Differentielle Genexpression im Rückenmark von Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) knock-out Mäusen

der Tierärztlichen Hochschule Hannover und

der Abteilung Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover

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Differentielle Genexpression im Rückenmark von Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) knock-out Mäusen

I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer

D O K T O R I N D E R V E T E R I N Ä R M E D I Z I N (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Katrin Schlarmann aus Steinfeld (i. Oldb.)

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.

Univ.-Prof. Dr. Claudia Grothe/ PD Dr. Peter Claus

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna

Tag der mündlichen Prüfung: 14. November 2006

Meiner Familie

gewidmet

2. Literaturübersicht... 3

2.1Das Fibroblastenwachtumsfaktor (FGF) – System ... 3

2.2Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) ... 4

2.3FGF-2 knock-out Mäuse ... 6

2.3.1Herstellung transgener FGF-2 knock-out Mäuse ... 6

2.3.2Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse ... 8

2.4FGF-2 und prä-messenger RNA Spleissen ... 11

2.5Konzeptioneller Hintergrund und Ziel der vorliegenden Arbeit... 13

3. Material und Methoden ... 14

3.1Chemikalien... 14

3.2Geräte... 15

3.3Sonstiges... 16

3.4Gewebe ... 17

3.4.1Rückenmark... 17

3.4.2Striatum ... 17

3.4.3Cerebraler Cortex ... 18

3.4.4Rückenmark für die in-situ-Hybridisierung ... 18

3.5Oligonukleotide (Primer) ... 18

3.6DNA-Längenmarker... 21

3.7Enzyme... 21

3.8Puffer und Lösungen ... 22

3.8.1 RT-PCR ... 22

3.8.2DNA-Agarosegelelektrophorese ... 22

3.8.3RNA-Agarosegelelektrophorese ... 22

3.8.5 Markierung von Sonden... 23

3.8.6In-situ-Hybridisierung ... 24

3.8.7 Reagenziensets ... 25

3.8.8 Nährmedien ... 25

3.9 Versuchstiere... 26

3.9.1 Tierhaltung und Zucht ... 26

3.9.2Gewebe-Präparation... 27

3.10Allgemeine Maßnahmen beim Umgang mit RNA ... 29

3.11Isolierung von Gesamt-RNA ... 29

3.12DNase-Verdau ... 31

3.13RNA-Reinigung... 31

3.14Formaldehyd-Agarosegel-Elektrophorese ... 31

3.15RNA-Quantifizierung... 33

3.16Einzelstrang-cDNA-Synthese durch reverse Transkription... 33

3.17Semiquantitative RT-PCR (Reverse-Transkriptase-Polymerase- Kettenreaktion)………….. ... 35

3.18Agarosegel-Elektrophorese ... 39

3.19Statistische Auswertung ... 40

3.20Klonieren von PCR-Produkten... 40

3.20.1Ligation der Banden-cDNA in einen geeigneten Vektor ... 42

3.20.2 Transformation kompetenter Bakterien mit dem Vektor pGEM^®-T ... 42

3.21Plasmid-Präparation (Minipräparation) ... 44

3.22Restriktionsanalyse der Plasmid-Klone ... 45

3.23 Sequenzierung... 45

3.24In-situ-Hybridisierung (ISH)... 47

3.24.1 Perfusion und Präparation von Rückenmarksgewebe... 47

3.24.3 Paraffin-Schnitte ... 49

3.24.4Linearisierung der Plasmid-DNA ... 50

3.24.5 Nicht-radioaktive Markierung von RNA mit Digoxygenin ... 51

3.24.6 ISH an Paraffinschnitten... 52

4. Ergebnisse... 55

4.1"Screening" nach alternativ gespleissten mRNA-Transkripten im Rückenmark.. 55

4.2Signifikante Hochregulation der Expression des metabotropen Glutamatrezeptors 1 (mGluR1) im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ... 59

4.3Ionotrope Glutamatrezeptor-Expression im Rückenmark und im cerebralen Cortex von FGF-2 knock-out Mäusen... 60

4.3.1 Signifikante Hinunterregulation der Expression der AMPA-Typ- Glutamatrezeptoren 3 und 4 im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ... 61

4.3.2Keine Expressionsunterschiede der AMPA-Typ Glutamatrezeptoren im cerebralen Cortex von Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen ... 64

4.4Dopaminrezeptor-Expression im Rückenmark und im Striatum von FGF-2 knock-out Mäusen ... 65

4.4.1Signifikante Hochregulation der Dopamin1-Rezeptor Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ... 68

4.5Histologischer Nachweis von Dopamin1-Rezeptor mRNA im zervikalen Rückenmark von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen ... 69

5. Diskussion ... 72

5.1Methodische Aspekte ... 72

5.1.1Semiquantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT- PCR) ... 72

5.1.2In-situ- Hybridisierung (ISH)... 73

5.3 Alternatives Spleissen und differentielle Expression im Rückenmark... 78

5.4Differentielle Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ... 80

5.4.1 Der metabotrope Glutamatrezeptor 1 ... 80

5.4.2 Die ionotropen Glutamatrezeptoruntereinheiten 3 und 4 vom AMPA-Typ ...81

5.4.3 Der Dopamin1-Rezeptor... 83

5.5Verteilung von Dopamin- und Glutamatrezeptoren im Rattenrückenmark... 86

5.5.1Überblick über die Verteilung der Dopaminrezeptoren im Rückenmark der Ratte ... 86

5.5.2Überblick über die Verteilung der ionotropen Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ im Rückenmark der Ratte ... 89

5.5.3Überblick über die Verteilung der Gruppe I metabotropen Glutamatrezeptoren im Rückenmark der Ratte... 91

5.6FGF-2 und differentielle Expression. Welche Rolle spielt dies für den Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse? Zeigen FGF-2 knock-out Mäuse Parallelen zu neurodegenerativen Erkrankungen?... 93

6. Zusammenfassung... 100

7. Summary... 102

8. Literaturverzeichnis ... 104

A Absorption

Abb. Abbildung

ALS Amyotrophe Lateralsklerose

Amp Ampicillin

AMPA α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat

AP Alkalische Phosphatase

BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat BLAST basic local alignement search tools

bp Basenpaare

cDNA komplementäre DNA

CO2 Kohlendioxid

DEPC Diethylpyrocarbonat

DIG Digoxigenin (Farbstoff aus Digitalis purpurea)

DNA Desoxyribonucleinsäure

DNase Desoxyribonuclease

D1R Dopamin1-Rezeptor

dNTP Desoxynuleotidtriphosphat

dsDNA doppelsträngige DNA

DTT Dithiothreitol

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ES-Zellen embryonale Stammzellen

EtBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

FGF-2 Fibroblastenwachstumsfaktor-2

FGFR Tyrosinkinase-Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptoren

g Gramm bzw. Erdbeschleunigung

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase

gDNA genomische DNA

hnRNA Kern-RNA

hsDNA Heringssperma-DNA

HSPG Heparansulfat-Proteoglykane

ionoGluR ionotroper Glutamatrezeptor vom AMPA-Typ

ISH in-situ-Hybridisierung

kb Kilobase; = 1000 Basenpaare

kDa Kilodalton

ko FGF-2 knock-out Mäuse

LB Luria Bertani (Bakterienmedium)

M Molar

mA Milliampere

µg Mikrogramm

mg Milligramm

mGluR1 metabotrober Glutamatrezeptor 1 MHH Medizinische Hochschule Hannover

min Minute

µl Mikroliter

ml Milliliter

µm Mikrometer

mM Millimolar

mmHg Millimeter Quecksilbersäule; 1 mmHg = 133,322 Pascal MMLV Moloney murine leukemia virus

MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure

mRNA messenger RNA

NBT Nitroblautetrazolium

NCBI National Center for Biotechnology Information (USA) NLS nuclear localization sequence

NMDA N-Methyl-D-aspartat

N-terminal Amino-terminales Ende von Proteinen OD260 optische Dichte bei 260 nm Wellenlänge

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PFA Paraformaldehyd

pGEM^®-T Plasmid der Firma Promega (Madison, USA)

PNS peripheres Nervensystem

Poly-A⁺ Polyadenyl

RM Rückenmark

RNA Ribonucleinsäure

RNase Ribonuclease

rpm Umdrehungen pro Minute

rRNA ribosomale RNA

RT Reverse Transkriptase

RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

SDS Natriumdodecylsulfat

SF3a66 Spleissfaktoruntereinheit SF3a66

SMA Spinale Muskelatrophie

SMN survival of motoneuron protein

snRNA small nuclear RNA

snRNPs prä-mRNA Komplexe

snoRNPs ribosomale Komplexe

s.o. siehe oben

SSC (Sodium-) Natriumcitrat/ (Sodium-) Natriumchlorid

ssDNA einzelsträngige DNA

s. u. siehe unten

Tab. Tabelle

Taq-Polymerase Thermus aquaticus DNA-Polymerase

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TE Tris-EDTA-Puffer

Tm Schmelztemperatur

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

tRNA Transfer-RNA

UV Ultraviolett

V Volt

vgl. vergleiche

wt Wildtyp-Mäuse

X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-ß-D-galactosid

ZNS zentrales Nervensystem

ZTL Zentrales Tierlabor

Statistische Größen

χ Mittelwert

n Anzahl der Versuche

p Irrtumswahrscheinlichkeit (Signifikanzniveau)

SEM Standardfehler des Mittelwertes (Standard Error ot the Mean)

1. Einleitung

Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) sind während der embryonalen Entwicklung und im adulten Organismus an einer Vielzahl biologischer Prozesse, wie Mitogenese, Angiogenese, Chemotaxis, Mesoderminduktion und Differenzierung von Zellen mesodermaler und neuroektodermaler Herkunft, beteiligt (SLACK et al., 1978;

