Aus der Abteilung Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Analyse der altersabhängigen Telomerverkürzung in verschiedenen Organen von Telomerase-knock-out und Wildtyp-Mäusen
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin Vorgelegt von Friederike Nellessen
aus Hamburg Hannover, 2009
Angenommen vom Senat der MHH am: 14.06.2011 Gedruckt mit Genehmigung der MHH
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. Karl Lenhard Rudolph
Referent: Prof. André Bleich, PhD Koreferent: Prof. Dr. med. Anette Melk Tag der mündlichen Prüfung: 14.06.2011 Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Hermann Haller Prof. Dr. Klaus Otto Prof. Dr. Martin Sauer
INHALTSVERZEICHNIS
Abbildungsverzeichnis 5
Widmung 7
Abkürzungsverzeichnis 8
Kapitel 1: Einleitung 9
1.1 Telomere 9
1.2 Telomerase 10
1.3 Das End-Replikationsproblem 11 1.4 Telomere und Alterung 13 1.5 Das Mausmodell 14 1.6 Ziel der Arbeit 16
Kapitel 2: Material und Methoden 17
2.1 Material 17
2.1.1 Versuchstiere 17 2.1.2 Chemikalien 18 2.1.3 Puffer, Lösungen, Medien 19
2.1.4 Geräte 19
2.2 Methode 19
2.3 Statistische Auswertung 21
Kapitel 3: Ergebnisse 22
3.1 Übersicht 22
3.2 Leber 22
3.3 Niere 24
3.4 Milz 26
3.5 Herz 28
3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse 30
Kapitel 4: Diskussion 32
4.1 Diskussion 32
4.1 Kritik 36
4.2 Ausblick 37
Literaturverzeichnis 38
Bildquellen 46
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Nummer Seite
1.1 Chromosom mit Telomer 9
1.2 Telomerverlängerung 11
1.3 DNA- Synthese 12
1.4 Telomerhypothese 13
1.5 Zellzyklus 15
2.1 Übersicht über die Versuchstiere I 17
2.2 Übersicht über die Versuchstiere II 18
3.1 Telomerlängenbestimmung Leber 22
3.2 Verteilung der mittleren Telomerlänge Leber (mTerc+/+, 3Monate) 23 3.3 Verteilung der mittleren Telomerlänge Leber (mTerc+/+, 12Monate) 23 3.4 Verteilung der mittleren Telomerlänge Leber (G3mTerc-/-, 3Monate) 23 3.5 Verteilung der mittleren Telomerlänge Leber (G3/G4mTerc-/-, 12Monate) 23
3.6 Telomerlängenbestimmung Niere 24
3.7 Verteilung der mittleren Telomerlänge Niere (mTerc+/+, 3Monate) 25 3.8 Verteilung der mittleren Telomerlänge Niere (mTerc+/+, 12Monate) 25 3.9 Verteilung der mittleren Telomerlänge Niere (G3mTerc-/-, 3Monate) 25
3.10 Verteilung der mittleren Telomerlänge Niere (G3/G4mTerc-/-, 12Monate) 25
3.11 Telomerlängenbestimmung Milz 26
3.12 Verteilung der mittleren Telomerlänge Milz (mTerc+/+, 3Monate) 27 3.13 Verteilung der mittleren TelomerlängeMilz (mTerc+/+, 12Monate) 27 3.14 Verteilung der mittleren Telomerlänge Milz (G3mTerc-/-, 3Monate) 27
3.15 Verteilung der mittleren Telomerlänge Milz (G3/G4mTerc-/-, 12Monate) 27 3.16 Telomerlängenbestimmung Herz 28
3.17 Verteilung der mittleren Telomerlänge Herz (mTerc+/+, 3Monate) 29 3.18 Verteilung der mittleren Telomerlänge Herz (mTerc+/+, 12Monate) 29 3.19 Verteilung der mittleren Telomerlänge Herz (G3mTerc-/-, 3Monate) 29 3.20 Verteilung der mittleren Telomerlänge Herz (G3mTerc-/-, 12Monate) 29 3.21 Durchschnittliche Telomerlänge aller Organe 30 3.22 Prozentualer Anteil kritisch kurzer Telomere 31
FÜR
Dr. Bernd Nellessen
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb. Abbildung
bp Basenpaare
BSA bovines Serumalbumin d, dest. Destilliert
DNA Desoxyribonukleinsäure h Stunde
HCl Salzsäure
G3 dritte Generation von knock-out Mäusen G4 vierte Generation von knock-out Mäusen Mg2Cl Magnesiumchlorid
Min. Minute
NaCl Natriumchlorid
p21 Zellzyklusinhibierendes Enzym
PBS Phosphate buffered Saline = phosphatgepufferte Salzlösung POT1,2 Protection of Telomere 1,2
Q-FISH quantitative Fluoreszenz in situ Hybridisierung RT-PCR real-time Polymerase chain reaction
Sek. Sekunde
STELA single telomere elongation length analysis
Tbl. Tabelle
mTerc Telomerase RNA Komponente in der Maus mTert Telomerase Reverse Transkriptase in der Maus TFI Telomer Fluoreszenz Intensität
TIN1,2 TRF1 interacting nuclear protein
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan TRF Telomere Restriction Fragment
TRF1, 2 TTAGGG repeat binding factor 1, 2
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EINLEITUNG
1.1 Telomere
Die Endabschnitte eukaryoter Chromosomen werden Telomere genannt, aus dem Griechischen “telos”, das Ende, und “meros”, der Ort. Sie bestehen aus repetitiven DNA-Abschnitten der Sequenz TTAGGG und bilden zusammen mit speziellen DNA- Proteinen (z.B. TRF1, TRF2, POT1, TIN1 und TIN2) einen Nukleo-Protein-Komplex, der wie eine Kappe den Chromosomenenden aufsitzt (Blackburn, 1991 und 2001, Smogorzewska et al., 2004).
Abb. 1.1 zeigt ein Chromosom, in der Vergrößerung ist ein Telomer dargestellt.
