Nierentransplantation bei Telomerase-Knockout-Mäusen

Klinik für Pädiatrische Nieren-, Leber- und Stoffwechselerkrankungen der Medizinischen Hochschule Hannover

Nierentransplantation

bei Telomerase-Knockout-Mäusen

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Andrea Mareke Weißbrodt aus Hannover

Hannover 2013

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 01.07.2014

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum Betreuerin: Prof. Dr. med. Anette Melk, PhD Referent: PD Dr. med. Johan Lorenzen Korreferentin: PD Dr. med. Cornelia Blume Tag der mündlichen Prüfung: 01.07.2014

Prüfungsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Thomas Werfel Prof. Dr. med. Georg Scheumann Prof. Dr. med. Torsten Witte

Inhalt

1 Einleitung ... 1

1.1 Die Bedeutung der Nierentransplantation als Nierenersatzverfahren ... 1

1.1.1 Auswirkung des Organalters auf die Transplantatfunktion ... 1

1.1.2 Altersbezogene Veränderungen von Nierengewebe und -funktion ... 2

1.2 Zelluläre Seneszenz und ihre klinische Bedeutung ... 3

1.3 Telomere ... 4

1.3.1 Definition ... 4

1.3.2 Struktur und Funktion ... 4

1.4 Das Endreplikationsproblem ... 5

1.5 Telomerase ... 7

1.5.1 Definition, Struktur und Funktion ... 7

1.5.2 Natürliches Vorkommen beim Menschen ... 8

1.5.2.1 Klinische Bedeutung kritisch kurzer Telomere ... 8

1.6 Der intrinsische Weg zellulärer Seneszenz - Replikative Seneszenz ... 9

1.6.1 Die Bedeutung von p53 und p21^WAF/CIP1 im Rahmen replikativer Seneszenz ... 10

1.7 Der extrinsische Weg zellulärer Seneszenz - Stress and aberrant signaling induced senescence (STASIS) ... 12

1.7.1 Die Bedeutung von p16^INK4a im Rahmen von STASIS ... 12

1.8 Die Telomerase-Knockout-Maus ... 13

1.9 Nierentransplantation bei mTERC^-/--Mäusen ... 16

1.10 Zielsetzung der Arbeit ... 17

2 Material und Methoden ... 18

2.1.1 Versuchstiere ... 18

2.1.2 Chemikalien und Enzyme ... 19

2.1.3 Pufferlösungen und Reagenzien aus eigener Herstellung ... 21

2.1.4 Oligonukleotide ... 23

2.1.5 Geräte und Software ... 23

2.2 Methoden ... 26

2.2.1 Das Transplantationsmodell ... 26

2.2.1.1 Vorbereitung des Spenders ... 26

2.2.1.2 Vorbereitung des Empfängers ... 28

2.2.1.3 Organtransplantation ... 29

2.2.1.4 Postoperative Phase ... 30

2.2.2 Postoperative Bestimmung der Nierenfunktion ... 30

2.2.2.1 Serumkreatinin ... 31

2.2.2.2 Harnstoff ... 31

2.2.3 Organentnahme ... 32

2.2.4 Organaufarbeitung ... 32

2.2.4.1 Fixierung ... 32

2.2.4.2 Einbettung ... 33

2.2.4.3 Erstellen von Paraffinschnitten ... 33

2.2.5 Histologische Färbungen ... 34

2.2.5.1 Periodic Acid Schiff (PAS)-Färbung ... 34

2.2.5.1.1 Auswertung ... 35

2.2.5.2 Masson-Trichrom (MT)-Färbung ... 36

2.2.5.2.1 Auswertung ... 37

2.2.6 Immunhistochemische Färbungen ... 37

2.2.6.1 Ki67-Antikörper-Färbung ... 38

2.2.6.2 γ-H2AX-Antikörper-Färbung ... 39

2.2.6.2.1 Auswertung ... 40

2.2.6.3 TUNEL-Färbung (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) ... 41

2.2.6.3.1 Auswertung ... 41

2.2.7 Molekularbiologische Methoden ... 42

2.2.7.1 RNA-Isolation ... 42

2.2.7.2 UV-Spektroskopie ... 43

2.2.7.3 Agarose-Gelelektrophorese ... 44

2.2.7.4 Complementary(c)-DNA-Synthese ... 45

2.2.7.5 Quantitative Real-time-Polymerase Chain Reaction (q-RT-PCR) ... 46

2.2.7.6 Berechnung der relativen Genexpression ... 47

2.2.8 Statistik ... 48

2.2.9 Beteiligte Personen ... 49

3 Ergebnisse ... 50

3.1 Überleben der Versuchstiere ... 50

3.2 Körpergewichte und Nierengewichte in mTERC^-/-- Mäusen ... 51

3.2.1 Präoperatives Körpergewicht ... 51

3.2.2 Prä- und postoperatives Nierengewicht ... 52

3.3 Nierenfunktion nach Transplantation ... 53

3.3.1 Serumkreatinin ... 53

3.3.2 Harnstoff ... 54

3.4 Histopathologische Veränderungen ... 54

3.4.1 Infiltrat ... 54

3.4.2 Glomerulosklerose ... 55

3.4.3 Interstitielle Fibrose ... 56

3.4.5 Proliferation ... 59

3.5 Expression von Seneszenzmarkern ... 62

3.5.1 Expression von p21^WAF/CIP1 ... 62

3.5.2 Expression von p16^INK4a ... 63

3.6 Entstehung von DNA-Schäden und Reparaturfähigkeit ... 64

3.6.1 γ-H2AX-positive Nuklei im Kortex ... 64

3.6.2 γ-H2AX-positive Nuklei im korticomedullären Übergang ... 66

4 Diskussion ... 69

4.1 Einordnung der Ergebnisse ... 69

4.1.1 Transplantatüberleben ... 69

4.1.2 Körpergewicht ... 69

4.1.3 Nierengewicht vor und nach Transplantation ... 70

4.1.4 Nierenfunktion ... 70

4.1.5 Glomerulosklerose ... 71

4.1.6 Interstitielle Fibrose ... 72

4.1.7 Apoptose ... 73

4.1.8 Proliferation ... 74

4.1.9 DNA-Schaden ... 74

4.1.10Zelluläre Seneszenz ... 75

4.1.10.1 p21^WAF/CIP1 - Marker für replikative Seneszenz ... 76

4.1.10.2 p16^INK4a - Marker für STASIS ... 77

4.2 Evaluation des Transplantationsmodells ... 79

4.3 Ausblick ... 82

5 Zusammenfassung ... 84

6 Literaturverzeichnis ... 85

7 Abbildungsverzeichnis ... 98

7.1 Abbildungen ... 98

7.2 Tabellen ... 99

8 Abkürzungsverzeichnis ... 100

9 Publikationen ... 104

9.1 Paper ... 104

9.2 Vorträge ... 104

9.3 Posterpräsentationen ... 104

10 Curriculum vitae ... 106

11 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 ... 107

12 Danksagung ... 108

1.1 Die Bedeutung der Nierentransplantation als Nierenersatzverfahren

Die erfolgreiche Transplantation von Organen ist eine der größten Errungenschaften der modernen Medizin. Durch die Verbesserung der Immunsuppression und die Verfeinerung chirurgischer Techniken hat sich die Nierentransplantation zur Therapie der Wahl bei der Behandlung der terminalen Niereninsuffizienz entwickelt. Eine gelungene Transplantation bedeutet für chronische Dialysepatienten in der Regel eine längere Lebenszeit (1) sowie eine erhebliche Verbesserung der Lebensqualität trotz der Notwendigkeit einer lebenslangen Immunsuppression (2). Auch in Bezug auf das Kosten-Nutzen-Verhältnis ist die erfolgreiche Nierentransplantation jahrelanger Dialyse vorzuziehen (3). Allerdings besteht ein großes Missverhältnis zwischen Patienten, die eine Nierentransplantation benötigen und der Zahl der verfügbaren Organe. Die Deutsche Stiftung Organtransplantation (DSO) registrierte für das Jahr 2010 insgesamt 3710 Anmeldungen zur Nierentransplantation in Deutschland, jedoch nur 2973 Transplantationen (4). Die große Organknappheit zieht Bemühungen nach sich, das Spenderkollektiv zu erweitern und alle verfügbaren Organe optimal zu nutzen. Ein Ansatz zur Lösung dieses Problems ist die Verwendung von Organen älterer Spender (5).

