In-situ- Hybridisierung (ISH)

Die ISH ist eine komplexe Methode zum Nachweis von mRNA vor Ort (in situ). In der zugrundeliegenden Arbeit wurde mit dieser Methode die zelltypspezifische Expression von D1R-mRNA in zervikalen Rückenmarksschnitten von Wildtyp- und FGF-2 knock-out-Mäusen untersucht. Hier soll ausdrücklich darauf hingewiesen werden, dass keine Aussagen über Expressionsunterschiede zwischen den beiden Mäusegruppen gemacht werden können, da die ISH keine quantitative Methode ist.

Als Negativkontrolle wird die mRNA sense Sonde verwendet, deren Sequenz der zellulären mRNA entspricht. Die antisense Sonde dagegen ist komplementär zur zellulären mRNA und ermöglicht deren Nachweis im Gewebepräparat (LEITCH et al., 1994). Es ist jedoch bekannt, dass auch die sense Sonde zu einer spezifischen Färbung führen kann. Ursache dafür sind sogenannte antisense RNAs, die neben der eigentlichen, kodierenden sense RNA (mRNA) vom Gegenstrang der DNA abgelesen werden. Dieses Phänomen wurde bei der Maus bei speziellen

Hitze-Schock Genen nachgewiesen (MURASHOV und WOLGEMUTH, 1996). Im Rahmen dieser Arbeit konnte keine spezifische Färbung durch die sense Sonde bei dem untersuchten Gen festgestellt werden. Sofern in entsprechenden Experimenten positive Signale auftreten, sollte die sense Sonde als Negativkontrolle hinterfragt werden.

Für eine erfolgreiche ISH sind drei Kriterien von besonderer Bedeutung. Erstens, die Integrität der Ziel-mRNA in den Gewebeschnitten, die entscheidend von der Gewebeaufbereitung abhängt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Paraffineinbettung gewählt, da die Morphologie des Gewebes erhalten bleibt, und somit eine hohe zelluläre Auflösung gewährleistet wird. Ein Verlust von bis zu 30%

der mRNA wurde dabei in Kauf genommen (LEITCH et al., 1994; JIN und LLOYD, 1997). Als zweites Kriterium spielt die Fähigkeit der Sonde, das Gewebe zu penetrieren, eine wichtige Rolle. Hierzu muss das Gewebe entsprechend vorbereitet werden. Es wurde ein Proteinase K - Verdau durchgeführt, da Proteine besonders nach Gewebefixierungen mit Paraformaldehyd (PFA) die mRNA im Gewebeschnitt maskieren können. Dabei durfte die Intensität des Verdaus nicht zu stark sein, weil sonst die mRNA freigesetzt wird, somit aus dem Gewebe verloren geht und zusätzlich die Gewebemorphologie angegriffen wird (MILLAR et al., 1993).

Anschließend wurde mit 4%igem PFA nachfixiert, um einem weiteren Verlust von Nukleinsäuren vorzubeugen (JIN und LLOYD, 1997). Eine Prähybridisierung in der späteren Hybridisierungslösung sollte das Gewebe auf die Bedingungen während der Hybridisierung vorbereiten. Um Hintergrundsignale zu reduzieren, enthielt die Hybridisierungs-Lösung spezifische DNA (Heringsperma-DNA), nicht-spezifische RNA (tRNA) und Denhardt’s-Lösung (SINGER et al., 1986). Durch den Zusatz von monovalenten Kationen (Na⁺ in SSC) wurde die Stabilität des Nukleinsäurehybrids durch elektrostatische Wechselwirkungen erhöht. Als Sonden wurden Sonden verwendet, da Hybride wesentlich stabiler als RNA-DNA-Hybride sind. Zudem sind sie sehr spezifisch und bis zu zehnmal sensitiver als DNA-Sonden (SCHENBORN und MIERENDORF, 1985). Nachteilig war die recht aufwendige Herstellung der RNA-Sonden durch in vitro-Transkription von einem

Transkriptionsvektor (Plasmid) und die Empfindlichkeit gegenüber ubiquitär vorkommenden RNasen, weshalb Bedingungen für RNase-freies Arbeiten geschaffen werden mussten. Das dritte Kriterium ist ein sensitives Nachweissystem, das schon geringe Mengen an Sonden-RNA-Hybriden sichtbar macht und eine möglichst geringe Hintergrundfärbung besitzt. Es wurde die indirekte nicht-radioaktive Markierung mit Digoxigenin eingesetzt, da der hochspezifische Anti-Digoxigenin-Antikörper nicht an tierisches biologisches Material bindet (HERRINGTON et al., 1989).

