Aus der Klinik für Pädiatrische Nieren-, Leber- und Stoffwechselerkrankungen
der Medizinischen Hochschule Hannover
Effekte von FGF-23 auf die Endothelfunktion:
in vitro Untersuchung an Zellen der Koronararterien
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
Vorgelegt von Jacqueline Haller aus Bremen
Hannover 2014
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 04.10.2017.
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Dieter Haffner 1. Referent: Prof. Dr. med. Jan Menne 2. Referent: Prof. Dr. med. Daniel Sedding Tag der mündlichen Prüfung: 04.10.2017
Prüfungsausschussmitglieder
Vorsitz: Prof. Dr. med. Tobias Welte 1. Prüfer: Prof. Dr. med. Carlos Guzman 2. Prüfer: PD Dr. med. Frank Gossé
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ... 1
1.1 Fibroblast growth factor 23 ... 3
1.2 Klotho ... 6
1.3 Das Endothel als Gefäßbestandteil und seine Funktion ... 8
1.4 Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und oxidativer Stress ... 9
1.5 Welche Rolle spielen Klotho und FGF-23 bei der CKD? ... 10
1.6 Aufbau und Ziel der Promotionsarbeit ... 12
2 MATERIAL UND METHODEN... 13
2.1 Chemikalien und Reagenzien ... 13
2.2 Verbrauchsmaterialien - allgemeiner Laborbedarf ... 14
2.3 Geräte ... 15
2.4 Zellkultur ... 16
2.4.1 Subkultivieren ... 16
2.4.2 Auftauen von Zellen ... 17
2.4.3 Kryokonservierung ... 17
2.5 Proteinisolation ... 18
2.6 Quantifizierung der Proteinkonzentration mittels BCA-Methode ... 19
2.7 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophore (SDS-Page) ... 20
2.8 Western Blot ... 22
2.8.1 Datenauswertung – Western Blot ... 26
2.9 Immunpräzipitation (IP) ... 27
2.10 RNA- Gewinnung ... 28
2.10.1 RNA-Protektion ... 28
2.10.2 RNA-Extrakion ... 28
2.11 RNA-Konzentrationsbestimmung ... 29
2.12 cDNA-Synthese (copy-DNA) ... 29
2.13 Quantitative real-time PCR (qPCR) ... 31
2.13.1 Datenauswertung – qPCR ... 32
2.14 Stimulationsversuche ... 33
2.14.1 Kurzzeitstimulation ... 33
2.14.2 Langzeitstimulation ... 33
2.15 Kolorimetrische Quantifizierung von Stickstoffmonoxid ... 34
2.15.1 Etablierungsprozess ... 34
2.15.2 Modifizierter Griess-Assay ... 36
2.15.3 Methode zur NO-Bestimmung nach Oxford Biochemical Research ... 37
2.16 ROS-Färbung ... 39
2.16.1 Datenauswertung – ROS-Färbung ... 40
2.17 Durchflusszytometrie ... 41
2.17.1 Datenauswertung – Durchflusszytometrie ... 42
2.18 Statistische Analyse ... 42
3 ERGEBNISSE ... 43
3.1 Expressionsprofil der HCAECs und HCASMCs ... 43
3.2 FGF-23 vermittelte Tyrosinphosphorylierung des FGF-Rezeptor 1 ... 45
3.3 FGF-23 beeinflusst nicht die Proteinlevel von FGFR1 und mKlotho ... 46
3.4 FGF-23 erhöht den sKlotho-Gehalt im Medium von HCAECs ... 48
3.5 Die Freisetzung von Stickstoffmonoxid wird bei HCAECs durch FGF-23 gefördert ... 51
3.6 FGF-23 reguliert die eNOS-Aktivität in HCAECs ... 53
3.7 FGF-23 steigert nicht die ROS-Produktion in HCAECs ... 56
3.8 FGF-23 stimuliert Klotho-abhängig die NO-Freisetzung bei HCAECs ... 59
4 DISKUSSION ... 60
4.1 HCAECs sind über FGFR1 ein potentielles Zielgewebe für FGF-23 ... 60
4.1.1 Expression von FGF-23 und FGF-2 ... 60
4.1.2 Expression der FGF-Rezeptoren... 60
4.1.3 Expression von Klotho ... 61
4.1.4 FGF-23 führt zur phosphorylierungsabhängigen Aktivierung des FGFR1 in HCAECs ... 62
4.2 FGF-23 stimuliert die Sekretion von sKlotho in HCAECs ... 62
4.3 FGF-23 stimuliert Klotho-abhängig die NO-Sekretion in HCAECs ... 62
4.3.1 Anstieg der NO-Sekretion unter FGF-23-Stimulation ... 62
4.3.2 eNOS-Aktivierung durch FGF-23 ... 63
4.3.3 FGF-23 reguliert die NO-Sekretion Klotho-abhängig ... 63
4.4 FGF-23 führt nicht zu oxidativen Stress in HCAECs ... 64
4.5 Klinische Relevanz von FGF-23 bei CKD ... 64
4.6 FGF-23 zeigt spezies- und organspezifische Effekte ... 65
5 ZUSAMMENFASSUNG ... 67
6 SCHRIFTVERZEICHNIS ... 69
7 LEBENSLAUF ... 78
8 ERKLÄRUNG NACH §2 ABS. 2 NR. 6 UND 7 PROMO ... 80
9 DANKSAGUNG ... 81
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1 EINLEITUNG
Die chronische Nierenerkrankung (englisch „chronic kidney disease“, CKD) ist eine komplizierte und progrediente Erkrankung, die unbehandelt zum terminalen Nierenversagen und auch zum Tod führt. Seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts ist die Medizin weit genug fortgeschritten, um betroffenen Erkrankten eine lebenserhaltende Behandlung in Form eines Nierenersatzverfahrens (Dialyse, Transplantation) bieten zu können, welche jedoch im Fall der Dialyse mit einer starken Reduzierung der Lebensqualität einhergeht.
Nach Angaben des Kuratoriums für Dialyse und Nierentransplantation e.V. erreichen jährlich 150 Kinder in Deutschland eine stark verminderte Nierenfunktion, die mit einem Nierenersatzverfahren wie der Dialyse behandelt werden muss. Gut zwei Drittel dieser Patienten werden bereits mit einer Nierenerkrankung geboren. Die Prävalenz der Kinder und Jugendliche, die zurzeit regelmäßig zur Dialysebehandlung gehen, liegt bei circa 250 Patienten. Nur rund 110 Kinder in Deutschland erhalten jährlich eine Spenderniere. In etwa der Hälfte der Fälle findet die Bauchfell-Dialyse (Peritonealdialyse) Anwendung, welche es den Kindern ermöglicht, im Vergleich zur Hämodialyse (künstliche Blutreinigung über einen externen Blutkreislauf), nicht drei Mal wöchentlich mehrere Stunden im Dialysezentrum verbringen zu müssen. Diese Form der Dialyse wird dem Spiel- und Bewegungsdrang der Kinder somit eher gerecht. Die Prozedur, bei der die Bauchhöhle als semipermeable Membran zur Entgiftung dient, muss allerdings täglich erfolgen und bringt auch ihre Komplikationen (v.a. Infektionen) mit sich.
Neben der Progression des Nierenversagens und der damit einhergehenden steigenden Mortalität, leiden die Patienten stark unter weiteren Begleiterkrankungen wie Blutarmut (renale Anämie), Knochenstoffwechselstörungen sowie Entgleisungen des Elektrolyt- und Säure- Basen-Haushalts. Dies bedeutet für die Patienten eine verminderte Lebensqualität durch Leistungsminderung. Hinzu kommen Wachstumsdefizite sowie eine erhöhte Frakturneigung. Zusätzlich besteht bereits in jungen Jahren die Belastung durch Risikofaktoren wie Bluthochdruck. Eine übersichtliche Zusammenstellung dieser Risikofaktoren in Abhängigkeit der CKD, under Dialyse und nach Transplanation ist in Tablette 1.1 dargestellt.
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Insgesamt ergeben sich daraus auch Risiken für lebensbedrohliche Komplikationen, zum Beispiel der Gefahr von schweren Herzrhythmusstörungen und thromboembolischen Geschehnissen. Gefolgt von Infektionen macht das erhöhte kardiovaskuläre Risiko bei nierenkranken Kindern die häufigste Todesursache aus. Internationale Studien zeigen, dass 40-50% der Todesfälle kardio- oder cerebrovaskulären Ursprungs sind (1). Es ist zudem bekannt, dass eine unabhängige graduierte Assoziation zwischen einer reduzierten glomerulären Filtrationsrate (GFR) und der Mortalität, dem Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse und der Krankenhauseinweisungen besteht (2,3). Abb. 1.1 hebt die Relevanz kardial bedingter Tode bei nierenkranken Kindern deutlich hervor.
Analysiert man eine Blutprobe von Kindern oder Erwachsenen mit CKD, ist auffällig, dass der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 23 (englisch „fibroblast growth factor 23“, FGF-23) im Serum bis zu 1000-fach höher ist als bei gesunden Vergleichspersonen (4,5).
Welche Rolle spielt der enorme Anstieg von FGF-23 in der Pathogenese der Nierenerkrankung und der Komorbidität der Patienten? Eine dermaßen exzessive Erhöhung der FGF-23-Serumkonzentration lässt auf eine essentielle Rolle im Krankheitsgeschehen vermuten. Nur dann, wenn die chronische Nierenerkrankung und ihre komplexe und vielfältige Auswirkung auf den Körper in Zukunft besser verstanden wird, kann die Therapie betroffener Kinder und Erwachsener optimiert und ihnen ein besseres Leben mit ihrer Erkrankung ermöglicht werden. Die Untersuchung der Veränderungen der FGF-23- Serumspiegel und deren Folgen insbesondere auf das Herz-/Kreislaufsystem scheinen daher wichtig und sinnvoll zu sein. Darüber hinaus ist über die physiologischen Wirkungen von FGF- 23 auf die Endothelfunktion nur wenig bekannt. So könnte FGF-23 sowohl schädliche als auch protektive Einflüsse auf das Herz-/Kreislaufsystem haben.