BÖHLEN, 1989; BIKFALVI et al., 1997). Die FGF-Familie umfasst derzeit 23 verschiedene Polypeptide. Der Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) ist eines davon (ORNITZ und ITOH, 2001). FGF-2 ist ein neurotropher Faktor, der die Proliferation und Differenzierung von neuronalen Präkursoren und von Gliazellen stimuliert (RAY et al., 1997). Nach Verletzungen vermittelt FGF-2 neurotrophe und neuriteninduzierende Effekte im zentralen und peripheren Nervensystem (KLIMASCHEWSKI et al., 1999; GROTHE und NIKKHAH, 2001). Hinsichtlich der Effekte von FGF-2 auf Motoneuronen gibt es eine Vielzahl von Befunden (GROTHE und WEWETZER, 1996). Exogen applizierter FGF-2 stimuliert das Überleben und die Cholinacetyltransferase-Aktivität kultivierter embryonaler bzw. postnataler Motoneurone (ARAKAWA et al., 1990; GROTHE et al., 1991; GROTHE und UNSICKER, 1992; HUGHES et al., 1993). In vivo Administration des Faktors verhindert das läsionsinduzierte Absterben postnataler Motoneurone und erhöht die Cholinacetyltransferase-Aktivität embryonaler Motoneurone (GROTHE et al., 1991;

GROTHE und UNSICKER, 1992). FGF-2 kommt in mehreren Isoformen vor, deren Bildung von einer gemeinsamen messenger RNA (mRNA) an alternativen Start- Codons translational reguliert wird. So wird die 18 kDa-Isoform am AUG Start-Codon translatiert, während die Herstellung höhermolekularer Isoformen (21 kDa, 23 kDa) an CUG Start-Codons initiiert wird (FLORKIEWICZ und SOMMER, 1989; PRATS et al., 1989; FLORKIEWICZ et al., 1991). Der unterschiedliche N-terminale Bereich der drei Isoformen führt zu verschiedenen intrazellulären Lokalisationen (BIKFALVI et al., 1995; CLAUS et al., 2003). Erst kürzlich konnte in der Abteilung Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) erstmals die spezifische Interaktion von

FGF-2 mit Proteinen der Spleissing-Maschinerie, wie dem survival of motoneuron (SMN)-Protein und der Spleissfaktoruntereinheit SF3a66, nachgewiesen werden (CLAUS et al., 2003, 2004; GRINGEL et al., 2004). SMN ist ein Spleissing- Assemblierungsfaktor und FGF-2 möglicherweise an der Regulation des Spleissens beteiligt. Diese Interaktionen lassen vermuten, dass FGF-2 einen Effekt auf alternatives Spleissen und/oder differentielle Genexpression besitzten könnte.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen die spezifischen Effekte der FGF-2-Abwesenheit auf alternatives Spleissen und differentielle Genexpression zu analysieren. Hierzu wird ein "Screening"-Experiment mit Kandidatengenen, die alternativ-gespleisste Transkripte im Rückenmark aufweisen (JENSEN et al., 2000), durchgeführt.

2. Literaturübersicht

2.1 Das Fibroblastenwachtumsfaktor (FGF) – System

Während der embryonalen Entwicklung spielen Fibroblastenwachstumsfaktoren (Fibroblast Growth Factors, FGFs) eine Rolle bei der Proliferation, Migration und Differenzierung von Zellen. Im adulten Organismus sind sie an der Aufrechterhaltung und Regeneration von Gewebe beteiligt (GROTHE und NIKKHAH, 2001; ORNITZ und ITOH, 2001; MALECKI et al; 2004). Die FGF-Familie umfasst derzeit 23 verschiedenen Polypeptide (ORNITZ und ITOH, 2001).

Fibroblastenwachstumsfaktoren bestehen aus 155 bis 268 Aminosäureresten (ORNITZ und ITOH, 2001). Alle FGFs besitzen eine sogenannte "zentrale Domäne", die aus etwa 120 Aminosäureresten besteht und in der die Sequenzübereinstimmung 30-60% beträgt. Die zentrale Domäne enthält konservierte Aminosäurereste und strukturelle Motive, die den FGFs eine gemeinsame Tertiärstruktur und die Fähigkeit, an Heparin zu binden, verleiht (ZHU et al., 1991; FAHAM et al., 1996).

Der größte Teil der im rauen endoplasmatischen Retikulum synthetisierten FGF- Proteine wird vom Golgi-Apparat in den Extrazellularraum sezerniert (MIYAMOTO et al., 1993; MIYAKE et al.,1998; MIYAKAWA et al., 1999; XU et al., 1999; OHMACHI et al., 2000; REVEST et al., 2000). FGF-1 und FGF-2 werden nicht sezerniert, da sie trotzdem in den Extrazellularraum gelangen, vermutet man, dass sie von beschädigten Zellen oder durch einen vom endoplasmatischen Retikulum-Golgi-Weg unabhängigen exozytotischen Mechanismus freigesetzt werden (MIGNATTI et al., 1992). Die dritte Gruppe (FGF-11 bis FGF-14) ist intrazellulär lokalisiert (SMALLWOOD et al., 1996; YAMAMOTO et al., 1998; MUNOZ-SANJUAN et al., 2000; WANG et al., 2000).

FGF-Proteine binden an hoch-affine transmembranäre Tyrosinkinase-Rezeptoren (FGFR). Diese bestehen aus einer extrazellulären, einer transmembranen Domäne sowie einer cytoplasmatischen Tyrosinkinase-Domäne (LEE et al., 1989; DIONNE et

al., 1990; JOHNSON und WILLIAMS, 1993). Die extrazelluläre Domäne besteht aus drei Immunglobulin-ähnlichen Schleifen (LEE et al., 1989). Die Schleifen II und III treten in Kontakt mit dem FGF-Liganden, dabei ist der COOH-terminale Anteil von Schleife III ausschlaggebend für die Bindungsspezifität (CHEON et al., 1994;

ORNITZ et al., 1996). Es sind vier FGFR bekannt, wobei durch alternatives Spleissen des COOH-Anteils der Schleife III verschiedene Spleiss-Varianten mit spezifischen Ligandenbindungs-Eigenschaften entstehen (JOHNSON et al., 1991;

VAINIKKA et al., 1992; ORNITZ et al., 1996). Die Bindung des FGF-Liganden führt zur Dimerisierung des Tyrosinkinase-Rezeptors und zur Aktivierung der Tyrosinkinase im cytosolischen Anteil. Dadurch kommt es zur Autophosphorylierung des Rezeptors. Über sogenannte SH2-Domänen können eine Reihe von Proteinen, wie z.B. Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2) oder Phospholipase Cγ, an die Phosphotyrosylreste des Rezeptors andocken. Im Falle von Grb2 erfolgt die Signaltransduktion in den Zellkern über eine Kaskade von Proteinkinasen. Bei Phospholipase Cγ-Aktivierung kommt es über die Inositoltrisphosphat (IP3)-Kaskade zur Signaltransduktion in den Kern. Beides führt zu einer Änderung der Genexpression (GOLDFARB et al., 2001).

FGF-Signale werden aber auch über niedrig-affine Rezeptoren, die aus Heparansulfat-Proteoglykanen (HSPG) bestehen, vermittelt (ORNITZ et al., 1992;

SPIVAK-KROIZMAN et al., 1994; LIN et al., 1999). Extrazellulärer FGF bindet fest an HSPG, dadurch wird die FGF-Diffusion eingeschränkt und die Interaktion mit Rezeptoren auf den Nachbarzellen gefördert (BAEG et al., 2001; MOSCATELLI et al., 1987). Zusätzlich unterstützen und stabilisieren HSPGs die Zusammenlagerung von FGF-Liganden und FGFR (SCHLESSINGER et al., 2000).

2.2 Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2)

Der Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) gehört der FGF-Familie an, die derzeit 23 verschiedene Polypeptide umfasst (ORNITZ und ITOH, 2001). Die zentrale

Domäne von FGF-2 enthält zwölf antiparallele ß-Faltblattstrukturen (ERIKSSON et al., 1991; ZHU et al., 1991). Die konservierten Aminosäure-Reste in diesen ß- Faltblattstrukturen führen zur Ausbildung der typischen dreidimensionalen Struktur, einer Kleeblattstruktur bestehend aus vier ß-Faltblatt-Blättern, die dreieckig angeordnet sind ( FAHAM et al., 1998). Konservierte basische Aminosäurereste im zehnten und elften ß-Faltblatt bilden die Heparin-bindende Region von FGF-2 (ERIKSSON et al., 1991; ZHU et al., 1991; FAHAM et al., 1998; PLOTNIKOV et al., 1999).

Das FGF-2 Gen liegt beim Menschen auf Chromosom 4, bei der Maus auf Chromosom 3 (LAFAGE-POCHITALOFF et al., 1990; MATTEI et al., 1992). Es enthält drei kodierende Exons, die durch zwei Introns getrennt sind. In Ratten kodiert Exon 1 für drei FGF-2 Isoformen (18 kDa, 21 kDa und 23 kDa), die durch alternative Initiation von einer gemeinsamen messengerRNA (mRNA) translatiert werden (FLORKIEWICZ et al., 1991). Die niedermolekulare 18 kDa-Isoform wird am AUG Start-Codon der FGF-2 mRNA translatiert, die höhermolekulare 21 kDa- und 23 kDa- Isoform dagegen am CUG Start-Codon (FLORKIEWICZ u. SOMMER, 1989; PRATS et al., 1989; ARNAUD et al., 1999). Der unterschiedliche N-terminale Bereich der drei Isoformen führt zu unterschiedlichen intrazellulären Lokalisationen. Die CUG- initiierten höhermolekularen Isoformen enthalten eine Kernlokalisationsequenz (nuclear localization sequence, NLS) im N-terminalen Bereich und eine weitere in der zentralen Domäne und sind im Zellkern lokalisiert (BIKFALVI et al., 1995; CLAUS et al., 2003). Dort ist die 23 kDa-Isoform in der Peripherie der Nukleoli, im Nukleoplasma und in Assoziation mit Chromatin aufzufinden (CLAUS et al., 2003).

Die AUG-initiierte 18 kDa FGF-2-Isoform enthält nur eine NLS in der zentralen Domäne und ist im Zytoplasma, aber auch im Zellkern lokalisiert. Im Zellkern ist die 18 kDa-Isoform mit den Nukleoli, dem Nukleoplasma und den Cajal-bodies assoziiert (CLAUS et al., 2003).