Bereits 1941 beschrieb Barbara McClintock diese besonderen Strukturen, die sich anders als Doppelstrangbrüche verhielten und denen sie eine schützende Funktion zuschrieb (McClintock, 1941). Ende der 70er Jahre gelang es Blackburn und Gall, die Telomersequenz des Protozoen Tetrahymena, TTGGGG, darzustellen
(Blackburn, 1978). Diese ist fast identisch mit der Sequenz anderer Eukaryonten, wie zum Beispiel der von Mäusen (TTAGGG), die auch mit der des Menschen identisch ist. 1988 isolierte Moyzis die ersten humanen Telomere (Moyzis et al., 1988).
Telomere haben einen G-reichen, etwa 200 Basenpaare (bp) langen 3`-Überhang (Henderson et al., 1989; Wright et al., 1997). Telomere werden nicht wie die restliche chromosomale DNA in Nukleosomen verpackt, sondern liegen zusammen mit
sequenzspezifischen telomerbindenden Proteinen vor, die die Telomere stabilisieren und verhindern, dass DNA-Reparaturmechanismen aktiviert werden (van Steensel et al., 1997; van Steensel et al., 1998). Das T-Loop Modell beschreibt, wie die
Telomersequenz sich zurückfaltet, eine Lasso-ähnliche Struktur bildet und mit Hilfe
verschiedener Proteine (z.B. TRF1, TRF2, POT1, TIN1 und TIN2) an weiter proximal gelegenen Abschnitten doppelsträngiger Telomersequenz inseriert (Griffith et al., 1999; de Lange, 2002).
Die Hauptfunktion der Telomere ist, wie bereits McClintock vermutete, die DNA vor Fusionen, Rekombination und Degradation zu schützen und so die Entstehung chromosomaler Instabilität zu verhindern, da diese zum Tod der Zelle führen kann (Blasco et al., 1997). Zudem positionieren sie die Chromosomen innerhalb des Zellkerns, was vor allem bei der Paarung homologer Chromosomen in der frühen Meiose und während der Zellteilung von Bedeutung ist (Blackburn, 1994). Weiterhin spielen Telomere eine besonders wichtige Rolle bei der DNA- Replikation (siehe Kapitel 1.3 „Das End-Replikationsproblem“).
1. 2 Telomerase
Das Enzym Telomerase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, ermöglicht die de- novo Synthese der Telomerenden und somit die Aufrechterhaltung der
Telomerlänge. Es besteht aus zwei essentiellen Komponenten, einer RNA- Untereinheit (TERC) als Matrize für die Synthese der Telomersequenz und einer katalytisch wirksamen reversen Transkriptase (TERT) (Greider et al., 1985 und 1989). Sie binden an die durch die DNA-Replikation ungepaart gebliebenen, also offenen 3’ Enden und verlängern diese um jeweils eine sechs Nukleotide
umfassende Sequenz (5’-TTAGGG in Vertebraten, in anderen Organismen
unterscheidet sich die Sequenz). Dann wird mit Hilfe der RNA-Primer, die sich an das nunmehr wesentlich längere 3’-Ende heften, der zugehörige 5’-Strang synthetisiert.
An diesem Vorgang der Bindung und Aktivierung der Telomerase ist eine Vielzahl von Proteinen regulativ beteiligt (Smogorzewska et al., 2004).
Abb. 1.2 Die Rolle der Telomerase bei der Replikation von Telomeren: Wenn der RNA-Primer am 5‘
Ende fertig ist, bleibt ein Teil des Leitstranges übrig. Die Telomerase bindet an diesen Teil und verlängert ihn durch Anhängen von Desoxyribonukleotiden. Die Telomerase wandert am Leitstrang entlang und vervollständigt dann mit Hilfe von Primase, DNA-Polymerase und Ligase den
Tochterstrang. Die ursprüngliche Länge des Chromosoms ist wieder erreicht.
1.3. Das End-Replikationsproblem
Hayflick und Moorhead beschrieben bereits 1961, dass sich humane Fibroblasten, im Gegensatz zu Tumorzellen, nur begrenzt teilen (Hayflick et al., 1961). Olovnikov stellte 10 Jahre später die These auf, dass sich die Chromosomenenden bei jeder Zellteilung verkürzen müssten (Olovnikov, 1971).
Die DNA-Polymerase kann nur an das freie 3´- Ende eines DNA-Strangs Nukleotide anhängen, nicht aber an das 5´-Ende. Daher wird während der Replikation der neue DNA-Strang immer in 5´ - 3´-Richtung synthetisiert. Der Leitstrang (5´-Strang) wird dabei in Laufrichtung der Replikationsgabel (5` - 3`) bis zum Erreichen einer neuen Replikationsgabel oder bis zum Ende des Chromosoms synthetisiert, wohingegen der Folgestrang (3´-Strang) diskontinuierlich in Gegenrichtung des Fortschreitens der Replikationsgabel gebildet werden muss. Immer wieder beginnend bei RNA-Primern werden kleine Segmente des neuen 5’-Stranges, sogenannte Okazaki-Fragmente, synthetisiert. Abschließend werden, nach Entfernen der RNA-Primer, die Okazaki- Fragmente durch DNA-Ligase miteinander verbunden (Abb. 1.2 und 1.3).
Abb. 1.3 zeigt den Ablauf der DNA-Synthese, in blau der Leitstrang („template strands“), in rot die neugebildeten Tochterstränge („lagging strand“ mit Okazaki Fragmenten und „leading strand“).
Am Ende des 3´-Stranges kann kein RNA-Primer mehr gesetzt werden. Dies führt, der Theorie von Olovnikov entsprechend, bei jeder Zellteilung zur Verkürzung um 50-100 bp der Telomere und somit der Chromosomen.
Durch die fehlende Expression der Telomerase in Zellen der meisten somatischen Gewebe im Menschen ist die proliferative Kapazität limitiert (Harley et al., 1990).