1.1.1 Auswirkung des Organalters auf die Transplantatfunktion

Ein hohes Spenderalter wurde als ein Hauptrisikofaktor für schlechtere Transplantatfunktion und kürzeres Transplantatüberleben identifiziert (6,7) (siehe Abb. 1). Ein verzögertes Einsetzen der Nierenfunktion nach Transplantation sowie eine geringere glomeruläre Filtrationsrate findet man häufiger bei Nieren älterer Spender (8). 2001 zeigten De Fijter et al. signifikant mehr akute Abstoßungen in Transplantaten von Spendern über fünfzig Jahren (9). Auch die Inzidenz der chronischen Transplantatnephropathie (chronic allograft nephropathy, CAN), deren histopathologische Veränderungen einer beschleunigten physiologischen Alterung

1 Einleitung

des Nierengewebes ähneln (10), steigt durch ein hohes Spenderalter und die Vorschädigung des transplantierten Organs (11). Diese Erkenntnisse rücken den Alterungsprozess des Nierengewebes in den Fokus der Transplantationsforschung.

Abbildung 1: Zusammenhang zwischen dem Alter des Spenders und dem Transplantatüberleben

Die Abbildung verdeutlicht die Verkürzung des Transplantatüberlebens mit steigendem Alter des Spenders (CTS collaborative transplant study K-17101-0809, www.ctstransplant.org).

1.1.2 Altersbezogene Veränderungen von Nierengewebe und -funktion

Die Alterung der Niere äußert sich makroskopisch durch einen Verlust von Gewebe, der insbesondere den Kortex betrifft (12) und auch bei Personen ohne Hinweis auf eine Nierenerkrankung auftritt (13, 14). Histologisch finden sich vermehrt Glomerulosklerose, interstitielle Fibrose und eine Verdickung der Gefäßintima (15).

in einem erhöhten renalen Gefäßwiderstand, einem reduzierten renalen Plasmafluss und einer geringeren glomerulären Filtrationsrate (16). Die Inzidenz des akuten Nierenversagens ist bei Personen über fünfundsechzig Jahren deutlich erhöht und verglichen mit jüngeren Patienten erlangt ein geringerer Anteil nach einem solchen Ereignis die vollständige Nierenfunktion zurück (17). Auch chronische Nierenerkrankungen treten bei älteren Patienten deutlich häufiger auf (18). Weiterhin können die Nieren durch andere Erkrankungen wie Diabetes mellitus und arterielle Hypertonie aufgrund des Alters über Jahrzehnte hinweg geschädigt worden sein.

1.2 Zelluläre Seneszenz und ihre klinische Bedeutung

Der hier dargestellte strukturelle und funktionelle Phänotyp alternder Nierenzellen wird mit dem Begriff „renale Seneszenz“ beschrieben (12). Die beschriebenen Veränderungen lassen sich auch auf andere humane Zellen übertragen.

„Seneszenz“ stammt von dem lateinischen Wort senex, was „Greis“ oder „hohes Alter“ bedeutet (19). Auf zellulärer Ebene beschreibt Seneszenz einen permanenten und irreversiblen Zellzyklusarrest (20, 21). 1961 stellten Hayflick und Moorhead erstmals fest, dass humane Fibroblasten ein definiertes replikatives Potential besitzen und nach 50-70 Zellteilungen ein irreversibler Zellzyklusarrest eintritt (22). In den folgenden Jahren konnten die in vitro beobachteten Veränderungen auch in vivo nachgewiesen werden (10). Seneszente Zellen bleiben metabolisch aktiv, reagieren aber nicht mehr auf mitogene Stimuli (23). Die Veränderungen drücken sich auch in einer veränderten Genexpression aus (24). Phänotypisch präsentieren sich seneszente Zellen typischerweise vergrößert mit vakuolenreichem Zytoplasma (22).

Nach aktuellem Stand wissenschaftlicher Erkenntnisse unterscheidet man zum Erreichen der Seneszenz auf zellulärer Ebene einen intrinsischen, Telomer- abhängigen und einen extrinsischen, Telomer-unabhängigen Weg. Beide werden im Folgenden näher erläutert.

1.3 Telomere

1.3.1 Definition

Die Grundlage für die Telomerforschung schufen in den dreißiger und vierziger Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts Hermann J. Muller (25) und Barbara McClintock im Rahmen ihrer Forschungen zur chromosomalen Stabilität (26). Sie entdeckten, dass sich die natürlichen Enden der Chromosomen von Bruchenden nach Doppelstrangbrüchen unterscheiden. Während intakte Chromosomen relativ stabil sind, kommt es nach Chromosomenbrüchen häufig zu End-zu-End-Fusionen, die zu dizentrischen Chromosomen, Ringchromosomen oder anderen instabilen Formen führen (27). Natürliche Chromosomenenden schienen davor geschützt zu sein. Sie bezeichneten diese spezialisierten Chromosomenenden als Telomere, abgeleitet aus dem Griechischen τέλος (telos, Ende) und μέρος (meros, Teil). 1978 beschrieb Elizabeth Blackburn erstmals die Telomersequenz am Chromosomenende des Wimperntierchens Tetrahymena (28). Die Entschlüsselung der humanen Telomersequenz 5’ TTAGGG 3‘ gelang Moyzis et al. zehn Jahre später (29).

1.3.2 Struktur und Funktion

Telomere sind Nukleoproteinkomplexe am Ende linearer Chromosomen (siehe Abb.

2). Sie bestehen aus repetitiven, nicht-proteinkodierenden Tandemwiederholungen des Hexanukleotids 5‘ TTAGGG 3‘ und dessen komplementären Strangs. Während die Telomersequenz in allen Wirbeltieren identisch ist, bestehen bedeutende Unterschiede in der Telomerlänge zwischen verschiedenen Spezies und Zellarten.

So sind zum Beispiel die Telomere von Mäusen um ein Vielfaches länger als humane Telomere (30, 31). Der TG-reiche Strang ragt am 3‘-Ende um einige hundert Basenpaare (bp) über sein CA-reiches Komplement hinaus. Durch Rückfaltung und Verbindung dieses Überhangs mit den doppelsträngigen Telomerbereichen entsteht eine Lasso-ähnliche Struktur, die als t (telomeric) -loop bezeichnet wird und das Chromosomenende vor der Degradation durch Nukleasen und unkontrollierter Fusion mit anderen Chromosomen schützt (32). An der Aufrechterhaltung dieser

Struktur sind diverse Telomer-spezifische Proteine beteiligt. Eine zentrale Rolle dabei spielt TRF-2 (telomere repeat binding factor), dessen Fehlen End-zu-End-Fusionen hervorruft (33), während TRF-1 an der Regulation der Telomerlänge beteiligt ist (34).

Neben den bereits erwähnten Funktionen sind die Telomere an einer Vielzahl weiterer biologischer Prozesse beteiligt (35), wie beispielsweise bei der Ausrichtung der Chromosomen in der Anaphase während der mitotischen und meiotischen Teilung (36). Jede Zellteilung geht mit einem Verlust von fünfzig bis zweihundert Basenpaaren am Telomer einher (37). Daraus resultiert das sog.

Endreplikationsproblem, welches in letzter Konsequenz den intrinsischen Weg zellulärer Seneszenz einleitet.

Abbildung 2: Struktureller Aufbau eines Chromosoms

Die Abbildung zeigt den strukturellen Aufbau eines Chromosoms. An den Enden der Chromatiden befinden sich die Telomere. Dabei handelt es sich um nicht-proteinkodierende Nukleoproteinkomplexe, deren Funktion der Schutz des Chromosoms vor Degradation durch Nukleasen und unkontrollierter Fusion mit anderen Chromosomen ist.

.