Bei der Suche nach dem für die Wahl der alternativen Initiations-Codons verantwortlichen Mechanismus wurde eine Internal Ribosome Entry Site (IRES) in der mRNA von FGF-2 entdeckt (VAGNER et al., 1995). Diese IRES ist in den ersten

176 Nukleotiden (5’ untranslatierte Region) der FGF-2 mRNA lokalisiert und steuert die Translation von den Initiations-Codons CUG 1, -2, -3 und AUG (ARNAUD et al., 1999; BONNAL et al., 2003). Kürzlich konnte festgestellt werden, dass die IRES der FGF-2 mRNA durch pathophysiologische Reize, wie z.B. Hodenreifung, Gehirnfunktionen und diabetische Hyperglykämie, aktiviert wird. Dabei konnten zwei regulatorische Elemente (IRES trans-acting factors, ITAFs) charakterisiert werden:

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AI (hnRNP AI), welches IRES aktiviert und die Translation einleitet, und p53, welches IRES inhibiert und somit die Translation verhindert (GONZALEZ-HERRERA et al., 2006).

Das FGF-2 Signal wird über hoch-affine Tyrosinkinaserezeptoren (FGFR) und niedrig-affine Heparansulfat-Proteoglykan-Rezeptoren vermittelt (BAIRD et al., 1988;

MCKEEHAN et al., 1998). Dabei bindet FGF-2 an alle vier FGFRs, weist jedoch die höchsten Affinitäten für die Spleiss-Varianten 1c, 3c und 4c auf (ORNITZ et al., 1996).

2.3 FGF-2 knock-out Mäuse

2.3.1 Herstellung transgener FGF-2 knock-out Mäuse

Die für die Generierung von FGF-2 knock-out Mäusen notwendige gezielte Mutation im FGF-2-Gen wurde von Dr. Thomas Doetschman (Departments of Molecular Genetics, Biochemistry and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 231 Bethesda Avenue, Cincinnati, Ohio 45267, USA) entwickelt (ZHOU et al., 1998):

Dabei wurde ein Austauschkonstrukt (replacement construct) hergestellt, welches zwei flankierende homologe Sequenzen enthält, zwischen denen die Mutation sitzt.

Durch ein doppeltes Cross-over in den beiden homologen Regionen wird die Originalsequenz durch die mutierte Sequenz ersetzt.

Doetschman isolierte zunächst aus der permanenten embryonalen Stammzelllinie 129P2/OlaHsd die Plasmid-DNA, welche 6,7 Kilobasen (kb) lang war. Von dieser Plasmid-DNA klonierte er ein 4 kb langes XbaI/BamHI-Fragment in das Bluescript KS II Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA). Ein 3,2 kb Hypoxanthin Phosphoribosyl- Transferase (Hprt) Minigen wurde benutzt, um ein 0,5 kb NarI/XbaI-Fragment aus der genomischen FGF-2-DNA auszutauschen. Als Negativ-Marker wurde ein Thymidin-Kinase-Gen am 3’-Ende der genomischen DNA inseriert.

Das Austauschkonstrukt wurde mittels Elektroporation in die embryonale Stammzelllinie E14TG2a transfiziert. 24 Stunden nach Elektroporation wurde mit einem Antibiotikum-haltigen Medium auf stabil transfizierte Zellen selektiert.

Anschließend, 48 Stunden nach Elektroporation, wurde Gancyclovir für 3-5 Tage hinzugegeben, welches vom Negativ-Marker (Thymidin-Kinase) in ein toxisches Produkt umgesetzt wurde. So wurden alle Zellen getötet, die den Negativ-Marker exprimieren, d.h., bei denen es zu keiner homologen Rekombination kam.

Resistente Kolonien wurden durch PCR mit einem Primerpaar für das DNA-Konstrukt getestet. Diese korrekt transfizierten ES-Zellen (E14TG2a), bei denen ein 0,5 kb Abschnitt, der 121 Basenpaare (bp) der proximalen Promotorregion und das komplette erste kodierende Exon enthielt, durch das Hprt-Minigen ersetzt wurde, wurden in Blastocysten (C57BL/6) injiziert. Die Blastocysten wiederum wurden in pseudogravide Ammenmäuse implantiert, welche die Blastozysten austrugen. Die entstandenen Tiere waren Chimären, denn sie enthielten ihr ursprüngliches Erbgut (129P2/OlaHsd) und das Erbgut aus den embryonalen Stammzellen (E14TG2a). Um herauszufinden, ob eine Transmission des DNA-Konstrukts in die Keimbahnzellen stattgefunden hat, wurden die Chimären (F0-Generation) mit dem Maus-Stamm Black Swiss (Taconic Farms, Großbritannien) verpaart. Gemäß der Mendelschen Regeln trugen etwa die Hälfte der daraus entstandenen F1-Generation das DNA- Konstrukt. Homozygote transgene Tiere erhielt man erst in der F2-Generation, die aus der Verpaarung der F1-Tiere hervorgeht. Die Genotypisierung wurde mittels der Schwanzspitzen-PCR mit einem Primerpaar für das FGF-2-Gen und einem weiteren Primerpaar für ein Fragment des Hprt-Minigens durchgeführt. Da die Black Swiss

Mäuselinie keinen genetisch identischen Hintergrund besitzt, musste dieser durch konsequente Bruder-Schwester-Verpaarung über mindestens 20 Generationen geschaffen werden.

2.3.2 Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse

FGF-2 knock-out Mäuse sind lebensfähig, entwickeln sich völlig unauffällig und erreichen die Geschlechtsreife mit 6-8 Wochen (ORTEGA et al., 1998). Beide Geschlechter sind fertil und produzieren normale Wurfgrößen, die wiederum gesund und unauffällig sind (DONO et al., 1998; ORTEGA et al., 1998; ZHOU et al., 1998).

Die FGF-2 defizienten Mäuse besitzen eine normale Lebenspanne und zeigen weder im Verhalten noch ihrer Morphologie Unterschiede zu Wildtyp-Mäusen (ZHOU et al., 1998). Die Sektion und Untersuchungen von Organen und Geweben ergaben, in Übereinstimmung mit der normalen, gesunden Erscheinung der FGF-2 knock-out Mäuse, keine auffallenden Veränderungen.

Obwohl das Gehirn der FGF-2 knock-out Mäuse makroskopisch keinen Unterschied zu Wildtyp-Mäusen zeigt (ORTEGA et al., 1998), weisen die knock-out Mäuse mikroskopisch sowohl während der embryonalen Entwicklung als auch im Erwachsenenalter Defekte in der Organisation und Differenzierung des cerebralen Cortex auf. So zeigen FGF-2 knock-out Mäuse im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen eine um 10% reduzierte Dicke des cerebralen Cortex (DONO et al., 1998). VACCARINO et al. (1999) konnten nachweisen, dass diese Reduktion durch eine Abnahme der Gesamtzellzahl, die sowohl Neurone als auch Astroglia betrifft, zustande kommt.

Schon in FGF-2 defizienten Mäuseembryonen kann am Tag 10,5 eine etwa 60%ige Reduktion von proliferierenden Zellen im pseudostratifizierten ventrikularen Epithelium (PVE) nachgewiesen werden (RABALLO et al., 2000). Man fand heraus, dass FGF-2 für die Entwicklung von cortikalen Progenitoren im dorsalen PVE notwendig ist. Das PVE ist an der Ausbildung des cerebralen Cortex beteiligt, indem es in cortikale Projektionsneurone differenziert und soll demnach hauptsächlich dazu

beitragen, dass glutamaterge pyramidale Zellen aus dem dorsalen Neuroepithelium radiär in die cortikale Platte einwandern (TAN et al., 1998). Das Fehlen von FGF-2 in diesem Entwicklungsstadium führt dazu, dass weniger glutamaterge pyramidale Zellen in die cortikale Platte einwandern. Dieses Ergebnis deckt sich mit Untersuchungen von KORADA et al. (2002). Sie fanden heraus, dass adulte FGF-2 knock-out Mäuse eine 40%ige Abnahme der glutamatergen pyramidalen Neurone im frontalen und parietalen Cortex, nicht aber im occipitalen Cortex aufweisen. Andere Zellen, wie z.B. cortikale GABA-Interneurone, sind nicht verändert. Auch sind die pyramidalen Zellen in FGF-2 defizienten Mäusen deutlich kleiner als in Wildtyp- Mäusen. Im frontalen Cortex von Wildtyp-Mäusen variiert die Zellgröße zwischen 151-200 µm². Dabei sind etwa 65% der pyramidalen Neurone größer als 151 µm². In FGF-2 knock-out Mäusen sind nur 38% der pyramidalen Neurone größer als 151 µm². FGF-2 ist also notwendig für die Regulation der Anzahl und Größe der glutamatergen pyramidalen Neurone im frontalen und parietalen Cortex. Aufgrund dieser Ergebnisse vermutete die Arbeitsgruppe, dass FGF-2 knock-out Mäuse im cerebralen Cortex eine Imbalance zwischen exzitatorischen (glutamatergen) und inhibitorischen Neuronen (GABA) besitzen und zeigten, dass die knock-out Mäuse bei Applikation von Pentobarbital (einem GABA-Rezeptor-Agonisten) einen verlängerten Nachschlaf haben. Die Defekte der FGF-2 knock-out Mäuse sind jedoch nicht nur auf den cerebralen Cortex beschränkt.

