nierenkanzerogener Substanzen,
sowie deren Wirkungsmechanismen in vitro
Dissertation
Zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften an der Universität Konstanz
Fachbereich Biologie
Vorgelegt von
Susanne Jelena Huljić
Konstanz, im Januar 2010 Tag der mündlichen Prüfung: 25.02.2010
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-122130
URL: http://kops.ub.uni-konstanz.de/volltexte/2010/12213/
Mein Dank gilt:
• Herrn Prof. D.R. Dietrich für die Vergabe und die Betreuung der Doktorarbeit.
• Herrn Prof. T. Hartung und Herrn Prof. C. Hauck für die Begutachtung der Arbeit.
• Herrn Dr. Dr. H.J. Ahr und Herrn Prof. Dr. B. Brüne für die Zusammenarbeit im Rahmen des vom BMBF geförderten Projekts „Entwicklung eines in vitro-Systems zur Früherkennung Nieren-Kanzerogener Substanzen“ (0313024A-C).
• dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) für die Finanzierung des Projekts.
• der Universität Konstanz für die Teilfinanzierung im Rahmen der Frauenförderung.
• Herrn Prof. Dr. N. Pfitzenmaier und seinem Ärzteteam für die freundliche Unterstützung.
• Herrn Dr. G. Mollweide für die freundliche Unterstützung.
Eine herzliches „Danke schön“ auch an folgende Personen und Arbeitsgruppen:
• Frau Dr. H. Ellinger-Ziegelbauer und Frau Dr. E. Ladenburger für die Beantwortung aller Fragen rund um die Real-Time PCR.
• der AG Ullrich für die Nutzung des LightCyclers.
• der AG Wendel, insbesondere Frau Dr. S. von Aulock für die Einführung und Nutzung des FACS-Geräts.
• der AG Bürkle, insbesondere Frau Dr. M. Moreno-Villanueva, Frau R. Steinhaus und Herrn Prof. A. Bürkle für die Nutzung des FADU-Assays sowie für die Beantwortung zahlreicher Fragen rund um diesen.
• Frau E. Bruske für die tolle Zusammenarbeit und die zahlreichen Diskussionen im Rahmen ihrer Diplomarbeit.
• Herrn H. Krieger für die Hilfe bei allen PC-Fragen und –Problemen im Laboralltag.
• der AG Dietrich für die Zusammenarbeit, die Diskussionen und die Anregungen.
Ferner möchte ich mich bei Euch bedanken:
• Nicola K., Sabine W., Christian und Stephanie H. und Christoph S.
• meinen Eltern
• Dominik und Katrin, sowie Joanna, Janek und Lara
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis... II Abkürzungsverzeichnis ...VI Abbildungsverzeichnis ...VIII Tabellenbverzeichnis...IX Zusammenfassung...X
1 Einleitung ... 1
1.1 Aufbau und Funktion der Niere... 1
1.1.1 Das Nierenkörperchen... 1
1.1.2 Der Nierentubulus... 2
1.1.3 Das Sammelrohr... 3
1.2 Zellspezifische Exposition proximaler Nierentubuluszellen ... 4
1.2.1 Aufnahme nephrotoxischer Substanzen durch Transport und Endozytose... 4
1.2.2 Toxifizierungsreaktionen im Rahmen des Fremdstoffmetabolismus ... 4
1.3 Proximale Nierenkortexzellen in vitro... 6
1.3.1 Primäre Zellkulturen ... 7
1.3.2 Zelllinien... 9
1.4 Nierentoxizität und Nierenkanzerogenität der Substanzen AA, OTA und Cycasin ... 12
1.4.1 Existieren spezies-spezifische Toxizitätsunterschiede? ... 12
1.4.2 Toxizität und Kanzerogenität der Aristolochia Säure ... 12
1.4.3 Toxizität und Kanzerogenität von Ochratoxin A ... 18
1.4.4 Toxizität und Kanzerogenität von Cycasin ... 25
2 Arbeitshypothese und Zielsetzung... 28
2.1 Arbeitshypothese ... 28
2.2 Zielsetzung... 28
2.3 Untergliederung der Arbeitshypothese und der Zielsetzung ... 29
3 Material und Methoden ... 31
3.1 Geräte ... 31
3.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial/-lösungen... 33
3.2.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterial ... 33
3.2.2 Zellkulturmedien und Verbrauchslösungen ... 35
3.2.3 Puffer und Verbrauchslösungen... 35
3.3 Zelllinien und Gewebematerial für Primärkulturen... 37
3.3.1 Zelllinien... 37
3.3.2 Humanes Nierenkortexgewebe ... 37
3.3.3 Schweinenierenkortexgewebe ... 37
3.3.4 Rattennierenkortexgewebe... 37
3.4 Kultivierung primärer Zellen und Zelllinien... 38
3.4.1 Lagerung und Kultivierung von Zelllinien ... 39
3.4.2 Isolation und Kultivierung primärer Nierenkortexzellen... 39
3.5 Wachstumskurven (Zellproliferation) ... 40
3.6 Toxin-Expositionen ... 40
3.6.1 Aristolochia Säure (AA) ... 40
3.6.2 Methylazoxymethanol Acetat (MAMAc) ... 41
3.6.3 Ochratoxin A (OTA) ... 41
3.7 Bestimmung der Zytotoxizität ... 41
3.7.1 Zellzahlbestimmung... 41
3.7.2 MTT-Reduktions-Assay ... 42
3.7.3 Statistische Auswertung ... 42
3.8 Zellzyklus-Untersuchung ... 42
3.8.1 FACS-Analyse ... 42
3.8.2 3H-Thymidin Einbau... 42
3.8.3 Statistische Auswertung ... 43
3.9 Untersuchung von DNA-Strangbrüchen: FADU-Assay ... 43
3.9.1 Prinzip... 43
3.9.2 Durchführung... 44
3.9.3 Statistische Auswertung ... 44
3.10 Genexpressionsanalyse: Real-Time PCR ... 44
3.10.1 Toxinexposition der Rattenzelllinie NRK-52E... 44
3.10.2 RNA-Isolation und Lagerung der RNA-Proben ... 45
3.10.3 Bestimmung der RNA-Quantität und –Qualität ... 45
3.10.4 Reverse Transkription ... 45
3.10.5 Optimierung und Durchführung der Real-Time PCR ... 46
3.10.6 Statistische Auswertung ... 47
3.11 Genexpressionsanalyse: Taqman® Real-Time PCR ... 47
3.11.1 AA und OTA-Exposition RKCm p0... 47
3.11.2 RNA-Isolation ... 48
3.11.3 Untersuchung der RNA-Quantität und Qualität... 48
3.11.4 Reverse Transkription ... 48
3.11.5 Taqman® Real-Time PCR ... 49
3.11.6 Statistische Auswertung ... 49
3.12 Genexpressions-Analyse: GeneChip®-Analyse, Affymetrix ... 49
3.12.1 Prinzip... 49
3.12.2 AA und OTA-Exposition RKCm p0... 50
3.12.3 RNA-Isolation und Qualitätskontrolle ... 50
3.12.4 Reverse Transkription, Hybridisierung und Qualitätskontrolle ... 50
3.12.5 Funktionelle Analyse ... 50
3.12.6 Statistische Analyse ... 50
4 Ergebnisse ... 52
4.1 Proliferation renaler Kortexzellen... 52
4.1.1 Optimierung der Kultivierungsbedingungen ... 52
4.1.2 Wachstumskurven ... 54
4.1.3 Zellmorphologie ... 56
4.2 Empfindlichkeit der in vitro-Systeme gegenüber AA, OTA und MAMAc ... 58
4.2.1 Toxizität der Aristolochia Säure... 58
4.2.2 Toxizität von Ochratoxin A... 60
4.2.3 Toxizität von Methylazoxymethanol Acetat ... 61
4.3 Molekulare Effekte von AA, MAMAc und OTA in vitro... 63
4.3.2 Induktion von DNA-Strangbrüchen und DNA-Reparatur durch AA... 66
4.3.3 Effekte von AA und OTA auf die Genexpression ... 69
5 Diskussion... 85
5.1 Optimierung der Kultivierungsbedingungen ... 85
5.2 Empfindlichkeit der in vitro-Systeme gegenüber AA, OTA und MAMAc ... 85
5.2.1 Zytotoxische Effekte ... 85
5.2.2 Zellzahlbestimmung und MTT-Reduktions-Test... 86
5.2.3 Zeit- und konzentrationsabhängige Effekte... 86
5.2.4 Abhängigkeit der Zytotoxizität vom Geschlecht und der Passage... 87
5.2.5 Sensitivität primärer Zellen im Vergleich zur Zelllinie... 87
5.3 Molekulare Effekte von AA, OTA und MAMAc in vitro... 89
5.3.1 AA: DNA-Strangbrüche, DNA-Reparatur und Effekte auf den Zellzyklus ... 89
5.3.2 MAMAc: Effekte auf den Zellzyklus... 91
5.3.3 AA- und OTA-induzierte Deregulation der Genexpression ... 92
5.4 Spezies-spezifische Toxizitätsunterschiede ... 95
5.5 Eignung primärer Schweinenierenkortexzellen ... 96
6 Schlussfolgerung und Ausblick ... 97
Literatur ... 98
Abkürzungsverzeichnis
AA Aristolochia Säure
AAN Aristolochia Säure Nephropathie AP Alkaline Phosphatase
AP-Stelle Apurin-/Apyrimidin-Stelle BER Basenexzisionsreparatur BEN Endemische Balkan Nephropathie
BMBF Bundesministerium für Bildung und Forschung BSA Bovines Serum Albumin
CDK Cyklin-abhängige Kinase c-DNA Copy DNA
CHN Chinese Herb Nephropathy DNA Desoxyribonukleinsäure DSB Doppelstrangbruch
EC20 Effektive Konzentration, die einen 20-prozentigen Effekt induziert EC50 Effektive Konzentration, die einen 50-prozentigen Effekt induziert EC80 Effektive Konzentration, die einen 80-prozentigen Effekt induziert FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
FADU Fluometric Detection of Alkaline DNA Unwinding FBS Fötales Bovines Serum
GG-NER Globale Genom Nukleotidexzisionsreparatur GGT Gamma-Glutamyltransferase
G1/2-Phase Gap1/2-Phase
HKC Humane Nierenkortexzellen