1.4 Das Endreplikationsproblem

Die zu replizierende DNA liegt als Doppelstrang vor. Ein Strang verläuft vom 5‘-Ende zum 3‘-Ende, der komplementäre Strang verläuft antiparallel vom 3‘-Ende zum 5‘- Ende. Die Elongation des DNA-Stranges durch das Enzym DNA-Polymerase erfolgt ausschließlich vom 3‘-Ende in Richtung 5‘-Ende (siehe Abb. 3). Um die Voraussetzung für die Replikation beider Stränge zu schaffen, repliziert das Enzym Primase kurze DNA-Sequenzen und präsentiert so der DNA-Polymerase ein freies 3’-OH-Ende, an dem die eigentliche Replikation beginnen kann. Der komplementäre

Strang, der vom 5‘-Ende in Richtung 3‘-Ende verläuft, wird mithilfe vieler sog. Primer repliziert. Die RNA-Primer werden anschließend von Endonukleasen entfernt. Die dabei entstehenden kurzen DNA-Abschnitte werden als Okazaki-Fragmente bezeichnet und von Ligasen miteinander verbunden. An den Telomeren können die Lücken, die beim Entfernen der RNA-Primer entstehen, nicht geschlossen werden, da kein vorhergehendes Nukleotid mit freiem 3‘-Ende zur Verfügung steht. Dieser Umstand führt bei jeder Replikation zum Verlust einiger Nukleotide. Erreichen die Telomere nach etwa 50 - 70 Zellteilungen eine kritische Länge (31), kann die T-Loop- Struktur nicht mehr aufrechterhalten werden und es besteht kein weiterer Schutz vor chromosomaler Fusion. Dieser Zustand kann unter anderem die Entstehung von Tumoren begünstigen. Um eine weitere unkontrollierte Proliferation der betroffenen Zellen zu verhindern, wird daher ein DNA-Schadenssignal ausgesandt und der intrinsische Weg zellulärer Seneszenz, auch als replikative Seneszenz bezeichnet, wird eingeleitet.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der DNA-Replikation

Dargestellt ist das Prinzip der DNA-Replikation: Die Elongation des DNA-Strangs durch die DNA- Polymerase kann ausschließlich vom 3‘-Ende Richtung 5‘-Ende erfolgen. Um die Replikation des vom 5’-Ende zum 3‘-Ende verlaufenden Komplementärstranges zu ermöglichen, repliziert das Enzym Primase kurze DNA-Sequenzen, die sogenannten Okazaki-Fragmente, und präsentiert so der DNA- Polymerase ein freies 3’-OH-Ende, an dem die eigentliche Replikation begonnen werden kann. Die dabei entstehenden Lücken werden anschließend von DNA-Ligasen geschlossen, lediglich an den Telomeren steht nach dem Entfernen der Primer kein freies 3‘-OH-Ende zur Verfügung, was eine

1.5 Telomerase

1.5.1 Definition, Struktur und Funktion

Die wesentliche Bedeutung der Telomerregion für die Stabilität der DNA und die Erkenntnisse über den stetigen Verlust von Basenpaaren im Rahmen der Proliferation führen zu der Frage, wie eukaryote Zellen diesem Abbau entgegenwirken können und warum nicht jedes Gewebe vom Endreplikationsproblem betroffen ist. Das Enzym Telomerase, welches 1985 von Greider et al. erstmals bei der Gattung Tetrahymena thermophila beschrieben wurde (38), ist zur Synthese telomerischer DNA fähig und kann so der Telomerverkürzung entgegenwirken. Bei der Telomerase handelt es sich um ein Ribonukleoprotein mit einer Größe von über 1000 kDA. Da sie die Transkription von RNA in DNA katalysiert, gehört die Telomerase zur Klasse der reversen Transkriptasen, verfügt aber über einige besondere Eigenschaften. Dazu gehört insbesondere die Verwendung eines Abschnitts der integrierten RNA-Untereinheit als Matrize für die DNA-Synthese sowie die Fähigkeit, vielfache Transkripte eines DNA-Abschnitts zu erstellen, in dem mehrere Transkriptionszyklen hintereinander am selben Substrat ablaufen (39, 40). Der Telomerase-Komplex besteht aus der katalytischen reversen Transkriptase-Einheit hTERT (human telomerase reverse transcriptase) und einer der telomerischen Sequenz komplementären RNA-Komponente hTERC (human telomerase rna component). In humanen Zellen hat die RNA-Komponente hTERC eine Länge von 451 Nukleotiden und umfasst die Templatesequenz 5’

CUAACCCUAAC 3’ (41-43). Die Synthese telomerischer DNA findet in der S-Phase des Zellzyklus statt (41). Sie beginnt mit der Bindung des 3’-Überhangs der Telomer- DNA an die Templatesequenz sowie an diverse Domänen der hTERC. Anschließend erfolgt die Elongation des DNA-Substrats am 3‘-Ende durch Einfügen von Nukleotiden in der Reihenfolge 5‘ TTAGGG 3‘, bis das 5‘-Ende der Templatesequenz erreicht wird. Die Telomerase bindet wieder am neu synthetisierten 3‘-Ende der Telomer-DNA und ein weiterer Transkriptionszyklus wird initiiert. Nach der Verlängerung des Guanin-reichen Strangs durch die Telomerase folgt die Synthese des komplementären Cytosin-reichen Strangs durch konventionelle DNA- Polymerasen, sodass schließlich eine doppelsträngige Telomer-DNA entsteht (39).

Versuche an hTERC-defizienten embryonalen Stammzellen zeigten eine zunehmende Telomerverkürzung und damit einhergehend eine reduzierte Wachstumsrate (42), wohingegen bei humanen Endothelzellen und Fibroblasten nach der Transfektion mit der hTERT-Untereinheit eine erheblich verlängerte Lebensspanne sowie eine reduzierte Expression von Seneszenzmarkern festgestellt werden konnten (43, 44). An der Regulation der Synthese telomerischer DNA sind verschiedene Prozesse beteiligt. Neben der Steuerung der Enzymaktivität durch Genexpression ist vor allem die Telomerregion selbst durch verschiedene Feedback- Mechanismen an der Regulation der Telomeraseaktivität beteiligt (45, 46).

1.5.2 Natürliches Vorkommen beim Menschen

Eine hohe Telomeraseaktivität findet man beim Menschen in Zellen, die hohen replikativen Anforderungen unterliegen, insbesondere in Keimzellen (47), Stammzellen und Progenitorzellen (48) sowie in Lymphozyten (47, 49). Die meisten somatischen Zellen hingegen verlieren nach Abschluss der embryonalen Entwicklung die Fähigkeit zur Synthese telomerischer DNA und sind folglich nur zu einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen fähig (50). 2003 entdeckten Masutomi et al., dass auch in somatischen Zellen Telomeraseaktivität vorhanden ist, welche aber nicht auszureichen scheint, um der Telomerverkürzung entgegenzuwirken (51). Auch die meisten malignen Zellen beim Menschen zeigen unabhängig von der Art des Tumors eine hohe Telomeraseaktivität (52, 53)

.

1.5.2.1 Klinische Bedeutung kritisch kurzer Telomere

Die Telomerlänge steht in Zusammenhang mit der Entwicklung alters-assoziierter Erkrankungen. So fand man in den Endothelzellen arteriosklerotischer Gefäße eine ausgeprägte Telomerverkürzung (55). Eine abnehmende Telomerlänge in B- und T-

eine Schwächung des Immunsystems zur Folge (55). Auch die Entwicklung einer Leberzirrhose, Colitis ulcerosa oder eines Herzversagens geht mit einer Telomerverkürzung einher (32). Des Weiteren wurden neben dem Alter einige epidemiologische Faktoren identifiziert, die zu einer beschleunigten Telomerverkürzung führen, darunter Rauchen, Übergewicht, Stress sowie ein niedriger sozio-ökonomischer Status (32).

Besonders eindrucksvoll zeigt sich die Verknüpfung der Telomerlänge mit Alterungsprozessen an den sogenannten Alterssyndromen. Diese zeichnen sich durch eine starke Beschleunigung physiologischer Alterungserscheinungen aus, die durch bestimmte Gendefekte hervorgerufen werden. Eines dieser Krankheitsbilder ist die Dyskeratosis congenita. Bei den Betroffenen zeigen sich häufig bereits in der ersten Lebensdekade Defekte hoch proliferativer Gewebe, wie beispielsweise der Haut oder des Knochenmarks, des Weiteren bestehen eine chromosomale Instabilität sowie eine Prädisposition zur Entwicklung bestimmter Tumoren, insbesondere Plattenepithelkarzinomen der Haut (56, 57). Überdies kommt es in vielen Fällen zu frühzeitigen Zahnschäden sowie Ergrauen und Verlust der Haare.

Fibroblasten und Lymphoblasten der Dyskeratosis congenita-Patienten zeigen, verglichen mit den Zellen gesunder Menschen desselben chronologischen Alters, kritisch kurze Telomere sowie eine deutlich niedrige Telomeraseaktivität (58, 59).

Weitere Beispiele für Krankheitsbilder mit beschleunigter Alterung sind das Bloom- Syndrom, das Werner-Syndrom, das Hutchinson-Gilford-Syndrom und das Down- Syndrom. In allen angeführten Beispielen finden sich Störungen der Telomerase- Biologie (55).