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1.1 Fibroblast growth factor 23
FGF-23 ist eines der 22 Mitglieder der FGF- Familie (6,7). Sie alle besitzen eine homologe Kernregion mit circa 120 Aminosäuren. N- und C-Terminus sind variabel und kennzeichnen die einzelnen Mitglieder (7,8). So lassen sich diese zusätzlich in sieben Subtypen gruppieren, wobei FGF-23 zusammen mit FGF-19 und FGF-21 der FGF-19-Subfamilie angehört (6,9,10). Eine FGF- Proteinstruktur sowie die Subtypen der FGF-23- Familie sind in Abb. 1.2 dargestellt. Um ihre biologische Funktion auszuüben, interagieren die FGFs über vier FGF-Rezeptoren (FGFR 1-4), welche Immunglobulin-ähnliche Transmembranproteine sind und zur Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen gehören (11). Der FGFR1 besitzt beispielsweise sieben Tyrosinkinasen: Tyr463, 583, 653. 654, 730 und 766 (12). Die FGFs spielen bereits während der Embryogenese eine wichtige Rolle und haben physiologische Funktionen im Bereich der Angiogenese, Mitogenese, Zelldifferenzierung, metabolischen Regulation und Wundheilung (13).
FGF-23 ist ein 32 kDa schweres, 251 Aminosäuren langes Glykoprotein (8). FGF-23 wird vor allem im Knochen von Osteozyten und Osteblasten produziert (14). Aber auch von Perizyten-ähnlichen Zellen, welche den Sinus venosus im Knochenmark ummanteln, vom
Nucleus ventralis lateralis des Thalamus, vom Thymus und von Lymphknoten wird FGF-23 produziert (15). Stimuliert durch veränderte Calcium- und Phosphatbedingungen bei verminderter Nierenfunktion, wie sie im Rahmen von Erkrankungen der Niere, aber auch physiologisch mit dem Alter auftritt, wird FGF-23 vermehrt generiert. Dies ist ebenso bei ernährungsbedingtem Überangebot von Phosphat der Fall. Die hydrophobe 24-Aminosäuren lange Signalsequenz von FGF-23 wird abgespalten und das Protein durch die Glykosyltransferase GALNT3 O-glykosyliert, um die reife, biologisch aktive FGF-23-Form zu generieren. Diese hat eine Halbwertszeit von ungefähr 50 Minuten (16).
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Als einen der ersten Hinweise auf die Funktion von FGF-23 ist ein Fall aus dem Jahr 1957 nach Prader bekannt, welcher beschreibt, dass bei einem 11 ½-jährigen Mädchen eine neu aufgetretene Hypophosphatämie (Phosphatmangel), eine gesteigerte renale Phosphatausscheidung und Rachitis auffällig waren. Diesen Phänotyp nannte Prader
„Phosphatdiabetes“. Er vermutete einen vom Tumor sekretierten zirkulierenden Faktor mit
„rachinogenen“ Eigenschaften, nachdem er beobachtete, dass die Symptome nach chirurgischer Entfernung eines diagnostizierten Knochentumors der Rippe verschwanden (17). Das beobachtete Krankheitsbild ist heute als FGF-23 mediierte tumor-induzierte Osteomalazie (TIO) bekannt.
Den Hauptwirkort von FGF-23 stellt die Niere dar. Dort führt FGF-23 über eine Hemmung der Natrium-abhängigen Phosphat-Transporter NaPi2a und NaPi2c zu einer gesteigerten Phosphatausscheidung. Durch die reduzierte Aktivierung der Transporter wird also weniger Phosphat im proximalen Tubulus der Niere zurückresorbiert und dadurch mit dem Urin ausgeschieden (18-20). FGF-23 spielt eine große Rolle im Knochenstoffwechsel, da es neben der phosphaturetischen Funktion auch eine Interaktion im Vitamin-D3-Stoffwechsel ausübt.
Durch die Hemmung der 1α-Hydroxylase (CYP27B1) wird der Umbau von 25-OH-D3 (Calcidiol) in biologisch aktives 1,25-(OH)2-D3 (Calcitriol) in den proximalen Tubuli der Niere reduziert.
Sinkt die Kalziumkonzentration im Serum (Hypokalzämie), antwortet die Nebenschilddrüse mit der Ausschüttung des Parathormons (PTH). Dabei wird die Freisetzung von Kalzium durch Osteoklasten gesteigert, um Kalzium im Blut wieder „parat zu stellen“. Gleichzeitig mit Kalzium wird aber auch Phosphat freigesetzt. Zudem steigert PTH die renale Reabsorption von Kalzium und damit dessen Verfügbarkeit im Extrazellularraum. Das freigesetzte Phosphat wird dagegen nicht vermehrt resorbiert, sondern geht über den Urin verloren. PTH stimuliert zusätzlich die Produktion von aktivem Vitamin-D.
Unter Einfluss von UV-Strahlung können Hautzellen Vitamin-D3 aus 7-Dehydrocholesterin synthetisieren. Vitamin D ist in seiner Form biologisch inaktiv und muss im ersten Schritt durch hepatische Cytochrom-P450-Enzyme an Position 25 zu 25-OH-D3 hydroxyliert werden.
Anschließend erfolgt die Hydroxylierung an Position 1 zu biologisch vollständig aktivem 1,25- (OH)2-D3 in den proximalen Tubuli der Niere. Das aktive Vitamin-D stimuliert die intestinale transzelluläre Kalzium-Resorption. Gleichzeitig wird auch die Phosphat-Wiederaufnahme gefördert. FGF-23 ermöglicht in diesem System durch seine phosphaturetische Funktion die Bereitstellung von Kalzium und verhindert gleichzeitig die Akkumulation von Phosphat (21).
Eine Überproduktion von FGF-23 resultiert in einer Hypophosphatämie und Rachitis bei Kindern bzw. Osteomalazie bei Erwachsenen (22,23). Im Tiermodell weisen Mäuse mit FGF- 23-Defizit ein Überangebot von Phosphat (Hyperphosphatämie) und einen gestörten Vitamin-D-Metabolismus auf. Neben der subkutanen, periartikulären, renalen, pulmonalen und gefäßassoziierten Kalzifikation, wird auch ein vorzeitiges Altern der Tiere beobachtet (24,25). Der Einfluss von FGF-23 auf den Knochenmetabolismus ist in der folgenden Abbildung 1.3 beschrieben.
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Im Vergleich zu den meisten Mitgliedern der FGF-Familie, bei der Heparansulfat die Bindung am FGF-Rezeptor ermöglicht (26,27), benötigt FGF-23 als Kofaktor Klotho, um den FGF- Rezeptor der Niere oder Nebenschilddrüse aktivieren zu können. Der Klotho/FGFR-Komplex bindet mit größerer Affinität FGF-23 als der FGF-
Rezeptor oder Klotho alleine (28). Während der Subtyp β-Klotho mit FGF-19 und FGF-21 interagiert, gehört α-Klotho zum Rezeptorkomplex von FGF-23. Zudem hat sich gezeigt, dass der FGF-Rezeptor 1 der prädominante Rezeptor für FGF-23 in der Niere (20) ist und auch bevorzugt von Endothelzellen exprimiert wird (29). In der Niere führt die Bindung des FGF-23-Klotho-Komplex am FGF- Rezeptor zur Autophosphorylierung der Rezeptor-Tyrosinkinase und stimuliert drei unterschiedliche Signalkaskaden: Ras-MAPK, PI3K-Akt und PLCγ-PKC (30) (Abb. 1.4).
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1.2 Klotho
Schaltet man ein spezielles Gen auf Chromosom 13 aus, zeigen sich typische Veränderungen des Alterns: Arteriosklerose, Gefäß- sowie Gewebeverkalkungen, Emphyseme, Infertilität, Hautatrophien, Leistungsminderung, Gonadendysplasie, Ataxie, Hypoglykämie und schwere Hyperphosphatämie. Die alterstypischen Symptome sind mit einer gesteigerten 1,25 (OH)2D3-Konzentration assoziiert (31). Das Gen, welches diesen Phänotypen erzeugt, benannte sein Entdecker Makoto Kuro-o nach der griechischen Göttin Klotho. Nach der griechischen Mythologie ist Klotho eine der drei Moiren und Tochter des Zeus. Klotho hat die Aufgabe, den Lebensfaden zu spinnen, der von Lachesis bemessen und von Atropos abgeschnitten wird. Es zeigt sich, dass die Lebenserwartung Klotho-defizienter Mäuse nur 5- 6% der Lebenserwartung vom Wildtyp entspricht (32). Umgekehrt ist die Lebenserwartung bei vermehrter Klotho-Expression um 20-30 % verlängert. Auch beim Menschen ist bekannt, dass einige Einzelnukleotid-Polymorphismen im Klotho-Gen mit einer veränderten Lebenserwartung, Osteoporose, Schlaganfall und Herzkranzgefäßerkrankungen assoziiert sind (33-35). Abb. 1.5 zeigt die makro- und mikroskopischen Veränderungen bei Klotho- Defizienz aus dem Mausmodell von Makoto Kuro.o et al.