HKCm/w p0/1 Humane Nierenkortexzellen männlich/weiblich Passage 0/Passage 1 HR Homologe Rekombination
IARC Internationale Agentur für Krebsforschung IHKE Immortalized Human Kidney Epithelial Cells LC50 Letale Konzentration50
LLC-PK1 Renale Zelllinie, die aus einem juvenilen Hampshire-Schwein wurde (ECACC Nr. 86121112) LOEC Loest observable effect Concentration
KG Körpergewicht
KI Konfindenzintervall MAM Methylazoxymethanol MAMAc Methylazoxymethanol Acetat
MGMT O6-Methylguanin DNA Methyltransferase MMR Fehlpaarungsreparatur (Mismatch Repair )
M-Phase Mitose-Phase
MW Mittelwert
mRNA Messanger RNA
nb Nicht bestimmt
NER Nukleotidexzisionsreparatur NHEJ Nicht-homologe Rekombination NK Negativkontrolle
NOEC No observable effect concentration NRK-52E Normal Rat Kidney Epithelial-Like Cells
OTA Ochratoxin A
OTα Ochratoxin alpha
PCR Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) PK Positivkontrolle
PKC Schweinenierenkortexzellen
PKCm/w p0/p1 Schweinenerenkortexzellen männlich/weiblich Passage 0/Passage 1 P/S Penicillin/Streptomycin
RCC Renales Zellkarzinom (Renal Cell Carcinoma) RKC Rattennierenkortexzellen
RKCm p0 Ratten Nierenkortexzellen männlich Passage 0 ROS Reaktive Sauerstoffspezies
rRNA Ribosomale RNA
RT Raumtemperatur
SEM Standard Error of the Mean S-Phase Synthese-Phase
Stabw Standardabweichung
TC-NER Transkriptionsgekoppelte Nukleotidexzisionsreparatur
üN über Nacht
UT Urothelialer Tumor VK Vehikelkontrolle
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Niere.. ...3
Abbildung 2: Strukturformel der Aristolochia Säure...12
Abbildung 3: Strukturformel von Ochratoxin A...18
Abbildung 4: Vermutete Wirkungsmechanismen von OTA ...24
Abbildung 5: Strukturformel von Cycasin...25
Abbildung 6: Strukturformel von MAMAc...25
Abbildung 7: Studienaufbau...30
Abbildung 8: Proliferation proximaler Rattennierentubuluszellen; Optimierung der Kultivierungsbedingungen...53
Abbildung 9: Wachstumskurven ...54
Abbildung 10: Zeitschema Toxinexposition. ...55
Abbildung 11: Zellmorphologie der Zelllinien IHKE, NRK-52E, LLC-PK1 ...56
Abbildung 12: Zellmorphologie primärer Nierenkortexzellen...57
Abbildung 13: Zytotoxizität Konzentrations-Wirkungskurve von AA in PKCm p1...58
Abbildung 14: Zytotoxizität Konzentrations-Wirkungskurve von AA in HKCm p1 und PKCm p1 ...58
Abbildung 15: Zytotoxizität Konzentrations-Wirkungskurve von OTA in RKCm p0...60
Abbildung 16: Zytotoxizität Konzentrations-Wirkungskurve von MAMAc in PKCm p1...61
Abbildung 17: Zytotoxizität Konzentrations-Wirkungskurve von MAMAc in HKCm p1 und PKCm p1 ...61
Abbildung 18: 3H-Thymidin-Einbau in NRK-52E nach AA-Exposition ...64
Abbildung 19: cdkn1a-Expression in NRK-52E nach AA-Exposition...65
Abbildung 20: Standardkurve DNA-Strangbrüche in PKCm p1...66
Abbildung 21: Indirekte Messung der DNA Strangbrüche in PKCm p1...67
Abbildung 22: Reparaturprozesse in PKCm p1 ...67
Abbildung 23: Reparaturprozesse in PKCm p1 nach UVC-Bestrahlung ...67
Abbildung 24: DNA-Stranbrüche in PKCm p1 durch 2,5-stündige AA-Exposition...68
Abbildung 25: Zeitabhängigkeit: DNA-Strangbrüche in PKCm p1 durch 125µM AA...68
Abbildung 26: Reparaturprozesse in PKCm p1 nach AA-Exposition (2,5h; 125µM). ...68
Abbildung 27: Genexpessions-Analyse Hauptkomponenten-Analyse (PCA)...76
Abbildung 28: Wirkungsmechanismus von AA in vitro (vorgeschlagen). ...89
Tabellenbverzeichnis
Tabelle 1: Eingesetzte Geräte ...31
Tabelle 2: Chemikalien und Verbrauchsmaterial...33
Tabelle 3: Zellkulturmedien, Medienzusätze und weitere Lösungen für die Zellkultivierung...35
Tabelle 4: Puffer und Verbrauchslösungen ...35
Tabelle 5: Kulturmedien und Zellkulturmaterial ...38
Tabelle 6: Zeit-Temperatur Schema der Reversen Transkription ...46
Tabelle 7: Primerpaare cdkn1a (p21) und 18SrRNA...46
Tabelle 8: Real-Time PCR-Bedingungen ...47
Tabelle 9:Mastermix der Reversen Transkription ...49
Tabelle 10: Zeit-Temperatur Schema der Reversen Transkription ...49
Tabelle 11: Parameter, die für die Optimierung der Kultivierungsbedingungen variiert worden sind...52
Tabelle 12: Verdopplungszeit und maximale Zelldichte von Nierenkortexzellen...55
Tabelle 13: AA-Zytotoxizität in PKCs; Abhängigkeit der Passage und des Geschlechts. ...59
Tabelle 14: AA-Zytotoxizität in Nierenkortexzellen ...60
Tabelle 15: MAMAc-Zytotoxizität in PKCs; Abhängigkeit der Passage und des Geschlechts ...62
Tabelle 16: Zytotoxizität von MAMAc in Nierenkortexzellen...62
Tabelle 17: Übersicht: Zellkulturen ...63
Tabelle 18: Übersicht: Toxin-Konzentrationen ...63
Tabelle 19: Effekt von Aristolochia Säure auf den Zellzyklus...64
Tabelle 20: Effekt von MAMAc auf den Zellzyklus ...65
Tabelle 21: Genexpressions-Analyse: 47 Gene ...70
Tabelle 22: Genexpressions-Analyse: deregulierte Gene in RKCm p0...74
Tabelle 23: Genexpressions-Analyse: GeneChip®-Analyse (Affymetrix). ...78
Tabelle 24: Genexpressions-Analyse: 47 Gene ...80
Tabelle 25: Genexpressions-Analyse: deregulierte Gene in RKCm p0...84
Zusammenfassung
Hintergrund: Aristolochia Säure (AA), Ochratoxin A (OTA) und Cycasin sind toxische und kanzerogene Naturstoffe. Eine nierentoxische und nierenkanzerogene Wirkung der Substanzen wurde in Nagetieren festgestellt. Eine Exposition des Menschen gegenüber den Substanzen AA und OTA wurde nachgewiesen und eine humane Exposition gegenüber dem Pflanzenextrakt Cycasin wird, als Folge der Nutzung der Cycad-Pflanzen für die Nahrungsmittelherstellung, vermutet. Trotz der Exposition ergaben sich bisher nur für AA eindeutige Hinweise auf nierentoxische und nierenkanzerogene Effekte im Menschen. Diese unterscheiden sich jedoch von den Effekten, die in Nagetieren beobachtet wurden. Es stellt sich daher die Frage, ob die beobachteten Unterschiede der durch AA-induzierten Effekte, bzw. die anscheinend fehlende Sensitivität des Menschen gegenüber OTA und Cycasin, auf spezies-spezifische Toxizitätsunterschiede zurückzuführen sind.
Arbeitshypothese und Zielsetzung: Durch den Einsatz von in vitro-Modellen kann humanes Probenmaterial zur Untersuchung potentieller human-spezifischer Effekte von toxischen Substanzen verwendet werden. In der vorliegenden Studie sollte daher die Hypothese überprüft werden, dass ausgewählte in vitro-Modelle, in Ergänzung zu in vivo-Studien, zur Aufklärung der Toxizität und der Wirkungsmechanismen der Substanzen AA, OTA und Cycasin (bzw. MAM, dem aktiven Metaboliten von Cycasin) und damit zur Ermittlung spezies-spezifischer Toxizitätsunterschiede beitragen können. Das Ziel dieser Studie war es, verschiedene in vitro- Systeme des Nierenkortex (Zelllinie, primäre Zellen) hinsichtlich ihrer Eignung als Zellmodelle für die oben genannte Fragestellung zu untersuchen. Ein besonderes Augenmerk galt der Möglichkeit, primäre Schweinenierenkortexzellen als Surrogat für humane Zellen einsetzen zu können.
Methoden: Die Sensitivität der in vitro-Modelle gegenüber den Toxinen wurde mittels Zelltoxizitätsassays (Zellzahlbestimmung, MTT-Reduktions-Test) ermittelt und eine Präselektion ausreichend sensitiver in vitro-Modelle durchgeführt. Des Weiteren wurden die Effekte der Genotoxine AA und MAMAc (synthetisches, stabilisiertes Derivat von MAM) auf den Zellzyklus (FACS-Analyse, 3H-Thymidin-Einbau) und die Induktion von DNA-Strangbrüchen und DNA- Reparatur (FADU-Assay) durch AA untersucht. Eine Analyse der Genexpression nach 24- und 48-stündiger AA- und OTA-Exposition wurde durchgeführt (Taqman®-Analyse; GeneChips®- Analyse) und die Resultate mit in vivo-Studien verglichen. Um erste Hinweise auf spezies- spezifische Toxizitätsunterschiede zu erhalten, wurde die Zytotoxizität der Substanzen AA und MAMAc (spezies-spezifische Unterschiede der Zytotoxizität von Ochratoxin A im in vitro-Modell wurde bereits von Dietrich und Kollegen untersucht (Dietrich et al. 2001)) gegenüber primären Nierenkortexzellen der Spezies Ratte, Mensch und Schwein untersucht.