1.6 Der intrinsische Weg zellulärer Seneszenz - Replikative Seneszenz

Das Phänomen der Seneszenz wurde 1961 erstmals von Hayflick und Moorhead beschrieben (22). Sie stellten fest, dass humane embryonale Fibroblasten in vitro nur zu einer begrenzten Anzahl mitotischer Zellteilungen fähig sind und anschließend in einen Zustand übergehen, in dem zwar die meisten Zellfunktionen erhalten bleiben,

dass Kulturen adulter Zelllinien diesen Ruhezustand deutlich früher erreichen, verglichen mit embryonalen Zellen (60). Die Anzahl der möglichen Zellverdopplungen wird als „Hayflick-Limit“ bezeichnet. Bei der Untersuchung dessen, was nach Erreichen des Hayflick-Limits den Zellzyklusarrest auslöst, entdeckte man, dass eine zunehmende Anzahl an Zellzyklen mit dem Abbau endständiger Chromosomenabschnitten, den sogenannten Telomeren einhergeht und diese als

„mitotische Uhr“ fungieren (61, 62). Wenn die Telomere eine kritische Länge erreichen, wird der intrinsische Weg zellulärer Seneszenz, auch als replikative Seneszenz bezeichnet, eingeleitet (30). Eine wesentliche Rolle bei diesem Prozess spielen der Transkriptionsfaktor p53 sowie der Zellzyklusinhibitor p21^WAF/CIP1 (61).

1.6.1 Die Bedeutung von p53 und p21

im Rahmen replikativer Seneszenz

Das humane p53-Gen hat eine Länge von etwa 20 kb und ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 lokalisiert (63). Es kodiert für ein in Wirbeltieren ubiquitäres Regulatorprotein, welches an grundlegenden physiologischen Prozessen des Zellzyklus beteiligt ist. Die Transkription von p53 wird durch verschiedene Arten von Stress ausgelöst, dazu gehören DNA-Schäden, Telomerverkürzung, Aktivierung von Onkogenen, Hypoxämie und der Verlust adäquater Wachstums- und Überlebenssignale (64). Die Aktivierung von p53 kann verschiedene Vorgänge induzieren, insbesondere die Arretierung des Zellzyklus (65), Reparatur von DNA- Schäden (66), Induktion von Apoptose (67) sowie die Einleitung replikativer Seneszenz (68). Diese Fähigkeiten zur negativen Regulation des Zellzyklus zeichnen den p53-Wildtyp als Tumorsuppressorgen aus (69). Die Bedeutung dieses Proteins bei der Tumorentstehung wird durch Untersuchungen an p53-defizienten Mäusen verdeutlicht. Der Verlust eines oder beider Allele führt zu einer deutlich vermehrten Entwicklung von Tumoren, deren Wachstum durch die Wiedereingliederung von p53-Wildtyp in die Tumorzellen aufgehalten werden kann (68, 70). Auch für die Beteiligung von p53 in der humanen Kanzerogenese gibt es heute reichlich Belege, so finden sich in 50 % aller humanen Tumorzellen Mutationen

Der Zellzyklusinhibitor p21^WAF/CIP1 ist eines der Zielgene von p53, welches die Induktion Telomer-abhängiger Seneszenz vermittelt (72). Dabei handelt es sich um einen zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitor (CKI), auch cyclin-dependent kinase inhibitory protein (CIP1) oder wild type p53-activated fragment 1 (WAF) genannt (72, 73). Die beiden wesentlichen Funktionen von p21^WAF/CIP1 sind die bereits genannte Inhibierung zyklin-abhängiger Kinasen durch deren Bindung (73) sowie die Rolle als Effektorprotein von p53 bei der Induktion replikativer Seneszenz (72) (siehe Abb. 4).

Des Weiteren ist p21^WAF/CIP1 an der Inhibition von Apoptose (74) sowie an Differenzierungsprozessen von Stammzellen und einer Reihe weiterer biologischer Prozesse beteiligt (75).

Die Signalkaskade, welche bei der Entstehung von DNA-Schäden in Gang gesetzt wird, beginnt mit der Bindung des Histons 2AX (H2AX) an die Stelle des DNA- Schadens. Dies führt zur Rekrutierung verschiedener Proteinkinasen, welche unter anderem H2AX, nun als γ-H2AX bezeichnet, und p53 phosphorylieren (76).

Phosphoryliertes p53 aktiviert p21^WAF/CIP1, welches die Aktivität der CyklinD1/CDK4/6- und CyklinE/CDK2-Komplexe inhibiert (77). Cyklin-abhängige Kinasen (CDK) sind in Assoziation mit Zyklinen entscheidend an der Steuerung zellulärer Proliferation beteiligt. Die Komplexe CyklinD/CDK4/6 und CyklinE/CDK2 ermöglichen die Hyperphosphorylierung des Tumorsuppressorproteins Retinoblastoma-Protein (Rb) und somit den Übergang von der G1-(gap-Phase) in die S-Phase (Synthese-Phase) des Zellzyklus (78, 79). Wird hingegen ein DNA-Schaden festgestellt, inhibiert p21^WAF/CIP1 die Aktivität der CDK, das Rb-Protein verbleibt im dephosphorylierten Zustand und inhibiert die Aktivität von Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie, die an der Regulation des Zellzyklus und der DNA-Synthese beteiligt sind (39, 80). Kommt es zu einer Komplexierung von E2F durch das Rb-Protein, wird eine weitere Expression E2F-abhängiger Gene, die für den G1-/S-Übergang notwendig sind, blockiert und es findet keine weitere Zellteilung statt (81, 82).

Untersuchungen an humanen Fibroblasten zeigen, dass die Inaktivierung von p21^WAF/CIP1 zu einer Umgehung der replikativen Seneszenz führt. Bei DNA-Schäden tritt kein Zellzyklusarrest ein, was die Verlängerung der Lebensspanne der betroffenen Zellen zur Folge hat. Diese Erkenntnisse verdeutlichen die Bedeutung von p21^WAF/CIP1 bei der Induktion der intrinsischen Seneszenz (83).

1.7 Der extrinsische Weg zellulärer Seneszenz - Stress and aberrant signaling induced senescence (STASIS)

Zahlreiche äußere Faktoren beeinflussen Wachstum und Replikation von Zellen.

Dabei können schädliche Einflüsse, wie oxidativer und metabolischer Stress, DNA- Schädigung oder epigenetische Veränderungen den extrinsischen Weg zellulärer Seneszenz, die sogenannte stress and aberrant signaling induced senescence (STASIS), einleiten (84). Eine wesentliche Rolle spielt dabei der Zellzyklusregulator p16^INK4a.

1.7.1 Die Bedeutung von p16

im Rahmen von STASIS

Die für das Protein p16^INK4a kodierende Region besteht aus zwei Exonen und ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 9 lokalisiert. Das Genprodukt p16^INK4a ist ein Prototyp der Cyklin-abhängigen Kinasen (CDK). Es inhibiert CDK 4 und 6 indem es mit Zyklin D um die CDK-Bindungsstelle konkurriert (85). Die Aufgabe der CDK 4 und 6 ist die Phosphorylierung des Rb-Proteins (86), das den Eintritt der Zelle von der postmitotischen Gap-Phase (G1-Phase) in die Synthese-Phase des Zellzyklus und damit die Replikation der DNA ermöglicht. Kommt es aber durch extrinsischen Stress zur Induktion von p16^INK4a, wird die Phosphorylierung des Rb-Proteins verhindert und die Zelle verbleibt in der G1-Phase (siehe Abb. 4).

P16^INK4a spielt sowohl bei der Zellalterung, als auch in der Tumorentstehung eine wesentliche Rolle (87). Melk et al. konnten die starke Korrelation von p16^INK4a- Expression mit Alterungsprozessen in menschlichen Nieren (85) und Nieren von Ratten (88) zeigen. P16^INK4a gehört zu den Tumorsuppressorgenen und der INK4- Genabschnitt ist in nahezu 50 % der humanen Krebszelllinien inaktiviert (56).

Shapiro et al. demonstrierten 1995, dass eine Wiedereingliederung des p16^INK4a- Gens in p16^INK4a-negativen NSCLC-Zellen durch retrovirale Infektion zu einer Verlangsamung des Tumorwachstums in vitro führt (57).

als mTERC (mouse telomerase rna component) bezeichnet wird, gelang die Züchtung von Mäusen, denen jegliche Telomeraseaktivität fehlte. Durch Kreuzen sukzessiver Generationen erhielt man mTERC^-/--Mäuse bis zur sechsten Generation, wobei es in jeder nachfolgenden Generation zu einer Telomerverkürzung um 4,8 +/- 2,4 kb kam. Da Mäuse verglichen mit Menschen über deutlich längere Telomere verfügen (40-150 kb vs. 5-20 kb) (12), zeigten sich in der ersten Generation (KO-G1) noch keine Folgen der aus dem Telomerase-Verlust resultierenden Telomerverkürzung (90). Die mTERC^-/--Mäuse späterer Generationen hingegen zeigten einen auffälligen Phänotyp und eine Reihe von Defekten, die mit der progredienten Telomerverkürzung in Verbindung gebracht werden können. In welcher Generation diese Veränderungen in Erscheinung treten, ist hingegen abhängig von dem genetischen Hintergrund und der Telomerlänge des untersuchten Inzuchtstammes (91). Bei den Tieren höherer Generationen mit kritisch kurzen Telomeren findet sich eine erhöhte embryonale Mortalität durch inkompletten Neuralrohrverschluss (92) sowie zunehmende Infertilität (91). Bei heranwachsenden und erwachsenen Tieren zeigen sich Alterserscheinungen, wie das vorzeitige Ergrauen des Fells, Alopezie und ulzerierenden Hautveränderungen (siehe Abb. 5), wobei eine inverse Korrelation der Telomerlänge mit den genannten Merkmalen besteht (93). Des Weiteren zeigen Tiere der späteren Generationen eine reduzierte Lebensspanne und eine geringere Größen- und Gewichtszunahme. Darüber hinaus finden sich zahlreiche Veränderungen in Geweben mit hohen Zellumsatzraten, was zu Milzatrophie, intestinaler Atrophie, verzögerter Wundheilung und einer Schwächung des Immunsystems durch geringere Proliferation von B- und T-Zellen führt (91, 93). Des Weiteren findet sich eine reduzierte Regenerationsfähigkeit der Leber nach akuter oder chronischer Schädigung (94, 95). Aktuelle Daten von Westhoff et al. zeigten eine ebenfalls eingeschränkte Regenerationsfähigkeit der Niere nach Ischämie-Reperfusionsschaden (96). Weitere Untersuchungen zeigten ein gehäuftes Auftreten maligner Tumoren bei den mTERC^-/--Mäusen. Es wird vermutet, dass ein Zusammenhang mit der ebenfalls zunehmenden chromosomalen Instabilität in Zellen mit kritisch kurzen Telomeren besteht (47). Die Auflösung der Telomerstruktur führt zu einer Zunahme chromosomaler End-zu-End-Fusionen, die wiederum mit spontaner Tumorentstehung in hochproliferierenden Organen

einen Schutz vor Tumoren bieten. So zeigen Telomerase-defiziente Mäuse beispielsweise eine geringere Anfälligkeit gegenüber epithelialen Hauttumoren (97).

In Vorarbeiten zu diesem Projekt verglichen wir den renalen Phänotyp von jungen (3- 6 Monate) und alten (14-18 Monate) mTERC^+/+-Mäuse und mTERC^-/--Mäuse der Generationen KO-G1, KO-G4 und KO-G5 miteinander, welche keinem extrinsischen Stress ausgesetzt waren.

Im Vergleich mit Wildtyp-Tieren zeigen mTERC^-/--Mäuse späterer Generationen ein geringeres Körper- und Nierengewicht, verglichen mit Wildtypen und KO-G1-Tieren.

Bei den älteren Tieren kommt ein Gewichtsverlust mit fortschreitendem Alter hinzu.

Die Nierenfunktion zeigt sich mit höherem Alter und höherer Generation tendenziell abnehmend. Histologisch zeigen junge mTERC^-/--Mäuse späterer Generationen ähnliche Veränderungen wie alte Wildtyp-Tiere, insbesondere eine Zunahme der interstitiellen Fibrose und Tubulusatrophie. Die größte Menge auffälliger Glomeruli bei jungen Tieren zeigen mTERC^-/--Mäuse der Generation KO-G5. Mit zunehmendem Alter kommt es zu einer Zunahme auffälliger Glomeruli in allen Gruppen. Der größte Anstieg der p21^WAF/CIP1-Expression als Marker für den Telomer- abhängigen Seneszenzweg findet sich bei den jungen KO-G4-Tieren. Verglichen mit Wildtypen und KO-G1-Tieren zeigt sich in den jungen Tieren weiterhin eine Induktion von p16^INK4a in den KO-G4-Tieren mit einem Maximum bei den KO-G5-Tieren.

Während es bei Wildtypen und KO-G1-Tieren im Alter zu einem Anstieg von p16^INK4a als Marker des Telomer-unabhängigen Seneszenzweges kommt, zeigen KO-G4- Tiere diesen Anstieg nicht. In der Gruppe der alten Tiere kann bei den KO-G4-Tieren ebenfalls die stärkste Expression von p21^WAF/CIP1 beobachtet werde, eine weitere Induktion von p16^INK4a ist in dieser Gruppe ebenfalls nicht zu beobachten.

Einige der beobachteten Veränderungen, wie beispielsweise der Anstieg von Tubulusatrophie und interstitieller Fibrose, stehen in Einklang mit der milden Pathologie in nicht erkrankten alternden humanen Nieren. Die aktuellen Daten legen nahe, dass späte Generationen von mTERC^-/--Mäusen mit alternden humanen Nieren vergleichbar sind und ein gutes Modell zur weiteren Untersuchung der renaler Alterungsmechanismen darstellen (unveröffentlichte Daten).

1.9 Nierentransplantation bei mTERC

-Mäusen

In weiteren Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass bei Nieren von Tieren mit kritisch kurzen Telomeren nach renaler Ischämie-Reperfusion eine höhere Anfälligkeit für akuten Zellschaden besteht und eine geringere Regenerationsfähigkeit nachweisbar ist. Eine Steigerung der Proliferationsrate, die bei Wildtyp-Tieren als Reaktion auf diese Belastung zu erwarten wäre, fällt bei den mTERC^-/--Mäusen höherer Generationen wesentlich geringer aus (96). Dies und eine höhere Expression von Seneszenzmarkern, insbesondere p16^INK4a und p21^WAF/CIP1, sprechen für eine reduzierte Fähigkeit des Organs auf extrinsischen Stress zu reagieren (96), (unveröffentlichte Daten).

Um die Ursachen der schlechteren Transplantatfunktion älterer Organspender weiter zu untersuchen und die Bedeutung der oben genannten Erkenntnisse im Rahmen einer Nierentransplantation zu beurteilen, wurde ein Transplantationsmodell an mTERC^-/--Mäusen entwickelt. Dafür wurden isogene Nierentransplantationen an mTERC^-/--Mäusen verschiedener Generationen vorgenommen und das Gewebe a) b)

Abbildung 5: mTERC^-/--Mäuse verschiedener Generationen

Die Abbildung zeigt mTERC^-/--Mäuse verschiedener Generationen. In Abb. 5a) sind eine mTERC^-/-- Maus der ersten Generation (KO-G1) sowie eine mTERC^-/--Maus der vierten Generation (KO-G4) einander gegenüber gestellt. Während bei dem KO-G1-Tier noch keine wesentliche Telomerverkürzung stattgefunden hat, verfügt das KO-G4-Tier lediglich über stark verkürzte Telomere. Dies äußert sich phänotypisch in einer geringeren Körpergröße, einem geringeren Gewicht und dem vorzeitigen Ergrauen des Fells, wie in Abb. 5b) deutlich wird (Mit herzlichem Dank an C.

Schildhorn für das Überlassen der Bilder).

KO-G1

KO-G4

KO-G4

nach Entnahme sechs Wochen nach Transplantation histologisch, immunhistochemisch und molekularbiologisch untersucht.

1.10 Zielsetzung der Arbeit

Die wachsende Lebenserwartung in Industrienationen und der zunehmende Bedarf an transplantierbaren Organen führen zu einem gesteigerten Interesse an der Physiologie und Pathophysiologie alternder Nieren. Zur Untersuchung von Transplantaten mit eingeschränkter Regenerationsfähigkeit sowie zur Entwicklung therapeutischer Interventionen ist ein Tiermodell notwendig. Das Ziel dieser Arbeit ist die Evaluation eines Transplantationsmodells sowie die Untersuchung des Einflusses kritisch kurzer Telomere auf die Funktion von Nierentransplantaten.

Die zu überprüfende Hypothese lautet, dass Nieren von mTERC^-/--Mäusen höherer Generationen mit kritisch kurzen Telomeren nach Transplantation aufgrund der höheren Anzahl seneszenter Zellen über eine eingeschränkte Regenerationsfähigkeit verfügen. Dies müsste sich bei den Tieren mit kritisch kurzen Telomeren durch eine schlechtere Nierenfunktion, eine geringere Proliferationsrate, eine erhöhte Apoptoserate sowie einer gesteigerten Expression von Seneszenzmarkern wie p16^INK4a und p21^WAF/CIP1 manifestieren, verglichen mit Wildtypen mit intakter Telomerasefunktion. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sollen weiterhin dem besseren Verständnis des zellulären Seneszenz-Mechanismus dienen, welchem eine entscheidende Bedeutung bei der Alterung wie auch der Entstehung alters- assoziierter Erkrankungen zukommt. Mit einem aussagekräftigen Transplantationsmodell können therapeutische Interventionen erprobt werden, wie zum Beispiel die Verwendung von gegen Seneszenzmarker gerichtete si-RNAs (small interfering RNA), die schließlich zur Verbesserung der Funktion von Transplantaten älterer Spender führen könnten.

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Versuchstiere

In den Versuchen wurde ein mTERC-Knockout-Stamm B6.Cg-Terc^tm1Rdp/J mit C57BL/6-Hintergrund von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) verwendet.

Durch Kreuzen heterozygoter Tiere (mTERC^+/-) erhielt man unter anderem mTERC^-/-- Mäuse der ersten Generation (KO-G1). Durch weiteres Kreuzen der KO-G1-Tiere und den daraus entstehenden Generationen erhielt man Knockout-Mäuse höherer Generation (KO-G3 und KO-G4). Um eine optimale Durchmischung des Genpools zu erreichen und einen „genetischen Drift“ mit Unterschied zwischen Wildtypen und KO- Tieren zu vermeiden, erfolgten außerdem regelmäßige Rückkreuzungen zwischen heterozygoten (Het) und Wildtyp (WT)-Tieren.

Vier Monate alte weibliche Tiere desselben Stammes, die vor dem Umzug der Arbeitsgruppe nach Hannover in Tierräumen des Zentrums für Medizinische Forschung in Mannheim unter denselben Bedingungen gezüchtet wurden, dienten als Kontrollgruppe für die Expression von p16^INK4a- und p21^WAF/CIP1-mRNA.

Zucht und Haltung der Versuchstiere erfolgte in zentralklimatisierten Tierräumen der PHENOS GmbH in Hannover. Die Mäuse wurden basierend auf einer Standarddiät mit Trinkwasser ad libitum und konstanten Licht-Dunkelheit-Phasen von jeweils zwölf Stunden gehalten und verpaart.

Das Aktenzeichen des Tierversuchsantrags lautet 433.9-42502-04-08/1513.

2.1.2 Chemikalien und Enzyme

Substanz Hersteller

Universal Blocking Reagenz BioGenex, Fremont (CA) Antibody diluting Buffer with Background

reducing components

Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

Ki-67 monoclonal Mouse anti-Rat IgG_2a Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

Mouse IgG2a BD Biosciences Clontech, Palo alto (CA)

EnVision+, liquid Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

3,3-Diaminobenzidin (DAB) liquid Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

Ethanol Merck, Darmstadt (D)

Methanol J.T. Baker, Griesheim (D)

Xylol Merck, Darmstadt (D)

Phosphate-buffered saline (PBS) Biochrom AG, Berlin (D) Wasserstoffperoxid J.T. Baker, Griesheim (D)

Eukit O. Kindler GmbH & Co., Freiburg (D)

Formalin 4 % Merck, Darmstadt (D)

Paraffin Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe (D)

Gill’s Hämatoxylin Nr. 3 Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Bouin’s Solution Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Scarlet Acid Fuchsin Solution Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Phosphotungstic Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Phosphomolybdic Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Aniline blue Solution Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Essigsäure J.T. Baker, Griesheim (D)

Perjodsäure Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Schiff’s Reagenz Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Proteinase K Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Equilibration Buffer Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB) TdT Enzyme “working strength” Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Reaction Buffer Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Stop/Wash Buffer Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Bovines Serumalbumin (BSA) 1 % Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB) Anti Digoxigenin Peroxidase Conjugate Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Methylenblau-Lösung Merck, Darmstadt (D)

Tween Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Phospho-Histone H2AX (Ser 139) (20E3)

rabbit mAb #9718

Vectastain Vector Laboratories, Burlingame (CA)

Biotinylated Anti Rabbit igG Reagent Vectastain Vector Laboratories, Burlingame (CA)

AB Complex Reagent Vectastain Vector Laboratories, Burlingame (CA)

Ammoniak Merck, Darmstadt (D)

Ultra pure DNAse/RNAse-freies Wasser Invitrogen, Darmstadt (D) First Strand Buffer Invitrogen, Darmstadt (D) Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP) Invitrogen, Darmstadt (D) Dithiothreitol (DTT) 0,1 M Invitrogen, Darmstadt (D) Random hexamer primer Invitrogen, Darmstadt (D)

RNAsin plus RNAse-Inhibitor Promega Corporation, Madison (WI) Reverse Transkriptase (MMLV-RT) Invitrogen, Darmstadt (D)

Agarosepulver Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe (D)

Formaldehyd Merck, Darmstadt (D)

BlueJuice, Gel Loading Buffer Invitrogen, Darmstadt (D) Ethidiumbromid E1385 Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe (D) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA),

pH 8,0

Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe (D)

Ficoll 400 15 % GE Healthcare, München (D)

Primer MWG Biotech AG, Ebersberg (D)

Magnesiumchlorid Merck, Darmstadt (D)

TaqMan Universal PCR Mastermix Applied Biosystems, Darmstadt (D)

Trizol Reagenz Invitrogen, Darmstadt (D)

Chloroform Merck, Darmstadt (D)

Isopropyl Alkohol Merck, Darmstadt (D)

CREA plus Reagenz Roche Diagnostics GmbH, Wien (A)

UREA/BUN Reagenz Roche Diagnostics GmbH, Wien (A)

Isofluran Baxter Deutschland GmbH,

Unterschleißheim (D)

Ampuwa-Spüllösung Fresenius Kabi AG, Bad Homburg (D)

2.1.3 Pufferlösungen und Reagenzien aus eigener Herstellung

Hämalaun nach P. Mayer (Hämatoxylin):

1 g Hämatoxylin in 1000 ml dest. Wasser lösen 0,2 g Natriumjodat hinzufügen

50 g chemisch reines Kalialaun (Kaliumaluminiumsulfat-12-hydrat) dazugeben und erwärmen

Nach dem Erkalten 50 g Chloralhydrat und 1 g kristalline Citronensäuremonohydrat dazugeben und lösen, danach filtrieren.

RNA-Laufpuffer (10x):

20 mM MOPS (pH 7,0) 1 mM EDTA

5 mM Natriumacetat

TAE Buffer (10x) 0,4 M TRIS

0,01 M EDTA-Na²⁺-Salz 0,2 M Essigsäure

pH 8,5+/- 0,2

Agarosegel:

1,19 g Agarosepulver 7,5 ml (10x)RNA-Laufpuffer 13,5 ml Formaldehyd

75 ml Ampuwa-Spüllösung

0,01 M Citratpuffer pH 6,0 2,1 g Citronensäuremonohydrat 900 ml destilliertes Wasser

ca. 13 ml von 2 M NaOH, bis pH = 6,0

mit destilliertem Wasser bis auf 1000 ml auffüllen

Ammoniumwater:

2 ml Ammoniaklösung (32 %) 1l 95 % Aqua dest.