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Die molekularen Grundlagen sind jedoch bis heute nicht geklärt. Klotho ist ein Proteohormon. Durch Hemmung des intrazellulären Insulin- und IGF-1 Signalweges, scheint Klotho seine anti-aging Effekte zu initiieren (36). Wie bei der Maus, ist das menschliche Klotho-Gentranskript 5,2 kb groß (37,38). Das membranständige Klotho besitzt eine vollständige Länge von 1014 Aminosäuren und wird vor allem im distalen Tubulus der Niere exprimiert (39). Durch alternatives Spleißen (40) oder Abspaltung der extrazellulären Domäne lässt sich die sekretierte Form mit nur 550 Aminosäuren erzeugen (soluble Klotho, sKlotho). Diese lässt sich im Blut, Urin und Liquor nachweisen (41). Die Abspaltung erfolgt durch die β-Sekretasen BACE1 (42), ADAM10 und ADAM17 (43). Im Gegensatz zur Maus, ist die sekretierte Form die prädominante von Klotho im Menschen (44). Es ließen sich von Ito et al. zwei Proteine mit Ähnlichkeiten zu Klotho identifizieren: β-Klotho (45) und das Laktase- ähnliche γ-Klotho (46). Zur Unterscheidung wird Klotho deshalb oft als α-Klotho bezeichnet.
Zu einen der positiven Eigenschaften von Klotho zählt der protektive Effekt auf die Endothelfunktion durch die Regulation von Stickstoffmonoxid (NO). Als Endothel bezeichnet man die innerste Schicht von Blutgefäßen (am Lumen orientiert), welche aus Endothelzellen besteht. Als humoraler Faktor steht Klotho unmittelbar und kontinuierlich in Kontakt mit der Endothelschicht der Gefäße. Das Endothel spielt eine entscheidende Rolle für die Gefäßfunktion und kontrolliert durch die Freisetzung von Stickstoffmonoxid den Vasotonus (47,48). Die NO-Produktion wird maßgeblich von Klotho beeinflusst. Es konnte gezeigt werden, dass bei Klotho-defizienten Mäusen das Ansprechen der endothelabhängigen Vasodilatation als Antwort auf Acetylcholin bei der Aorta und bei Arteriolen signifikant vermindert ist (49). Weitere Tiermodelle zeigten, dass L-NAME als NOS-Inhibitor die Harnexkretion von Nitrit und Nitrat in gleichen Maßen in Wildtyp (WT) (+/+) und bei heterozygoten Klotho Mäusen (+/-) senkt. Es wurden dabei heterozygote Mäuse verwendet, weil homozygote Klotho-defiziente Mäuse (-/-) frühzeitig sterben. Die durch Klothomangel induzierte Abnahme von NO könnte deshalb auf der Inhibierung der NO-Synthese beruhen.
Möglicherweise sinkt der NO-Gehalt in Klotho-defizienten Mäusen aufgrund eines schnelleren Abbaus von NO. Ergänzend wurde gezeigt, dass bei OLFET-Ratten (Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty) mit dem WT Klotho-Gen die NO-Synthese erhöht ist (50). Wenn man eine Parabiose zwischen WT und Klotho heterozygote Mäuse durchführt (chirurgische Verbindung zweier Tiere, die sich in der Folge einen Kreislauf teilen) kann man eine normale endotheliale Funktion in Klotho heterozygoten Mäusen wiederherstellen. Die gesenkte NO- Synthese in Klotho-defizienten Mäusen ist dabei nicht unbedingt eine Folge der Hyperphosphatämie oder Hypervitaminose D, da der schützende Effekt von Klotho in Klotho heterozygoten Mäusen trotz normaler Phosphat- und Vitamin D-Level gesenkt ist. Wie Klotho die NO-Synthese vermittelt ist nicht bekannt. Diskutiert wird, dass ein Klothodefizit die endotheliale NO-Synthase (eNOS) herunterreguliert und somit auch die NO-Synthese.
Alternativ könnte Klotho ein unbekanntes Vorläufermolekül in eine aktive Form metabolisieren, welches die NO-Synthese stimuliert (49,51).
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1.3 Das Endothel als Gefäßbestandteil und seine Funktion
Das menschliche Blutgefäß setzt sich im Wesentlichen aus drei Schichten zusammen. Von innen (Lumen) nach außen sind diese die Tunica intima (Intima), Tunica media (Media) und Tunica externa (Adventitia). Die Endothelzellen befinden sich in der Intima-Schicht und haben damit direkten Kontakt zum Blut.
Die pathologische Veränderungen in der Funktion des Endothels fast man unter dem Begriff
„endotheliale Dysfunktion“ zusammen. Die Endothelschicht ist verantwortlich für die Gefäßweitenregulation, Gefäßwandpermeabilität, die Modulation der adhäsiven Eigenschaft und Thrombozytenaggregationshemmung. Bei einer Dysfunktion ist das Endothel in seiner regulatorischen Funktion eingeschränkt. Die verminderte Vasodilatation wird vor allem im Zusammenhang mit dem Verlust der endothelabhängigen NO-Freisetzung gesehen und ist ein Risikofaktor für die Entstehung von Arteriosklerose und koronarer Herzerkrankungen (52). Ursächlich für das verminderte NO-Angebot kann eine reduzierte Expression oder Signalwegstörung der endothelialen NO-Synthase oder ein Mangel an der von eNOS benötigten Substrate und Kofaktoren sein. Besonders interessant ist der Abbau von NO durch Reaktive Sauerstoffspezies (ROS): Superoxidanionen reagieren mit NO drei Mal schneller als mit der Superoxiddismutase (SOD), welche Sauerstoffradikale entfernt (53). Die endotheliale Dysfunktion ist damit ein bedeutender Risikofaktor für kardiovaskuläre Ereignisse (54). Die Abbildung 1.6 soll diese Abläufe modellhaft veranschaulichen.
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1.4 Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und oxidativer Stress
Eine Stoffwechsellage, bei der ROS in hoher Konzentration vorliegt, bezeichnet man als oxidativen Stress. Oxidativer Stress ist vor allem dadurch bekannt, dass ROS als Nebenprodukt beim Elektronentransport in der Atmungskette produziert werden kann, wenn Elektronen unspezifisch an molekularen Sauerstoff transferiert werden. Zur Familie der reaktiven Sauerstoffspezies gehören vor allem freie Radikale mit ungepaarten Elektronen.
Dazu zählen beispielsweise Hyperoxid-Anionen und Hydoxyl-Radikale oder Stoffe mit oxygenierenden Eigenschaften wie Wasserstoffperoxid (Abb. 1.7).
Oxidativer Stress ist maßgeblich an
der Ausbildung vieler
neurodegenerativer und
kardiovaskulärer Erkrankungen sowie an der Entstehung von Krebs beteiligt (55). Klotho schützt vor oxidativem Stress. Die Bindung von Klotho an Klotho-Rezeptoren der Zelloberfläche führt zur Inhibition der FOXO3a-Phosphorylierung und fördert dessen Translokation in den Zellkern. Dort bindet FOXO3a direkt an den SOD2-Promotor und steigert dessen Expression (56). Die SOD2
vermindert ROS, indem es Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid umwandelt, welches durch die Katalase in Sauerstoff und Wasser abgebaut und damit unschädlich gemacht wird (Abb. 1.8).
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1.5 Welche Rolle spielen Klotho und FGF-23 bei der CKD?
Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz weisen reduzierte Serumkonzentrationen von sKlotho aufgrund einer verminderten renalen Klotho-Synthese auf (56). Neueste Studien zeigen, dass die Methylierung des Klotho-Promotors invers mit der GFR korreliert und zugleich auch den klinischen sowie histologischen Schweregrad der CKD anzeigt (57). Weitere Untersuchungen ergeben zudem, dass eine erniedrigte Serumkonzentration von sKlotho mit Zeichen der Gefäßdysfunktion wie der Gefäßwandsteifigkeit und der Prävalenz kardiovaskulärer Erkrankungen einhergeht (58,59). Es besteht also ein Zusammenhang zwischen den kardiovaskulären Erkrankungen bei CKD-Patienten und FGF-23 und Klotho.
Zusammenfassend wurde bisher folgendes festgestellt:
Die Serumkonzentration von FGF-23 ist bei CKD-Patienten enorm erhöht. Klotho ist ein Kofaktor für FGF-23, um bevorzugt den FGFR1 zu aktivieren. Die wichtigste Komorbidität bei CKD ist die kardiovaskuläre Manifestation, welche mit einer erhöhten Mortalität einhergeht.
Klotho hat dabei protektive Eigenschaften auf die Blutgefäße. Bei CKD-Patienten ist Klotho jedoch vermindert und mit einem schlechteren Gefäßstatus assoziiert. Oxidativer Stress und Urämietoxine sind bekannte Risikofaktoren für kardiovaskuläre Erkrankungen (Abb. 1.9).
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1.6 Aufbau und Ziel der Promotionsarbeit
Ziel der Arbeit ist es den Einfluss von FGF-23 auf die Endothelfunktion in vitro zu untersuchen.
Hierfür wurden nicht immortalisierte humane Primärzellen der Koronararterien herangezogen: zum einen Endothelzellen (HCAEC), welche die Innenschicht der Blutgefäße auskleiden und zum anderen glatte Muskelzellen (HCASMC), welche die mittlere Gefäßschicht dominieren und für die Endothel-initiierte Vasomotorik verantwortlich sind.
Die käuflich erworbenen HCAECs und HCASMCs sind Gewebeproben gesunder adulter Männer und sollen in den in vitro Untersuchungen Hinweise über das in vivo Verhalten der Zellen geben.