Ergebnisse: 1) AA und MAMAc induzierten in renalen Zelllinien (IHKE, NRK-52E und LLC- PK1) und in primären Nierenkortexzellen (Ratte, Mensch, Schwein) zeit- und konzentrations- abhängige zytotoxische Effekte. Hierbei wiesen primäre humane Nierenkortexzellen im
Vergleich zur Zelllinie IHKE eine höhere Sensitivität auf. Primäre Schweinenierenkortexzellen waren gegenüber MAMAc im Vergleich zur Zelllinie LLC-PK1 empfindlicher. Die Sensitivität der primären Zellen gegenüber AA hingegen war nach 24-stündiger Exposition höher, bei längerer Exposition (48h) jedoch zur Zelllinie LLC-PK1 vergleichbar. Auch in primären Rattennieren- kortexzellen und der Zelllinie NRK-52E wurde für die 48-stündige Exposition eine vergleichbare AA-Toxizität beobachtet. Bei einer 24-stündigen AA-Exposition reagierten NRK-52E-Zellen im Vergleich zu primären Zellen sensitiver. Die Zelllinie NRK-52E wies auch gegenüber MAMAc (24h, 48h) eine höhere Sensitivität auf. Aufgrund der tendenziell höheren Sensitivität primärer Zellen wurden diese für die darauf folgenden Untersuchungen molekularer Effekte von AA, MAMAc und OTA eingesetzt. 2) Nach 48-stündiger AA- und MAMAc-Exposition konnte, mittels der FACS-Analyse, kein signifikanter Effekt auf den Zellzyklus festgestellt werden. Tendenziell war jedoch ein G2/M-Arrest für beide Toxine zu erkennen. Darüber hinaus konnte eine AA- induzierte Verminderung der Zellproliferation und eine Genexpressionserhöhung des Zellzyklus- spezifischen Gens cdkn1a beobachtet werden. Eine Induktion von DNA-Strangbrüchen durch AA wurde ebenfalls nachgewiesen. Eine Untersuchung der Effekte von AA und OTA auf die Genexpression wurde in primären proximalen Rattennierenkortexzellen durchgeführt, um die Vergleichbarkeit zu bestehenden in vivo-Resultaten zu erhöhen. Obwohl eine Deregulation
„Toxin-relevanter“ Gene, in Übereinstimmung mit in vivo-Resultaten, im in vitro-Modell nachgewiesen wurde, war die Anzahl deregulierter Gene und das Ausmaß der Expressionsderegulation, unabhängig vom Toxin, gering. 3) AA und MAMAc zeigten nach 24- stündiger Exposition spezies-spezifische Toxizitätsunterschiede in vitro. Die Toxizität beider Substanzen war in primären Schweinenierenkortexzellen am höchsten, gefolgt von Nierenkortexzellen der Ratte und des Menschen. Im Gegensatz dazu, war die Zytotoxizität der Substanzen AA und MAMAc nach 48-stündiger Exposition vergleichbar (Ausnahme:
Zytotoxizität von AA, PKCMp1 > HKCm p1 = RKCm p0).
Diskussion: Die Sensitivität primärer Nierenkortexzellen (Mensch, Schwein) war im Vergleich zur entsprechenden Zelllinie größer oder vergleichbar. Nur die Zelllinie NRK-52E war gegenüber MAMAc im Vergleich sensitiver. Es ist zu vermuten, dass die jeweils größere Sensitivität auf den Differenzierungsgrad zurückzuführen ist, der in primären Zellen generell höher ist. Entsprechend der Erwartung lassen die Ergebnisse, die eine AA-induzierte Zellproliferationsreduktion und eine Expressionsinduktion des Zellzyklus-spezifischen Gens cdkn1a zeigen, eine im in vitro-Modell induzierte DNA-Schadensantwort erkennen. Dies lässt auf eine, für weitere mechanistische Untersuchungen notwendige, Sensitivität des renalen Zellmodells gegenüber dem Nephrotoxin AA schließen. Das geringe Ausmaß der AA- und OTA- induzierten Genexpressionsderegulation und die geringe Anzahl deregulierte Gene erscheinen durch die relativ niedrigen Toxinkonzentrationen bedingt zu sein. Eine Deregulation „Toxin- relevanter“ Gene ist jedoch zu beobachten. Die in vitro-Studie ergibt erste Hinweise auf spezies-spezifische Unterschiede der Toxine AA und MAM-Acetat. So zeigt der Vergleich der Zytotoxizität der Substanzen, dass die Toxizität in Schweinenierenkortexzellen generell am höchsten ist. Diese Beobachtung stimmt mit Ergebnissen überein, die zeigen, dass die
Metabolisierung des Toxins AA zu toxischen Derivaten in Schweinenierenkortexzell-Fraktionen am höchsten ist. Des Weiteren zeigt sich, dass Rattennierenkortexzellen im Vergleich zu humanen Nierenkortexzellen sensitiver sind.
Ausblick: Die vorliegende Studie zeigt, dass in vitro Modelle, insbesondere primäre Zellkulturen, für mechanistische Untersuchungen der Toxizität von AA, OTA und Cycasin genutzt werden können. Die Möglichkeit, menschliche Zellen einsetzen zu können, erlaubt zudem die Erforschung spezies-spezifischer Toxizitätsunterschiede der Substanzen. Die geringe Verfügbarkeit humaner Zellen, deren heterogene Qualität und die Kosten des Erwerbs primärer Zellen kann in vitro-Studien jedoch beeinträchtigen. Aufgrund der genetischen Vergleichbarkeit der Spezies Schwein und Mensch, sowie der anatomischen und physiologischen Ähnlichkeit der Nieren, sollte in zukünftigen Studien die Verwendung von primären Schweinenierenkortexzellen als mögliches Surrogat in Erwägung gezogen werden.
1.1 Aufbau und Funktion der Niere
Die Niere liegt in Säugern als paariges Organ vor. Sie ist von einer Nierenkapsel umgeben und wird in drei Bereiche untergliedert: die außen liegende Nierenrinde (Cortex renalis), das äußere Nierenmark und das innere Nierenmark (Abbildung 1). Das Nierenmark (Medulla renalis) besitzt die Form von Pyramiden, dessen Spitzen als Papillen bezeichnet werden. Die Papillen reichen in die Nierenkelche, die sich zum Nierenbecken (Pelvis renalis) zusammenschließen. Das Nierenbecken stellt das erweiterte obere Ende des Harnleiters dar (Sands und Verlander 2005).
Die Funktionseinheit der Niere ist das Nephron. Die menschliche Niere besteht aus ca. 1–
1,25Mio, die der Ratte aus etwa 30.000–35.000 Nephronen. Das Nephron besteht aus dem Nierenkörperchen und dem Nierentubulus, der sich wiederum in den proximalen Tubulus, den Intermediärtubulus und den distalen Tubulus unterteilt (Abbildung 1). Der gerade Abschnitt des proximalen Tubulus (pars recta), der Intermediärtubulus und der gerade Teil des distalen Tubulus (pars recta) werden als Henle-Schleife bezeichnet. Der distale Tubulus geht in das Sammelrohr über, das in das Nierenbecken mündet. Abhängig von der Lage des Nierenkörperchens innerhalb des Kortex werden subkortikale, midkortikale und juxtamedulläre Nephrone unterschieden. Darüber hinaus gibt es je nach Länge der Henle-Schleife lange und kurze Nephrone. Kurze Nephrone (v.a. kortikale) reichen bis in das äußere und lange bis in das innere Nierenmark. Einige lange Nephrone (v.a. juxtamedullär) reichen bis in die Papillenspitze (Kriz und Kaissling 1985; Cojocel 2004).
Die Aufgaben der Niere sind vielfältig. So zählt die Exkretion von Stoffwechselendprodukten und von Fremdstoffen zu einer der 5 Hauptaufgaben. Die Niere ist des Weiteren für die Konservierung von Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Kohlehydraten und Fettsäuren zuständig.
Auch die Regulation des Wasser- und Elektrolyt-Haushaltes und des Säuren-Basen-Haushaltes zählt zu den Funktionen der Niere. Eine weitere Aufgabe ist die Produktion und die Metabolisierung von Hormonen (Hierholzer und Fromm 1997; Sands und Verlander 2005).
1.1.1 Das Nierenkörperchen
Das Nierenkörperchen bildet die filtrierende Einheit der Niere und besteht aus dem Glomerulus und der Bowman´schen Kapsel. Der Glomerulus ist ein Kapillarnetz, das zwischen der afferenten und der efferenten Arteriole zwischengeschaltet ist. Die Bowman´sche Kapsel, die eine Erweiterung des proximalen Tubulus darstellt, liegt auf den glomerulären Kapillaren. Das Blut und mit ihm die harnpflichtigen Substanzen gelangen über die afferente Arteriole in die Glomeruli. Die glomeruläre Filtrationsbarriere ist eine größen- und ladungsabhängige Barriere dar, die Proteine und Plasmabestandteile mit einer Größe von ca. 10 bis 70kDA in Abhängigkeit ihrer negativen Ladung zurückhält. Durch die glomeruläre Filtration werden etwa 10% des
durchfließenden Blutplasmas abfiltriert, so dass in der Niere eines erwachsenen Menschen täglich ca. 180L Primärharn gebildet werden (Sands und Verlander 2005; Silbernagl 2005).
1.1.2 Der Nierentubulus
In dem Nierenkörperchen folgenden Tubulussystem erfolgt die Aufkonzentrierung des Harns. So werden 99% des Wassers, aber auch die Solute (wie u.a. Elektrolyte, Kohlenhydrate, Aminosäuren), die der Körper benötigt, im Tubulussystem rückresorbiert und dem Blut in den peritubulären Kapillaren wieder zugeführt. Neben der tubulären Rückresorption wird die endgültige Zusammensetzung des Harns durch die tubuläre Sekretion bestimmt. Hierbei werden organische Anionen und Kationen, Proteine sowie Fremdstoffe aktiv aus dem Blut in das tubuläre Lumen transportiert (Wright und Dantzler 2004; Sands und Verlander 2005; Silbernagl 2005).