5.2 Zusammenfassung der Ergebnisse

Nachdem Interaktionen des Fibroblastenwachstumsfaktors-2 (FGF-2) mit generellen Komponenten des Spleissosom-Komplexes, wie dem survival of motoneuron (SMN)-Protein und der Spleissfaktoruntereinheit SF3a66 (CLAUS et al., 2003; CLAUS et al., 2004; GRINGEL et al., 2004), nachgewiesen werden konnten, lag die Vermutung nahe, dass FGF-2 eine Rolle beim prä-mRNA-Spleissen spielt. Der Nachweis von alternativem Spleissen bestimmter Transkripte bei Abwesenheit von FGF-2 in knock-out Mäusen wäre ein Hinweis auf die mögliche regulatorische Funktion von FGF-2 während des Spleissing-Prozesses. Hierzu wurde zunächst ein "Screening"-Experiment durchgeführt, bei dem bekannte, alternativ-gespleisste Transkripte im Rückenmark analysiert wurden. Diese Suche ergab in FGF-2 knock-out Mäusen keinen Hinweis auf alternativ-gespleisste mRNAs, erbrachte aber den Nachweis, dass mehrere Gene im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen differentiell exprimiert werden. So konnte mittels semiquantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gezeigt werden, dass sowohl die Expression des metabotropen Glutamatrezeptors 1 (mGluR1) als auch die des Dopamin1 -Rezeptors (D1R) im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen signifikant hochreguliert wird, während die Expression der ionotropen AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren 3 und 4 im Rückenmark dieser Mäuse signifikant

hinunterreguliert wird. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 15 zusammenfassend dargestellt.

FGF-2 knock-out Mäuse weisen eine signifikante Abnahme der glutamatergen pyramidalen Neurone im cerebralen Cortex auf (KORADA et al., 2000). Bei der Untersuchung der Expression ionotroper Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ im cerebralen Cortex von FGF-2 knock-out Mäusen wurden im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen keine Expressionsunterschiede festgestellt (Abb. 15). Da dopaminerge Fasern aus der Substantia nigra das Striatum innervieren und die Expression des D1R im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen hochreguliert wird, erfolgte eine Überprüfung der Expression im Striatum dieser Mäuse. Es waren im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen keine Unterschiede hinsichtlich der D1R-mRNA-Expression im Striatum sichtbar (Abb. 15). Mit der ISH konnte die zelluläre Lokalisation der D1 R-mRNA-Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen geklärt werden. Durch Verwendung von DIG-markierten antisense-D1R-RNA-Sonden lies sich die D1R-mRNA-Expression in multipolaren Nervenzellen der gesamten grauen Substanz des zervikalen Rückenmarks nachweisen. Besonders deutlich fiel der Nachweis in multipolaren Wurzelzellen des Ventralhorns aus. Die Größe, Lage und Struktur dieser Zellen (Perikaryon, Dendriten, Axon) lassen den Schluss zu, dass es sich dabei um Motoneurone handelt. Hinsichtlich der zellulären Verteilung der D1R-mRNA-Expression im zervikalen Rückenmark war kein Unterschied zwischen FGF-2 knock-out und Wildtyp-Mäusen erkennbar (Abb. 15).

Abb. 15: Schematische Übersicht der Ergebnisse

Abbildung 15 zeigt schematisch die Expressionen des metabotropen Glutamatrezeptors 1 (mGluR1), der ionotropen AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren 3 und 4 (ionoGluR3+4) und des Dopamin1-Rezeptors (D1R) im Rückenmark sowie im cerebralen Cortex und im Striatum von FGF-2 knock-out Mäusen. Mittels ISH konnte im zervikalen Rückenmark (RM) von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen eine D₁R-mRNA-Expression in multipolaren Nervenzellen der gesamten grauen Substanz, besonders deutlich aber in Motoneuronen des Ventralhorns nachgewiesen werden.

Nachweis von D1 R-mRNA-Expression

mittels ISH in Motoneuronen des

zervikalen RMs

= hochreguliert

= hinunterreguliert

= unverändert

mGluR1 ionoGluR3 + 4 D

R

Expression im RM:

Expression im RM:

Expression im RM:

Expression im Striatum:

Expression im cerebralen

Cortex: