

200 µl/l Proteaseninhibitor (Complete ), Roche, Mannheim (Nr. 1697498)

20 ml/l ProClin 150^ Sigma, Deisenhofen

pH 7,2 (Nr. 4-8123)

Biotin-markiertes Haptoglobin

Zum Nachweis der Haptoglobinkonzentrationen in den Blutproben mit Hilfe eines kompetitiven Verdrängungsverfahrens wurde biotinyliertes (Biotinamidocaproate-N-Hydroxysuccinimidester (BXNHS), Sigma, Deisenhofen) porcines Haptoglobin eingesetzt (hergestellt im Institut für Physiologie, Biochemie und Hygiene der Tiere der Universität Bonn, HISS, 2001). Biotin war hierzu in 30-fachem molaren Überschuss dem affinitätschromatographisch gereinigten Haptoglobin zugesetzt worden (HISS, 2001). Das Endprodukt wurde mit einem gleichen Volumen an Glycerin versetzt und bei –20 °C aufbewahrt.

Waschpuffer (PBS)

1,36 M NaCl Roth, Karlsruhe (Nr. A 1149) 81 mM Na2HPO4 AppliChem, Darmstadt (Nr. 1046) 27 mM KCl Roth, Karlsruhe (Nr. 6783)

15 mM KH2PO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. P 5379) 55 g/l Tween^20 AppliChem, Darmstadt (Nr. A 1389)

20 ml/l ProClin 150 Sigma, Deisenhofen (Nr. 4-8123) Von diesem Waschpufferkonzentrat wurden zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung 10 ml auf 1 l H2O aufgefüllt (pH 7,3).

Antiserum

Zur Quantifizierung der Haptoglobinkonzentration wurde ein Kaninchen-Antiserum (hergestellt im Institut für Physiologie, Biochemie und Hygiene der Tiere der Uni-versität Bonn, HISS, 2001) verwendet, dass durch aktive Immunisierung mit porcinem, bovinem, caninem, equinem und humanem Haptoglobin gewonnen wurde.

Das Serum wurde aliquotiert bei –20 °C gelagert.

Streptavidin-Peroxidase

Im ELISA zum Nachweis von Haptoglobin wurde Streptavidin-Peroxidase (Sigma, Deisenhofen, Nr. S 5512) als Enzymsystem eingesetzt.

Substratlösung

Substratpuffer

0,05 M Zitronensäure Roth, Karlsruhe (Nr. 6490.1) 0,055 M Na2HPO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. 6580) 0,05 % Harnstoffperoxid Roth, Karlsruhe (Nr. 2317.1)

20 ml/l ProClin 150^ Sigma, Deisenhofen (Nr. 4-8123) pH 4,05

TMB-Stammlösung

12,5 mg TMB (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin) AppliChem, Darmstadt

(Nr. A 3840)

1 ml DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma, Deisenhofen (Nr. D 5879) Die Substratlösung ergibt sich aus 17 ml Substratpuffer und 340 µl TMB.

Stoppreagenz

Zum Abstoppen der Enzym-Substrat-Reaktion wurde 1 M Oxalsäure (Roth, Karlsruhe Nr. 8879.1) eingesetzt.

2.1.3.7 Materialien für die Bestimmung der Immunglobulin G-Konzentration

Alle aufgeführten Materialien, hergestellt von der Firma Bethyl, Montgomery, USA, wurden kommerziell bei der Firma NatuTec, Frankfurt als komplette ELISA-Testkits (Nr. E100-104 + E101) für porcines IgG (s. Pkt. 2.1.5.1) bezogen.

Polyklonaler Primärantikörper

Zur Bestimmung der IgG-Konzentration wurde ein affinitäts-chromatographisch gereinigter, polyklonaler Ziege-anti-Schwein IgG (Fc-Fragment) Antikörper mit einer Ausgangskonzentration von 10 µg/ml verwendet.

Beschichtungspuffer:

Eine Carbonat-Bicarbonat Kapsel wurde in 100 ml Wasser gelöst. Daraus ergab sich eine 0,05 M Lösung mit einem pH-Wert von 9,6. Der Puffer wurde bei 4 °C aufbewahrt.