Proximaler Tubulus
Sowohl die Rückresorption als auch die tubuläre Sekretion findet vorwiegend im proximalen Tubulus statt. Für den Transport sind aktive und passive Transportprozesse verantwortlich.
Aufgrund der energieverbrauchenden, aktiven Transportprozesse ist der Anteil an Mitochondrien in proximalen Tubuluszellen hoch. Neben dem hohen Anteil Mitochondrien ist die durch Mikrovilli stark vergrößerte apikale Membran, die sogenannte Bürstensaummembran, für proximale Tubuluszellen charakteristisch. Beide Zelleigenschaften sind jedoch nicht gleichmäßig im proximalen Tubulus ausgeprägt. Der im Nierenkortex lokalisierte proximale Tubulus besteht aus drei epithelialen Zelltypen, die drei Segmente bilden (S1, S2 und S3). Zellen des S1-Segments, die ausschließlich im pars convoluta lokalisiert sind, zeichnen sich durch eine stark ausgeprägte Bürstensaummembran und zahlreiche Mitochondrien aus, die die hohe aktive Transportkapazität der S1-Zellen widerspiegeln. Zellen des S2-Segments, die sich an das S1-Segment anschließen und im pars convoluta und pars recta liegen, weisen eine im Vergleich zu S1- und S3-Zellen geringer ausgeprägte Bürstensaummembran auf und besitzen weniger Mitochondrien. Zellen des S3-Segemnts liegen im pars recta. Zellen dieses Segments haben die längste Bürstensaummembran und den geringsten Anteil an Mitochondrien (Sands und Verlander 2005).
Henle-Schleife
Der dünne absteigende Teil, der dünne aufsteigende Teil, der nur in langen Nephronen vorhanden ist, sowie der dicke aufsteigende Ast der Henle-Schleife bestehen aus epithelialen Zelltypen. Diese besitzen im Gegensatz zu proximalen Zellen wenige Mitochondrien und die Transportprozesse erfolgen weitestgehend passiv. Im absteigenden Ast der Henle-Schleife wird vor allem Wasser resorbiert, während im aufsteigenden Ast, der weitgehend Wasser undurchlässig ist, Natriumchlorid aktiv resorbiert wird. Dies führt zum Aufbau eines osmotischen Gradienten im Nierenmark, der die Voraussetzung für die Konzentrierung des Urins darstellt (Sands und Verlander 2005; Silbernagl 2005).
Distaler Tubulus
Dem dicken aufsteigenden Ast der Henle-Schleife, der auch als der gerade Teil des distalen Tubulus bezeichnet wird, folgt der konvolute distale Tubulus, dessen Zellen sich durch basolateral liegende, große Mitochondrien und durch eine hohe Natrium-Kalium-ATPase- Aktivität auszeichnen. Dem distalen Epithelium folgt der Verbindungstubulus. Beide Abschnitte des Nephrons weisen eine hohe Na+-Rückresorpition auf (Sands und Verlander 2005).
1.1.3 Das Sammelrohr
Das Sammelrohr wird aufgrund seiner Entwicklungsgeschichte nicht dem Nephron zugerechnet.
Es verläuft von der Nierenrinde bis in die Nierenpapille. In diesem Abschnitt des Nephrons erfolgt vor allem die Aufkonzentrierung des Harns. Hierbei ist der Einbau von Aquaporinen in die Plasmamembran in Abhängigkeit von dem antidiuretischen Hormon Vasopressin für die Permeabilität des Sammelrohrs und den passiven Übertritt von Wasser in das hypertone Nierenmark von Bedeutung (Cojocel 2004; Sands und Verlander 2005).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Niere (http://www.transplantationszentrum-freiburg.de/images/i_niere.jpg) (A) und des Nephrons (mit kurzer und langer Henle-Schleife) (B): 1) Nierenkörperchen: Bowman-Kapsel und Glomerulus; 2) Proximaler Tubulus (pars convoluta); 3) Proximaler Tubulus (pars recta); 4) Intermediärtubulus (pars descendes) 5) Intermediärtubulus (pars ascendens); 6) Distaler Tubulus (pars recta); 7) Macula Densa; 8) Distaler Tubulus (pars convoluta); 9) Verbindungstubulus; 10) Sammelrohr (kortikal); 11) Sammelrohr (äußeres medulläres); 12 Sammelrohr (inneres medulläres) (Sands und Verlander 2005).
1.2 Zellspezifische Exposition proximaler Nierentubuluszellen
Aufgrund ihrer Funktion, die die Ausscheidung von Fremdstoffen beinhaltet, ist die Niere gegenüber diversen toxischen Substanzen exponiert (Haschek und Rousseaux 1998; Cojocel 2004; Sands und Verlander 2005). Die anatomischen, funktionellen und biochemischen Unterschiede der Zelltypen führen zu einer heterogenen Verteilung und zellspezifischen Wirkung nephrotoxischer Fremdstoffe innerhalb des Organs (Guder und Ross 1984; Lash 1990; Lash 1994). Insbesondere proximale Tubuluszellen sind aufgrund ihrer zahlreichen Transportsysteme (Wright und Dantzler 2004) und des hohen Gehalts an biotransformierenden Enzymen (Lohr et al. 1998), die zur Bildung reaktiver Zwischenprodukte beitragen können, in vergleichsweise hohem Ausmaß gegenüber nephrotoxischen Substanzen exponiert (Berndt 1989; Braunlich 1990; Lash 1994). Zellspezifische pathologische Veränderungen und/oder die Induktion von Kanzerogenese können Folge solcher Expositionen sein.
1.2.1 Aufnahme nephrotoxischer Substanzen durch Transport und Endozytose
Der proximale Tubulus ist der Hauptort für die Rückresorption und die Sekretion organischer Anionen und Kationen (Pritchard und Miller 1996; Wright und Dantzler 2004; Sands und Verlander 2005). Beide Prozesse können zu einer Aufnahme nephrotoxischer Substanzen führen (Dahlmann et al. 1998; Jung et al. 2001). Die hierfür verantwortlichen und auf basolateraler und apikaler Seite lokalisierten Transportsysteme werden zwei Transporter- Familien zugeordnet. Die sogenannten Solute Carrier-Transporter (Slc) umfassen die Organische Anionen transportierenden Polypeptide (Oatp; Slco) (Robertson und Rankin 2006), die Organische Kationen-Transporter (Oct; Slc22) und die Organische Anionen-Transporter (Oat; Slc22) (Koepsell und Endou 2004). Zu den sogenannten ATP-bindenden Kassetten- Transportern (Abc-Transporter) zählen die P-Glykoproteine (Abcb1) (Chan et al. 2004) und die sogenannten Multidrug Resistance-Proteine (Abcc, Mrp) (Kruh und Belinsky 2003; Van De Water et al. 2005). Der Transport erfolgt über erleichterte Diffusion (Slc-Transporter), über sekundär aktiven (Slc-Transporter) oder über aktiven Transport (ABC-Tranporter).
Auf apikaler Seite weisen proximale Tubuluszellen zusätzlich eine hohe endozytotische Aktivität auf (Christensen et al. 2009). Diese wirkt dem Proteinverlust durch die Ausscheidung von Urin entgegen. Die rezeptorvermittelte Endozytose kann jedoch auch zur Aufnahme nephrotoxischer Substanzen führen, wie beispielsweise zur Aufnahme des Aminoglycosid-Antibiotikums Gentamycin (Moestrup et al. 1995; Schmitz et al. 2002).
1.2.2 Toxifizierungsreaktionen im Rahmen des Fremdstoffmetabolismus
Proximale Tubuluszellen zeichnen sich durch einen hohen Gehalt und durch eine hohe Aktivität biotransformierender Enzyme aus (Cojocel et al. 1983; Lohr et al. 1998). Die Biotransformation dient der Umwandlung lipophiler Stoffe in hydrophile Derivate und damit der Ausscheidung
dieser Substanzen. In einigen Fällen können jedoch durch den Fremdstoffmetabolismus toxische Zwischenprodukte gebildet werden (Efferth 2006).
Biotransformation Phase I
Die Einführung oder Freilegung einer funktionellen Gruppe (Funktionalisierung), die als Angriffspunkt für die darauf folgende Konjugationsreaktion (Phase II) dient, geschieht in der ersten Phase des Fremdstoffmetabolismus. Diese Reaktion beinhaltet die Konvertierung der Substanz in eine nukleophile oder elektrophile Verbindung verbunden. Zu den am Phase I- Stoffwechsel beteiligten Enzymen zählen Monooxygenasen (CYP-P450, FMO), Oxidasen, Reduktasen, Dehydrogenasen und Esterasen. Cytochrom P450-Enzyme (CYP-P450), als deren Hauptreaktion die Oxidationsreaktion gilt, bilden hierbei die größte Gruppe der Phase I-Enzyme.
Sie weisen eine breite Substratspezifität aus und sind substratinduzierbar (Efferth 2006).
Biotransformation Phase II
In der Phase II des Fremdstoffmetabolismus erfolgt die Konjugation hydrophiler endogener Moleküle an das in Phase I modifizierte Derivat. Hierbei werden zwei Reaktionstypen unterschieden. Reaktionen, in denen das Konjugat reaktiv ist, werden als Typ 1-Reaktionen bezeichnet (Bsp. Glucuronidierungsreaktion). Konjugationsreaktionen, in denen das in der Phase-I gebildete Substrat das reaktive Molekül darstellt, werden als Typ 2-Reaktionen bezeichnet (Bsp. Glutathion-Transfer). In der zweiten Phase des Fremdstoffmetabolismus spielen Transferasen, darunter die Glutathion-S-Transferase (GST), die UDP- Glucuronosyltransferase (UGT), die Sulfotransferasen (SULT), die Acetyltransferasen (AT), die Acyl-CoA-Aminosäure-N-Acyltransferasen (NAT) und die Methyltransferasen (MT) eine wesentliche Rolle. Vor allem die durch UGTs katalysierten Glucuronidierungsreaktionen stellen einen bedeutenden Anteil der Phase II-Reaktionen dar (Efferth 2006).