In der Zellkultur wurde das Wachstumsverhalten der HCAECs (und HCASMCs) beobachtet und Protein- sowie RNA-Extrakte gewonnen. Die Proteinlysate wurden mittels Western Blot auf die Expression von FGF-23, Klotho in gebundener (membrane Klotho, mKlotho) und löslicher (soluble Klotho, sKlotho) Form sowie die FGF-Rezeptoren 1-4 untersucht. Zudem wurde der zeit-und konzentrationsabhängige Einfluss von FGF-23 auf die Endothelfunktion, die ROS-Produktion und die Klotho-Sekretion genauer analysiert. Um einen Vergleichsparameter zu haben, wurde bei allen Stimulationen mit FGF-23 auch das am besten verstandene Mitglied der FGF-Familie, FGF-2, mitgeführt. Die Endothelfunktion wurde mittels Messung der NO-Freisetzung im Zellkulturmedium unter FGF-Stimulation gemessen. Zudem wurde der Aktivierungszustand der eNOS über die Phosphorylierung von Serin1177 und Dephosphorylierung von Threonin495 im Western Blot untersucht. Die ROS- Produktion konnte mikroskopisch und mittels Durchflusszytometrie über eine Fluoreszenzfärbung visualisiert und quantifiziert werden. Die Analysen sollen Hinweise darauf geben, wie das Gefäßsystem unter dem Einfluss von FGF-23 reagiert und inwieweit die Klotho-Expression bzw. Sekretion damit korreliert. Ein konzentrationsabhängiger Einfluss von FGF-23 in HCAECs und HCASMCs soll mit Hinblick auf die deutlich erhöhten FGF-23- Serumverhältnisse von Patienten mit CKD untersucht werden. Die wichtigen Risikofaktoren für die kardiovaskulären pathologischen Veränderungen werden mittels der NO-Freisetzung und der Untersuchung von ROS beobachtet. Somit könnten die beschriebenen Analysen neben dem Aufschluss der physiologischen Wirkungen von FGF-23 auf die Endothelfunktion auch das Verständnis für die CKD assoziierte kardiovaskuläre Komorbidität verbessern.
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2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Chemikalien und Reagenzien
Allgemeine Chemikalien/Reagenzien
Ammoniumpersulfat Roth, Karlsruhe, D
Bovin Serum Albumin GERBU Biotechnik, Heidelberg, D
Bromphenolblau 669,96g/mol AppliChem, Darmstadt, D
Deoxycholinsäure (DOC) Sigma-Aldrich, Seelze, D
Dimethyl Sulfoxide HybriMax (DMSO) Sigma-Aldrich, Seelze, D di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat Merck Millipore, Darmstadt, D
EDTA AppliChem, Darmstadt, D
Entwickler G138i AGFA, Bonn, D
Ethanol 99% vergällt (1% MEK) AppliChem, Darmstadt, D
Fixierer G334i AGFA, Bonn, D
Glucose-6-Phosphat Sigma-Aldrich, Seelze, D
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (#G2921) Sigma-Aldrich, Seelze, D
Glycerin 92,1g/mol Merck Millipore, Darmstadt, D
Glycin 75,07g/mol AppliChem, Darmstadt, D
Luminata Cristendo Western HRP Substrate Merck Millipore, Darmstadt, D Luminata Forte Western HRP Substrate Merck Millipore, Darmstadt, D Magnesiumsulfat MgSO4 246,48g/mol Merck Millipore, Darmstadt, D
Methanol Merck Millipore, Darmstadt, D
Milchpulver Roth, Karlsruhe, D
Natriumchlorid 58,44g/mol AppliChem, Darmstadt, D
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat Merck Millipore, Darmstadt, D Natronlauge c(NaOH) 2mol/L Merck Millipore, Darmstadt, D Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH)
(#N9910)
Sigma-Aldrich, Seelze, D Nitratreduktase (#N7265-10UN) Sigma-Aldrich, Seelze, D
Odyssey Blocking Buffer LI-COR, Bad Homburg vor der
Höhe, D
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific, Braunschweig, D
Pierce ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific, Braunschweig, D
Restore Western Blot – Stripping Buffer Thermo Scientific, Braunschweig, D
Rinderserumalbumin (BSA) als Standard Thermo Scientific, Braunschweig, D
RNase Away®, Molecular Bio Products Thermo Scientific, Braunschweig, D
Rothi®Histofix 4%, Formaldehydlösung Roth, Karlsruhe, D
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Rothiphorese Gel 30 (37, 5:1) Roth, Karlsruhe, D
SDS-Pellets 288,38g/mol Roth, Karlsruhe, D
TEMED Tetrametylenetylendiamid 99% Roth, Karlsruhe, D Trichloraceticacid (TCA) 163,39g/mol AppliChem, Darmstadt, D TRIS ultrapure base 121,14g/mol AppliChem, Darmstadt, D
Triton x-100 Sigma-Aldrich, Seelze, D
Trypan Blue Solution (0,4%) Sigma-Aldrich, Seelze, D
Tween 20 Roth, Karlsruhe, D
Puffer
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS; pH 7,2-7,3) KH2PO4 1,2g
Na2HPO4 -12H2O NaCl 2,2g
ad 500 ml Aqua ad injectabilia
Zentralapotheke MHH, Hannover, D
2.2 Verbrauchsmaterialien - allgemeiner Laborbedarf
Material
µ-slides VI0,4 ibidi treat Ibidi GmbH
15 ml (optisch klar), 50 ml (braun) Reaktionsgefäße Polypropylen
Greiner, Frickenhausen, D Amersham Hybond-ECL 0,45µm Nitrocellulose
Membranes
GE Healthcare, Braunschweig, D C-Chip Neubauer Improved DHC-N01 Disposable
Hemocytometer Counting Chamber
Digital Bio, Changan, ROK CELLSTAR® 24 Well Zellkultur Multiwell Platten Greiner, Frickenhausen, D Chromatographie-Papier 3MM Chr 580x680mm Th.Geyer, Renningen, D Cronex 5 Medical x-ray film AGFA, Mortsel, B Cryo Einfrierröhrchen 2 ml mit Innengewinde
Polypropylen
Greiner, Frickenhausen, D Dynabeads® Protein A for Immunoprecipitation, 5
ml
Life Technologies, Darmstadt, D
DynaMagTM-2 Life Technologies, Darmstadt, D
Flow cytometry Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht, D
Gewebekulturflasche T-25, T-75, T170cm2 Sarstedt, Nümbrecht, D Micro Amp Fast optical 96 well retraction plate with
Bar code
Applied Bio Systems, von Life Technologies, Darmstadt, D
Microtest Plate 96-well flat bottom Sarstedt, Nümbrecht, D
PCR-Cooler (Kühlakku) Eppendorf, Hamburg, D
Reagiergefäß 0,2 ml; 1,5 ml Sarstedt, Nümbrecht, D SafeSeal Reagiergefäß 1,5ml Sarstedt, Nümbrecht, D
15
Schott-Laborglasflaschen DURAN, Wertheim/Main, D
Serologische Pipetten 5 ml, 10 ml, 25 ml Sarstedt, Nümbrecht, D
Steritop-Filter Merck Millipore, Darmstadt, D
X-Wipes mit Incidin 1% Bode, Hamburg, D
Zellschaber 24 cm, 30 cm TPP, Trasadingen, CH
2.3 Geräte
Bezeichnung
BD FACSCanto II flow cytometer BD Biosciences, Heidelberg, D
Extend ED2202S-CW Sartorius, Göttingen, D
Fluoreszenzmikroskop: Axio Observer Carl Zeiss, Oberkochen, D
Heat-stir CB 162 Stuart, Stone Stafford Shire, UK
Heizblock MHR 23 HLC, Bovenden, D
infinite M200PRO Tecan, Mainz, D
Mikroskop: Axiovert 40CFL Carl Zeiss, Oberkochen, D
Mini Potean Tetra Cell BioRad, München, D
Nanodrop Thermo Scientific, Braunschweig, D
Odeyssey Fc LI-COR, Bad Homburg vor der
Höhe, D
Ohaus balance Pioneer PA214 Ohaus, Nänikon, CH
pH-Meter 761 Knick Calimatic, Berlin, D
Pipetus Hirschmann Laborgeräte,
Eberstadt, D
Power Pac 3000 BioRad, München, D
Power Pack Basic BioRad, München, D
Roler Mixer SRT6 Stuart, Stone Stafford Shire, UK
Seesaw rocker SSL4 Stuart, Stone Stafford Shire, UK
Tank Blot BioRad, München, D
Thermo cycler 7900H Fast Real Time PCR System Applied Bio Systems, v. Life Technologies, Darmstadt, D
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, New York, USA
Wärmeschrank Memmert, Schwabach, D
Wasserbad: GFL 1083 Schüttel-Wasserbad GFL, Burgwedel, D
Zellkultur Werkbank: Safe 2020 Thermo Scientific, Braunschweig, D Zellkulturinkubator: Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Scientific, Braunschweig, D Zentrifuge: Centrifuge 5424R, 5430R Eppendorf, Hamburg, D
Zentrifuge: eppendorf centrifuge 5804R Thermo Scientific, Braunschweig, D Zentrifuge: Heraeus Laborfuge 400 Thermo Scientific, Braunschweig, D
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2.4 Zellkultur
In der Zellkultur wurden humane Endothel- und Muskelzellen aus der Koronararterie verwendet. Diese charakterisieren die innere und mittlere Schicht eines Gefäßes und sind maßgeblich an dessen Funktion beteiligt.
Es handelt sich um Primärzellen, welche von Passage zwei bis sieben kultiviert und für die Versuche eingesetzt wurden. Bei höheren Passagen zeigen sich morphologische und funktionale Veränderungen, sodass von einer beginnenden pathologischen Zelldifferenzierung auszugehen ist.