Waschpuffer 50 mM Tris/NaCl 0,05 % Tween 20 pH 8,0

Lösung zur Absättigung („Postcoat-Lösung“) 50 mM Tris/NaCl

1 % BSA pH 8,0

Testpuffer 10 % Tween 20

0,5 ml wurden zu 100 ml der „Postcoat-Lösung“ gegeben.

Referenzserum

Zur Anfertigung der Standardverdünnungsreihe wurde ein porcines Referenzserum mit einer IgG-Konzentration von 18,2 mg/ml eingesetzt.

Polyklonaler Sekundärantikörper

Als Detektionsantikörper wurde ein Ziege-anti-Schwein IgG (Fc-Fragment) polyklonaler Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, verwendet.

Stoppreagenz

Zum Abstoppen der Enzym-Substrat-Reaktion wurde 1 M Oxalsäure (Roth, Karlsruhe Nr. 8879.1) eingesetzt.

2.1.3.8 Materialien für die Bestimmung der Immunglobulin A-Konzentration

Alle aufgeführten Materialien der Herstellerfirma Bethyl, Montgomery, USA wurden kommerziell bei der Firma NatuTec, Frankfurt als vollständige ELISA-Testkits (Nr.

E100-102 + E101) zum Nachweis von porcinem IgA (s. Pkt. 2.1.5.2) bezogen.

Polyklonaler Primärantikörper

Es wurde ein durch Affinitätschromatographie gereinigter, polyklonaler Ziege-anti-Schwein IgA Antikörper als Primärantikörper mit einer Ausgangskonzentration von 10 µg/ml eingesetzt, um die IgA-Plasmakonzentrationen zu ermitteln.

Beschichtungspuffer:

Eine Carbonat-Bicarbonat Kapsel wurde in 100 ml Wasser gelöst. Daraus ergab sich eine 0,05 M Lösung mit einem pH-Wert von 9,6. Der Puffer wurde bei 4 °C aufbewahrt.

Waschpuffer 50mM Tris/NaCl 0,05 % Tween 20 pH 8,0

Lösung zur Absättigung („Postcoat-Lösung“) 50 mM Tris/NaCl

1 % BSA pH 8,0

Testpuffer 10 % Tween 20

0,5 ml wurden mit 100 ml der „Postcoat-Lösung“ vermischt.

Referenzserum

Zur Anfertigung der Standardverdünnungsreihe für den Nachweis der IgA-Konzentrationen wurde ein porcines Referenzserum mit einer IgA-Konzentration von 3,0 mg/ml eingesetzt.

Polyklonaler Sekundärantikörper

Es wurde ein Ziege-anti-Schwein IgA polyklonaler Antikörper als Sekundärantikörper verwendet, der Peroxidase-konjugiert war.

Stoppreagenz

Zum Abstoppen der Enzym-Substrat-Reaktion wurde 1 M Oxalsäure (Roth, Karlsruhe Nr. 8879.1) eingesetzt.

2.1.3.9 Materialien für die Bestimmung von oxidativem Stress

Für die Messung von oxidativem Stress (s. Pkt. 2.1.6.1) wurden Testkits der Firma Callegari, Parma, Italien verwendet, die über MicroMedical, Königstein/Taunus, bezogen wurden.

Diese enthielten alle notwendigen Reagenzien und Materialien:

Kapillaren (20 µl)

Reaktionsgefäße mit Deckel, gefüllt mit 1 ml eines Puffergemisches (pH 4,8) Küvetten (12,75 x 12,40 mm) mit Deckel

Chromogengemisch mit N,N,diethyl-para-phenylendiamin

2.1.3.10 Materialien zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität 2,2’-Azinobis-(3-ethylenbenzothiazolin-

6-sulfonat) = ABTS Aldrich, Deisenhofen (Nr. A-1888) Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-

2-carboxylsäure) Aldrich, Deisenhofen (Nr. 23,881-3) Myoglobin (equines Herzmyoglobin) Sigma, Deisenhofen (Nr. M-1882) Kaliumhexacyanoferrat (III), (K3[Fe(CN)6]) Sigma, Deisenhofen (Nr. P-8131)

Sephadex G-15 Sigma, Deisenhofen (Nr. G-15-120) Natriumazid (NaN3) Sigma, Deisenhofen (Nr. S-2002) Ethanol Roth, Karlsruhe (Nr. K 928.1) Salzsäure (Chlorwasserstoffsäure, HCl, 37 %) Roth, Karlsruhe (Nr. 9277)