Dieses Limit ist erreicht, wenn die Telomere so stark (also kritisch) verkürzt sind, dass die T-Loop Struktur nicht mehr aufrecht erhalten werden kann, so dass sich die Chromosomenenden „öffnen“ (englisch: „uncapping“) und dadurch DNA-
Schädigungssignale ausgelöst werden. Über das Protein p53 geht die Zelle dann entweder in die Apoptose, also den programmierten Zelltod, oder über p21 in das Stadium der zellulären Seneszenz (siehe auch Kapitel 1.5). Mutationen in der
Apoptose, DNA-Schädigungsantworten oder in den Zellzykluskontrollpunkten G2 und M (siehe bitte Abb 1.5) können das Überleben oder das weitere Wachstum von Zellen mit genomischen Anomalitäten ermöglichen und dadurch die maligne Entartung der Zelle begünstigen (Kastan et al., 2004).
Die Rolle der Telomerase ist dabei ambivalent. Zum einen wirkt die Hemmung der Telomerase als Tumorsuppressor in transformierten Tumorzellen (Wright et al., 2001), gleichzeitig limitiert dies aber auch die regenerative Kapazität von Geweben und Organen während des Alterns (Djojosubroto, 2003).
Abb. 1.4 schematische Darstellung der abnehmenden Telomerlänge bei zunehmender Zahl von Zellteilungen und die Konsequenzen in den unterschiedlichen Zelllinien: Telomrase-positve
Keimzellen haben eine konstante Telomerlänge, bei Stammzellen reicht die Telomeraseaktivität, die Verkürzung der Telomere abzuschwächen und bei somatischen Zellen kommt es zu Apoptose, Seneszenz oder Immortalisierung.
1.4 Telomere und Alterung
Durch die kontinuierliche Verkürzung der Telomere bei der Zellteilung und fehlender Telomerase-Aktivität ist die Lebensdauer somatischer Zellen beschränkt (Allsopp et al., 1992). Sind die Telomere kritisch verkürzt (in dieser Arbeit ab 500TFI), kommt es zur Seneszenz, welche durch permanenten Proliferationsverlust und morphologische Veränderungen charakterisiert ist (Allsopp et al., 1992; Wright et al., 1992). Kritisch kurze Telomere verlieren ihre Schutzfunktion, was zur Aktivierung von DNA-
Schädigungssignalwegen führt, welche die Zelle in die Apoptose führen können (Satyanarayana et al., 2004).
Telomerverkürzung scheint postnatal nicht linear zu verlaufen. So kommt es während der ersten beiden Lebensjahre in peripheren Blutzellen, im Vergleich zu späteren Lebensabschnitten, zu einer schnelleren Verkürzung der Telomere (Frenck et al., 1998). Da Blutzellen Telomerase-positiven Ursprungs sind (Stamm- und
Progenitorzellen), lässt dies darauf schließen, dass die Telomerase-Aktivität nicht immer in der Lage ist, der Telomerverkürzung vollständig entgegen zu wirken.
Während vor allem mitotisch aktive Organe im Alter von Telomerverkürzung betroffen sind, finden sich in inaktiven Organen wie Gehirn und Myokard relativ stabile Telomerlängen während der Alterung (Takubo et al., 2002). Es gibt aber auch Telomerverkürzung in Geweben mitotisch schwach aktiver Organe, wie z.B. der Leber (Wiemann et al., 2002). Möglicherweise ist in solchen Organen nur eine mitotisch aktive Subpopulation von Zellen von der Telomerverkürzung betroffen. Im
Telomer länge
Zellteilungen Keimzellen
Stammzellen
somatische Zellen
Seneszenz
Apoptose
Apoptose
Menschen konnte für eine Reihe von chronischen Erkrankungen unterschiedlicher betroffener Organe eine verstärkte Telomerverkürzung gezeigt werden: so sind zum Beispiel die Telomere in Hepatozyten von Patienten mit chronischen
Lebererkrankungen und -zirrhose (Kitada et al., 1995; Wiemann et al., 2002; Calado et al., 2010), in den Kolonepithelzellen bei Colitis ulcerosa (Kinouchi et al., 1998) und in peripheren Blutzellen bei bestimmten Knochenmarkserkrankungen verkürzt
(Brummendorf et al., 2001; Vulliamy et al., 2001, Calado et al., 2010).
1.5 Das Mausmodell
Um die Zellalterung wissenschaftlich genauer untersuchen zu können, wurde ein Mausmodell gezüchtet, in dem eine der essentiellen Untereinheiten (mTerc) der Telomerase deletiert wurde. In den Zellen dieser Mäuse kann keine Verlängerung der Telomere durch Telomerase stattfinden, die Mäuse haben schon bei Geburt weniger lange Telomere. In der ersten Generation dieser Mäuse, G1mTerc-/-, konnte aufgrund der bei Maus-Inzuchtstämmen relativ langen Telomere (40 kb) kein
pathologischer Phänotyp im Vergleich zu den Wildtypmäusen (genetisch nicht veränderte Mäuse, mTerc+/+) festgestellt werden (Blasco et al., 1997; Lee et al., 1998). Bei weiterer Kreuzung von Mäusen der ersten Generation und damit weiterer Verkürzung der Telomerlänge konnte aber in der dritten Generation (G3 mTerc-/-) von mTerc-/- ein gehäuftes Auftreten von chromosomalen Fusionen sowie in vitro die Auflösung der schützenden T-Loop-Struktur als Zeichen kritisch kurzer Telomere beobachtet werden (Blasco et al., 1997). In der sechsten Generation (G6 mTerc-/-) ließen sich folgende Pathologien beobachten: Einige Mäuse verstarben aufgrund der gestörten Entwicklung bereits in der Embryonalphase (Hererra et al., 1999), die überlebenden Tiere zeigten vor allem in hochproliferativen Organen (männliches Fortpflanzungssystem, intestinale Epithelien, hämatopoetisches System) eine Beeinträchtigung des Gleichgewichts zwischen Apoptose (erhöht) und Proliferation (erniedrigt) (Lee et al., 1998; Rudolph et al., 1999). In den alternden Tieren war die Stressantwort herabgesetzt und das Überleben vermindert, es zeigten sich graue Haare, Haarverlust und Hautläsionen sowie eine erhöhte Inzidenz an spontanen Tumoren (Rudolph et al., 1999). Dies ist ein Hinweis darauf, dass
Telomerverkürzungen zu vielen alternden Phänotypen beitragen. Wegen dieser Eigenschaften eignet sich die mTerc -/- -Maus besonders für die vorliegende Arbeit.