Toxifizierungsreaktionen
Als Folge der Fremdstoffmetabolisierung, vor allem in der Phase I des Fremdstoffwechsels, können elektrophile und nukleophile Reaktionsprodukte entstehen, die eine höhere Toxizität als die Ursprungssubstanz aufweisen. Die Konjugat-Verfügbarkeit, wie die von Glutathion beispielsweise, kann hierbei eine ausschlaggebende Rolle spielen. So begünstigt eine limitierte Konjugat-Verfügbarkeit die Bildung reaktiver Metabolite. Die Konjugationsreaktion in Phase II des Fremdstoffmetabolismus führt im Gegensatz zur Phase I mit einigen Ausnahmen (Bsp.:
Toxizität der durch UGTs gebildeten Acylglukuronide der Carboxylsäure) zur vollständigen Detoxifizierung der Ursprungssubstanz (Plant 2003; Efferth 2006).
1.3 Proximale Nierenkortexzellen in vitro
In vitro-Systeme stellen ein im Vergleich zum Tiermodell vereinfachtes Untersuchungsmodell dar. Durch das Ausschalten systemischer Einflüsse wird die Vergleichbarkeit zwischen den Versuchsansätzen erhöht. Im Gegensatz zu Tiermodellen ist der Einsatz von in vitro-Modellen kostengünstiger und weniger zeitintensiv. Aufgrund dieser Tatsache und der meist einfachen Handhabung, können in vitro-Studien mit vergleichsweise großen Versuchansätzen und mit einer hohen Durchsatzrate durchgeführt werden. Auch wird der Nutzen von in vitro-Systemen angesichts der Möglichkeit deutlich, humanes Probenmaterial zur Aufklärung toxikologischer Fragestellungen einsetzen zu können. Darüber hinaus erlaubt die Isolation und Vermehrung spezifischer Zelltypen, die Erfassung zelltypspezifischer Effekte. Es ist jedoch zu beachten, dass diese Effekte, aufgrund fehlender systemischer Einflüsse, im Vergleich zum in vivo-System unvollständig oder verändert sein können (Spielmann 2004). Auch das Fehlen charakteristischer Zelleigenschaften als Folge von Anpassungsprozessen und/oder einem Verlust der Differenzierung kann Toxin-induzierte Effekte beeinflussen (Ford 2005). Bei der Interpretation von in vitro-Studienergebnissen ist des Weiteren zu beachten, dass die Ausprägung von Zellcharaktereigenschaften in vitro zwischen Zellkulturen des gleichen Zelltyps verschieden (Hohage et al. 1998; Wilkening et al. 2003) und von Kultivierungsbedingungen, Proliferationsstatus und Kultivierungsdauer abhängig sein können (Rabito et al. 1984; Miller 1986; Gstraunthaler et al. 1999).
Für die erfolgreiche Nutzung von in vitro-Modellen ist der Einsatz gut charakterisierter Modelle von Vorteil, welche laut Gstraunthaler und Pfaller im Idealfall über folgende Eigenschaften verfügen sollten (Gstraunthaler und Pfaller 1992; Pfaller und Gstraunthaler 1998): Erhalt der Zellpolarität, Expression der zellspezifischen Membran- und Markerenzyme Gamma- Glutamyltransferase (GGT) und Alkaline Phosphatase (AP), Expression zellspezifischer biotransformierender Enzyme und Transportsysteme, Bildung sogenannter „Domes“, die auf den transepithelialen Transport von Flüssigkeit zurückzuführen sind sowie eine der in vivo-Situation entsprechende Empfindlichkeit gegenüber Hormonen und Nephrotoxinen. Wie auch die beiden Autoren betonen, besitzt jedoch keine der verfügbaren Zelllinien über alle diese Eigenschaften.
Es ist des Weiteren zu erwähnen, dass in Abhängigkeit der jeweiligen Fragestellung die Relevanz einzelner Zelleigenschaften verschieden sein kann.
Eine Zusammenfassung toxikologisch relevanter Zelleigenschaften der in dieser Studie eingesetzten in vitro-Modelle wird im Folgenden gegeben. Dabei liegt der Fokus bei den Transport- und Biotransformationseigenschaften, soweit sie bis zum jetzigen Zeitpunkt untersucht worden sind.
1.3.1 Primäre Zellkulturen
Primäre proximale Nierentubuluszellen
Bei primären Zellkulturen handelt es sich um frisch aus dem Organ isolierte Zellen, die in Kultur gebracht worden sind. Primäre Zellen sind im Gegensatz zu permanenten Zelllinien nur für eine beschränkte Zeitdauer kultivierbar und eine Subkultivierung der Zellen ist nicht immer möglich (Barron et al. 1990; Boogaard et al. 1990; Baer et al. 1997). Auch Einschränkungen in der Verfügbarkeit und der Menge des Gewebematerials können den Versuchsaufbau beeinflussen.
Die jeweils notwendige Primärpräparation kann zeitintensiv sein und eine mögliche Ursache für Variabilität darstellen (Gesek et al. 1987; McLaren et al. 1995). Ebenso kann die Herkunft des Gewebematerials einen Einfluss auf die Empfindlichkeit der Zellen haben und die Variabilität erhöhen (Ford 2005). Im Vergleich zu Zelllinien werden primäre Zellkulturen jedoch als das der Ursprungszelle vergleichbarere in vitro-Modell angesehen, da der Verlust charakateristischer morphologischer, biochemischer und funktioneller Zelleigenschaften in primären Zellen geringer scheint (Ford 2005). Die Charakterisierung toxikologisch relevanter Eigenschaften wurde in primären proximalen Nierentubuluszellkulturen verschiedener Spezies durchgeführt. Die meisten Studien liegen zum jetzigen Zeitpunkt für primäre proximale Rattennierenkortexzellen vor (Boogaard et al. 1989; Chen et al. 1989; Boogaard et al. 1990; Haenen et al. 1996).
Primäre Rattennierenkortexzellen
Im Vergleich zu primären Nierenkortexzellkulturen anderer Spezies, ist die Kultivierung primärer Rattennierenkortexzellen mit Einschränkungen verbunden. So ist die Proliferationskapazität relativ gering und eine Subkultivierung der Zellen ist nicht möglich (Miller 1986; Barron et al.
1990). Nichtsdestotrotz stellen primäre Rattennierenkortexzellen ein häufig genutztes in vitro- Modell dar (Imamdi et al. 2004; Jiang et al. 2004; de Graauw et al. 2007). Die Morphologie proximaler Tubuluszellen, auf Kollagen-beschichteten Zellkulturschalen kultiviert, wird als typisch epithelial beschrieben (Schaaf et al. 2001). Darüber hinaus konnten die für proximale Tubuluszellen charakteristischen Bürstensaummembran-Markerenzyme Gamma- Glutamyltransferase (GGT) und Alkaline Phosphatase (AP) nachgewiesen werden (Miller 1986;
Lash et al. 1995). Die Aktivität beider Enzyme scheint jedoch nicht konsistent zu sein. So wurde eine Aktivitätsabnahme beider Markerenzyme in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer beobachtet (Bruggeman et al. 1989; Chen et al. 1989; Lash et al. 1995; Schaaf et al. 2001).
Auch biotransformierende Enzyme zeigten eine zeitabhängige Aktivitätsabnahme. So wurde ein Aktivitätsverlust sowohl für Phase I- als auch für Phase II-Enzyme nachgewiesen. Während die Phase I-Enzymaktivität vor allem innerhalb der ersten 24h verloren zu gehen scheint, verläuft die Aktivitätsabnahme der Phase II-Enzyme langsamer (Bruggeman et al. 1989; Schaaf et al. 2001).
Im Gegensatz zur relativ ausführlichen Untersuchung der Enzymaktivität (Schaaf et al. 2001), ist die Transportkapazität proximaler Rattennierenkortexzellen bislang nur eingeschränkt untersucht worden. So konnte unter anderem der Natrium-abhängige Glukose- und Phosphattransport nachgewiesen werden (Chen et al. 1989; Schaaf et al. 2001). Darüber hinaus scheinen primäre
Rattennierenkortexzellen über Transporter für organische Anionen zu verfügen (Bruggeman et al. 1989). Ein in vitro-in vivo Genexpressionsvergleich konnte in proximalen Tubuluszellen die mRNA-Hochregulation einiger Transporter, darunter des Glukose-Transporters Typ 1 (Glut1) sowie der ATP-bindenden Kassetten-Transporter (ABC-Transporter) Abcc1 (Mrp1) und Mdr2 zeigen. Die Mehrzahl der Membrantransporter lag jedoch im Vergleich zum in vivo-Modell herunterreguliert vor (Weiland et al. 2006).
Primäre Schweinenierenkortexzellen
Im Gegensatz zu der nur eingeschränkten Charakterisierung von primären Rattennierenkortexzellen bezüglich ihrer Transportsysteme, wurde die Expression und Aktivität der Membrantransporter in primären Schweinenierenkortexzellen ausführlich untersucht (Schlatter et al. 2006). Wie Schlatter und Kollegen zeigen konnten, exprimiert das in vitro-Modell die meisten wichtigen Transportsysteme. Darunter sind die ABC-Transporter Abcb1 (P-gp), Abcc1 (Mrp1) und Abcc2 (Mrp2), deren Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene nachgewiesen wurde. Neben der Expression, wurde auch die Aktivität dieser Transportsysteme in der Zellkultur aufgezeigt. Des Weiteren wurde die Expression des Na+/HCO3- Co-Transporters Slc4a4 (Nbc1) auf mRNA- und Proteinebene nachgewiesen, sowie die mRNA-Expression und Aktivität des Organischen Anionen-Transporters Slc22a8 (Oat3), des Peptidtransporters Slc15a1 (Pept1) und des Sodiumabhängigen Glukosetransporters Slc5a2 (Sglt2). Die mRNA des Organische Anionen transportierenden Polypeptids Slco1a2, (Oatp-a) wurde ebenfalls expremiert. Im Gegensatz zu diesen Transportsystemen war der organische Kationen- und Anionen-Transporter Slc22a1 (Oct1) und Slc22a6 (Oat1) zwar in frisch isolierten Zellen, nicht jedoch in den Zellkulturen feststellbar (Schlatter et al. 2006).