Wasserstoffperoxid (H2O2, 30 %ig) Sigma, Deisenhofen (Nr. H-1009)

Puffer (PBS)

1,36 M NaCl Roth, Karlsruhe (Nr. A 1149) 81 mM Na2HPO4 AppliChem, Darmstadt (Nr. 1046) 27 mM KCl Roth, Karlsruhe (Nr. 6783)

15 mM KH2PO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. P 5379) Von diesem Pufferkonzentrat wurden zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung 10 ml auf 1 l H2O aufgefüllt (pH 7,3).

2.1.3.11 Materialien für die Immunhistochemie

Isotone Kochsalz-Lösung (0,9 %) Braun, Melsungen (Nr. 3200950)

Tissue-Tek^, O.C.T. Compound Vogel, Medizinische Technik und Elektronik (Nr.SA-4583) Methanol Roth, Karlsruhe

Aceton Aldrich Chemical CO., Milwaukee, WI, USA

Wasserstoffperoxid (H2O2, 30 %ig) Sigma, Deisenhofen (Nr. H-1009) 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) DakoCytomation, Hamburg

(Nr. K 346911)

Glycerin (Kaisers Glycerin-Gelatine) Merck, Darmstadt (Nr. 1.09242)

Monoklonale Primärantikörper

Für den immunhistochemischen Nachweis der Gewebeantigene IgA, IgM sowie der CD4+- und CD8+-markierten T-Lymphozyten (s. Pkt. 2.2.3) wurden folgende monoklonale, unkonjugierte Primärantikörper eingesetzt:

Maus-anti-Schwein-IgA : Isotyp: IgG1 (Maus)

keine Kreuzreaktivität mit porcinem IgM und IgG Gebrauchsverdünnung: 1:500

(Biozol, Eching, Nr. BZL03353) Maus-anti-Schwein-IgM: Isotyp: IgG1 (Maus)

keine Kreuzreaktivität mit porcinem IgA und IgG Gebrauchsverdünnung: 1:200

(Biozol, Eching, Nr. BZL03352) Maus-anti-Schwein-CD8: Isotyp: IgG2a (Maus)

Gebrauchsverdünnung: 1:800 (Biozol, Eching, Nr. BZL01432) Maus-anti-Schwein CD4a: Isotyp: IgG2b

Gebrauchsverdünnung: 1:500

(SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA, Nr. 4515-01), Die Verdünnungen der Antikörper wurden mit PBS vorgenommen.

Polyklonaler Sekundärantikörper

Für die immunhistochemischen Untersuchungen (s. Pkt. 2.2.3) wurde als Sekundärantikörper ein polyklonaler Ziege-anti-Maus-Antikörper (affinitätsgereinigt, Peroxidase-konjugiert, DakoCytomation, Hamburg, Nr.: P 0447) mit einer Spezifität für alle murinen IgG Subklassen sowie murines IgA und IgM verwendet und in einer Verdünnung von 1:100 in PBS eingesetzt. Die Kreuzreaktivität mit porcinen Immunglobulinen lag bei ca. 4 %.

Waschpuffer (PBS)

1,36 M NaCl Roth, Karlsruhe (Nr. A 1149) 81 mM Na2HPO4 AppliChem, Darmstadt (Nr. 1046) 27 mM KCl Roth, Karlsruhe (Nr. 6783)

15 mM KH2PO4 Sigma, Deisenhofen (Nr. P 5379) Von diesem Waschpufferkonzentrat wurden zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung 10 ml auf 1 l H2O aufgefüllt (pH 7,3).