Es wurden sowohl junge (drei Monate alte) als auch alte (zwölf Monate alte) Mäuse
der dritten und vierten Generation dieses Genotyps untersucht, und mit jungen und alten Wildtyp-Mäusen verglichen. Einige der Mäuse waren homozygote p21-knock- out- Mäuse. Protein 21 ist ein Cyclin-abhängiger Kinase Inhibitor (CDKN1A), der auf Chromosom 6 kodiert ist und das Fortschreiten des Zellzyklus am Kontrollpunkt G1
reguliert. Die Expression dieses Gens wird durch das Tumorsuppressorprotein p53 streng kontrolliert. P21 spielt eine Rolle bei Wachstumsstop und Zelldifferenzierung, induziert Seneszenz und reguliert die DNA-Replikation in der S-Phase und DNA- Reparaturen. Ein Funktionsverlust der CDKN1A führt, im Gegensatz zu einem Ausschalten von p53, nicht zu einem erhöhten Tumorvorkommen und verlängert die Lebenserwartung von Telomerase-knock-out Mäusen trotz dysfunktionaler Telomere (Choudhury et al., 2007). Choudhury et al. konnten ebenfalls zeigen, dass die
Inzidenz kritisch kurzer Telomere durch die Deletion von p21 nicht beeinflusst wurde.
In dieser Arbeit wurden die Daten der p21-knock-out-Mäuse daher zu den entsprechenden Gruppen der G3mTerc-/- oder mTerc+/+ hinzugefügt.
Abb. 1.5 zeigt den Zellzyklus mit den Kontrollpunkten, G1, (grün), G2 (rot lang) und M (rot kurz). G1
(orange) beschreibt die Phase zwischen der letzten mitotischen Teilung und dem Beginn der DNA- Synthese, die Zelle wächst. Wenn die Voraussetzungen günstig sind für eine weitere Zellteilung (Kontrollpunkt G1), geht die Zelle über in die Synthese – Phase (blau). In der G2 . Phase (rosa) wächst die Zelle heran. Am Kontrollpunkt G2 wird überprüft, ob die DNA – Replikation vollständig und
fehlerfrei war. In der M –Phase (grün) kommt es, wenn alle Chromosomen an den Spindeln hängen (Kontrollpunkt M), zur Zellteilung. G0 (orange/lila) beschreibt die Ruhephase der sich nicht teilenden Zelle.
G1
1.6 Ziel der Arbeit
In dieser Arbeit soll die Verkürzung der Telomerlänge im alternden Organismus untersucht werden und der Unterschied zwischen der physiologischen
Telomerverkürzung in Wildtyp-Mäusen im Gegensatz zu der zu erwartenden stärkeren Verkürzung bei Telomerase-knock-out-Mäusen dargestellt werden.
Gesucht wurde nach Unterschieden in der Länge der Telomere zwischen den jungen Mäusen der beiden Genotypen, zwischen den jungen und alten Mäusen desselben Genotyps und zwischen den alten Mäusen der beiden Genotypen in vier
verschiedenen Organen anderer mitotischer Aktivität.
K a p i t e l 2
MATERIAL UND METHODEN
2.1 Material
2.1.1 Versuchstiere
Die für diese Versuche verwendeten mTerc-/- und mTerc+/+ Mäuse stammen aus dem Mausstamm C57BL/6J (Jackson-Laboratory, U.S.A.) und wurden in den zentral klimatisierten Tierräumen des zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover bei 20-24° Celsius und einer Luftfeuchte von 50-60% in einem
zwölfstündigen Tag-Nacht-Rhythmus in Makrolonkäfigen gehalten und verpaart.
Futter (Fa. Altromin) und Wasser standen ad libidum zur Verfügung. Alle tierexperimentellen Methoden wurden unter Berücksichtigung der im Tierschutzgesetz verankerten Richtlinien durchgeführt.
Für diese Arbeit wurden Leber, Niere, Milz und Herz von folgenden Mäusen untersucht:
Tbl. 2.1. Übersicht über die Versuchsgruppen I
Wildtypen Telomerase knock – out Mäuse 12 Monate mTerc+/+, p21-/-
mTerc+/+
mTerc+/+, p21+/+
G4mTerc-/-, p21+/+
G4mTerc-/-, p21-/- G3mTerc-/-
3 Monate mTerc+/+ G3mTerc-/-
P21 (Cdkn1A) hat eine Kontrollfunktion im Zellzyklus und induziert über
mitochondriale Dysfunktion die Seneszenz der Zelle (Passos, 2010, Ju et al., 2007).
Die in dieser Arbeit verwendeten Mäuse stammen aus dem Mausstamm C57BL/6J, Cdkn1a-/- Mäuse wurden, wie in Roy Choudhury, 2007 beschrieben, mit Terc+/- Mäusen über mehrere Generationen bis G3 Terc-/- Cdkn1a +/- gekreuzt. Die
Ergebnisse der beiden Gruppen der Cdkn1a+/+ bzw. Cdkn1a-/- wurden bei fehlender Beeinflussung der Telomerlänge (siehe bitte auch Kap. 1.5) in dieser Arbeit mit den Daten der Gruppen der 12 Monate alten G3/4- bzw der mTerc+/+ Mäusen
zusammengezogen. Eine genaue Darstellung der ausgewerteten Zellkerne enthält Tabelle 2.2. Bei der Auswertung der Milzbilder wurden nicht einzelne Zellkerne untersucht, sondern, aufgrund der hohen Signaldichte, Gesichtsfelder.