2.4.1 Subkultivieren
Das Protokoll orientiert sich an den Angaben der Firma PromoCell. Vorbereitend wird das Medium im Wasserbad erwärmt (37°C) und das Detach Kit auf Raumtemperatur gebracht.
Im ersten Schritt wird das Medium aus der Zellkulturflasche abgesaugt und anschließend 100 µl Hepes-BSS-Lösung pro cm² der Zelloberfläche hinzugegeben. Die Flasche wird für 15 Sekunden geschwenkt, sodass die Zellen gewaschen und vom Serumanteil des Mediums befreit werden. Der Serumanteil im Medium hemmt Trypsin, dass im zweiten Schritt nach Absaugen der Hepes-BSS-Lösung hinzugegeben wird (100 µl Trypsin/EDTA-Lösung pro cm²).
Das Ablösen der Zellen durch Trypsin bei Raumtemperatur wird unter dem Mikroskop beobachten und durch leichtes Klopfen zusätzlich unterstützt. Nach dem Ablösen der Zellen wird das Trypsin durch die Gabe von 100 µl TNS (Trypsin Neutralizing Solution) per cm² neutralisiert. Die Zellsuspension wird in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt und
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anschließend drei Minuten bei 220 x g zentrifugiert. Zwischenzeitlich werden die neuen Zellkulturflaschen mit vorgewärmten PromoCell Growth Medium vorbereitet. Nach Zentrifugation wird der Überstand verworfen, das Zellpellet durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren in Medium resuspendiert und anschließend auf neue Zellkulturflaschen ausgesät. Es folgt die übliche Inkubation bei 37°C, 5% CO2.
Zellkulturbedarf
Endothelial Cell Growth Medium MV2 Kit Promo Cell, Heidelberg, D Smooth Muscle Cell Growth Medium 2 Kit Promo Cell, Heidelberg, D
Detach Kit Promo Cell, Heidelberg, D
Human Coronary Artery Smooth Muscle Cells (HCASMC)
1. HCASMC-p, Lot-Nummer: 9052004.4 2. HCASMC-c, Lot-Nummer: 9052004.5
Promo Cell, Heidelberg, D
Human Coronary Artery Endothelial Cells (HCAEC) 1. HCAEC –p, Lot-Nummer: 1111804.1 2. HCAEC –c Lot-Nummer: 0113008.7
Promo Cell, Heidelberg, D
2.4.2 Auftauen von Zellen
Das Protokoll orientiert sich an den Angaben der Firma PromoCell. Vor dem Auftauen wird das entsprechende Medium in die neuen Zellkulturflaschen gegeben und im Inkubator 30 Minuten vorgewärmt. Der Transport der Zellen aus dem flüssigen Stickstoff erfolgt zügig und auf Eis. Die Kryo-Röhrchen mit den Zellen werden im Wasserbad (37°C) erwärmt und durch leichtes Schütteln gleichmäßig aufgetaut. Anschließend werden die Zellen in warmen Kulturmedium resupendiert, ausgesät und bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Nach 16 bis 24 Stunden wird das Medium gewechselt, um den restlichen DMSO-Anteil aus dem Gefriermedium zu entfernen. Sind die Zellen bereits zu 70-90% konfluent gewachsen, kann auch eine Subkultivierung (2.4.1) erfolgen.
2.4.3 Kryokonservierung
Zur Lagerung der HCAECs sowie HCASMCs werden diese kryokonserviert. Dazu werden die Zellen mittels Detach Kit abgelöst (2.4.1). Das gewonnene Zellpellet wird in 1 ml des entsprechenden Mediums mit 10% DMSO-Gehalt resuspendiert und in ein Kryo-Röhrchen überführt. Dieses wird schnellstmöglich bei -80°C eingefroren. Am folgenden Tag werden die Zellen auf Eis zur Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff transferiert.
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2.5 Proteinisolation
Die Methode dient der Gewinnung von Proteinen aus den HCAECs sowie HCASMCs. Hierbei werden Phosphatase-Inhibitoren verwendet, welche Phosphorylierungsstellen schützen sollen, sowie ein Protease-Inhibitor, welcher das enzymatische Verdauen der Proteine verhindert. Die Proteine werden so vorbereitet, dass sie anschließend per Western Blot analysiert werden können. Bei der Durchführung wird darauf geachtet, die Proben stets gekühlt auf Eis zu lagern, um die Proteine zusätzlich vor enzymatischen Abbau zu schützen.
Daher werden zu Beginn die verwendeten Geräte auf 4°C heruntergekühlt und Reagenzien auf Eis gestellt. Der Proteinlysepuffer wird wie folgt vorbereitet: 1 ml Lyse Puffer, 10 µl Protease-Inhibitor-Cocktail, 1 mM Na3VO4 sowie 20 mM NaF werden zusammengefügt und auf Eis gestellt. NaF muss zur Aktivierung zuvor kurz erhitzt werden. Nach diesen Vorbereitungen kann das Zellmedium von der Zellkulturflasche abgesaugt werden. Die Zellen werden daraufhin zwei Mal mit 5 ml eiskaltem PBS gewaschen. Im Anschluss werden die Zellen in 5 ml eiskaltem PBS mittels Zellschaber abgelöst. Die Suspension wir in ein 15 ml Reaktionsgefäß 5 Minuten bei 450 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird absaugt, das Zellpellet auf Eis gestellt. Das Zellpellet kann nun in 100-200 µl des vorgefertigten Proteinlysepuffers resuspendiert werden. Die Menge des Proteinlysepuffers richtet sich nach dem Ausmaß der Zellzahl, ist aber für einen Durchgang immer einheitlich festzulegen. Die Suspension wird in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß transferiert und zehn Minuten bei 4°C am Überkopfschüttler inkubiert. Anschließend wird zehn Minuten bei 14000 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand enthält das gewonnene Gesamtprotein und wird in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß gefüllt und zügig bei -25°C weggefroren. Das entstandene Pellet stellt Detritus dar und kann verworfen werden.
Proteinisolationspuffer Lysis Buffer
1%
150 mM 50 mM 5 mM ad 1 L ddH2O
Triton x-100 NaCl Tris EDTA
10 ml 8,78 g 6,06 g 1,86 g
Sodium fluoride Sigma-Aldrich, Seelze, D
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich, Seelze, D
19 Protease Inhibitor Cocktail P8340
AEBSF, 104 mM Aprotinin, 80 μM Bestatin, 4 mM E-64, 1.4 mM Leupeptin, 2 mM Pepstatin A, 1.5 mM
Sigma-Aldrich, Seelze, D
2.6 Quantifizierung der Proteinkonzentration mittels BCA-Methode
Das Verfahren mit Bicinchoninsäure (BCA) dient der quantitativen Bestimmung des Proteingehalts einer Probe. BCA reagiert als wasserlösliches Salz spezifisch mit Kupferionen (Cu+-Ionen). Bei der Reaktion von zwei BCA-Moleküle mit einem Cu+-Ion entsteht ein violettes Produkt, welches eine starke Absorption bei 562 nm zeigt und photometrisch gemessen werden kann. Das Cu+ entstammt der Biuret-Reaktion: im alkalischen Milieu reduzieren die zu bestimmenden Proteine Cu2+ zu Cu+. Das Ausmaß des Produkts richtet sich damit nach dem Proteingehalt.
Rinderserumalbuminlösungen (BSA) mit bekanntem Proteingehalt werden eingesetzt, um eine Kalibrationsreihe bzw. Standardreihe zu erstellen. Die Quantifizierung beginnt mit dem Auftauen der Proben auf Eis. Währenddessen wird die Standardreihe mit Serumalbumin in 0,2% Deoxycholinsäure (DOC) angesetzt. Anstelle von 0,2% DOC kann auch ddH2O eingesetzt werden, es wurde jedoch überwiegend nach der etablierten Methode mit DOC gearbeitet.
Die Vorverdünnung der Proben von 1:50 erfolgt mit DOC 0,2%. Die BCA-Reagenzien A und B werden im Verhältnis 1:50 gemischt. In die Vertiefung einer 96-well-Platte werden 25 µl vom jeweiligen Standard, von den Proben und dem Blank (entspricht DOC 0,2%) pipettiert. Die Proben werden als Doppelbestimmung aufgetragen. In jede Vertiefung werden 200 µl des vorgefertigten BCA-Reagenz gegeben und 60 Minuten bei 60°C inkubiert. Die Messung erfolgt am infinite M200PRO (Tecan, Mainz, D) bei 562 nm mit einer Referenzlänge von 690 nm. Die Auswertung wird mit dem Programm Magellan V7.0 (Tecan, Mainz, D) durchgeführt.
Es wird dabei darauf geachtet, dass die Absorptionswerte der Proben im Bereich der Standards liegen und höher als im Blank sind. Andernfalls muss die Proteinkonzentration der Proben durch Verdünnen angepasst werden.
20 BCA Protein Assay Reagent
BCA Reagent A: Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Bicinchoninsäure und Natriumtartrat in 0,1 M Natriumhydroxid BCA Reagent B: 4% Kupfersulfat
Albumin Standard Ampulle: 2 mg/ml bovines Serumalbumin (BSA) in 0,9% Kochsalzlösung und 0,05% Natriumazid
Thermo Scientific, Braunschweig, D
2.7 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophore (SDS-Page)
Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist eine analytische Methode zur Trennung von Proteinen nach der molekularen Masse in einem elektrischen Feld. Es werden Polyacrylamidgele von 10-12% aus eigener Herstellung verwendet. Diese werden bei 7°C kühl gelagert und maximal bis zu zwei Wochen nach Herstellung eingesetzt.
Die Proteinproben, die nach der beschriebenen Methode (2.5) gewonnen werden, müssen zunächst auf Eis auftauen. Von jeder Probe werden pro Vertiefung im SDS-Gel 50 µg Gesamtprotein eingesetzt. Mittels einer Proteinkonzentrationsbestimmung (2.6) wird für jede Probe der Gesamtproteingehalt erfasst und das Volumen für 50 µg Gesamtprotein berechnet. Dieses wird in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 6-fach SDS- Laemmli-Puffer (LP) versetzt. Die LP-Zugabe entspricht 1/6 des Probenvolumens. Dem Proteinmarker wird ebenfalls LP hinzugegeben, um das Gesamtvolumen dem der Proben anzunähern. Die Proben sowie der Marker werden im Heizblock bei 95°C für 5 Minuten aufgekocht und im Anschluss abzentrifugiert (4°C, 30 Sekunden, 10000 rpm), um das Gesamtvolumen beim Auftragen vollständig entnehmen zu können. Beim Erhitzen verlieren die Proteine ihre Tertiärstruktur (denaturieren) und bekommen eine uniforme negative Ladung (durch Maskierung der Proteine mit SDS). Die Vorbereitungen dienen einem gleichmäßigen elektrophoretischen Wanderungsverhalten der Polypeptide, welches sich in der Geschwindigkeit ausschließlich nach dem Molekulargewicht richtet. Das Gel wird in der Apparatur nach den Vorgaben der Firma Biorad entsprechend aufgebaut. Nachdem die Proben in die Taschen des Gels pipettiert wurden, wird eine Spannung von 80 V angelegt.
Sobald die Proben in das Sammelgel gewandert sind wird die Spannung auf 150 V erhöht.
Der Gellauf wird beendet, wenn die blaue Lauffront die untere Gelkante erreicht hat.
21 SDS-Page-Gele
Trenngel (Volumen für 2 Gele) 6% 8% 10% 12%
ddH2O 6,6 ml 5,8 ml 5 ml 4,2 ml
Tris base 1,5 M pH 8,8 + 0,5% SDS 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml Acylamid 30% + Bisacrylamid 0,8% 2,4 ml 3,2 ml 4 ml 4,8 ml
AP 20% (Ammoniumpersulfat) 24 µl 24 µl 24 µl 24 µl
TEMED 24 µl 24 µl 24 µl 24 µl
Sammelgel (Volumen für 2 Gele) 4%
ddH2O 3,5 ml
Tris base 0,5 M pH 6,8 + 0,5% SDS 1,5 ml Acylamid 30% + Bisacrylamid 0,8% 2 ml AP 20% (Ammoniumpersulfat) 12 µl
TEMED 12 µl
SDS-Page-Puffer 0,5 M TRIS-HCL (pH 6,8) 0,5 M
ad 1 L ddH2O
TRIS 60,52 g
1,5 M TRIS-HCl (pH 8,8) 1,5 M
ad 1 L ddH2O
TRIS 181,8 g
6x Laemmli Puffer (pH 8,0)
50 mM TRIS base 61 mg
5 mM EDTA 0,1ml
5% (w/v) SDS 0,5 g
200 mM DTT 309 mg
50% (v/v) Glycerol 99% 5 ml
5% (w/v) Bromphenolblau 500 µg
ad 10ml ddH2O
22
2.8 Western Blot
Der Western Blot ist ein Verfahren, um Proteine mittels eines elektrischen Feldes auf eine Trägermembran zu übertragen, um diese schließlich über für das zu untersuchende Protein spezifische Antikörper und bestimmte Reaktionen nachzuweisen. Die negativ geladenen Proteine wandern in Richtung der Anode und werden dabei vom Polyacrylamidgel (SDS-Page, 2.7) auf eine Membran übertragen. Der Proteinübertrag auf die Membran wird über Farbstoffe wie Ponceau S kontrolliert und so der Erfolg des
Transfers beurteilt. Der spezifische Nachweis einzelner Proteine erfolgt über gegen das zu untersuchende Antigen gerichteten Antikörper (Primärantikörper). In einem zweiten Schritt werden Sekundärantikörper verwendet, die am Primärantikörper binden. Diese sind mit einem Enzym wie der Meerrettichperoxidase (HRP) oder einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Indirekt kann dann per Chemilumineszenz auf einem Röntgenfilm (lichterzeugende Umsetzung eines Substrates durch die HRP) oder einem Infrarot-Laser die jeweilige Proteinbande sichtbar gemacht werden.
Der Western Blot beginnt mit dem Zusammensetzen eines
„Gel/Membran/Filter-
Sandwiches“. In die Klemmkassette wird ein mit Transferpuffer getränkter Schwamm gelegt. Darauf folgen drei in Transferpuffer getränkte Filterpapiere in der Größe des Gels. Nun kann das Gel aus dem Glas entnommen werden. Das Sammelgel wird vorsichtig abgetrennt und das Trenngel auf
die oberste Papierschicht gelegt. Hierbei ist darauf zu achten, dass das Gel nicht einreißt oder Blasen entstehen. Nun wird eine Nitrocellulosemembran kurz mit ddH2O durchfeuchtet und anschließend in Transferpuffer eingelegt. Daraufhin kann sie auf das Gel aufgetragen und planiert werden. Hier sind ebenfalls durch sorgfältige Glättung Blasen zu vermeiden. Es folgen nun drei weitere Schichten Filterpapiere und abschließend ein weiterer Schwamm,
23
welche ebenfalls mit Transferpuffer getränkt werden. Bei 4°C im Kühlraum läuft der Western Blot (Wet Blot) 75 Minuten bei konstanten 400 mA in Transferpuffer. Nach erfolgreichem Blot wird die Membran kurz mit ddH2O abgespült und für drei Minuten in TBS-T geschwenkt.
Daraufhin wird die Membran für eine Stunde mit Blocking-Milk (Entwicklung per Chemilumineszenz) oder Blocking-Buffer von LI-COR mit 5% BSA (Entwicklung per Fluoreszenz) bei Raumtemperatur geblockt. Bei der Detektion von phosphorylierten Proteinen wird zum Blocken TBS mit 5% BSA verwendet. In dieser Zeit wird der jeweilige Primärantikörper angesetzt. Nach dem Blocken der Membran wird diese im 50 ml Reaktionsgefäß mit dem Primärantikörper für 15-17 Stunden im Kühlraum bei 4°C auf einem Rollenmischer inkubiert. Nach Inkubation wird die Membran auf einem see saw rocker (35 spm) vier Mal fünf Minuten mit TBS-T gewaschen, um die unspezifischen Antikörperbindungen zu entfernen. Anschließend wird die Membran in einem 50 ml Reaktionsgefäß zusammen mit dem Sekundärantikörper auf dem see saw rocker (35 spm) für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Verdünnung des Sekundärantikörpers errechnet sich als dreifaches der Verdünnung des zuvor eingesetzten Primärantikörpers.
Nach Entfernen des Sekundärantikörpers wird die Membran drei Mal für fünf Minuten mit TBS-T und anschließend einmal für fünf Minuten mit TBS gewaschen. Dies zeigt erfahrungsgemäß eine Verbesserung des Hintergrundbildes. Western Blots mit Anwendung von fluoreszenzgekoppelten Sekundärantikörpern werden durch ODYSSEY® Fc (LI-COR; 700 nm-Kanal 30 Sekunden, 800 nm-Kanal 7 Minuten) ausgewertet. Die Entwicklung per Chemilumineszenz erfolgt über Luminata forte (2-3 Minuten, 7 ml pro Membran) oder ECL (eine Minute, 7 ml pro Membran) in der Dunkelkammer mit Röntgenfilmen. Im Anschluss werden die Membranen mit TBS feucht gehalten und können eingeschweißt bei 4°C gelagert werden.
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wird als Kontrollprotein verwendet, da es als Enzym der Glykolyse ubiquitär vorhanden ist. Eine fehlerhafte Interpretation einer Signalveränderung durch ein ungleichmäßiges Auftragen der Proteinproben kann dadurch vermieden werden. Der Sekundärantikörper ist hier als Ausnahme mit einer Verdünnung von 1:15000 zu verwenden.