Humane primäre Nierenkortexzellen
Humane primäre Nierenkortexzellen weisen eine epithelartige Morphologie auf und expremieren den epithelialen Marker Cytokeratin (Baer et al. 1997; Cummings et al. 2000). Auch die Aktivität des in der Bürstensaummembran lokalisierten Markerenzyms Alkaline Phosphatase (AP) konnte nachgewiesen werden (Baer et al. 1997).
Wie in primären Schweinenierenkortexzellen, konnte auch in primären humanen Nierenkortexzellen konnte die Expression und die Aktivität verschiedener Transportsysteme nachgewiesen werden (Lash et al. 2006). So wurde die Proteinexpression der Organische Anionen-Transporter Slc22a6, Slc22a7, Slc22a8 und Slc22a11 (Oat1-4) und des Organischen Kationen-Transporters Slc22a2 (Oct2) für eine Kultivierungsdauer von 5 Tagen nachgewiesen.
Des Weiteren wurde die Proteinexpression von Slc22a5 (Octn2) gezeigt. Der Transporter Slc22a4 (Octn1) war hingegen nicht nachweisbar. Für die Untersuchung der Transportaktivität wurden die folgenden Substanzen eingesetzt: p-Aminohippurat (PAH) und Methotrexat (MTX), Allocrite der Organische Anionen-Transporter Slc22a6 (PAH und MTX) und Slc22a8 (PAH), Carnitin (Carn), ein Allocrit der Transportsysteme Slc22a5 (Octn2) und Slc22a4 (Octn1), und 3-
apikaler Seite wurde Transportaktivität festgestellt. Die Aufnahme von C-Glycylsarcosin (GlySar) als Marker des Oligopeptid-Transporters PepT2 und die Aufnahme der neutralen Aminosäure Leucin (Leu) wurde ebenfalls beobachtet. Es wurde des Weiteren die Expression der Transporter Abcc2 (Mrp2) und Abcc5 (Mrp5) untersucht und beide Transporter nachgewiesen.
Darüber hinaus wurde die Aktivität des P-Glykoproteins (P-gp, Mdr1, Abcb1) über den Transport des Substrats Verapamil gezeigt (Lash et al. 2006).
Auch die Expression verschiedener biotransformierender Enzyme wurde in konfluenten humanen Nierenkortexzellkulturen nachgewiesen, u.a. die Proteinexpression der Phase I- spezifischen Enzyme Cyp1b1, Cyp3a4, Cyp3a5, Cyp2d6 und Cyp4a11 (Cummings et al. 2000;
Lash et al. 2008). Die Proteinexpression der Enzyme Cyp1a1, Cyp1a2, Cyp2a6, Cyp2b6, Cyp2c8 und Cyp2e1 konnte hingegen nicht bestätigt werden (Lash et al. 2008). Unter den Phase II-spezifischen Enzymen wurde die Expression der Glutathion S-Transferasen Gsta, Gstt und Gstp (Cummings et al. 2000; Lash et al. 2008), der Sulfotransferasen Sult1a3, Sult1e und Sult2a1 und der UDP-Glucuronosyltransferasen Ugt1a1, Ugt1a6 und Ugt2b7 nachgewiesen (Lash et al. 2008). Eine Abnahme der Expression in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer wurde sowohl für Phase I als auch für Phase II-spezifische Enzyme beobachtet.
Der Effekt der Subkultivierung der humanen primären Nierenkortexzellkultur auf die Expression der biotransformierenden Enzyme Gamma-Glutamyltransferase (GGT), Glutathion Disulfid Reduktase (GRD), Glutathion-S-Transferase (GST) und Glutathion Peroxidase (GPX) wurde von Cummings und Kollegen untersucht (Cummings et al. 2000). Es zeigte sich hierbei, dass die Aktivität der GGT, nicht jedoch die der Enzyme GRD, GST und GPX bis zur vierten Passage vergleichbar ist.
1.3.2 Zelllinien
Bei Zelllinien handelt es sich im Gegensatz zu primären Zellkulturen um permanente Zellkulturen. Die Verwendung von Zelllinien für toxikologische Untersuchungen hat mehrere Vorteile. Die meisten Zelllinien sind käuflich zu erwerben und aufgrund der uneingeschränkten Proliferation ist die Größe des Versuchsansatzes nicht limitiert. Darüber hinaus sind die Handhabung und die Kultivierung der Zellen einfach und die Vergleichbarkeit der Versuchsansätze ist gewährleistet. Hierbei muss jedoch beachtet werden, dass sich Zellcharaktereigenschaften von Zelllinien in Abhängigkeit von Proliferationsstatus und Kultivierungsbedingungen verändern können (Rabito et al. 1984; Scheinman 1988;
Gstraunthaler et al. 1999). Die gute Charakterisierung einzelner Zelllinien wie beispielsweise die der Zelllinie LLC-PK ermöglicht die Untersuchung spezifischer toxikologischer Fragestellungen.
Solche Charakterisierungsstudien verdeutlichen jedoch auch die Nachteile dieses Modells.
Zelllinien verfügen nur noch in geringem Maße über die ursprünglichen Zellcharaktereigenschaften oder haben diese gänzlich verloren. Als Folge der Transformation können chromosomale Aberrationen, veränderte Genstrukturen oder Genexpressionsveränderungen vorliegen (Maehle et al. 1992), aufgrund derer nicht
ausgeschlossen werden kann, dass die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber Nephrotoxinen beeinflusst ist.
Eine Reihe verschiedener Nierenzelllinien stehen für die Untersuchung nephrotoxischer Substanzen zur Verfügung, darunter die Rattenzelllinie NRK-52E (De Larco und Todaro 1978), die Schweinezelllinie LLC-PK1 (Hull et al. 1976) sowie die humane fötale Zelllinie IHKE (Tveito et al. 1989).
Zelllinie NRK-52E
Die Rattenzelllinie NRK-52E (DSMZ Nr. ACC 199) stammt aus proximalen Tubuluszellen einer männlichen Osbourne-Mendel Ratte (De Larco und Todaro 1978). Eine Untersuchung der Markerenzym-Aktivität ergab, dass NRK-52E-Zellen im Vergleich zu frisch isolierten proximalen Tubuluszellen eine relativ geringe Aktivität der Gamma-Glutamyltransferase (GGT) und der Alkalinen Phosphatase (AP) aufweisen (Lash et al. 2002). Es ist naheliegend, dass der Verlust der Enzymaktivität auf die fehlende Bürstensaummembran zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu wurde eine zu frisch isolierten Zellen vergleichbare Aktivität der Glutathion S-Transferase (GST), der Gamma-Glutamylcystein Synthetase (GCS), der Glutathion Peroxidase (GPX) und der Glutathion Disulfid Reduktase (GRD) festgestellt (Lash et al. 2002).
Eine Untersuchung der ABC-Transporter in NRK-52E-Zellen zeigte die mRNA-Expression des P-Glykoproteins (P-gp, Mdr1, Abcb1) sowie der Transporter Abcc1 (Mrp1), Abcc3 (Mrp3), Abcc4 (Mrp4) und Abcc5 (Mrp5). Die Transporter Abcc2 und Abcc6 (Mrp6) konnten nicht nachgewiesen werden (Van de Water et al. 2007). Zusätzlich konnte die Proteinexpression der Transporter P- gp und Abcc4 sowie die Aktivität von P-gp gezeigt werden. Hierbei war allerdings eine von der Kultivierungsdauer abhängige Reduktion der Proteinexpression und der Aktivität zu beobachten (Van de Water et al. 2007). Im Gegensatz zum Nachweis verschiedener ABC-Transporter durch Van de Water und Kollegen konnten Lash und Kollegen die mRNA-Expression der Organische Anionen-Transporter Oat1 (Slc22a6), Oat3 (Slc22a8), Oatp1a1 (Slc1a1) und Oatp1a3 (Slco1a3), der ABC-Transporter Abcc2 (Mrp2) und Abcc5 (Mrp5) sowie des Natrium-Dicarboxylat 2 Carrier NaC2 (Slc13a3) nicht feststellen (Lash et al. 2007).
Zelllinie LLC-PK1
Die 1958 aus dem Nierenkortex eines männlichen, juvenilen Hampshire-Schweins isolierte epitheliale Zelllinie LLC-PK1 (ECACC Nr. 86121112) ist ein gut charakterisiertes und häufig verwendetes Zellkulturmodell (Hull et al. 1976). Die Schweinezelllinie weist viele Zellcharaktereigenschaften proximaler Tubuluszellen auf. So besitzt die konfluente Zellkultur eine hohe Aktivität der in der apikalen Bürstensaummembran lokalisierten Enzyme AP und GGT (Rabito et al. 1984; Gstraunthaler et al. 1985). Im Gegensatz dazu ist jedoch die Aktivität beider Markerenzyme des proximalen Tubulus in exponentiell wachsenden LLC-PK1-Zellen gering (Rabito et al. 1984). Weiterhin verfügen die Zellen über einen Natrium-abhängigen apikalen Glukose-, Aminosäuren- und Phosphat-Transport (Rabito und Ausiello 1980; Rabito 1983;
Rabito und Karish 1983; Rabito et al. 1984). Auch hierbei wurden Unterschiede in der Transportleistung zwischen konfluenter und proliferierender Kultur gezeigt: die Zellen der konfluenten Kultur haben einen im Vergleich erhöhten Glukosetransport sowie einen reduzierten Aminosäuren- und Phosphattransport (Mullin et al. 1980; Sepulveda et al. 1982; Scheinman 1988). Auch der transzelluläre Transport des organischen Kations Tetraethylammonium (TEA) konnte in LLC-PK1-Zellen nachgewiesen werden (Fauth et al. 1988; Saito et al. 1992), nicht jedoch der Transport des organischen Anions p-Aminohippurat (Fauth et al. 1988; Hori et al.
1993). Als Folge der Transportaktivität, der Zelladhäsion und der Zellkontakte (Tight Junctions) bildet der LLC-PK1-Monolayer sogenannte Domes, die aus dem transepithelialen Transport von Flüssigkeit resultieren (Hull et al. 1976).