FGF-2-defiziente Mäuse weisen im Durchschnitt einen um 10 mmHg niedrigeren Blutdruck als Wildtyp-Tiere auf (DONO et al., 1998; ZHOU et al., 1998). Dieser hypotensive Phänotyp ist überraschend, da vorherige Studien gezeigt haben, dass exogen appliziertes FGF-2 eine Hypotension in normotensiven und hypertensiven Tieren hervorrief (CUEVAS et al., 1991; LAZAROUS et al., 1995). Mehrere Untersuchungen sprechen dafür, dass es sich bei dem reduzierten Blutdruck von FGF-2 knock-out Mäusen um die Konsequenz einer autonomen Dysfunktion, die mit Hypotension assoziiert ist, handelt (BANNISTER, 1988). Nach chronischer Angiotensin II-Infusion zeigen FGF-2 defiziente Mäuse einen übertriebenen Anstieg des Blutdruckes, weshalb die Ursache für den niedrigen Blutdruck keine chronische

glatte Muskel- und/oder Myocardinsuffizienz sein kann (DONO et al., 1998). Bei akuter Isoproterenol-Infusion kommt es in FGF-2 knock-out Mäusen zu einem drastischen Abfall des Blutdruckes, während Wildtyp-Mäuse keine Veränderung zeigen (DONO et al., 1998). In Zusammenhang mit einem beeinträchtigten Anstieg der Herzfrequenz sagt dieses Ergebnis aus, dass die Vasodilatation nicht durch einen Anstieg der sympathischen Nervenaktivität kompensiert wird. Dies ist ein Phänomen, das bei den meisten menschlichen Patienten mit autonomer Dysfunktion auftritt (MATHIAS, 1998). Interessanterweise wird FGF-2 und sein Tyrosinkinase- Rezeptor Typ 1 (FGFR1) in autonomen Wurzelzellen des Nucleus intermediolateralis im thorakalen Rückenmark von Ratten exprimiert (GROTHE und UNSICKER, 1990;

STACHOWIAK et al., 1994; MEISINGER et al., 1996; BLOTTNER et al., 1997) und das Überleben dieser Neurone durch exogen applizierten FGF-2 reguliert (BLOTTNER et al., 1989a; BLOTTNER und BAUMGARTEN, 1992).

Eine weitere Auffälligkeit, die man bei FGF-2 knock-out Mäusen feststellte, ist eine um etwa drei Tage verzögerte Wundheilung. So gibt es zwischen Tag 1 und 7 keinen signifikanten Unterschied in der Wundheilung von knock-out- und Wildtyp- Mäusen.

Die Verzögerung tritt erst in der zweiten Woche der Wundheilung (also ab Tag 14) auf. Bei den Wildtyp-Tieren ist nach 14 Tagen die zugefügten Hautläsionen (eine einzelne kreisrunde Hautstanze, die das gesamte Epithel erfasste; Lokalisation:

mittlerer Rücken) zu 50% verheilt. Knock-out-Tiere zeigen eine 50%ige Heilung der zugefügten Hautläsionen erst nach Tag 17 (ORTEGA et al., 1998).

Als neurotropher Faktor ist FGF-2 auch an der Entwicklung und Regeneration des Nervengewebes beteiligt (GROTHE und NIKKHAH, 2001; DONO, 2003). So zeigen FGF-2 knock-out Mäuse im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen eine Woche nach Quetschung des Nervus ischiadicus nahe der Verletzung fünfmal mehr regenerierte, myelinisierte Axone mit erhöhtem Myelin- und Axondurchmesser. Aufgrund der quantitativen Verteilung von Makrophagen und kollabierten Myelinscheiden wird vermutet, dass die Wallersche Degeneration bei FGF-2 knock-out Mäusen schneller als bei Wildtyp-Mäusen abläuft (JUNGNICKEL et al., 2004). Die Abwesenheit von FGF-2 scheint das Überleben und die Regeneration von Nervengewebe zu

beeinflussen. So kommt es nach Axotomie des Nervus ischiadicus bei Wildtyp- Mäusen zu einem normalen Verlust von sensorischen Neuronen (ca. 35%) und zu einer signifikanten Verminderung der Anzahl von calcitonin gene-related peptide (CGRP)-positiven Neuronen ( ca. 69%) in ipsilateralen lumbaren Spinalganglien. Bei FGF-2- und FGFR3 knock-out Mäusen dagegen gibt es keinen offensichtlichen Verlust von Neuronen, und die Anzahl der CGRP-positiven Neurone wird nicht signifikant verringert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass FGF-2 über den FGFR 3 entscheidend an der Regulation des Überlebens von lumbaren sensorischen Neuronen nach Nervenläsionen beteiligt ist (JUNGNICKEL et al., 2005;

JUNGNICKEL et al., 2006; GROTHE et al., 2006).

2.4 FGF-2 und prä-messenger RNA Spleissen

Unter prä-mRNA Spleissen versteht man das Entfernen der Introns aus der prä- mRNA und die Verknüpfung der Exons durch eine zweifache Umesterung. Die prä- mRNA, auch heterogene Kern-RNA (hnRNA) genannt, entsteht durch Transkription der DNA und ist eine 1:1-Kopie dieser mit einem Poly-A⁺-Schwanz. Das prä-mRNA Spleissen findet im Zellkern statt und wird in eukaryoten Zellen von einem Komplex aus mehr als 100 verschiedenen Ribonucleoproteinen und fünf kleinen RNA- Molekülen (small nuclear RNAs, snRNAs), dem sogenannten Spleissosom, durchgeführt (BURGE et al., 1999; JURICA und MOORE, 2003; NILSEN, 2003).

Durch prä-mRNA Spleissen entsteht die mRNA, welche als Informationsträger für die Proteinbiosynthese dient.

Das prä-mRNA Spleissen ist eine von mehreren Möglichkeiten, die Genexpression in eukaryoten Organismen zu regulieren, weil es nicht nur zum Entfernen der Introns dient, sondern auch unterschiedliche mRNA-Transkripte aus einer einzigen prä- mRNA entstehen lässt, was die Proteinvielfalt wesentlich erhöht. Diesen Vorgang bezeichnet man als alternatives Spleissen. Über dessen Regulation weiß man bisher recht wenig. Es ist jedoch bekannt, dass die Regulation des alternativen Spleissens

z. B. über Spleissfaktoren (Proteine, die Signale auf der prä-mRNA erkennen und die Auswahl der Spleiss-Stellen beeinflussen) erfolgt. Der Spleissfaktor SF3a120 ist ein solches Protein. SF3a120 bildet einen Komplex mit SF3a66 und SF3a60 (BROSI et al., 1993). Sowohl die 18 kDa- als auch die 23 kDa-Isoform von FGF-2 bindet direkt an die C-terminale Region von SF3a66 (GRINGEL et al., 2004). So könnte FGF-2 durch Bindung an SF3a66 den Spleissfaktor SF3a120 hinsichtlich der Auswahl von Spleiss-Stellen auf der prä-mRNA regulatorisch beeinflussen.

Des weiteren konnte in unserer Arbeitsgruppe erstmals eine direkte Bindung von FGF-2 an den N-terminalen Bereich des survival of motoneuron (SMN)-Proteins nachgewiesen werden (CLAUS et al., 2003; CLAUS et al., 2004). Das SMN-Protein ist ein Assemblierungsfaktor für ribosomale Komplexe (snoRNPs) und prä-mRNA Komplexe (snRNPs). Möglicherweise besitzt es auch Funktionen bei der Transkription (TERNS und TERNS, 2001). Im Cytoplasma ist SMN Teil eines Komplexes mit spleisseosomalen Sm-Proteinen und Gemin-2, -3 und -4 (FRIESEN u. DREYFUSS, 2000). Im Zellkern kommt SMN in den nuclear gems (Gemini der Cajal bodies) vor. Es konnte gezeigt werden, dass SMN und die 23 kDa FGF-2 Isoform in Zellkernen von Schwannzellen (Gliazellen des peripheren Nervensystems) in nuclear gems co-lokalisieren (CLAUS et al., 2003). Im Zytoplasma assembliert SMN-Protein zunächst Sm-Proteine ringförmig auf einer U2 snRNA (small nuclear RNA), wodurch der inaktive 12S U2 snRNP (small ribonucleoprotein particle)- Komplex entsteht, der einen der vier Hauptkomponenten des späteren Spleissosoms darstellt. Unsere Arbeitsgruppe konnte zudem zeigen, dass der U2 snRNP-Komplex mit FGF-2 co-immunpräzipitiert (CLAUS et al., 2004).

2.5 Konzeptioneller Hintergrund und Ziel der vorliegenden Arbeit

Deletionen bzw. Mutationen des SMN1-Gens des Menschen führen zu einer neurodegenerativen Erkrankung, der Spinalen Muskelatrophie (SMA). Obwohl SMN ubiquitär exprimiert wird, kommt es bei den betroffenen Patienten spezifisch zur Degeneration von spinalen Motoneuronen innerhalb der ersten beiden Lebensjahre.

In ihrer schwersten Ausprägung führt die Erkrankung in diesem Zeitraum zum Tod des Patienten. Die Befunde unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass der intrazelluläre Wachstumsfaktor FGF-2 mit Komponenten der Spleissing-Maschinerie (SMN und SF3a66) direkt interagiert. Es stellt sich daher die Frage, ob die Bindung von FGF-2 an die Komplexe einen regulativen Effekt auf das Spleissen ausübt. Die Abwesenheit von FGF-2 kann möglicherweise zu Veränderungen der Regulation des Spleissens führen. Über die molekulare Pathologie der SMA ist bisher nur wenig bekannt.

Möglicherweise kommt es bei Deletion des SMN1-Gens zu Störungen der Spleissing-Regulation.

Vor diesem Hintergrund sollte daher untersucht werden, ob Veränderungen des SMN-Interaktionsproteins FGF-2 zu differentiell gespleissten Transkripten führen. Ein Nachweis von alternativ gespleissten mRNA-Transkripten in FGF-2 knock-out Mäusen kann ein Hinweis auf eine mögliche regulierende Funktion dieses Faktors sein.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in Screening-Experimenten alternativ gespleisste Transkripte im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen zu charakterisieren.

Dieses Gewebe wurde zur Analyse gewählt, da einerseits verschiedene gespleisste Kandidaten-Transkripte bekannt waren und andererseits spinale Motoneurone bei der SMA degenerieren. Die durchgeführten Screening-Experimente haben keinen Nachweis alternativ-gespleisster mRNAs erbracht, jedoch konnten interessanterweise differentiell regulierte Transkripte nachgewiesen werden. Durch diesen Befund konnte ein neuer molekularer Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse beschrieben werden.