Tbl. 2.2 Übersicht der Versuchsgruppen II mit Anzahl der untersuchten Zellkerne bzw Gesichtsfelder (nur Milz)
mTerc Alter Leber (n) Milz (n) Niere (n) Herz (n) mTerc+/+ 3 Monate 420 60 390 360 mTerc+/+ und
mTerc+/-
12Monate 360 72 360 330 G3mTerc-/- 3 Monate 240 47 270 270 G3mTerc-/-
und
G4mTerc+/-
12Monate 360 66 360 360
1.2 Chemikalien
Blocking Reagent Böhringer Mannheim
BSA Sigma
Citronensäure Roth Dapi (in mounting medium) Vectashield deionisiertes Wasser Ampuwa
Ethanol J. T. Baker
HCl 37% Merck
Formaldehyd Roth
Formamid Roth
NaCl Merck
PBS (Phosphate buffered Saline) Gibco
Pepsin Sigma
Tris AppliChem
Tween Sigma
Xylol Merck
2.1.3 Puffer, Lösungen, Medien
Hybridisierungslösung Tris pH 7,2, 1mM; Magnesiumchlorid; Formamid;
Blocking Reagenz (10% Lösung); dWasser Washing Solution Formamid, 70%; Tris pH 7,2, 10mM; 0,1% BSA,
dWasser
TBS-Tween TrisHCl, 20mM; NaCl, 137mM; 0,1%Tween 20 Pepsin Lösung 200mg Pepsin, 200ml dWasser, 168µl HCL 37%
Citratpuffer 192,3g/mol Zitronensäure, 1M; 177,99g/mol Sodiumphosphat, 1M; dWasser
2.1.4 Geräte
Heizblock Eppendorf
Histomat Fa Reichert-Jung/Heidelberg
Mikroskopkamera, digital Olympus
Mikroskop Olympus
Mikrotom Leica RM2255
Objektträger Menzel und Glaser, Superfrost Plus
Reaktionsgefäß Eppendorf
Telomere Analysis Programme Steven S.S. Poon, Peter M. Lansdorp TFL-TELO V1.0a
Vortex Omnilab
2.2 Methode: Quantitative Fluoreszenz in situ Hybridisierung (QFisH)
Durch Markierung der Telomere mit einer spezifischen Sonde, die mit Fluoreszein gekoppelt ist, kann am Computer die Veränderung der relativen Telomerlänge
anhand der Intensität der Signale bestimmt werden. Dabei ist die Menge gebundener Sonde, also die Intensität der positiven Signale (Telomer Fluoreszenz Intensität (TFI)), direkt proportional zur Telomerlänge.
Nach dem Entnehmen der Organe Herz, Leber, Milz und Niere aus der Organbank (- 80°C), wurden diese 24 Stunden in 4% Formol gelagert und am folgenden Tag am Histomaten der Pathologie (Prof. Kreipe) entwässert. Das Einbetten der Organe in Paraffin geschah in der Zellpathologie der Medizinischen Hochschule Hannover. Die 3m dick geschnittenen Paraffinschnitte wurden auf Superfrost Plus Objektträgern der Firma Menzel und Glaser aufgezogen und bei Raumtemperatur aufbewahrt. Zur quantitativen Fluoreszenz in situ Hybridisierung wurde folgendes Protokoll befolgt:
Nach einem 12 minütigen Xylolbad und einer Alkoholreihe (100%, 90%, 70% für jeweils 5 Min.) wurden die Schnitte 2x5 Min. in PBS gewaschen. Danach wurden die Schnitte 15 Min. bei 250 Watt in zuvor aufgekochtem Citratpuffer in der Mikrowelle gekocht, nach dem Abkühlen (15 Min.) und wiederum zweimaligem Waschen in PBS wurden die Schnitte im 37°C warmen Wasserbad mit Pepsin angedaut.
Anschließend wurden die Schnitte 2x4 Min. in PBS gewaschen, danach für 2 Min. in 4% Formol fixiert. Nachdem die Schnitte erneut für 2x4 Min. in PBS gewaschen worden waren, folgte eine aufsteigende Alkoholreihe für jeweils 5 Min. bei 70%, 90%
und 100%. Nach dem Trocknen wurde die Hybridisierungslösung (Tris pH 7,2;
Magnesiumchlorid; Formamid; BR; dWasser ) aufgetragen, die Objektträger wurden mit Deckgläschen bedeckt und für 3 Min. bei 80°C auf der Heizplatte erhitzt, dann in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Deckgläschen mit Hilfe einer washing solution (Formamid, Tris pH 7,2, 10% BSA, dWasser) abgeklopft, die Schnitte dann 2x20 Min. in selbiger Lösung im Dunkeln auf dem Shaker gewaschen. Nach 2x5 Min. Waschen mit TBS- Tween und 3x 5 Min. Waschung in PBS, ebenfalls auf dem Shaker, wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 90%, 100%) entwässert. Auf die getrockneten Schnitte wurde DAPI aufgetragen, die Objektträger mit Deckgläschen bedeckt und kühl (-4°C) aufbewahrt. Als interne Kontrolle diente ein
Leberparaffinschnitt. Die Schnitte wurden zeitnah mikroskopiert und in 100facher Vergrößerung mit konstanten Einstellungen (ca. 2 Sek. Verschlusszeit) in einer Ebene fotografiert. Es wurden in Leber, Niere und Herz Zellkerne ausgewertet und in Milz Gesichtsfelder, da einzelne Kerne nicht zu differenzieren waren (siehe bitte auch Tbl. 2.2).
Die anschließende Auswertung erfolgte mit Hilfe der TFL Telomer Analysis Software (TFL-TELO V1.0a, Blasco et al., 1997). Aus den gemessenen Werten wurde für
jedes Bild ein Mittelwert gebildet und daraus der Mittelwert für jedes Tier errechnet.
Die Grenze für kritisch kurze Telomere wurde entsprechend den derzeitigen
wissenschaftlichen Erkenntnissen in dieser Arbeit bei 500 TFI (Telomer Fluoreszenz Intensität) festgelegt.
2.3 Statistische Auswertung
Zur Berechnung der statistischen Signifikanzen und Standardabweichungen wurden Microsoft Excel und die „Graphpad Instat“-Software sowie das Programm SPSS 17.0 verwendet. Die Abbildungen und die Verteilungskurven nach Gauß wurden ebenfalls mit Hilfe des Microsoft Office Excel Programms erstellt.