Eine Untersuchung der Aktivität verschiedener Phase I-spezifischer Enzyme zeigte jedoch, dass die Zelllinie LLC-PK1 über eine im Vergleich zum Rattennieren-Homogenat geringe Aktivität ausgewählter biotransformierender Enzyme zu verfügen scheint (Gonzalez und Tarloff 2004). So wurde gezeigt, dass die Aktivität der Cytochrom P450-Enzyme (Cyp) Cyp1a1, Cyp1a2 und Cyp2e1, der Flavin Monooxygenase (FMO), der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der Prostaglandin H Synthase (Cox-1) im Vergleich reduziert ist (Gonzalez und Tarloff 2004). Eine Untersuchung der Expression des Phase II-spezifischen Enzyms Glutathion S-Transferase ergab weiterhin, dass im Gegensatz zum Schweinenierenkortex-Gewebematerial in der Zelllinie LLC-PK1 nur die Isoenzyme Gstm und Gstp, nicht jedoch das Isoenzym Gsta vorhanden zu sein scheinen (Bohets et al. 1996).
Zelllinie IHKE
Die humane fötale Zelllinie IHKE stammt aus einer primären epithelialen Nierenzellkultur und wurde mittels Nickel(II)-Behandlung generiert (Tveito et al. 1989). Die Zelllinie weist chromosomale Aberrationen, sowie veränderte Genstrukturen und eine erhöhte Expression von p53 auf (Maehle et al. 1992).
1.4 Nierentoxizität und Nierenkanzerogenität der Substanzen AA, OTA und Cycasin
1.4.1 Existieren spezies-spezifische Toxizitätsunterschiede?
Aristolochia Säure (AA), Ochratoxin A (OTA) und Cycasin sind toxische und kanzerogene Naturstoffe (Laqueur und Spatz 1968; Arlt et al. 2002; O'Brien und Dietrich 2005). Die Nierentoxizität und Nierenkanzerogenität wurden für AA und OTA in Nagetieren nachgewiesen (Mengs et al. 1982; Bendele et al. 1985; Boorman et al. 1992). Auch für Cycasin, beziehungsweise für Methylazoxymethanol (MAM), welches das Aglykon und damit der toxische Metabolit von Cycasin ist (Kobayashi und Matsumoto 1965), wurde eine nierenkanzerogene Wirkung in Nagetieren beobachtet (Hirono et al. 1968; Hirono et al. 1971).
Es wurde gezeigt, dass Menschen gegenüber den Substanzen AA und OTA exponiert wurden (Radic et al. 1997; Peraica et al. 1999; Nortier und Vanherweghem 2002). Auch eine humane Exposition gegenüber dem Pflanzenextrakt Cycasin kann als Folge der Nutzung der Cycad- Pflanzen für die Nahrungsmittelherstellung vermutet werden (Morgan und Hoffmann 1983). Trotz der beschriebenen Exposition des Menschen gegenüber diesen Toxinen und trotz der beobachteten Toxizität und Kanzerogenität in Nagetieren, ergaben sich bisher nur für AA eindeutige Hinweise auf nierentoxische und -kanzerogene Effekte im Menschen (Nortier et al.
2000; Nortier und Vanherweghem 2002). Im Unterschied zu Nagetieren, in denen der Nierenkortex nicht nur von der akuten, sondern auch von der tumorigenen und kanzerogenen Wirkung des Toxins betroffen ist (Mengs et al. 1982; Mengs 1988), scheint AA im Menschen, trotz nachgewiesener AA-DNA-Addukte im Nierenkortex, ausschließlich zu urothelialen Karzinomen zu führen (Nortier et al. 2000). Insbesondere im Hinblick auf eine humane Risikoabschätzung ist es notwendig, mögliche spezies-spezifische Unterschiede zu identifizieren und die spezifische Toxizität und die Wirkungsmechanismen im Menschen aufzuklären.
1.4.2 Toxizität und Kanzerogenität der Aristolochia Säure
Toxinderivate AA I und AA II
Aristolochia Säuren sind toxische (Mengs 1987;
Balachandran 2005) und kanzerogene (Mengs U. 1982; Mengs 1988) Naturstoffe, die in verschiedenen Spezies der Gattungen Aristolochia und Asarum (Aristolochiaceae) nachgewiesen wurden (Schaneberg et al. 2002;
Jong et al. 2003). Zu den im Pflanzenextrakt Abbildung 2: Strukturformel der Aristolochia Säure I (A) und der Aristolochia Säure II (B) (Schmeiser et al. 1984)
enthaltenen Nitrophenanthrencarbonsäure-Derivaten zählen die in Abbildung 2 dargestellten Hauptderivate Aristolochia Säure I (AA I) und Aristolochia Säure II (AA II) (Pailer M 1955; Pailer M 1966), die sich durch eine Methoxygruppe unterscheiden. Diese scheint für die unterschiedliche Toxizität und Mutagenität der Derivate ausschlaggebend zu sein. So wurde das Derivat AA I nach einer 24-stündigen Exposition der Zelllinie LLC-PK1 als das zytotoxischere Derivat identifiziert (Zytotoxizität ermittelt via Neutralrot-Assay; IC50-Werte: 10µM (AA I) und 80µM (AA II)) (Balachandran 2005). Zudem scheint auch das durch AA I induzierte DNA- Adduktlevel im Vergleich zu AA II höher zu sein (Pfau et al. 1990). Im Gegensatz dazu wurden im Mutations-Assay nur geringe Unterschiede zwischen den beiden Derivate nachgewiesen (Schmeiser et al. 1984), beziehungsweise AA II als das aktivere Derivat identifiziert (Gotzl und Schimmer 1993).
Nephrotoxizität und Kanzerogenität von AA im Nagetier und im Menschen
Das nephrotoxische und kanzerogene Potential von AA I und AA II wurde zunächst in Nagern nachgewiesen (Mengs U. 1982; Mengs 1988; Mengs und Stotzem 1993). So führte eine akute AA-Applikation (einmalige Gabe; 77% AA I, 21% AA II) in der Ratte und in der Maus zu einer akuten tubulären Nekrose im Nierenkortex (Mengs 1987). Bereits wenige Tage nach Beginn einer subchronischen Behandlung (35 Tage; 10mg/kg/KG, subkutane Injektion) führte AA (40%
AA I und 60% AA II) in der Ratte zusätzlich zum Verlust der Bürstensaummembran proximaler Tubuluszellen (Lebeau et al. 2005), zu interstitieller Fibrose im renalen Kortex und in der Medulla, sowie zu urothelialer Dysplasie (Debelle et al. 2002; Debelle et al. 2004). Nach chronischer oraler AA-Applikation (3-12 Monate) entwickelten sich in der Ratte Karzinome im Vormagen und zu einem geringeren Anteil Karzinome in der Blase und in der Niere (Mengs U.
1982). In Mäusen induzierte AA Karzinome des Vormagens, des Magens, der Lunge, sowie Adenome der Niere, maligne Lymphome und Hämangiome des Uterus (Mengs 1988).
Erste Hinweise auf das nierentoxische Potential von AA im Menschen ergaben sich im Jahr 1991, als mehrere Frauen im Anschluss an eine, in einer belgischen Klinik durchgeführten Schlankheitskur eine progressive interstitielle renale Fibrose entwickelten (Vanherweghem et al.
1993). Nachdem die Nephropathie, die in erster Linie durch eine interstitielle Fibrose im äußeren Nierenkortex und Atrophie der proximalen Tubuli gekennzeichnet ist (Depierreux et al. 1994), der vorangegangenen chronischen Aufnahme von AA durch chinesische Tee-Produkte zugeordnet werden konnte, wurde sie als sogenannte Chinese Herb Nephropathy (CHN) bezeichnet (Vanhaelen et al. 1994). Die Entstehung von Karzinomen des Urotheliums infolge der AA- Exposition verdeutlichte schließlich auch das kanzerogene Potential von AA im Menschen (Cosyns et al. 1994; Vanherweghem et al. 1995; Nortier et al. 2000; Nortier und Vanherweghem 2002). Obwohl die Entstehung der Urothelialkarzinome weitestgehend als Spätfolge der CHN betrachtet wird, wird auch ein von der Nephrotoxizität unabhängiger Verlauf der AA-induzierten Kanzerogenese diskutiert (Nortier et al. 2003; Nortier und Vanherweghem 2007). Es ist an dieser Stelle anzumerken, dass trotz der Kanzerogenität von AA in beiden Spezies, die Zielorgane in
Ratte und Mensch zum Teil verschieden zu sein scheinen. So scheint AA im Menschen, im Gegensatz zur Ratte, keine Tumore im Nierenkortex zu induzieren.
Nachdem die durch AA-induzierte CHN auch in Patienten außerhalb der in Belgien betroffenen Kohorte beschrieben werden konnte (Lord et al. 1999; Arlt et al. 2002), wurde die Bezeichnung Aristolochic Acid Nephropathy (AAN) eingeführt (Gillerot et al. 2001; Cosyns 2003). Zusätzlich zur sogenannten Aristolochic Acid Nephropathy scheint die Aristolochia Säure auch in der erstmals 1956 beschriebenen Endemischen Balkan Nephropathie (BEN) eine kausale Rolle zu spielen (Arlt et al. 2007; Slade et al. 2009). Unterstützt wird diese Hypothese unter anderem durch das sich gleichende Krankheitsbild beider Nephropathien (Cosyns et al. 1994). Zusätzlich lassen AA-DNA-Addukte in Gewebematerialien von BEN-Patienten und Personen, die in endemischen BEN-Gebieten leben, einen Einfluss von AA in der Endemischen Balkan Nephropathie vermuten (Arlt et al. 2002; Grollman et al. 2007). Als möglicher kontaminierender Faktor wird die in BEN-Gebieten vorkommende Aristolochia clematitis angesehen, deren AA- Gehalt nachgewiesen wurde (Hranjec et al. 2005).