2.1.3.12 Materialien für die histomorphometrischen Ausmessungen Übersichtsfärbung mit HE (s. Pkt. 2.2.4)

Formaldehydlösung, Roti^®-Histofix, 4 % Roth, Karlsruhe (Nr. P087.3) Mayers Hämalaunlösung Merck, Darmstadt (Nr. 1.09249) May-Grünwalds Eosin-Methylblau Merck, Darmstadt (Nr. 1.01424) Isopropanol Roth, Karlsruhe (Nr. 9866)

Rotihistol Roth, Karlsruhe (Nr. 6640) Entellan Merck, Darmstadt (Nr. 1.07961)

2.1.4 Untersuchung von Parametern der unspezifischen Abwehr in Proben-material aus den Versuchen I und II (s. Pkt. 2.1.1.2 und 2.1.2.2)

2.1.4.1 Phagozytoseaktivität und oxidativer Burst Testprinzip und -durchführung

Die Eliminierung von Fremdpartikeln durch Phagozytose und anschließender Bildung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten der neutrophilen Granulozyten und Monozyten ist ein entscheidender Mechanismus in der Immunabwehr bei bakteriellen und mykotischen Infektionen. Phagozytierende Zellen setzen mit Hilfe einer membranständigen NADPH-Oxidase Superoxidanionen frei, welche zu Wasserstoff-peroxid dismutieren. H2O2 kann in einer Myleoperoxidase-katalysierten Reaktion die aufgenommenen Mikroorganismen oxidativ inaktivieren.

In den eigenen Untersuchungen wurde die Phagozytoseaktivität sowie der oxidative Burst der neutrophilen Granulozyten aus heparinisiertem Vollblut aufgrund des Testumfangs dreimalig gemessen: vor, während und nach der Fütterung mit ß-Glukan-haltigem Futter. Eine Übersicht ist in Abb. 7 gezeigt. Aus technischen Gründen umfassten die Untersuchungen jeweils drei aufeinander folgende Tage, wobei aufgrund des Messumfangs pro Tag drei Tiere einer jeden Gruppe beprobt wurden. Damit wurden insgesamt neun Tiere jeder Gruppe in diese Messungen miteinbezogen. Für die Untersuchungen wurden die kommerziell erhältlichen Testkits Phagotest^ und Bursttest (Phagoburst^, s. Pkt. 2.1.3.5) eingesetzt. Die Methode ist für eine in vitro Diagnostik im Humanbereich etabliert, sie ist jedoch mit Blut von Tierspezies kompatibel. Die Durchführung orientierte sich an den Arbeitsanweisungen des Herstellers (s. Pkt. 2.1.3.5).

Vor Beginn der Testdurchführung wurden die einzelnen Lösungen gemäß den Herstellerangaben folgendermaßen gelöst bzw. verdünnt: durch Auflösung von

Salzen in 1000 ml Wasser wurde eine gebrauchsfertige Waschlösung hergestellt;

eine Stammlösung (20 ml) der „Lysing Solution“, die nach der stimulierten Pagozytose zur Lyse der Erythrozyten und gleichzeitigen Fixierung der Leukozyten führt, wurde mit Wasser in einem Verhältnis von 1:10 verdünnt und anschließend auf Raumtemperatur erwärmt; eine Substratlösung wurde durch Auflösen einer Substrattablette in 1 ml der zuvor erwähnten Waschlösung rekonstituiert und bis zur weiteren Verwendung vor Lichteinfluss geschützt aufbewahrt.

Aus den heparinisierten Vollblutproben (s. Pkt. 2.1.1.2 und 2.1.2.2) wurden jeweils 100 µl entnommen und in 5 ml Rundbodenröhrchen (s. Pkt. 2.1.3.4) überführt. Ein Anhaften von Blut an den Röhrchenwänden wurde dabei vermieden. Sowohl die Messung der Phagozytose-aktivität als auch die des oxidativen Burst wurde in Doppelbestimmungen vorgenommen und es wurden jeweils Kontrollen, ebenfalls zweifach angesetzt, mitgeführt. Die Röhrchen wurden zunächst für 10 Minuten auf Eis gestellt, um die Proben auf 0 °C zu kühlen.

Die nachfolgenden Arbeitsschritte werden für den Phagotest^ und Bursttest (Phagoburst^) getrennt dargestellt:

Zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität wurde allen vier Ansätzen eine, mittels Waschlösung, 1:2 (v/v) verdünnte Bakterien-Suspension (Orpegen Pharma, 50 x 10⁷ Bakterien/ml) von stabilisierten, mit Antikörpern und Komplement aus gepooltem Serum opsonisierten und mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC)-markierten Escherichia coli-Bakterien in einer Menge von 20 µl zugegeben. Mischvorgänge, auch die im Folgenden genannten, wurden mit Hilfe eines Vortex-Mischers (s. Pkt. 2.1.3.1) vorgenommen. Die gewählte Verdünnungsstufe der Bakterien wurde in einem vorab durchgeführten Testversuch ermittelt, wobei sich hierbei 53 % - 61 % der gemessen-en neutrophilgemessen-en Granulozytgemessen-en phagozytoseaktiv zeigtgemessen-en. Damit konnte ein Freiraum für die Messung einer möglichen Stimulation oder Suppression aufgrund der ß-Glukan-Supplementierung gewährleistet werden. Bei unverdünntem Bakterieneinsatz (1 x 10⁹ Bakterien/ml) lag dagegen der prozentuale Anteil phagozytoseaktiver neutrophiler Granulozyten zwischen 85 % und 90 %. Die Bakterien wurden aliquotiert bei –20 °C aufbewahrt.

Nach Zugabe der Bakteriensuspension inkubierten die Testansätze für 10 min bei 37

°C in einem geschlossenen Schüttelwasserbad (s. Pkt. 2.1.3.1), um die Zellen zur Phagozytose der angebotenen Bakterien zu stimulieren. Da die Aufnahme der Bakterien über die Zellmembran temperaturabhängig ist, wurden die Kontrollen für

diesen Zeitraum auf Eis gestellt. Mit Hilfe der Kontrollansätze konnten eine Autofluoreszenz sowie der Anteil an spontan phagozytierenden Zellen ermittelt werden. Anschließend wurden allen Proben 100 µl der gebrauchsfertigen eiskalten

„Quenchlösung“ zugegeben, um die Fluoreszenz von adhärenten, nicht aufgenommenen Bakterien zu unterdrücken. Es folgten zwei Waschvorgänge, indem jeweils 3 ml der Waschlösung jedem Ansatz zugefügt wurden und nach anschließender Zentrifugation (5 min, 250 x g, 4 °C, s. Pkt. 2.1.3.1) der Überstand abgesaugt wurde (s. Pkt. 2.1.3.1). Zur Lyse der Erythrozyten sowie zur Fixierung der Leukozyten wurden allen Vollblutproben jeweils 2 ml der auf Zimmertemperatur vorgewärmten „Lysing Solution“ zugegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend folgte wiederum eine Zentrifugation (5 min, 250 x g, 4 °C) mit Dekantierung des Überstandes. Nach Zugabe von 3 ml Waschlösung wurde dieser Vorgang wiederholt und abschließend inkubierten die Proben mit jeweils 200 µl der DNA-Färbelösung (Propidiumiodid, 40 µg/ml) lichtgeschützt für 10 min auf Eis. Die Anfärbung der DNA lässt eine Unterscheidungsmöglichkeit zwischen Leukozyten, nicht lysierten Erythrozyten, Thrombozytenaggregaten sowie Bakterienartefakten zu.

Zur Stimulation des oxidativen Bursts wurden den Vollblutproben der Positivansätze jeweils 20 µl einer unverdünnten E. coli-Suspension (Orpegen Pharma, 1 x 10⁹Bakterien/ml) zugeführt. Hierbei handelte es sich um stabilisierte, opsonisierte, nicht Fluoreszenz-markierte Bakterien. Die Bakterien wurden vorab aliquotiert und bei –20 °C gelagert. In einem Vorversuch wurde die geeignete Bakterienkonzentration ermittelt, wobei ein unverdünnter Einsatz von Bakterien eine messbare Burstaktivität bei 57 % - 61 % der neutrophilen Granulozyten ergab. Damit war die Möglichkeit gegeben, sowohl eine Stimulation als auch Suppression feststellen zu können. Den Blutproben der Kontrollansätze wurden anstelle der E.

coli-Suspension 20 µl der Waschlösung beigemischt. Alle Ansätze inkubierten über 10 min bei 37 °C im geschlossenen Schüttelwasserbad (s. Pkt. 2.1.3.1).