Die Telomerlängen wurden mit Hilfe von Student’s t-Test miteinander verglichen.
Zum Vergleich der Häufigkeiten der kritisch kurzen Telomere wurde der Chiquadrat- Test, bei kleinen Erwartungshäufigkeiten Fishers exakter Test durchgeführt. Alle Signifikanztests erfolgten zweiseitig auf dem Niveau alpha = 0,05. Zur
Berücksichtigung des multiplen Testens wurde für jedes Organ eine Bonferroni- Korrektur durchgeführt. Es werden sowohl die rohen p-Werte als auch die Bonferroni-Signifikanzprüfungen zum Niveau alpha = 0,05 dargestellt (Kennzeichnung durch „*“).
K a p i t e l 3
ERGEBNISSE
3.1 Übersicht
Es wurden die Längen der Telomere in den Kernen von Hepatozyten, Lymphozyten, Nierentubuluszellen und Kardiomyozyten von drei Monate sowie zwölf Monate alten Wildtyp-Mäusen (mTerc+/+ und mTerc+/-) und späten Generationen (G3 und G4) von Telomerase-knock-out-Mäusen (mTerc-/-) untersucht (Tbl. 2.2).
Die nachfolgende Darstellung der Ergebnisse ist nach Organen gegliedert.
3.2 Leber
Wie aus Abbildung 3.1 bis 3.6 ersichtlich, sind die Telomere in Leberzellen von drei Monate alten mTerc+/+ Mäusen (n=13) nicht signifikant länger (mittlere Telomerlänge:
1335,87 TFI) als in gleichaltrigen G3 mTerc-/- Mäusen (n=9, mittlere Telomerlänge:
1208,17 TFI, p=0,23). In zwölf Monate alten Mäusen ist im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen eine Verkürzung der Telomere sowohl in mTerc+/+ und mTerc+/-
Mäusen zu beobachten (mittlere Telomerlänge in zwölf Monate alten Mäusen:
1178,48TFI, p=0,0072 im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen), ebenso in G3/G4 mTerc-/- Mäusen (mittlere Telomerlänge in zwölf Monate alten Mäusen: 998,91 TFI, p=0,010 im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen). Telomere in zwölf Monate alten G3/G4 mTerc-/- Mäusen sind gegenüber den 12 Monate alten mTerc+/+ und mTerc+/- Mäusen verkürzt (p=0,0012).
Abb. 3.1 Telomerlängenbestimmung mittels Q-FISH an Maus-Hepatozyten. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte, die in den benannten Genotypen gemessen wurden. Die Error-Bars zeigen die
Standardabweichung. *p=0,05 nach Bonferroni-Korrektur.
Leber
0 500 1000 1500 2000
mTerc+/+, 3Monate mTerc+/+ und mTerc+/-, 12Monate G3mTerc-/-,
3Monate G3/G4mTerc-/-,
12Monate
n=13 n=23 n=9 n=25
Telomerlänge [TFI]
p=0,0012 p=0,010 p=0,0072
p=0,23
3.1
*
*
*
Abb. 3.2 bis 3.5 Mittlere Telomerlänge: roter Balken, kritisch kurze Telomere(<500 TFI): schwarz- gestrichelte Linie, Angabe in Prozent. Die Diagramme zeigen die Verteilung der mittleren
Telomerlänge in den Zellkernen der Hepatozyten aus: (3.2) mTerc+/+ Mäusen, 3 Monate alt, (3.3) mTerc+/- u. mTerc+/+ Mäusen, 12 Monate alt, (3.4) G3 mTerc-/- Mäusen, 3 Monate alt, (3.5) G3/G4 mTerc-/- Mäusen, 12 Monate alt.
In den Verteilungsdiagrammen (Abb. 3.2-3.5) zeigt sich im Vergleich zu drei Monate alten G3 mTerc-/- Mäusen (p=0,557) in drei Monate alten mTerc+/+ Mäusen keine höhere Anzahl kritisch kurzer Telomere (<500TFI). Im Rahmen der Alterung kommt es in zwölf Monate alten G3/G4 mTerc-/- im Vergleich zu drei Monate alten Tieren zu
Leber,mT erc+/+,3Monate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500
Telomerlänge[TFI]
Zellen [%]
Leber,mT erc+/+,mTerc+/-, 12M onate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telomerlänge[TFI]
Leber,G3mTerc-/-,3Monate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telomerlänge [TFI]
Leber,G3/G4mTerc-/-,12Monate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telomerlänge [TFI]
3.2
3.3
3.4
3.5
0,7%
2,2%
0%
Zellen [%]Zellen [%]Zellen [%]
8,3%
einer Zunahme kritisch kurzer Telomere (p< 0,001*). Im Vergleich zwölf Monate alter Tiere zeigen sich in G3/G4 mTerc-/- gegenüber mTerc+/+ signifikant mehr kritisch kurze Telomere (p< 0,001*).
3.3 Niere
In Nierenzellen von drei Monate alten mTerc+/+ Mäusen (n=13) sind die Telomere nicht signifikant unterschiedlich (mittlere Telomerlänge: 1115,48 TFI) zu den
Telomeren der gleichaltrigen G3mTerc-/- Mäuse (n=9, mittlere Telomerlänge:
953,93TFI, p=0,16), siehe auch Abbildungen 3.6 bis 3.10. In zwölf Monate alten Mäusen ist im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen bei den mTerc+/+ Mäusen (mittlere Telomerlänge: 1066,24 TFI, p= 0,86 im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen) und bei den G3/G4 mTerc-/- Mäusen (mittlere Telomerlänge: 1018,17 TFI, p=0,30 im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen) keine signifikante Änderung der Telomerlänge zu sehen. In zwölf Monate alten Mäusen sind die Telomere der G3/G4 mTerc+/- gegenüber den mTerc+/+ Mäuse nicht signifikant verkürzt (p= 0,33).
Abb. 3.6 Telomerlängenbestimmung mittels Q-FISH an Nierenzellen (3.8).
Das Diagramm zeigt die Mittelwerte, die in den benannten Genotypen gemessen wurden. Die Error- Bars zeigen die Standardabweichung. Alle p-Werte nicht signifikant nach Bonferroni-Korrektur.