Genotoxizität und Mutagenität der Aristolochia Säure
Die Aristolochia Säuren AA I und AA II sind genotoxisch wirksame Verbindungen, die sich nach metabolischer Aktivierung an die DNA binden können (Schmeiser et al. 1988). Während in der Mehrzahl der Studien ausschließlich Purin-Addukte nachgewiesen wurden (Stiborova et al.
2001; Stiborova et al. 2002; Stiborova et al. 2003), wurden vereinzelt auch Pyrimidin-Addukte (dC-AA I, dC-AA II) in vitro gefunden (Arlt et al. 2000; Chan et al. 2007).
Für die metabolische Aktivierung von AA I und AA II wurde die Nitroreduktion als die entscheidende toxifizierende Reaktion und das zyklische Nitreniumion als DNA-reaktives Metabolit vorgeschlagen (Schmeiser et al. 1988; Pfau et al. 1990; Pfau et al. 1991). Tatsächlich konnte die Bildung von DNA-Addukten via Nitroreduktion durch die zytosolischen Enzyme NAD(P)H:Quinon Oxidoreduktase (Nqo1) und zu geringerem Anteil Xanthin Oxidase sowie durch die mikrosomalen Enzyme NADPH:Cytochrom P450 Reduktase, Cyp1A und Cyp1A2 gezeigt werden (Stiborova et al. 2001; Stiborova et al. 2003; Stiborova et al. 2005; Stiborova et al. 2005). Hierbei entsprach das in vitro durch AA I induzierte DNA-Adduktmuster dem in vivo (Ratte) identifizierten. Die Aktivierung von AA I und AA II konnte darüber hinaus auch durch Peroxidasen (Prostaglandin H-Synthase) katalysiert werden (Schmeiser et al. 1997; Stiborova et al. 2001) und die AA-Mutagenität durch die der Phase II zugehörigen Biotransformationsenzyme Sulfotransferasen Sult1a1 und Sult1b1 erhöht werden (Meinl et al. 2006).
Die Mutagenität von AA I und AA II wurde in den Salmonella typhimurium-Stämmen TA1537 und TA100 nachgewiesen. Die zusätzliche Behandlung von AA mit metabolisierenden Enzymen (S9- Fraktion) führte zu einer leicht verminderten Mutagenität. Im Gegensatz zum mutagenen Potential, das AA in den Stämmen TA1537 und TA100 zeigte, war die Mutagenität des Toxins im Nitroreduktase-defizienten Stamm TA100 NR gering (Schmeiser et al. 1984).
Molekulare Wirkungsmechanismen der Aristolochia Säure in der Ratte
Bei den durch AA I und AA II erzeugten DNA-Addukten (bulky adducts), die im Ratten-Vormagen (Zielorgan) mittels 32P-Postlabeling-Analyse identifiziert wurden, handelt es sich ausschließlich um die Purin-Addukte 7-(deoxyadenosin-N6-yl)aristolactam I (dA-AA I), 7-(deoxyguanosin-N2- yl)aristolactam I (dG-AA I), sowie 7-(deoxyadenosin-N6-yl)aristolactam II (dA-AA II) und 7- (deoxyguanosin-N2-yl)-aristolactam II (dG-AA II) (Stiborova et al. 1994). Das durch AA I induzierte DNA-Adduktlevel in vivo erwies sich hierbei im Vergleich zu dem durch AA II induzierten als höher. Die Ergebnisse verdeutlichen außerdem, dass sich AA, ungeachtet des Derivats, bevorzugt an Adenin bindet. Die mögliche Bedeutung der Addukte dA-AA I und dA- AA II für den Prozess der Kanzerogenese wird durch die Langlebigkeit von dA-AA I sowie durch die mutagene Eigenschaft der Adenin-Addukte hervorgehoben (Schmeiser et al. 1990; Fernando et al. 1993; Broschard et al. 1994). Wie Broschard und Kollegen zeigen konnten, führen Adenin- Addukte, im Gegensatz zu Guanin-Addukten, zu einem komplementären Einbau von dAMP, mit der Folge einer A:T→T:A Transversions-Mutation (Broschard et al. 1994). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wurde eine A:T→T:A Transversions-Mutation im h-ras-Gen in Zusammenhang mit einer Genaktivierung dieses Gens in kanzerösem Ratten-Gewebematerial identifiziert (Schmeiser et al. 1990).
Zusätzlich zur Identifikation in Zielorganen (Niere, Vormagen) wurden auch AA-DNA-Addukte in Nicht-Zielorganen (Magen, Leber) nachgewiesen. Dabei ergab sich das gleich Adduktmuster (Schmeiser et al. 1988; Pfau et al. 1990). Auch AA-induzierte Mutationen wurden im Big-Blue Rattenmodell sowohl in der Niere (Zielorgan) als auch in der Leber (Nicht-Zielorgan) gefunden und ein Zusammenhang zwischen den AA-induzierten DNA-Addukten und Mutationen postuliert (Mei et al. 2006; Arlt et al. 2007). Während die ermittelte Anzahl der DNA-Addukte und die Mutationsfrequenz im Zielorgan (Niere) im Vergleich zum Nicht-Zielorgan höher lag, konnte eine konzentrationsabhängige Zunahme der Addukt- und Mutationsfrequenz für beide Organe gezeigt werden. Auch die Mutationsspektren waren vergleichbar. Bei der häufigsten Mutation, die sowohl in der Niere als auch in der Leber identifiziert werden konnte, handelt es sich um eine A:T→T:A Transversions-Mutation (Mei et al. 2006). Trotz der nachgewiesen Genotoxizität und Mutagenität von AA in beiden Organen, ist die AA-induzierte Genexpressionsantwort in Niere und Leber organspezifisch (Chen et al. 2006). Aufgrund der Ergebnisse, die DNA-Addukte und Mutationen sowohl in Zielorganen als auch in Nicht-Zielorganen zeigen, postuliert Mei, dass zusätzliche Faktoren, wie eine spezifische Beeinträchtigung physiologischer Prozesse, für die Tumorbildung verantwortlich sind (Mei et al. 2006).
Eine spezifische Beeinträchtigung physiologischer Prozesse in proximalen Nierentubuluszellen des S3-Segments konnten Pozdzik und Kollegen in Wister-Ratten nachweisen (Pozdzik et al.
2008; Pozdzik et al. 2008). Infolge täglicher AA-Applikation (10mg AA/kg KG; subkutane Injektion) waren bereits wenige Tage nach Beginn der Studie nekrotische proximale Tubuluszellen und interstitielle Entzündungsreaktionen zu beobachten. Tubuläre Atrophie, die mit reduzierter Zellregeneration (Proliferation und Differenzierung) und mit Apoptose in
Verbindung gebracht wurde, und interstitielle Fibrose wurden nach subchronischer AA- Applikation (7-35 Tage) nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, in Übereinstimmung mit vorangegangenen Studien (Debelle et al. 2002; Debelle et al. 2004), dass die Folgen einer AA- Exposition in der Ratte mit dem Krankheitsbild der humanen AAN, zu dem tubuläre Atrophie und interstitielle Fibrose zählen (Nortier und Vanherweghem 2002), vergleichbar sind.
Molekulare Wirkungsmechanismen der Aristolochia Säure im Menschen
Untersuchungen der AA-Wirkungsmechanismen in der Ratte und im Menschen zeigen ähnliche genotoxische und mutagene Effekte des Toxins. Wie in Rattengewebe wurden auch in humanem Gewebematerial, das von AAN-Patienten stammte, bisher ausschließlich Purin- Addukte nachgewiesen (Schmeiser et al. 1996; Bieler et al. 1997; Mei et al. 2006). Hierbei trat das DNA-Addukt 7-(deoxyadenosin-N6-yl)aristolactam I (dA-AA I) am häufigsten auf (Schmeiser et al. 1996; Nortier et al. 2000). Zu einem geringerem Anteil waren auch 7-(deoxyguanosin-N2- yl)aristolactam I (dG-AA I) und 7-(deoxyadenosin-N6-yl)aristolactam II (dA-AA II) mittels dem 32P- Postlabeling Assay nachweisbar (Bieler et al. 1997; Nortier et al. 2000). Die Identifikation von dA-AA I im Gewebematerial verschiedener AAN-Patienten mehrere Jahre nach Einnahme der AA-kontaminierten Tee-Präparate verdeutlicht die Langlebigkeit dieses Addukts in humanem Gewebe (Schmeiser et al. 1996; Nortier et al. 2000; Lord et al. 2004).
Ähnlich wie in der Ratte, beschränkt sich der Nachweis von DNA-Addukten in Organmaterial von AAN-Patienten nicht auf die Zielorgane (Niere, Urether). AA-induzierte Addukte wurden in Organen nachgewiesen, die nicht mit dem kanzerogenen Potential von AA in Verbindung gebracht werden (Arlt et al. 2004; Lord et al. 2004). Darüber hinaus konnten keine Unterschiede im DNA-Adduktlevel zwischen Nierengeweben festgestellt werden, in denen sich ein Urothelialkarzinom entwickelt hatte und in denen keine Karzinomentwicklung festzustellen war (Nortier und Vanherweghem 2007).
Eine Untersuchung von atypischen Urothelialzellen und Tumorzellen von AAN-Patienten ergab eine Proteinüberexpression des Transkriptionsfaktors TP53 (Cosyns et al. 1999). Zusätzlich wurde eine A:T→T:A Transversions-Mutation im TP53-Gen in urothelialem Tumorgewebe einer AAN-Patientin nachgewiesen (Lord et al. 2004). Der Transkriptionsfaktor TP53, der nach Schädigung der DNA einen Zellzyklusstop und DNA-Reparatur, sowie Apoptose induzieren kann, spielt für den Erhalt der genomischen Integrität eine wesentliche Rolle. Die Schlüsselfunktion des Proteins wird auch durch die Tatsache deutlich, dass mehr als 50% der humanen Krebserkrankungen eine TP53-Mutation beinhaltet (Efferth 2006; Helton und Chen 2007). Daher wird ein Zusammenhang zwischen den Urothelialkarzinomen von AAN-Patienten und den beobachteten AA-induzierten TP53-Mutationen vermutet (Cosyns et al. 1999; Arlt et al.
2001; Simoes et al. 2008; Nedelko et al. 2009).