Anschließend wurden allen Proben 20 µl des nicht fluorogenen Substrats Dihydrorhodamin 123 (DHR 123, 25 µg/ml) zugegeben. Diese Reagenz dient als Burst-Indikator, weil durch intrazelluläres H2O2 mittels Oxidation die Bildung des Fluorochroms Rhodamin 123 (R 123) induziert wird. Mit Hilfe der nichtstimulierten Kontrollansätze konnten die Autofluoreszenz sowie der Anteil an Rhodamin 123-positiven Leukozyten ermittelt werden, die burstunabhängig reaktive

Sauerstoffspezies gebildet hatten. Diese Zellen werden später bei der Messauswertung berücksichtigt, indem sie von der Anzahl der burstaktiven Zellen subtrahiert werden. Nach Zugabe des Substrats wurden alle Röhrchen für weitere 10 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Durch nachfolgende Zugabe der „Lysing Solution“ wurden, während einer Inkubationszeit von 20 min bei Raumtemperatur, die Erythrozyten lysiert sowie die Leukozyten fixiert. Im Anschluss folgte eine Zentrifugation (5 min, 250 xg, 4 °C, s. Pkt. 2.1.3.1), der Überstand wurde durch Absaugen entfernt. Dieser Waschvorgang wurde nach Zugabe von 3 ml Waschlösung wiederholt. Es folgte die DNA-Färbung mittels Propidiumiodid (200 µl pro Ansatz, Konzentration: 40 µg/ml) unter lichtgeschützter Inkubation auf Eis (10 min).

Auswertung mittels Durchflusszytometrie

Die Zellen zur Erfassung des oxidativen Burst wurden innerhalb von 30 Minuten, die Zellen zur Ermittlung der Phagozytoseaktivität innerhalb von 60 Minuten nach Abschluss der Testdurchführung gemessen. Dabei wurden pro Ansatz 15.000 Zellen erfasst. Die Messung erfolgte mit Hilfe des FACScan™ (s. Pkt. 2.1.3.1) mit Argonlaser (Lichtquelle mit einem Exzitationsbereich von 488 nm) sowie des Messprogramms CellQuest™ (s. Pkt. 2.1.3.2).

Mit Hilfe eines Durchflusszytometers können Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner in einem Flüssigkeitsstrom fokussierter Partikel analysiert werden. Dabei werden gleichzeitig mehrere physikalische und biochemische Parameter von jeweils einer einzelnen Zelle erfasst. Die Lichtstreuung ist am größten im Kleinwinkelbereich (0-10°) des einfallenden Lichtstrahls (Vorwärtsstreulicht = Forward Angle Light Scatter, FSC). Dieses Vorwärtsstreulicht ist charakteristisch für die Zellgröße. Ein geringerer Anteil des Lichts streut seitwärts (90°) zum einfallenden Lichtstrahl (Seitwärtsstreulicht = Side Scatter, SSC) und gibt Informationen über die Granularität, die Membranfältelung und die äußere Form der Zellen. Mittels beider Lichtstreuparameter lassen sich Lymphozyten, Monozyten und neutrophile Granulozyten voneinander unterscheiden.

Die Auswertung wurde mit dem Softwareprogramm Win MDI 2.7 (s Pkt. 2.1.3.2) vorgenommen, wodurch eine quantitative Bestimmung der Phagozytose sowie des oxidativen Burst neutrophiler Granulozyten möglich war. Dazu wurde die korrelierte Zweiparameterdarstellung gewählt. Zunächst wurden aufgrund der Korrelation von

FSC und SSC die Lymphozyten, Monozyten und neutrophilen Granulozyten einer Probe dargestellt, wobei jede Leukozytensubpopulation ihr eigenes, charakteristisches Muster aufwies. Die graphische Darstellung erfolgte als Histogramm (Density plot, Abb. 3 und 4). Bei einem Density plot wird eine dreidimensionale Darstellung der Ereignisse simuliert, wobei die Anzahl der Ereignisse den „dritten“ Parameter darstellt. Zunächst wurde die vermutete Population der neutrophilen Granulozyten eingegrenzt.