Niere
0 500 1000 1500 2000
mTerc+/+, 3Monate mTerc+/+und mTerc +/-, 12Monate
G3mTerc-/-, 3Monate G3/G4mTerc-/- 12Monate
Telomerlänge [TFI]
3.6
n=13 n=23 n=9 n=25 p=0,16
p=0,86 p=0,33
p=0,30
Abb. 3.7 bis 3.10 Mittlere Telomerlänge: roter Balken. Anteil kritisch kurzer Telomere (<500 TFI):
schwarz-gestrichelte Linie, Angabe in Prozent. Die Diagramme zeigen die Verteilung der mittleren Telomerlänge in den Zellkernen der Nierenzellen aus: (3.7) mTerc+/+ Mäusen, 3 Monate alt, (3.8) mTerc+/- und mTerc+/+ Mäusen, 12 Monate alt, (3.9) G3 mTerc-/- Mäusen, 3 Monate alt, (3.10) G3/G4 mTerc-/- Mäusen, 12 Monate alt.
In den Verteilungsdiagrammen (Abbildung 3.7-3.10) zeigen sich in drei Monate alten G3mTerc-/- mehr kritisch kurze Telomere als in gleichaltrigen mTerc+/- Mäusen
(p=0,001*). Im Rahmen der Alterung kommt es in zwölf Monate alten mTerc+/- Mäusen zu einer signifikanten Zunahme kritisch kurzer Telomere (p=0,002*), in
Niere,mT erc+/+,3Monate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500
Telomerlänge [TFI]
Niere,mT erc+/+,mTerc+/-, 12 Monate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telomerlänge [TFI]
Niere,G3mTerc-/-,3 Monate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telomerlä nge [TFI]
Niere,G3/G4mTerc-/-, 12Mo nate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telomerlänge [TFI]
3.7
3.8
3.9
3.10
1,0%
4,7%
5,2%
8,6%
Zellen [%]Zellen [%]Zellen [%]Zellen [%]
G3/G4mTerc-/- im Vergleich zu drei Monate alten Tieren zeigt sich keine signifikante Änderung der Häufigkeit kritisch kurzer Telomere (p=0,098). Im Vergleich zwölf Monate alter Tiere zeigt sich ebenfalls kein Unterschied bei kritisch kurzen Telomeren in G3/G4mTerc-/- Mäusen und mTerc+/- Mäusen (p=0,036).
3.4 Milz
In den Zellkernen der weißen Pulpa in der Milz sind die Telomere in drei Monate alten mTerc+/+ Mäusen (n=10, mittlere Telomerlänge: 1655,20TFI) länger als in gleichaltrigen G3 mTerc-/- Mäusen (n=9, mittlere Telomerlänge: 1093,95TFI, p=0,0005). In zwölf Monate alten Mäusen ist im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen in den mTerc+/+ und mTerc+/- Mäusen (n=23, mittlere Telomerlänge:
1164,31TFI) eine Verkürzung der Telomere zu beobachten (p=0,0004 im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen), in den G3/G4 mTerc-/- Mäusen (n=22, mittlere Telomerlänge: 1156,57TFI) kommt es zu keiner signifikanten Verlängerung der Telomere (p=0,63 im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen). Telomere in den zwölf Monate alten Mäusen sind in G3/G4 mTerc-/- sowie mTerc+/+ und mTerc+/- Mäusen ähnlich lang (p=0,94).
Abb. 3.11 Telomerlängenbestimmung mittels Q-FISH an Lymphozyten der Milz, das Diagramm zeigt die Mittelwerte, die in den benannten Genotypen gemessen wurden. Die Error-Bars zeigen die Standardabweichung. *p=0,05 nach Bonferroni-Korrektur.
Milz
0 500 1000 1500 2000
Telomerlänge [TFI]
mTerc+/+, 3Monate mTerc+/+ und mTerc+/-, 12Monate G3mTerc-/-, 3Monate G3/G4mTerc-/- 12Monate p=0,0004
p=0,0005 p=0,94
n=10 n=23 n=9 n=22 p=0,63
3.11
*
*
Abb. 3.12 – 3.15 Die Diagramme zeigen die Verteilung der mittleren Telomerlänge in den Zellkernen der Lymphozyten aus: (3.12) mTerc+/+ Mäusen, 3 Monate alt, (3.13) mTerc+/- u. mTerc+/+ Mäusen, 12 Monate alt, (3.14) G3 mTerc-/- Mäusen, 3 Monate alt, (3.15) G3/G4 mTerc-/- Mäusen, 12 Monate alt. Mittlere Telomerlänge: roter Balken, kritisch kurze Telomere(<500 TFI): schwarz-gestrichelte Linie, Angabe in Prozent
In den Verteilungsdiagrammen (Abb. 3.12-3.15) haben drei Monate alte mTerc+/+
Mäuse und gleichaltrige G3mTerc-/- Mäuse keine kritisch kurzen Telomere (<500TFI).
Bei G3 mTerc-/- Mäusen kommt es im Alter zu keiner signifikanten Zunahme der kritisch kurzen Telomere (p=0,040). Bei den zwölf Monate alten Mäusen haben G3
M i l z ,m T e r c +/+, 3 M o n a t e
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telom erlä nge [TFI]
M i l z ,m T e r c +/+,m T e r c +/-, 12Monate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telom erlä nge [TFI]
M ilz, G3mTerc-/-, 3M onate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telomerlä nge [TFI]
Milz, G3/G4m Terc-/-,12M onate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Te lomerlänge [TFI]
3.12
3.13
3.14
3.15
0%
0%
0%
9,1%
Zellen [%]Zellen [%]Zellen [%]Zellen [%]
mTerc-/- Mäuse signifikant mehr kritisch kurze Telomere (<500TFI) als die gleichaltrigen mTerc+/+ Mäuse (p=0,011*).