Alcoholacid:

4 ml Ammoniaklösung (32 %) 1l 95 % Ethanol

2.1.4 Oligonukleotide HPRT

forward primer 5´ TGACACTGGTAAAACAATGCAAACT 3´

reverse primer 5´ AACAAAGTCTGGCCTGTATCCAA 3´

Sonde 5´ TCCACCAGCAAGCTTGCAACCTTAACC 3´

p21^WAF/CIP1

forward primer 5´ CAGCCACAGGCACCATGTC 3´

reverse primer 5´ ACGGCGCAACTGCTCACT 3´

Sonde 5´ ATGTCCGACCTGTTCCGCACAGGA 3´

p16^INK4a

forward primer 5´ AACCTTGCCCATCATCATC 3´

reverse primer 5´ GGGCACTGCTGGAAGCC 3´

Sonde 5´ CCGAACTCTTTCGGTCGTA 3´

2.1.5 Geräte und Software

Gerät oder Software Hersteller

Mikroskop DM LB2 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Mikroskop DM 5500B Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Kamera DFC 320 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Kamera DFC 360FX Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Software Qwin, Version V3.0 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D) Software ImageJ 1.37c National Institutes of Health, Bethesda (MD)

Software LASAF Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

RTD-PCR Applied Biosystems, Darmstadt (D)

Dampfdrucktopf "Pascal" Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

Kühlzentrifuge M. u. S. Laborgeräte GmbH, Wiesloch (D)

TissueLyser Qiagen, Hilden (D)

Waage Kern und Sohn GmbH,

Balingen-Frommern (D)

Thermomixer Eppendorf AG, Hamburg (D)

Mikrowelle Sharp, Osaka (J)

Photometer Eppendorf AG, Hamburg (D)

UV-Kamera Applied Biosystems, Darmstadt (D)

Elektrophoresekammer Biorad, Hercules (CA)

Ausgießstation EG 1150 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Mikrotom RM 2165 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Mikrotomklingen Feather, Osaka (J)

Wärmeplatte HI 1220 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Brutschrank Memmert GmbH & Co KG, Schwabach (D)

PCR-Cycler („MyCycler Personal Thermal Cycler“)

Biorad, Hercules (CA) Magnetrührgerät Polymax MR 3002 Heidolph Instruments,

Schwabach (D)

Taumler Polymax 1040 Heidolph Instruments, Schwabach (D)

Vortexgerät, Heidolph Reax top Heidolph Instruments, Schwabach (D)

pH-Meter, pH M62 Standard Firma Kurt Hillerkus, Krefeld (D)

Mini Vannas Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Vannas Tübingen Fine Science Tools, Heidelberg (D) Extra fine “Bonn” Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Dumont forceps Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Eye dressing forceps Fine Science Tools, Heidelberg (D) Sterilizing container Fine Science Tools, Heidelberg (D) Surgical scissors Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Silicon mat Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Knüpfpinzette Aesculap, Tuttlingen (D) Mikro-Nadelhalter FD243R Aesculap, Tuttlingen (D) Mikro-Schere OC498R Aesculap, Tuttlingen (D)

Membranspatel Geuder AG, Heidelberg (D)

Skalpell B. Braun AG, Melsungen (D)

Nahtmaterial Ethicon, Norderstedt (D)

MERSILENE 4/0 EH7147H PROLENE 10/0 EH7595G

Mikro-Klemme FE690K Aesculap, Tuttlingen (D)

Stereomikroskop (M3) Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D) Narkosegerät Isofluran Table System Univentor, Zejtun (M)

Kanülen 20G 1/1/2 0,9 X 40mm Becton Dickinson GmbH, Franklin Lakes (NJ)

Einbettungsschälchen Eppendorf AG, Hamburg (D)

Filterspitzen Eppendorf AG, Hamburg (D)

Pipetten (2-1000 µl) Eppendorf AG, Hamburg (D)

Pipetten (5, 10 und 25 ml) Sarstedt, Nürnberg (D)

Probenröhrchen Eppendorf AG, Hamburg (D)

Küvetten Eppendorf AG, Hamburg (D)

Gewebeinfiltrationseinheit Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Objektträger Superfrost Plus Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig (D) Deckgläser 0101232 Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig (D)

2.2 Methoden

2.2.1 Das Transplantationsmodell

Für das Transplantationsmodell dienten männliche vier bis sechs Monate alte Mäuse des Inzuchtstammes B6.Cg-Terc^tm1Rdp/J als Spendertiere: mTERC^+/+-Mäuse (WT), mTERC^+/- -Mäuse (Het), mTERC^-/--Mäuse der 1. Generation (KO-G1), mTERC^-/-- Mäuse der 3. Generation (KO-G3) und mTERC^-/--Mäuse der 4. Generation (KO-G4).

Als Empfängertiere wurden drei bis fünf Monate alte Weibchen mit dem Genotyp WT oder Het desselben Stammes verwendet.

Es handelt sich um ein sogenanntes „life-supporting“-Nierentransplantationsmodell.

Dieses zeichnet sich dadurch aus, dass beide Eigennieren des Empfängertieres entnommen werden, sodass das transplantierte Organ allein für die Aufrechterhaltung der Nierenfunktion und somit auch für das Überleben des Empfängertieres verantwortlich ist.

Da es sich um isogene Transplantationen handelt, besteht aufgrund der genetischen Identität von Spender und Empfänger keine Gefahr einer akuten Abstoßung.

Demzufolge ist auch keine Immunsupression notwendig.

Nach sechs Wochen wurde das Empfängertier getötet, die transplantierte Niere entnommen und das Gewebe einer histologischen, immunhistochemischen sowie molekularbiologischen Untersuchung zugeführt.

2.2.1.1 Vorbereitung des Spenders

Vor Beginn der Operation wurde der Spender gewogen und anschließend mit einer Isofluran-Sauerstoff-Narkose (4,6% Isofluran; Air 200 ml/min) anästhesiert. Das Anästhetikum wurde über einen direkt über der Schnauze angebrachten Spritzenkonus appliziert. Im Verlauf wurde der Isoflurangehalt zur Aufrechterhaltung der Narkose auf 2 % reduziert. Nachdem die Narkose eingetreten war, wurde das Tier in Rückenlage auf einer Heizplatte fixiert, um ein Absinken der Körpertemperatur während des Eingriffs zu verhindernd (siehe Abb. 6). Es folgte eine Desinfektion der Hautoberfläche mit 70 % Ethanol. Anschließend wurde das Abdomen des

eröffnet und Magen, Darm und Milz mit einem angefeuchteten Wattestäbchen auf die linke Seite geschoben. Anschließend wurden das Ligamentum triangulare sinistrum und das Ligamentum phrenico splenicum durchtrennt und die linke Niere, Aorta abdominalis und Vena cava inferior (V. cava inf.) sowie der linke Ureter freigelegt. Es folgte das Freipräparieren der Niere einschließlich des Gefäßstiels sowie der Aorta abdominalis und der V. cava inf. mithilfe einer Mikropinzette. Alle größeren Gefäßabgänge wurden mit dem Elektrokauter koaguliert und durchtrennt. Zunächst erfolgte das Absetzen des Ureters. Anschließend wurde die Aorta durch eine Mikroklemme oberhalb der rechten Nierenarterie abgeklemmt. Mit einer weiteren Mikroklemme wurden 3 mm unterhalb der Nierengefäße Aorta und V. cava inf.

gemeinsam abgeklemmt und mit einem Faden umschlungen. Die V. cava inf. wurde cranial des Abgangs der Nierenvene abgesetzt. Anschließend wurde die Aorta von kaudal zwischen Mikroklemme und Faden punktiert und die Niere mit mindestens 200 µl 0,9 % Natriumchloridlösung perfundiert. Anschließend wurden Aorta und V. cava inf. mit der vorbereiteten Ligatur abgebunden und unterhalb des Fadens abgesetzt. Das Organ wurde bis zur Transplantation in ein Behältnis mit 4°C kalter physiologischer Kochsalzlösung gegeben und bei 4°C gelagert. Die Dauer der kalten Ischämie betrug 30 min. Abschließend wurde auch die kontralaterale Niere entnommen und wie unter 2.2.4. beschrieben für die weitere Untersuchung aufgearbeitet. Das Spendertier wurde im narkotisierten Zustand durch cervikale Dislokation getötet.

Abbildung 6: Lagerung des Spendertiers

Die Abbildung zeigt eine auf der Heizplatte fixierte Maus. Der über der Schnauze angebrachte

Spritzenkonus dient zur Applikation des Anästhetikums (Mit herzlichem Dank an C. Schildhorn für das Überlassen des Bildes).

2.2.1.2 Vorbereitung des Empfängers

Die Empfänger wurden gewogen, wie unter 2.2.1.1 beschrieben anästhesiert und auf der Heizplatte fixiert. Nach der Desinfektion wurde die Bauchdecke durch eine mediane Längslaparotomie eröffnet und an beiden Seiten Haken zur besseren Darstellung des OP-Feldes angebracht. Der Darm wurde mit einem feuchten Wattestäbchen in die rechte Bauchhöhle geschoben und mit feuchten Kompressen abgedeckt.

Zunächst wurde die linke Eigenniere freipräpariert, der Gefäßstiel ligiert und durchtrennt und die Niere entnommen. Anschließend wurden Aorta abdominalis und V. cava inf. freipräpariert und der Blutfluss mittels Gefäßklemmen kranial und kaudal des Abgangs der Nierengefäße unterbrochen.