Abb. 3: Auswertung der Messungen der Phagozytoseaktivität von neutrophilen Granulozyten im Kontrollansatz (a) und Testansatz (b) mittels Streulichtdiagramm Mittels Durchflusszytometrie wurden Leukozytensubpopulationen (Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten) anhand ihrer charakteristischen Streulichteigenschaften gemessen. Dabei wird das Vorwärtsstreulicht (FSC) durch die Zellgröße und das Seitwärtsstreulicht (SSC) durch die Granularität, die Membranfältelung sowie die äußere Form der Zellen beeinflusst. Im eingegrenzten Bereich befindet sich die vermutete Population neutrophiler Granulozyten. Abb. 3a zeigt den Kontrollansatz, d.

h. die Zellen wurden nicht zur Phagozytose stimuliert; in Abb. 3b fand eine temperaturabhängige Stimulation statt. Als Darstellungsweise wurde der Density plot gewählt.

a b

Abb. 4: Auswertung der Messungen des oxidativen Burst von neutrophilen Granulozyten im Kontrollansatz (a) und Testansatz (b) mittels Streulichtdiagramm

Mittels Durchflusszytometrie wurden Leukozytensubpopulationen (Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten) anhand ihrer charakteristischen Streulichteigenschaften gemessen. Dabei wird das Vorwärtsstreulicht (FSC) durch die Zellgröße und das Seitwärtsstreulicht (SSC) durch die Granularität, die Membranfältelung sowie die äußere Form der Zellen beeinflusst. Im eingegrenzten Bereich befindet sich die vermutete Population neutrophiler Granulozyten. Abb. 4a zeigt den Kontrollansatz, d.

h. den Zellen wurden keine Bakterien angeboten und sie produzierten somit keine phagozytose-abhängigen Sauerstoffspezies; in Abb. 4b fand eine Inkubation mit Bakterien statt. Als Darstellungsweise wurde der Density plot gewählt.

Bei der weiterführenden Quadrantenanalyse (Abb. 5 und 6) fanden nur solche Ereignisse Berücksichtigung, die innerhalb des eingegrenzten Bereichs (Abb. 3 und 4) lagen. Durch die Verwendung zweier Fluorochrome für die Messung der Phagozytoseaktivität (FITC und Propidiumiodid) bzw. des oxidativen Burst (Rhodamin 123 und Propidiumiodid) wurde eine Zweifarbenfluoreszenzanalyse vorgenommen, wobei jeweils beide Farbstoffe eine unterschiedliche Fluoreszenz-farbe aufweisen; die Fluoreszenz jedoch mit derselben Wellenlänge angeregt werden kann.

In der graphischen Darstellung (Abb. 5 und 6) enthalten die unteren Quadranten Bakterien und Debris. Phagozytierende Granulozyten befinden sich im oberen rechten, nicht phagozytierende Zellen im oberen linken Quadranten. Der Anteil an phagozytierenden Zellen wurde aus der Anzahl der Ereignisse im oberen rechten Quadranten, bezogen auf die Summe der Ereignisse aus den beiden oberen

a b

Quadranten berechnet. Aus den beiden Test- und Kontrollansätzen wurde der Anteil an phagozytierenden bzw. R 123-positiven Zellen als arithmetisches Mittel bestimmt.

Der Anteil phagozytierender bzw. R 123-positiver Granulozyten in den beiden Kontrollansätzen wurde von dem Anteil in den Testansätzen subtrahiert. Die errechnete Differenz spiegelt den Anteil der phagozytose- bzw. burstaktiven Zellen wieder.

Abb. 5: Auswertung der Messungen der Phagozytoseaktivität von neutrophilen Granulozyten im Kontrollansatz (a) und Testansatz (b) mittels Quadrantenanalyse Mittels Quadrantenanalyse wurden die Zellen anhand ihrer Fluoreszenzsignale unterteilt. Als Fluorochrome wurden Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) als Marker der phagozytoseaktiven Zellen und Propidiumiodid als DNA-Färbemittel zum Ausschluss von Bakterien und Zellaggregationsartefakten verwendet. Während die beiden unteren Quadranten Bakterien und Debris enthalten, können die phagozytierenden Zellen im oberen rechten und die nicht phagozytierenden Zellen im oberen linken Quadranten ermittelt werden. Abb. 5a zeigt den Kontrollansatz, d. h. die Zellen wurden nicht zur Phagozytose stimuliert; in Abb. 5b fand eine temperaturabhängige Stimulation statt. Der Anteil an phagozytierenden Zellen wurde aus der Anzahl der Ereignisse im oberen rechten Quadranten,

Im Dokument Untersuchungen zur immunmodulativen Wirkung von [beta]-1,3/1,6-Glukanen bei Schweinen (Seite 21-50)