3. Material und Methoden

3.1 Chemikalien

Acrylamid BioRad, München

Agar Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Ampicillin Roth, Karlsruhe

Borsäure Fluka, Buchs, Schweiz

Bromphenolblau Na-Salz Roth, Karlsruhe

Chloroform Fluka, Buchs, Schweiz

DEPC Sigma-Aldrich, Taufkirchen

dNTP (10 mM) Gibco, Invitrogen, Karlsruhe

DTT (0,1 M) Invitrogen, Karlsruhe

Ethanol J.T. Baker, Deventer, Niederlande

Ethidiumbromid (1%) Roth, Karlsruhe

EDTA Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Formaldehyd (37%) Merck, Darmstadt

Formamid Merck, Darmstadt

Glycerol Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Heringssperma-DNA Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Isopropanol J.T. Baker, Deventer, Niederlande

Kaisers-Glyceringelatine Merck, Darmstadt

Lithiumchlorid (4 M) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Maleinsäure Sigma-Aldrich, Taufkirchen

ß-Mercaptoethanol Fluka, Buchs, Schweiz

MgCl2 J.T. Baker, Deventer, Niederlande

MOPS Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Natriumacetat Fluka, Buchs, Schweiz

Natriumchlorid Roth, Karlsruhe

Paraformaldehyd Merck, Darmstadt

PBS Fluka, Buchs, Schweiz

Random Primer (3 µg/µl) Invitrogen, Karlsruhe

Saccharose Roth, Karlsruhe

Tris Roth, Karlsruhe

TritonX-100 Roche, Mannheim

tRNA (100 mg/ml) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

X-Gal Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Xylol J.T. Baker, Deventer, Niederlande

3.2 Geräte

Autoklav LVSA 40/60 Zirbus, Bad Grund

DNA-Agarosegelelektrophoresekammer Renner, Darmstadt Kamm: 14 Zähne, 1 mm

Fluoreszenzmikroskop IX-70 Olympus, Hamburg Geldokumentation BioDocII^TM Biometra, Göttingen

Haake Thermostat C10 Roth, Karlsruhe

Hybridisieungsofen Heraeus, Hanau

Inkubator "Mini-38" Sauer, Reutlingen Lichtmikroskop CK30-F200 Olympus, Hamburg

Magnetrührer MR 2002 Heidolph, Schwabach

Makro-Pipettierhelfer Brand, Wertheim/Main

Mikrowellengerät Sharp, Hamburg

pH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin

Pipetten: Pipetman^® Gilson Abimed, Langenfeld 20 µl, 100 µl, 200 µl und 1000 µl

Reagenzglasschüttler REAX top Heidolph, Schwabach RNA-Agarosegelelektrophoresekammer:

Horizon^® 58 Gibco, Invitrogen, Karlsruhe

Rotationsmikrotom RM 2155 Leica, Nussloch Schüttelinkubator 3032/3033 GFL^®, Burgwedel Sony Digital Camera Res. 756x581 Biometra, Göttingen Sony Digital Graphic Printer Biometra, Göttingen

Spannungsgerät: Modell 250EX Gibco, Invitrogen, Karlsruhe

Sterilbank HERAsafe Heraeus, Hanau

Thermocycler Primus 25/96 MWG-Biotech, Martinsried Trockenschrank Memmert Omnilab, Hannover

UV/Vis-Spektralphotometer DU^® 520 Beckmann, München Waage Sartorius universal Sartorius, Göttingen

Wasserbad GFL^®, Burgwedel

Mikro-Zentrifuge neoLab, Heidelberg

Tisch-Zentrifuge 5415 D Eppendorf, Wessling-Berzdorf Kühlzentrifuge Z 233 MK-2 Hermle, Wehigen

Kühlzentrifuge Z 323 K Hermle, Wehigen

3.3 Sonstiges

Deckgläser (24x60 mm) Menzel-Gläser^®, Braunschweig

Glaswaren Schott, Mainz

Kimwipes^® Lite 200 Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien

Kryoröhrchen (2 ml) Nunc, Roskilde, Dänemark

Latexhandschuhe SAFESKIN (puderfrei) Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Nitrilhandschuhe SAFESKIN (puderfrei) Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Objektträger (silanisiert) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

PCR-Tubes (0,2 ml) Merck, Darmstadt

Petrischalen (Ø 10 cm) Becton Dickinson, Heidelberg Pipettenspitzen: gelb (0,2 ml), blau (1 ml) Sarstedt, Nümbrecht

Proben- und Zentrifugenröhrchen:

Falcon^® 15 ml, 50 ml Becton Dickinson, Heidelberg Reaktionsgefäße:

Eppendorf^® 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml Sarstedt, Nümbrecht Rundbodenröhrchen (10 ml) Sarstedt, Nümbrecht

3.4 Gewebe

3.4.1 Rückenmark

Rückenmarkgewebe von insgesamt 50 weiblichen 129P2/OlaHsd x Black Swiss- Mäusen (ZHOU et al., 1998) wurden für die RT-PCRs eingesetzt. Genauer gesagt, waren es 21 Wildtyp- und 29 FGF-2 knock-out Mäuse. Die PCRs wurden aus statistischen Gründen mehrmals mit unabhängigen Proben wiederholt, d. h. pro Experiment (RT-PCR) wurde neues Rückenmarkgewebe von je 3 bis 4 Wildtyp- und ebensovielen FGF-2 knock-out Mäusen eingesetzt. Das Rückenmark der im Durchschnitt 3 bis 4 Wildtyp- und 3 bis 4 FGF-2 knock-out Mäuse wurde zu jeweils einer Wildtyp- und einer FGF-2 knock-out-Probe zusammengefasst.

Einigen dieser 50 Tiere wurden ebenfalls Striatum und cerebraler Cortex entnommen (siehe unten). Die Gewebe-Präparation ist in Kapitel 3.9.2 beschrieben.

3.4.2 Striatum

Striatum von 15 weiblichen 129P2/OlaHsd x Black Swiss-Mäusen (8 Wildtyp- und 7 FGF-2 knock-out Mäusen) wurde für die RT-PCR eingesetzt.

3.4.3 Cerebraler Cortex

Cerebraler Cortex von 6 weiblichen 129P2/OlaHsd x Black Swiss- Mäusen (3 Wildtyp- und 3 FGF-2 knock-out Mäuse) wurde für die RT-PCR eingesetzt.

3.4.4 Rückenmark für die in-situ-Hybridisierung

Zusätzlich zu den 50 oben genannten Mäusen wurden 10 weitere weibliche 129P2/OlaHsd x Black Swiss- Mäuse ( 5 Wildtyp- und 5 FGF-2 knock-out Mäuse) mit 4%igem Paraformaldehyd (PFA) perfundiert, das Rückenmark entnommen, in Paraffin eingebettet und der in-situ-Hybridisierung unterzogen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 60 Mäuse verwendet.

3.5 Oligonukleotide (Primer)

Um alternatives Spleissen in FGF-2 knock-out Mäusen zu untersuchen, wurden Primerpaarsequenzen der folgenden Gene Agrin, gam2GABA, ICH-1, mGluR1 und n-src (Erläuterungen siehe unten), anhand einer wissenschaftlichen Veröffentlichung, in der man diese Primer zur Erforschung alternativen Spleissens eingesetzt hatte (JENSEN et al., 2000), entworfen. Die übrigen spezifischen Primer wurden von unserer Arbeitsgruppe ausgewählt und von der Firma MWG-Biotech AG, Martinsried, BRD, hergestellt.

Amplifizierung des Agrin-Gens (NM 021604):

Agrin_for (5’-Primer): 5’ – GGG ATA GTT GAG AAG TCA GTG GGG G – 3’

Agrin_rev (3’-Primer): 5’ – CGA AGC CAG CGG TTG GTG TTG – 3’

Amplifizierung des Dopaminrezeptor 1-Gens (D1R) (NM 010076):

D1R_for (5’-Primer): 5’ – GGT CCA AGG TGA CCA ACT TC – 3’

D1R_rev (3’-Primer): 5’ – TGC CTT GTG CCA GCT TAG CTG – 3’

Amplifizierung des Dopaminrezeptor 2-Gens (D2R) (NM 010077):

D2R_for (5’-Primer): 5’ – GTC CTG TCC TTC ACC ATC TC – 3’

D2R_rev (3’-Primer): 5’ – GGG CAT GGT CTG GAT CTC AA – 3’

Amplifizierung des Dopaminrezeptor 3-Gens (D3R) (NM 007877):

D3R_for (5’-Primer): 5’ – GCC ATC AGC ATA GAC AGG TA – 3’

D3R_rev (3’-Primer): 5’ – AGC CAG CAG ACA ATG AAG GC – 3’

Amplifizierung des Fibroblastenwachstumsfaktor-2-Gens (FGF-2) (NM 008006):

FGF-2_for (5’-Primer): 5’ – CGT CAA ACT ACA GCT CCA AGC AGA – 3’

FGF-2_rev (3’-Primer): 5’ – GGA TCC GAG TTT ATA CTG CCC AGT – 3’

Amplifizierung der gamma2-Untereinheit des GABAA-Rezeptors (gam2GABA) (NM 177408):

gam2GABA_for (5’-Primer): 5’ – GTA TGG CAC CCT GCA TTA TTT TGT – 3’

gam2GABA_rev (3’-Primer): 5’ – TTG ATT GGT TGC TGA TCT GGG ACG – 3’

Amplifizierung des Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Gens (GAPDH) (BC 064681):

GAPDH_for (5’-Primer): 5’ – CAG AAC ATC ATC CCT GCA TCC ACT – 3’

GAPDH_rev (3’-Primer): 5’ – GTT GCT GTT GAA GTC ACA GGA GAC – 3’