3.5 Herz
In Herzmuskelzellen von drei Monate alten mTerc+/+ Mäusen (n=12, mittlere Telomerlänge: 1154,73TFI) sind die Telomere nicht signifikant länger als in
gleichaltrigen G3 mTerc-/- Mäusen (n=9, mittlere Telomerlänge: 951,46TFI, p=0,056).
In den zwölf Monate alten mTerc+/+ Mäusen (n=11, mittlere Telomerlänge:
932,85TFI) ist im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen keine Telomerverkürzung zu sehen (p=0,027). In zwölf Monate alten G3 mTerc-/- Mäusen (n=12, mittlere
Telomerlänge: 1116,71TFI) ist im Vergleich zu drei Monate alten G3 mTerc-/- Mäusen (n=9) keine signifikante Änderung der Telomere zu beobachten (p=0,093). In zwölf Monate alten G3 mTerc-/- Mäusen sind die Telomere nicht länger als in gleichaltrigen mTerc+/+ Mäusen (p=0,048).
Abb. 3.16 Telomerlängenbestimmung mittels Q-FISH an kardialen Myozyten. Die Abbildung zeigt die Mittelwerte, die in den benannten Genotypen gemessen wurden. Die Error-Bars zeigen die
Standardabweichung. Alle p-Werte nicht signifikant nach Bonferroni-Korrektur.
Herz
0 500 1000 1500 2000
Telomerlänge [TFI] mTerc
+/+, 3Monate mTerc+/+ und mTerc+/-, 12Monate
G3mTerc-/-, 3Monate G3/G4mTerc-/-, 12Monate p=0,056
p=0,027
p=0,048
p=0,093
3.16
n=12 n=11 n=9 n=12
Abb. 3.17 – 3.20 Die Diagramme zeigen die Verteilung der mittleren Telomerlänge in den Zellkernen der Myozyten aus: (3.17) mTerc+/+ Mäusen, 3 Monate alt, (3.18) mTerc+/+ Mäusen, 12 Monate alt, (3.19) G3 mTerc-/- Mäusen, 3 Monate alt, (3.20) G3 mTerc-/- Mäusen, 12 Monate alt. Mittlere
Telomerlänge: roter Balken, kritisch kurze Telomere(<500 TFI): schwarz-gestrichelte Linie, Angabe in Prozent
In den Verteilungsdiagrammen (3.17-3.20) zeigen sich in drei Monate alten mTerc+/+
Mäusen signifikant weniger kritisch kurze Telomere als in drei Monate alten
G3mTerc-/- Mäusen (p< 0,001*). Im Rahmen der Alterung kommt es sowohl in zwölf Monate alten G3mTerc-/- Mäusen als auch in 12 Monate alten mTerc+/- Mäusen zu
Herz,mTerc+/+,3M onate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telomerlänge [TFI]
Herz,G3mTerc-/-,3Monate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telom erlänge [TFI]
Herz,G3mT erc-/-,12Monate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telom erlänge [TFI]
Herz,mTerc+/+,12M onate
0 5 10 15 20
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Telom erlänge [TFI]
3.17
3.18
3.19
3.20
0%
2,1%
4,8%
0,6%
Zellen [%]Zellen [%] Zellen [%]Zellen [%]
einer signifikanten Änderung des prozentualen Auftretens kritisch kurzer Telomere im Vergleich zu drei Monate alten G3mTerc+/+ Mäusen (p=0,001* bzw p=0,006*).
Während es bei mTerc+/- Mäusen zu einer Zunahme kritisch kurzer Telomere kommt, nehmen die kritisch kurzen Telomere in G3mTerc-/- Mäusen ab. Im Vergleich zwölf Monate alter Tiere zeigt sich in G3mTerc+/+ gegenüber mTerc+/+ kein signifikanter Unterschied kritisch kurzer Telomere (p=0,095).
3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse
Insgesamt tritt bei den mTerc+/+ Mäusen in drei von vier Organen (Herz, Leber, Milz) eine Verkürzung der Telomere im Alter auf. Bei den G3mTerc-/- Mäusen kommt es nur in der Leber mit dem Alter zu einer Verkürzung der Telomere. Die drei Monate alten mTerc+/+ Mäuse haben nur in der Milz signifikant längere Telomere als die gleichaltrigen G3mTerc-/- Mäuse. Bei den alten Mäusen sind die Längendifferenzen etwas geringer. In der Leber zeigen mTerc+/+ Mäuse längere Telomere als
G3mTerc-/- Mäuse. Im Herzen zeigen G3mTerc-/- Mäuse längere Telomere als mTerc+/+ Mäuse.
Abb. 3.21: Durchschnittliche Telomerlänge, aufgeteilt nach Alter und Organen. p< 0,05 nach Bonferroni-Korrektur.
Der prozentuale Anteil kritisch kurzer Telomere aller Organe und Altersstufen ist in Tabelle 3.22 nochmals zur Übersicht dargestellt.
0 500 1000 1500 2000 2500
Leber Niere Milz Herz
mTerc+/+, 3Monate
mTerc+/+ und mTerc+/-, 12Monate G3mTerc-/-, 3Monate
G3/G4mTerc-
/-12 Monate
Telomerlänge [TFI]
p<0,05 p<0,05
p<0,05
p<0,05 p<0,05
p<0,05 p<0,05
Abb. 3.22: Prozentualer Anteil kritisch kurzer Telomere, aufgeteilt nach Alter und Organ. Alle p-Werte
<0,05 nach Bonferroni-Korrektur.
In Niere und Herz von mTerc+/+ zeigt sich mit dem Alter eine signifikante Zunahme kritisch kurzer Telomere (p=0,002 und p=0,006). Bei den G3/G4 mTerc+/+ Mäusen zeigt sich in Leber eine signifikante Zunahme kritisch kurzer Telomere, während im Herz die Zahl kritisch kurzer Telomere abnimmt (p<0,001 und p=0,001). In den drei Monate alten Mäusen haben G3 mTerc+/+ in Niere und Herz mehr kritisch kurze Telomere (p=0,001 und p<0,001), in den 12 Monate alten Mäusen haben G3/G4 mTerc+/+ in Leber und Milz mehr kritisch kurze Telomere (p<0,001 und p=0,011).