24 Primärantikörper
Antigen Antikörper Verd.* Spezies
FGF-23 FGF-23 (P-15) Anti-human FGF- 23 Antibody
1:1000 1:1000
Ziege Ziege
Santa Cruz, Heidelberg, D R&D Systems,
Wiesbaden-Nordenstadt, D
FGF-2 Basic FGF (19A9) Rabbit mAb
1:500 Kaninchen R&D Systems,
Wiesbaden-Nordenstadt, D
Klotho Klotho (E-21) Anti-Klotho antibody (ab69208)
1:500 1:1000
Ziege Kanninchen
Santa Cruz, Heidelberg, D Abcam, Cambridge, UK
FGFR1 Anti- FGFR1 antibody - ChIP Grade (ab10646) Receptor 1 (D8E4) XP® Rabbit mAb
1:800
1:1000
Kaninchen
Kaninchen
Abcam, Cambridge, UK
Cell Signaling
Technology, Frankfurt am Main, D
FGFR2 Anti-FGFR2 antibody (ab10648)
1:500 Kaninchen Abcam, Cambridge, UK
FGFR3 FGF Receptor 3 (C51F2) Rabbit mAb
1:1000 Kaninchen Cell Signaling
Technology, Frankfurt am Main, D
FGFR4 FGF Receptor 4 (D3B12) XP®
Rabbit mAb
1:1000 Kaninchen Cell Signaling
Technology, Frankfurt am Main, D
Phospho- Tyrosinkinasen
p-Tyr (PY20) 1:150 Maus Santa Cruz, Heidelberg, D
eNOS eNOS (6H2) Mouse mAb
1:1000 Maus Cell Signaling
Technology, Frankfurt am Main, D
25 phospho-eNOS Phospho-eNOS
(Ser1177) Antibdy Phospho-eNOS (Thr495) Antibody
1:800
1:800
Kaninchen
Kaninchen
Cell Signaling
Technology, Frankfurt am Main, D
Cell Signaling
Technology, Frankfurt am Main, D
NOS NOS (pan) Antibody
1:1000 Kaninchen Cell Signaling Technology, Frankfurt am Main, D GAPDH GAPDH (14C10)
Rabbit mAb
1:10000 Kaninchen Cell Signaling Technology, Frankfurt am Main, D β-Aktin β-Aktin (15E3)
Rabbit mAb
1:2000 Kaninchen Cell Signaling Technology, Frankfurt am Main,
*Verdünnung
Sekundärantikörper
Goat anti-rabbit IgG HRP Santa Cruz, Heidelberg, D Bovine anti-mouse IgG HRP Santa Cruz, Heidelberg, D Donkey anti-goat IgG HRP Santa Cruz, Heidelberg, D
Goat anti-rabbit IRDye® 680RD 0,5mg Odyssey LI-COR, Bad Homburg vor der Höhe, D
Goat anti-rabbit IRDye® 800CW 0,5mg Odyssey LI-COR, Bad Homburg vor der Höhe, D
Goat anti-mouse IRDye® 680RD 0,5mg Odyssey LI-COR, Bad Homburg vor der Höhe, D
Goat anti-mouse IRDye® 800CW 0,5mg Odyssey LI-COR, Bad Homburg vor der Höhe, D
Donkey Anti-Goat IgG IRDye® 800CW 0,5mg Odyssey LI-COR, Bad Homburg vor der Höhe, D
Puffer und Lösungen des Western Blots Blocking-Lösungen
5% (w/v) ad 100 ml TBS-T
Milchpulver 5 g
5% (w/v) ad 50 ml
BSA 2,5 g
26 LI-COR Blocking Buffer
5% (w/v) ad 50 ml TBS
BSA 2,5 g
25 mM 192 mM 0,01%
5%/ 18%
ad 1 L ddH2O
TRIS Glycin SDS20%(w/v) Methanol 100%
3,0 g 14,4 g 0,5 ml 50 ml/180 ml
Running Buffer (pH 8,3 - 8,5)
250 mM 1,92 M 0,5%
ad 1 L ddH2O
TRIS Glycin SDS 20%
30,3 g 144,2 g 100 ml
10x TBS-HCl (pH 7,6 ) 200 mM
1,4 M ad 1 L ddH2O
TRIS NaCl
24,2 g 80 g
1x TBS-T 0,1% (v/v) ad 1 L ddH2O
10x TBS Tween20
100 ml 1 ml
Membrananfärbung
Pierce Reversible Protein Stain Kit for nitrocellulose membranes
Reversible Stain, Destain, Stain Eraser Thermo Scientific, Braunschweig, D
2.8.1 Datenauswertung – Western Blot
Mit Hilfe der Software Image Studio (LI-COR, Bad Homburg vor der Höhe, D) kann eine densitometrische Analyse der Proteinbanden erfolgen. Bei Stimulationsbedingungen werden die Ergebnisse auf die unstimulierte Kontrolle normiert. Dabei wird die Validität der Ergebnisse anhand des Vergleiches mit den Werten für GAPDH oder β-Aktin bewertet.
27
2.9 Immunpräzipitation (IP)
Bei der Immunpräzipitation wird u.a. über einen spezifischen Antikörper ein bestimmtes Antigen vom Gesamtprotein separiert. In diesem Fall soll mittels Antikörper-gekoppelter magnetischer Beads der FGFR1 isoliert werden, um anschließend mittels SDS-Page (2.7) und Westen Blot (2.8) die Phospho-Tyrosine des FGFR1 genauer zu analysieren. Dafür werden pro Ansatz 50 µl Dynabeads Protein A in PBS in ein 2 ml Reaktionsgefäß gegeben. Die Reaktionsgefäße werden zum Waschvorgang zunächst eine Minute in den Magnetständer gestellt. Der Überstand wird verworfen, die magnetischen Beads anschließend in 500 ml PBS mit 0,02% Tween (PBS-T) resuspendiert. Dieser Vorgang wird zwei Mal wiederholt. Daraufhin können die magnetischen Beads direkt in der vorbereiteten Antikörperlösung resuspendiert werden. Die Antikörperkonzentration pro 50 µl Beads beträgt 5 µg/50 µl PBS-T. Beads und Antikörper inkubieren über Nacht bei 4°C am Überkopfschüttler. Anschließend führt man den bereits beschriebenen Waschzyklus drei
Mal durch. Die mit dem Antikörper gekoppelten Beads werden zum Schluss in 50 µl PBS-T pro zu untersuchender Probe resuspendiert. Zur Lagerung der Beads wird PBS mit 0,01 bis 0,1% Tween verwendet. Die Antikörper-gekoppelten Beads werden zu je 50 µl in 2 ml Reaktionsgefäße entsprechend verteilt und zwei Minuten in den Magnetständer gestellt. Der Überstand wird verworfen.
Die Proteinprobe wird mit PBS-T auf 100 µl eingestellt und mit den Antikörper- gekoppelten Beads resuspendiert. Es
folgt eine zweistündige Inkubation bei 4°C am Überkopfschüttler. Nach Inkubation werden die Proben zwei Minuten in den Magnetständer gestellt, der Überstand wird als Kontrolle für die Effektivität der Immunpräzipitation verwendet. Es folgt ein dreifach wiederholter Waschzyklus in 500 µl PBS-T. Beim dritten Mal werden die Proteine mit 100 µl PBS-T resuspendieren, in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführen und anschließend wieder in den Magnetständer gestellt. Die Elution des Zielantigens erfolgt durch Hinzugabe von 20 µl 50 mM Glycin-Puffer (pH 2,8) und 10 µl 3-fachem SDS-Laemmli-Puffer. Die Proben werden für zehn Minuten bei 70°C erhitzt. Nach zwei Minuten am Magnetständer kann der Überstand entnommen und für die SDS-Page verwendet werden.
28 Puffer der Immunpräzipitation
Waschpuffer (pH 7,4) 0,2%
ad 100 ml PBS
Tween-20 200 µl
Elutionspuffer (pH 2,8) 50 mM
ad 100 ml ddH2O
Glycine 0,375 g
2.10 RNA- Gewinnung
2.10.1 RNA-Protektion
Das Protokoll orientiert sich am „RNAprotect Cell Reagent Handbook“ (Qiagen; 2010). Die Methode dient der Stabilisierung von RNA aus Zellkulturen und stellt eine Möglichkeit dar, RNA von verschiedenen Zellpassagen geschützt zu lagern, um später von den gesammelten Proben die mRNA zu isolieren (2.10.2). Das Zellkulturmedium wird bis auf ein Restvolumen von 500 µl aspiriert und anschließend das fünffache Volumen RNAprotect Cell Reagent (entspricht hier 2,5 ml) hinzugefügt. Hierdurch lösen sich die Zellen ohne weitere Intervention ab. In einem 15 ml Reaktionsgefäß werden die Zellen im RNAprotectReagent bei -25°C aufbewahrt.
RNeasy Mini Protect Kit
RNAlater RNA Stabilization Reagent, RNeasy Mini Spin Columns,
Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-freie Reagenzien und Puffer
QIAGEN Venlo, NL
2.10.2 RNA-Extrakion
Zur Gewinnung der RNA aus den HCAECs und HCASMCs werden folgende Schritte durchlaufen: Die mit RNAprotect Cell Reagent vorbehandelte Zellen werden auf Eis aufgetaut. Anschließend werden die Proben für fünf Minuten bei 5000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Auf das Zellpellet werden 350 µl RLT Buffer gegeben und mittels Vortexer vollständig im Puffer gelöst.
Das homogenisierte Lysat wird in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 350 µl 70%igem Ethanol durch Auf- und Abpipettieren vermischt. Das Gesamtvolumen wird auf eine Säule („RNeasy spin column“) gegeben, die in einem 2 ml Sammelröhrchen steckt. Es folgt
29
eine Zentrifugation für 15 Sekunden bei 8000 x g. Der Durchfluss im Sammelröhrchen wird verworfen und die Säule mit 700 µl Buffer RW1 gewaschen. Auch danach wird der Durchfluss verworfen. Es erfolgt zwei Mal hintereinander der gleiche Waschzyklus mit je 500 µl Buffer RPE, wobei im zweiten Vorgang die Zentrifugation auf zwei Minuten verlängert wird. Nach Verwerfen des Durchflusses wird nochmals eine Minute mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen. Die Säule wird nun in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß geben und mit 15 µl RNase-freiem Wasser eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird durch einminütiges Zentrifugieren bei 8000 x g das RNA-Produkt eluiert. Das Eluat wird erneut auf die Säule aufgebracht und eine Minute bei 8000 x g zentrifugiert.
2.11 RNA-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentration der isolierten RNA (2.10.2) wird anhand des Nanodrop- Spektrophotometers (Thermo Scientific, Braunschweig, D) gemessen. Beim Einsetzten von 1 µl der RNA-Probe kann über dessen Absorptionswert bei einer Wellenlänge von 260 nm die RNA-Konzentration kalkuliert werden. Eine Absorptionseinheit A260 entspricht 40 µg ssRNA/ml (englisch single stranded, deutsch Einzelstrang). Die RNA-Konzentration (c) ergibt sich damit aus:
𝑐 [ µ𝑔 𝑅𝑁𝐴
𝑚𝑙 ] = 𝐴260∗ 40
Ein Absorptionsquotient A260/A280 zeigt die Reinheit der RNA-Probe an, da aromatische Aminosäurereste von Proteinen bei 280 nm absorbieren. Diese Ratio sollte daher stets bei einer RNA-Isolierung berücksichtig werden.