Amplifizierung des AMPA-typ Glutamatrezeptor 1-Gens (ionoGluR1) (NM 008165):

ionoGluR1_for (5’-Primer): 5’ – CAG TAG AGG AGG ACT TGT TAG GTT – 3’

ionoGluR1_rev (3’-Primer): 5’ – CTA GGA CAG GAA ACA GCA CAG AAG – 3’

Amplifizierung des AMPA-typ Glutamatrezeptor 2-Gens (ionoGluR2) (NM 013540):

ionoGluR2_for (5’-Primer): 5’ – CAA CAG ATG GCA CGC ATC CAT TTG – 3’

ionoGluR2_rev (3’-Primer): 5’ – CTT AAT TGT CGC TGT GTG TGC TCC – 3’

Amplifizierung des AMPA-typ Glutamatrezeptor 3-Gens (ionoGluR3) (NM 016886):

ionoGluR3_for (5’-Primer): 5’ – CCT GCT GGA GTC AAC CAT GAA TGA – 3’

ionoGluR3_rev (3’-Primer): 5’ – GAG TTT CAT GCG TTT GGA CTC TGC – 3’

Amplifizierung des AMPA-typ Glutamatrezeptor 4-Gens (ionoGluR4) (NM 019691):

ionoGluR4_for (5’-Primer): 5’ – CAC TGC TAA TCT GGC TGC ATT CCT – 3’

ionoGluR4_rev (3’-Primer): 5’ – CTG CCC TGG ACT TGT AAC AGA ACT – 3’

Amplifizierung des metabotropen Glutamatrezeptor 1-Gens (mGluR1) (BC 079566):

mGluR1_for (5’-Primer): 5’ – CCT GGG GTG CAT GTT TAC TCC – 3’

mGluR1_rev (3’-Primer): 5’ – AGG CCG TCT CGT TGG TCT TCA – 3’

Amplifizierung des Caspase 2-Gens (ICH-1) (BC 034262):

ICH-1_for (5’-Primer): 5’ – GTC TCA TCT TCA TCA ACT CC – 3’

ICH-1_rev (3’-Primer): 5’ – ATG CTA ACT GTC CAA GTC TA – 3’

Amplifizierung des Peripherin 56/58-Gens (Peph 56/58) (X 59840):

Peph 56/58_for (5’-Primer): 5’ – TGC CTG AGA TGG AGC CTC TCC AGG A – 3’

Peph 56/58_rev (3’-Primer): 5’ – GCA TGC AGA GCA GGA CTG GAT ACA G – 3’

Amplifizierung des Peripherin 61/58-Gens (Peph 61/58) (X 15475):

Peph 61/58_for (5’-Primer): 5’ – TCC CGC CTA GAA CTG GAG CGC AAG – 3’

Peph 61/58_rev (3’-Primer): 5’ – TGG CGG CGT CCG ACA GGT CAG CAT – 3’

Amplifizierung des src-Tyrosinkinase Gens (src) (M 17031):

src_for (5’-Primer): 5’ – CCA AGC TCT TCG GAG GCT TCA ACT – 3’

src_rev (3’-Primer): 5’ – CAC ATA GTT GCT GGG GAT GTA ACC – 3’

3.6 DNA-Längenmarker

λ DNA/ Pst I-Marker (47507 bp) MBI Fermentas, St. Leon-Rot

3.7 Enzyme

Apa I (10 U/µl) MBI Fermantas, St. Leon-Rot

DNase I (30 U/µl) Stratagene, Heidelberg

Hind III (10 U/µl) MBI Fermentas, St. Leon-Rot MMLV-Reverse Transkriptase (200 U/µl) Invitrogen, Karlsruhe

Proteinase K (2 µg/ml) Merck, Darmstadt

Pst I (10 U/µl) MBI Fermentas, St. Leon-Rot

Sac II (10 U/µl) Promega, Mannheim

Sp6-Polymerase (15 U/µl) Promega, Mannheim

Taq DNA Polymerase (5 U/µl) Eppendorf, Wessling-Berzdorf T3-Polymerase (50 U/µl) Stratagene, Heidelberg

T4 DNA Ligase (3 WeissU/µl) Promega, Mannheim T7-Polymerase (50 U/µl) Stratagene, Heidelberg

3.8 Puffer und Lösungen

3.8.1 RT-PCR

First Strand Buffer (5x) Invitrogen, Karlsruhe

Taq-Eppendorf-Puffer (10x) Eppendorf, Wessling-Berzdorf 500 mM KCl

100 mM Tris-HCl ; pH 8 1,5 M MgCl2

3.8.2 DNA-Agarosegelelektrophorese

DNA–Ladepuffer (6x) 2 g Saccharose

1 ml EDTA 0,5 M; pH 8 auf 5 ml dH2O

Bromphenolblau (wenig)

TBE-Puffer (1x) 54 g Tris-HCl; pH 8

27,5 g Borsäure 4,6 g EDTA Salz auf 5 l dH2O

3.8.3 RNA-Agarosegelelektrophorese

MOPS-Puffer (10x); pH 7 0,4 M MOPS

0,1 M NaAc 0,01 M EDTA

MOPS-Puffer (1x); 150 ml 15 ml 10xMOPS-Puffer 3 ml Formaldehyd (37%) 132 ml DEPC-H2O

RNA-Ladepuffer (5x) 400 µl 10xMOPS-Puffer

308 µl Formamid 200 µl Glycerin 100%

72 µl Formaldehyd

8 µl 500 mM EDTA; pH 8 12 µl DEPC-H2O

Bromphenolblau (wenig)

3.8.4 Restriktionsverdau

Puffer B+ (10x) für Enzym Apa I MBI Fermentas, St. Leon-Rot Puffer C (10x) für Enzym Sac II Promega, Mannheim

Puffer O+ (10x) für Enzym Pst I MBI Fermentas, St. Leon-Rot Puffer R (10x) für Enzym Hind III MBI Fermentas, St. Leon-Rot REact 4-Puffer (10x) MBI Fermentas, St. Leon-Rot

3.8.5 Markierung von Sonden

Transkriptionspuffer (5x) für T7-Polymerase Stratagene, Heidelberg Transkriptionspuffer (5x) für T3-Polymerase Stratagene, Heidelberg Transkriptionspuffer (5x) für Sp6-Polymerase,

DTT (100 mM) Promega, Mannheim

RNase –Inhibitor (40 U/µl) Stratagene, Heidelberg

3.8.6 In-situ-Hybridisierung

Dehnhardt’s Solution Sigma-Aldrich, Taufkirchen Maleinsäurepuffer (pH 7,5) 100 ml 1 M Maleinsäure

150 ml 1 M NaCl

auf 1000 ml DEPC-H2O

PBS-Puffer (pH 7,4) 0,2 g KCl

0,2 g KH2PO4

1,15 g Na2HPO4

8 g NaCl

auf 1000 ml DEPC-H2O TE-Puffer (pH 7,4) 50 ml 1 M Tris-HCl; pH 7,4

1 ml 0,5 M EDTA ; pH 8 auf 500 ml DEPC-H2O Trisalinepuffer (pH 9,5) 100 ml 1 M Tris-HCl; pH 8

100 ml 1 M NaCl 50 ml 1 M MgCl2

auf 1000 ml DEPC-H2O

20x SSC-Puffer (pH 7) 87,65 g NaCl

44,1 g Natrium-Citrat auf 500 ml DEPC-H2O

3.8.7 Reagenziensets

DIG RNA Labeling Mix (10x konz., 40 µl) Roche, Mannheim DIG Nucleic Acid Detection Kit Roche, Mannheim

• Markierte Kontroll-DNA

• DNA-Verdünnungspuffer

• Anti-DIG-AP-Konjugat (750 U/ml)

• NBT/BCIP-Stammlösung

• Blocking-Reagenz (1%)

LigaFast^TM Rapid DNA Ligation System Promega, Madison, USA

• T4 DNA Ligase (3 WeissU/µl)

• 10x Rapid Ligation Buffer

pGEM^®-T Vector (50 ng/µl) Promega, Madison, USA QIAprep^® Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden

QIAquick^® Spin Kit Qiagen, Hilden

RNeasy^® Mini Kit Qiagen, Hilden

TRIzol^® Reagenz Invitrogen, Karlsruhe

3.8.8 Nährmedien

LB-Medium (pH 7,5) 10 g Trypton

5 g Hefeextrakt 5 g NaCl

mit dH2O auf 1000 ml autoklavieren

LB-Agar LB-Medium 1,5% Agar

autoklavieren, unter 50°C abkühlen lassen, dann Antibiotikum zugeben

3.9 Versuchstiere

3.9.1 Tierhaltung und Zucht

Homozygote FGF-2 knock-out- und die dazugehörigen heterozygoten Wildtyp-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) bezogen. Sie wurden ursprünglich durch gezielte homologe Rekombination generiert und hatten einen gemischten 129P2/OlaHsd x Black Swiss Hintergrund (ZHOU et al., 1998). Durch Bruder-Schwester-Verpaarung wurde die Zucht fortgeführt, um genetisch identische Tiere, die sich nur im FGF-2-Gen unterscheiden, zu erhalten. Jedes dieser Tiere wurde mittels Schwanzspitzen-PCR genotypisiert (ZHOU et al., 1998). Die heterozygoten FGF-2 Wildtyp-Mäuse wurden mit einem Primerpaar für das FGF-2- Gen (oIMR840, oIMR841) identifiziert. Um homozygote FGF-2 knock-out Mäuse zu identifizieren, wurde zusätzlich ein weiteres Primerpaar (oIMR775, oIMR876) eingesetzt, welches ein Fragment des in den FGF-2 Locus inserierten Hprt (Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase) -Minigens amplifizierte.

Im Rahmen der Arbeit wurden 60 weibliche 129P2/OlaHsd x Black Swiss Mäuse aus eigener Zucht verwendet. Für die Gewebe-Präparation und in-situ-Hybridisierung wurden nur adulte ca. 8 Wochen alte, weibliche Tiere mit einem durchschnittlichen Gewicht von 23 ± 5 g eingesetzt. Die Mäuse wurden im Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) in Gruppen von 4-5 Tieren bei einer Raumtemperatur von 22 ± 2°C, einer Luftfeuchtigkeit von 55 ± 5% und einem künstlichen Tag/Nacht-Rhythmus von jeweils 12 Stunden in Makrolon-Käfigen

(TypIII) auf Standardeinstreu für Labortiere (Altromin, Altrogge, Lage, BRD) gehalten.

Die Tiere erhielten Altromin-Haltungsfutter (Altrogge, Lage, BRD) und Wasser ad libitum.

3.9.2 Gewebe-Präparation

3.9.2.1 Gewinnung von Rückenmarkgewebe

Für die Tötung von Wirbeltieren zu wissenschaftlichen Zwecken galt § 4 Abs. 3 des Tierschutzgesetzes in der Fassung vom 25.5.1998. Die Tötung der Mäuse im Rahmen dieser Arbeit wurde dem Tierschutzbeauftragten der MHH (Herrn Prof. Dr.

Hedrich, Institutsleiter des ZTL) angezeigt. Es wurden nicht mehr Tiere getötet, als für den verfolgten Zeck erforderlich waren.

Die Mäuse wurden einzeln durch 5-minütige Kohlendioxid (CO2)-Einleitung in den Tierkäfig getötet.

Anschließend wurde das Tier in Bauchlage fixiert. Das Fell wurde mit 70%igem Ethanol befeuchtet, um bei der Präparation Verunreinigungen durch Haare zu vermeiden. Das Operationsbesteck wurde zur Keimabtötung ebenfalls in 70%igem Alkohol aufbewahrt. Mit einer chirurgischen Pinzette (No. 08-231-130, Allgaier Instrumente GmbH, Frittlingen, BRD) wurde die Rückenhaut 1 cm kranial der Schwanzwurzel angehoben und mit einer Metzenbaumschere (Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD) eine horizontale Inzision gesetzt. Diese wurde zu beiden Seiten in einem Bogen nach kranial fortgeführt und die Haut anschließend von kaudal nach kranial stumpf von der Unterlage gelöst und nach kranial umgeschlagen.

Es folgte die Freipräparation der Wirbelsäule. Diese wurde mit einer chirurgischen Pinzette fixiert, leicht angehoben, anschließend wurden mit einer geraden, spitzen Schere (No. 04-124-145, Allgaier Instrumente GmbH, Frittlingen, BRD) an beiden Seiten parallel zur Wirbelsäule die Bauch- und Brusthöhle eröffnet. Die Wirbelsäule wurde unter Schonung der Körperhöhlenorgane nach dorsal freipräpariert und ein

Tupfer untergelagert. Mit einem Einmalskalpell (No. 10, Medizin AG, Köln, BRD) wurde die Wirbelsäule kranial der Schwanzwurzel quer eingeschnitten. Die weitere Präparation wurde unter Zuhilfenahme eines Operationsmikroskopes (OPMI 9, Carl Zeiss AG, Oberkochen, BRD) durchgeführt. In den Wirbelkanal (Canalis vertebralis) wurde eine feine, spitze Schere (No. 15003-08, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD) eingeführt und damit der Wirbelbogen (Arcus vertebrae) unterhalb der Gelenkfortsätze (Processus articulares) an beiden Seiten unter Schonung des Rückenmarks eingeschnitten. Der dorsale Teil der Wirbelsäule wurde so von kaudal nach kranial abgetrennt und das Rückenmark freigelegt.

Mit einem Einmalskalpell (No. 15, Medizin AG, Köln, BRD) wurde ein Querschnitt durch das Rückenmark kranial der Intumescentia cervicalis und auf Höhe des Conus medullaris vorgenommen. Unter Zuhilfenahme einer Uhrmacherpinzette (Dumont No.

5, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD) und des Skalpells (No. 15) wurde das Rückenmark vorsichtig nach Durchtrennung der Spinalnerven herausgelöst und sofort in beschriftete 1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Wessling-Berzdorf, BRD) überführt. Diese wurden in flüssigem Stickstoff gelagert.

3.9.2.2 Gewinnung von bestimmten Großhirnabschnitten

Die Anleitung zur Präparation von Striatum und cerebralem Cortex wurde vorgenommen nach "A Dissection and Tissue Culture Manual of the Nervous System" (SHAHAR, VELLIS, VERNADAKIS und HABER, 1989). Zur genaueren Orientierung wurde "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates" (PAXINOS und FRANKLIN, 2001) hinzugezogen. Mit einer Vannas-Mikroschere (No. 15003-08, Fine Science Tools, Heidelberg, BRD) wurde die Schädeldecke vorsichtig abpräpariert und so das Gehirn freigelegt. Nach Durchtrennung der ventral verlaufenden Gehirnnerven mit einem Sterilskalpell (No. 15) wurde das Gehirn mit einer Uhrmacher Pinzette (No. 5) aus dem Schädel entnommen und mit der dorsalen

Fläche auf eine Glasplatte gelegt, so dass die ventrale Fläche sichtbar war. Um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden, wurde das Gehirn mit isotonischer Kochsalz-Lösung (0,9%, Braun GmbH, Melsungen, BRD) befeuchtet. Es erfolgte ein transverser Schnitt durch das Gehirn vor dem Chiasma opticum und ein zweiter transverser Schnitt auf Höhe des Chiasma opticums. Die Gewebescheibe wurde auf die vordere Schnittfläche gelegt. Nun erfolgten zwei horizontale Schnitte, um das Striatum vom cerebralen Cortex darüber und dem basalen Vorderhirn darunter zu trennen. Dann wurden zwei vertikale Schnitte vorgenommen, um das Striatum vom medialen Septum und dem lateralen Cortex abzugrenzen.

Striatum und cerebraler Cortex wurden getrennt in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und in flüssigem Stickstoff gelagert.

3.10 Allgemeine Maßnahmen beim Umgang mit RNA

RNA ist sehr anfällig gegenüber äußeren Einflüssen (alkalische Hydrolyse, hohe Temperaturen) und wird leicht degradiert. Insbesondere Ribonukleinsäure abbauende Enzyme (RNasen) stellen eine große Gefahr dar, da diese sehr stabil sind, ubiquitär vorkommen und in der Regel keine Kofaktoren (SELA et al., 1957;

BLACKBURN und MOORE et al., 1982) benötigen.

Um Kontaminationen der Proben mit RNasen und damit ihre Zerstörung zu verhindern, wurden Gefäße und Gebrauchsgegenstände vor Benutzung bei 121°C autoklaviert oder mit DEPC-Wasser behandelt. Außerdem wurden sterile Einmalhandschuhe getragen und die Proben während des Pipettierens auf Eis gelagert.

3.11 Isolierung von Gesamt-RNA

Die Isolierung der Gesamt-RNA erfolgte unter Verwendung von TRIzol^® (Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, BRD) gemäß der dazugehörigen Anleitung. TRIzol^® ist

eine gebrauchsfertige Lösung aus Phenol und Guanidiniumisothiocyanat, die zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen und Geweben eingesetzt wird. Die Verwendung von TRIzol^® stellt eine Verbesserung der RNA-Isolierungsmethode nach CHOMCZYNSKI und SACCHI (1987) dar.

Die mit flüssigem Stickstoff tiefgefrorenen Gewebeproben wurden abgewogen und mit 0,75 ml TRIzol^® pro 100 mg Gewebe in einen 1 ml Potter (Wheaton, USA) überführt. Dieser wurde zuvor einige Minuten mit DEPC-Wasser behandelt, um RNasen zu reduzieren. Das Gewebe wurde sofort homogenisiert, 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann in 2 ml-Reaktionsgefäße überführt.

Anschließend erfolgte eine Zugabe von 0,2 ml Chloroform pro 0,75 ml TRIzol^®. Die Reaktionsgefäße wurden verschlossen und 15 Sekunden kräftig von Hand geschüttelt. Nach dreiminütiger Inkubation wurde das Gemisch 10 Minuten mit

12000 x g bei 4°C in einer Kühlzentrifuge (Z 233 MK-2, Hermle, Wehigen, BRD) zentrifugiert. Im Anschluss an die Zentrifugation erhält man drei Phasen: eine untere organische Phase (Phenol-Chloroform-Phase), eine mittlere feste und eine obere wässrige Phase. Diese enthält die Gesamt-RNA und wurde deshalb in neues 1,5 ml- Reaktionsgefäß überführt. Dabei wurde eine Verunreinigung durch die Interphase, welche die DNA der Zellen enthält, vermieden. Anschließend wurde 0,5 ml Isopropanol pro 0,75 ml TRIzol^® zum Fällen der RNA zugegeben, gut gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde 10 Minuten mit 12000 x g bei 4°C zentrifugiert. Danach wurde der Überstand entfernt und das Sediment mit 75%igem Ethanol gewaschen. Wiederum wurde 5 Minuten mit 7500 x g bei 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen und das RNA-Präzipitat 10 Minuten bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Abschließend wurde das RNA-Pellet in 50 µl autoklaviertem DEPC-Wasser durch 10-minütiges Erhitzen auf 55°C im Wasserbad (GFL^® , Burgwedel, BRD) gelöst. Die Gesamt-RNA wurde kurzzeitig bei –20°C gelagert.

3.12 DNase-Verdau

Da das Vorhandensein von DNA-Kontaminationen in der gelösten RNA nicht auszuschließen war, wurde ein DNase-Verdau vorgenommen.

Dazu wurden 50 µl RNA-Lösung, 20 µl 5x DNaseI-Reaktionspuffer (Stratagene, Heidelberg, BRD), 10 µl RNase-freie DNaseI (30 U/µl, Stratagene, Heidelberg, BRD) und 20 µl dH2O gemischt und 15 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert.

Durch Zugabe von 4 µl EDTA 0,5 M (pH 8), 12,5 µl 4 M LiCl und 377 µl 100%igem Ethanol wurde die RNA gefällt und gleichzeitig das Enzym DNaseI inaktiviert. Sofort im Anschluss wurde die RNA 30 Minuten bei –20°C gelagert. Zur Weiterverwendung wurde die gefällte RNA zunächst durch 15-minütige Zentrifugation mit 12 000 x g bei 4°C pelletiert. Danach wurde der Überstand entfernt und das Pellet mit 100 µl 70%igem Ethanol gewaschen (10 Minuten mit 12 000 x g bei 4°C). Der Überstand wurde verworfen, das Pellet erneut 5 Minuten mit 12 000 x g bei 4°C zentrifugiert.