2.12 cDNA-Synthese (copy-DNA)
Die komplementäre DNA (englisch complementary DNA) ist eine mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase aus RNA synthetisierte DNA. Diese lässt sich dann im nächsten Schritt mittels PCR (englisch Polymerase chain reaction) amplifizieren. Die Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase und synthetisiert zunächst von einer einzelsträngigen RNA einen RNA-DNA-Hybridstrang. Die RNase H kann dann den RNA-Anteil des RNA-DNA- Hybriden entfernen. Der DNA-Einzelstrang kann später von der DNA-Polymerase zum Doppelstrang ergänzt werden.
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Zu Beginn werden die benötigten Komponenten bei Raumtemperatur aufgetaut: gDNA Wipeout Buffer, Quantiscript Reverse Transscriptase, Quantiscript RT Buffer, RT Primer Mix und RNase freies Wasser. Der gDNA Wipeout Buffer entfernt mögliche Kontaminationen der RNA mit genomischer DNA. Die RNA-Proben werden auf Eis aufgetaut, um einer RNA- Degradation durch RNAsen vorzubeugen. Pro Reaktion werden in einem 200 µl Reaktionsgefäß 2 µl gDNA Wipeout Buffer und 400 ng der RNA-Probe vorgelegt. Um ein einheitliches Volumen von 12 µl für jede Probe zu erhalten, wird das vorgelegte Volumen mit RNase-freiem Wasser ergänzt. Der Ansatz wird bei 42°C für drei Minuten inkubiert. Während dessen wird der Reverse-Transcription MasterMix in einem 200 µl Reaktionsgefäß angesetzt und auf Eis gelagert. Zur RNA-Probe (12 µl) werden 6 µl des MasterMixes in einem 200 µl Reaktionsgefäß gegeben. Es folgt die reverse Transkription im Thermocyler (Applied Bio Systems, Darmstadt, D) während einer Inkubationszeit von 15 Minuten bei 42°C. Im Anschluss wird durch Erhitzen bei 95 °C in drei Minuten die Reverse Transkriptase inaktiviert.
Die Proben werden bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Quanti Tect Rev Transcribtion Kit
gDNA Wipeout Buffer, Quantiscript Reverse Transcriptase,
Quantiscript RT Buffer, RT Primer Mix,
RNase-Free Water
QIAGEN Venlo, NL
MasterMix (Volumen pro Ansatz)(QIAGEN)
SYBR green 12,5 µl QIAGEN Venlo, NL
ddH2O 5 µl
Primermix 2,5 µl
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2.13 Quantitative real-time PCR (qPCR)
Die PCR ist eine Methode der enzymatischen Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente. Die PCR basiert auf thermisch variierenden Zyklen und benötigt Erhitzung- sowie Abkühlungsphasen. Im ersten Schritt (Denaturierungsphase) wird die doppelsträngige DNA- Matrize durch Erhitzen auf 95°C in Einzelstränge separiert. Senkt man anschließend die Temperatur auf 45-65°C können komplementäre DNA Oligonukleotide (Primer) an der DNA- Matrize binden (Primer-Hybridisierung). Die Temperaturspannweite ergibt sich aufgrund verschiedener Basensequenzen der jeweiligen Primer und der damit einhergehenden unterschiedlich starken Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen (annealing- Temperatur). Eine zu niedrige Temperatur führt zu unspezifischen und eine zu hohe Temperatur möglicherweise zu keiner Bindung des Primers. Der Primer bildet den Startpunkt, an dem die DNA-Polymerase am freien 3‘-Ende der DNA Nukleotide (dNTPs) weitere dNTPs hinzufügt, bis der neue Doppelstrang vollständig ist. Da auch die neu generierten DNA-Fragmente im nächsten Zyklus als Matrize dienen ergibt sich ein exponentieller Anstieg der Amplifikationsprodukte (Kettenreaktion). Bei der qPCR kann das DNA-Produkt zusätzlich während der Amplifikation quantifiziert werden. In der durchgeführten qPCR werden der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green als Reporter und ROX als passiver Referenzfarbstoff eingesetzt. Das Fluoreszenzsignal von SYBR Green zeigt die Amplifikationsrate an, da es mit der doppelsträngigen DNA interkaliert. Nur in der exponentiellen Phase kann eine valide Quantifizierung vorgenommen werden, da während dieser Zeit optimale Reaktionsbedingungen vorliegen. Als endogene Kontrolle wird -Aktin eingesetzt, da es als sogenanntes housekeeping gene konstitutiv exprimiert wird.
Die Proben werden als Triplikat angesetzt. Während des Pipettierens der Proben in eine 96- well-Platte werden die Proben über einen PCR-Cooler (Eppendorf, Hamburg, D) geschützt. Es werden nur speziell für die PCR geeignete RNA-/ DNA-freie Materialien verwendet. 20 µl des entsprechenden MasterMixes (2.11) werden in die 96-Well Platte vorgelegt. Anschließend werden 5 µl der vorverdünnten Proben in die entsprechenden Plattenvertiefungen geben.
Durch vorsichtiges Beklopfen des Plattenrandes kann ein Mischen der Komponenten erreicht werden. Die Platte wird mit einer Folie abgedeckt und mittels Rakel befestigt. Die qPCR erfolgt am 7900H Fast Real-Time PCR System (Applied Bio Systems, Darmstadt, D) Über die Software SDS 2.4 (Applied Bio Systems, Darmstadt, D) werden Einstellungen festgelegt (Standard curve, 96 well plate, Blank temp.) und die PCR gestartet. Die qPCR erfolgt in zwei repetitiven Schritten (2step PCR) und bildet folgendes Profil:
1. Aktivierung der DNA-Polymerase 95°C, 5min 2. DNA-Denaturierung + Hybridisierung 95°C, 10sek.
3. Polymerisation + Elongation 60°C, 30sek. 40 Zyklen
32 QuantiTect Primer Assays
Hs_FGFR1_1_SG (QT000102837) QIAGEN Venlo, NL
Hs_FGFR2_1_SG (QT00098560) QIAGEN Venlo, NL
Hs_FGFR3_1_SG (QT01000685) QIAGEN Venlo, NL
Hs_FGFR4_1_SG (QT00027636) QIAGEN Venlo, NL
Hs_ACTB_2_SG (QT01680476) QIAGEN Venlo, NL
QuantiFast SYBR® Green PCR Kit
HotStarTaq Plus DBA Polymerase QIAGEN Venlo, NL QuantiFast SYBR Green PCR Buffer
(balancierte Kombination aus NH4+- und K+-Ionen) SYBR Green I dye
ROX dye
2.13.1 Datenauswertung – qPCR
Die Ergebnisse aus der qPCR wurden mit einem Thermocycler (SDS 2.4; 7900H Fast Real Time PCR System, Applied Bio Systems, Darmstadt, D) generiert und anhand einer endogenen Kontrolle (Aktin-ACTB-Primer) beurteilt. Die RNA-Ergebnisse sind in ihrer relativen Expression (rel. E) dargestellt. Diese errechnet sich nach der deltaCT-Methode (nach Livak, 1997):
∆𝐶𝑇 = 𝐶𝑇𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒− 𝐶𝑇𝐴𝐶𝑇𝐵 𝑟𝑒𝑙. 𝐸 = 2−(∆𝐶𝑇)
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2.14 Stimulationsversuche
2.14.1 Kurzzeitstimulation
Eine Stimulation der HCAECs und HCASMCs mit FGF-23 in der Zeitspanne von 15 bis 60 Minuten soll zeigen, ob sich der Gehalt an sKlotho oder Stickstoffmonoxid im jeweiligen Zellkulturmedium ändert. In einer 24- Well Platte werden 106 Zellen (HCAECs oder HCASMCs) mit reduziertem Medium, welches kein FGF enthält (englisch „conditioned medium“, CdM), ausgesät. Nach 24-stündigem Wachstum werden die Zellen nach einem festen
Schema mit FGF-23, FGF-2 und Angiotensin II stimuliert. Es wird immer eine unstimulierte Kontrolle mitgeführt (Abb. 2.5). Der Überstand wird nach entsprechender Zeit entnommen und in Flüssigstickstoff schockgefroren. Zusätzlich wird auch, 60 Minuten vor Stimulationsbeginn, Klotho über einen neutralisierenden Antikörper (200ng/ml, R&D) inhibiert, um so später die NO-Freisetzung unter Klotho-Hemmung zu messen. Zum Vergleich wurde parallel die gleiche Behandlung mit der IgG-Kontrolle (entsprechend 200ng/ml, R&D) des Klotho-Antikörper durchgeführt. Zudem soll die Untersuchung des Zelllysates der HCAECs unter den gleichen Stimulationsbedingungen in Zellkulturflaschen Hinweise zur Aktivierung der eNOS und des FGFR1 geben.
2.14.2 Langzeitstimulation Eine potenzielle Auswirkung auf die Rezeptorexpression von FGFR1 und membranständigem Klotho in den HCAECs und HCASMCs durch FGF-23- Stimulation über ein bis zwei Tage soll untersucht werden. Die Zellen werden dafür gleichmäßig auf die benötigte Anzahl Zellkulturflaschen ausgesät. Nach erreichen der Konfluenz werden die Zellen mit FGF-23 und FGF-2 stimuliert.
Eingesetzt werden Konzentrationen von 50, 100 und 200 ng/ml. Es wird jeweils