Der restliche Überstand wurde entfernt, das RNA-Pellet 10 Minuten bei Raumtemperatur luftgetrocknet und anschließend in 50 µl DEPC-Wasser aufgenommen.

3.13 RNA-Reinigung

Die Gesamt-RNA, die für die Genexpressionsanalysen eingesetzt wurde, musste einen sehr hohen Reinheitsgrad aufweisen. Aus diesem Grund wurde die Gesamt- RNA nach dem DNase-Verdau zusätzlich aufgereinigt gemäß dem "RNeasy^® Mini Protocol for RNA Clean-up" (Qiagen, Hilden, BRD).

3.14 Formaldehyd-Agarosegel-Elektrophorese

Nukleinsäuremoleküle sind bei pH 7 aufgrund ihres Zucker-Phosphat-Rückgrates negativ geladen und wandern deshalb in einem elektrischen Feld in Richtung der

Anode. Dabei ist ihre Wanderungsgeschwindigkeit abhängig von ihrer Größe und Konformation. Unterschiedlich lange Nukleinsäuremoleküle lassen sich also voneinander trennen, indem man sie im elektrischen Feld durch eine Agarosematrix wandern lässt. Da sich bei zunehmender Agarosekonzentration die Dichte des Agarosegels verändert, werden verschiedene Trennbereiche optimal erfasst.

Die Nukleinsäuren wurden durch den interkalierenden und fluoreszierenden Farbstoff Ethidiumbromid (EtBr) unter UV-Bestrahlung als sogenannte Banden im Gel sichtbar gemacht.

Die Kontrolle des DNase-Verdaus erfolgte anhand des Laufverhaltens der Gesamt- RNA in einem 1%igen Agarosegel, das mit MOPS-Puffer und Formaldehyd angesetzt wurde. Formaldehyd wurde zugesetzt, um die RNA zu denaturieren und ubiquitär vorkommende RNasen zu inaktivieren.

Zur Herstellung eines 35 ml-Gels wurden 0,42 g Agarose in einen Erlenmeyerkolben eingewogen, 30,5 ml autoklaviertes DEPC-Wasser und 3,5 ml 10x MOPS-Puffer zugegeben. Das ganze wurde in einem Mikrowellengerät erhitzt, bis die Agarose vollständig gelöst war. Nach Abkühlung auf 50°C wurden 1 ml Formaldehyd (37%) und 1 µl Ethidiumbromid (1%ige-Lösung) hinzupipettiert und durch vorsichtiges Schwenken gemischt. Dieser Schritt erfolgte, ebenso wie die nachfolgenden, im Abzug. Anschließend wurde die flüssige Gel-Masse blasenfrei in den integrierten Gelträger der Elektrophoresekammer des Horizon^® 58-Gerätes (Gibco BRL, Invitrogen GmbH, Karlsuhe, BRD) gegossen und ein Kamm (8 Zähne) eingesetzt.

Während des Abkühlens entstanden dadurch Geltaschen zum Einbringen der Probe.

Nach Erstarrung des Gels und Entfernung des Kammes wurde die Elektrophoresekammer mit 1x MOPS-Puffer gefüllt.

10 µl Gesamt-RNA-Probe wurde mit 2 µl 5x RNA-Ladepuffer versetzt. Nach 5- minütiger Denaturierung bei 65°C im Wasserbad wurden die Proben sofort auf Eis gekühlt und in die Taschen des Gels pipettiert. Die Denaturierung bewirkte eine Auflösung der Sekundärstrukturen der RNA. Die Elektrophorese wurde mit 70 V für 60 Minuten durchgeführt. Unter UV-Licht wurden die Banden dargestellt und

fotodokumentiert. Als intakt wurde die RNA bewertet, wenn die 18S- und die 28S- ribosomale RNA-Bande klar sichtbar waren und die 28S-RNA-Bande eine höhere Intensität aufwies.

3.15 RNA-Quantifizierung

In einem UV/Vis-Spektrophotometer DU^® 520 (Beckmann, München) wurde die Konzentration der gelösten RNA durch eine Absorptionsmessung (A) bei 260 und 280 nm Wellenlänge in einer Quarzküvette festgestellt. Hierzu wurde die RNA 1:20 in dH2O verdünnt. Als Leerwert diente die Absorption von reinem dH2O.

Der RNA-Reinheitsgrad wurde über den Quotient A260/A280 bestimmt. Bei einer reinen RNA-Präparation liegt der Wert des Quotienten bei Messung in dH2O bei 1,9 bis 2,1. Die Absorption wird als optische Dichte (OD) angegeben und ist proportional zur Konzentration der absorbierbaren Teilchen (Nukleinsäuren).

Die Gesamt-RNA-Konzentration (c) wurde wie folgt quantifiziert:

1 OD260 =ˆ 40 µg RNA/ml

c [µg/ml] = A260 x Verdünnungsfaktor x 40 µg/ml

3.16 Einzelstrang-cDNA-Synthese durch reverse Transkription

Einzelsträngige RNA-Moleküle werden aufgrund ihrer 2’-OH-Gruppe relativ leicht degradiert. Um die Sequenz einer RNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren, muss sie erst in einzelsträngige stabilere DNA umgeschrieben werden. Hierfür macht man sich die charakteristische Eigenschaft von Retroviren zunutze, mit Hilfe einer Reversen Transkriptase ihre genetische Information, die in Form von RNA vorliegt, nach Infektion von eukaryonten Zellen

durch Synthese von DNA-RNA-Hybriden in komplementäre DNA (cDNA) umzuschreiben. In vitro wird die Fähigkeit der Reversen Transkriptase ausgenutzt, um an die Einzelstrang-RNA zu binden und einen komplementären DNA-Strang zu synthetisieren. Dieser cDNA-Strang lässt sich dann als Vorlage (Template) in der Polymerase-Kettenreaktion einsetzen. Man spricht auch von einer RT-PCR (Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, siehe 3.17), da der PCR eine reverse Transkription vorausgegangen ist.

Zuerst werden RNA und Primer, hier Hexamerprimer, zusammen pipettiert und dann auf 70°C erhitzt, um die Sekundärstrukturen der RNA aufzulösen. Durch das langsame Abkühlen auf Raumtemperatur können die Hexamerprimer an die mRNA hybridisieren. Die sogenannten Hexamerprimer (random hexamers) hybridisieren irgendwo zufällig an die mRNA, wodurch später alle mRNA-Bereiche in der cDNA vertreten sind. Somit entstehen kurze Stücke doppelsträngige Nukleinsäure (priming), die als Ansatzpunkte für die Reverse Transkriptase dienen. Nun gibt man Puffer, Nukleotide, RNase-Inhibitor und Reverse Transkriptase hinzu und inkubiert 90 Minuten bei 42°C, dem Temperaturoptimum der Reversen Transkriptase. Für molekularbiologische Zwecke wird die klonierte Mäuse-Leukämie-Virus-Reverse- Transkriptase (MMLV-RTase) eingesetzt, weil die intrinsische RNase H-Aktivität der MMLV-RTase ausreichend ist, um die nach der cDNA-Synthese verbleibenden intakten mRNA-Moleküle zu degradieren, die sonst mit der cDNA als Schablone konkurrierend die PCR stören.

Um die Expression von mRNA-Transkripten in unterschiedlichen Geweben (hier:

Rückenmark, Striatum und cerebraler Cortex) vergleichen zu können, mussten für die beiden Proben (Probe 1 = FGF-2 knock-out-Gewebe, Probe 2 = Wildtyp- Gewebe) jeweils gleiche RNA-Konzentrationen geschaffen werden. Durch die RNA- Quantifizierung (3.15) wurde zunächst die Gesamt-RNA-Konzentration der beiden Proben in µg/µl bestimmt. Laut Protokoll konnten maximal 17 µl RNA-Lösung eingesetzt werden. Also wurde zuerst bestimmt, wieviel µg RNA sich in 17 µl der Probe mit der geringeren Gesamt-RNA-Konzentration befanden. Daraus ergab sich die Menge an RNA in µg, die in beiden Proben nachher vorhanden sein sollte. Diese

wurde dann durch die Probe mit der höheren Gesamt-RNA-Konzentration dividiert, wodurch sich ergab, wieviel µl RNA-Lösung von dieser Probe eingesetzt werden mussten, um auf die gewünschte RNA-Menge (µg) zu kommen. Um auf 17 µl RNA- Lösung zu kommen, wurde mit RNase-freiem Wasser aufgefüllt. Beide Proben enthielten nun in jeweils 17 µl RNA-Lösung die gleiche Menge an RNA in µg.

Zu der RNA-Lösung (17 µl) wurden 2 µl Random Primer (3 µg/µl) und 5 µl First Strand Buffer (5x)

zugegeben und 2 Minuten bei 70°C im Wasserbad inkubiert.

Nach einer Abkühlung auf Eis wurden 5 µl ddH2O

4 µl DTT (0,1 M)

3 µl First Strand Buffer (5x) 2 µl dNTP (10 mM)

1 µl MMLV-Reverse Transkriptase (200 U/µl) 1 µl RNase-Inhibitor (40 U/µl)

hinzupipettiert.

Nach vorsichtigem Mischen erfolgte eine 90-minütige Inkubation bei 42°C im Wasserbad. Zum Schluss wurde der Ansatz wieder auf Eis gekühlt. Das endgültige Volumen pro Probe betrug 40 µl.

Die cDNA wurde bei –20°C gelagert.

3.17 Semiquantitative RT-PCR (Reverse-Transkriptase-Polymerase- Kettenreaktion)

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist eine in vitro- Technik zur Vervielfältigung bzw. Amplifizierung eines spezifischen Genfragments