Zur Vorbereitung der Gefäßanastomosen wurde die Aorta mit einem 10/0 Faden perforiert, etwas nach oben gezogen und mit einer gebogenen Mikroschere 1mm lang eingeschnitten. Die V. cava inf. wurde mit der Mikropinzette etwas hochgezogen und mit der Mikroschere 2 mm inzidiert. Anschließend wurden beide Gefäße mit Kochsalzlösung gespült.

2.2.1.3 Organtransplantation

Die Spenderniere wurde zunächst rechts der Aorta platziert und die Aorta der Spenderniere mit einem 10/0 Faden am oberen und unteren Rand der Öffnung an der Aorta des Empfängers fixiert. Anschließend wurde auf der linken Seite von oben nach unten fortlaufend vernäht. Daraufhin legte man die Niere auf die linke Seite der Aorta und anastomosierte die rechte Seite mit einer fortlaufenden Naht. Die Nahtenden wurden kurz abgeschnitten und nicht verknotet. Bei der venösen Anastomose wurde gleichermaßen verfahren und die V. cava inf. des Spenders End- zu-Seit an die des Empfängers anastomosiert (siehe Abb. 7). Vor Freigabe der Blutzirkulation wurde zur Blutstillung 15-30 Sekunden (sec) mit einem Wattestäbchen auf die Anastomosen gedrückt. Anschließend wurden die Mikroklemmen entfernt.

Für die Anastomosierung des Ureters wurde zunächst die Harnblase aufgesucht und nach oben gezogen. Anschließend wurde die Blase mit einer 23 G Kanüle von rechts unten nach links oben durchstochen und der Ureter in das obere Ende der Kanüle eingefädelt. Die Kanüle wurde vollständig zurückgezogen und der Ureter an der Austrittsstelle mit einer Mikroklemme geklippt, um ein Zurückgleiten in die Blase zu verhindern. Schließlich wurde der Ureter an der Eintrittsstelle in die Blase mit einem 10/0 Faden anastomosiert. Das Ureterende wurde an seiner Austrittstelle kurz abgeschnitten und konnte sich in die Blase zurückziehen. Die Perforation in der Blasenwand wurde verschlossen. Abschließend wurde die Bauchdecke mit einem 4/0 Faden verschlossen.

Postoperativ erhielten die Empfängertiere eine Antibiotikaprophylaxe mit Cephazolin (100 mg/kg KG intramuskulär) und wurden bis zum Erwachen aus der Narkose beobachtet. Zur postoperativen Analgesie wurde das Trinkwasser der Tiere für drei Tage mit Metamizol (0,8 mg/ml) versetzt.

erfolgte durch retroorbitale Punktion und es wurden maximal sieben Tropfen pro Woche entnommen. Das Vollblut wurde nach 5 min bei Raumtemperatur für 10 min bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, das Serum abpipettiert und bei -19°C eingefroren. Das gefrorene Serum wurde auf Trockeneis in das Labor von Prof. Dr. Norbert Gretz, Zentrum für Medizinische Forschung, Fakultät für Klinische Medizin Mannheim der Universität Heidelberg versendet. Dort wurde die Bestimmung von Serumkreatinin und Harnstoff vorgenommen.

2.2.2.1 Serumkreatinin

Die Bestimmung des Serumkreatinins erfolgte mit Hilfe des Creatinin Plus-Tests der Firma Roche Diagnostics. Grundlage dieser enzymatischen Methode ist die Bestimmung von Sacrosin nach Umwandlung von Kreatinin durch die katalytische Wirkung von Kreatininase, Kreatinase und Sacrosinoxidase zu Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid. Durch weitere Reaktion des Wasserstoffperoxids mit 4-Aminophenazon und HTIB (2,4,6-Trijod-3-hydroxybenzoesäure), katalysiert durch das Enzym Peroxidase, entsteht ein Chinoniminfarbstoff, dessen Farbintensität direkt proportional der Kreatininkonzentration ist und fotometrisch gemessen werden kann.

2.2.2.2 Harnstoff

Zur Harnstoffbestimmung wurde der UREA/BUN-Test von der Firma Roche Diagnostics verwendet. Dabei handelt es sich ebenfalls um einen enzymatischen UV-Test, bei dem zunächst Harnstoff durch Urease zu Kohlenstoffdioxid und Ammoniak hydrolysiert wird. Das Ammoniak reagiert anschließend mit α-Ketoglutarat und NADH, katalysiert durch die GLDH (Glutamatdehydrogenase), zu Glutamat und NAD⁺. Der Verbrauch von NADH führt zu einer Extinktionsabnahme, die mit dem Fotometer erfasst werden kann.

2.2.3 Organentnahme

Zur Entnahme des Transplantats sechs Wochen postoperativ wurden die Tiere zunächst erneut wie unter 2.2.1.1 beschrieben einer Narkose mit Isofluran unterzogen und fixiert. Anschließend wurden durch retroorbitale Punktion 10 bis 20 Tropfen Vollblut entnommen. Die Bauchwand wurde V-förmig eingeschnitten und lateral auf beiden Seiten bis oberhalb des Zwerchfells eröffnet, das Zwerchfell durchtrennt und die Thoraxwand nach kranial verlagert. Daraufhin wurde der linke Ventrikel mit einer 24G Kanüle punktiert und mit 10 ml eiskalter 0,9 %iger Kochsalzlösung perfundiert sowie nach 2 min die Leber mehrfach verletzt um einen ausreichenden venösen Abfluss zu ermöglichen. Nach der Perfusion wurde der Darm mittels eines angefeuchteten Wattestäbchens auf die linke Seite geschoben, um einen optimalen Blick auf die retroperitonealen Organe zu ermöglichen.

Anschließend folgten die makroskopische Beurteilung der transplantierten Niere sowie deren Entnahme und die Entnahme von Herz, Leber und Milz. Die Organe wurden gewogen und Leber, Herz und Milz jeweils in zwei Teile geteilt, von denen je ein Stück auf Alufolie in flüssigen Stickstoff gegeben und eines in Formalin fixiert wurde. Die Niere teilte man nach der Entkapselung in vier Teile und legte die Pole zur Gewinnung von DNA und RNA umgehend auf Alufolie in flüssigen Stickstoff ein.

Des Weiteren wurde je eine Gewebescheibe jeder Niere in flüssigem Stickstoff und eine in Formalin fixiert.

2.2.4 Organaufarbeitung

Für die feingewebliche Untersuchung des Nierenparenchyms wurden Paraffinschnitte angefertigt. Dies umfasst die Fixierung, das Schneiden, Einbetten und Färben des Gewebes.

2.2.4.1 Fixierung

Die Fixierung dient dazu, der unmittelbar nach der Entnahme einsetzenden Autolyse entgegenzuwirken und ermöglicht die Erhaltung der Gewebe- und Zellmorphologie.

Zunächst wurde das Gewebe bei Raumtemperatur für 24 Stunden in einer PBS-

Vernetzung der Proteine durch Bildung von Hydroxymethylenbrücken untereinander bewirkt. Die Aufbewahrung bis zur Einbettung erfolgte in 70 %igem Ethanol, das wöchentlich ausgetauscht wurde. Anschließend wurde das Gewebe einer aufsteigenden Alkoholreihe zugeführt, zunächst 96 %igem Ethanol, dann 99 %igem Ethanol und schließlich Xylol.

2.2.4.2 Einbettung

Die Einbettung dient dazu dem Gewebe die notwendige Konsistenz zu verleihen, um es in wenige µm dünne Scheiben zu schneiden. In der Lichtmikroskopie wird üblicherweise Paraffin verwendet.

Die für die Einbettung vorgesehenen Metallschälchen wurden auf 55°C vorgewärmt und auf die 60°C warme Heizplatte des Einbettungsgerätes gestellt. Anschließend wurde eine kleine Menge Paraffin in die Schälchen gegeben, die den Boden bedeckte. Diese ließ man kurz erkalten, platzierte die Organe darin und füllte die Schälchen vollständig. Schließlich wurde der Block auf Eis gekühlt, aus dem Schälchen gelöst und anschließend bei 4°C gelagert.

2.2.4.3 Erstellen von Paraffinschnitten

Zum Schneiden diente ein Mikrotom, ein Gerät, das die Erstellung von Schnitten definierbarer Dicke ermöglicht. Es wurden 3 µm dicke Schnitte erstellt und mit einem Pinsel in ein Warmwasserbad überführt. Diese Maßnahme dient dazu, die Bildung von Falten im Gewebe zu verhindern.

Anschließend wurden die Schnitte auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger gezogen. Auf jedem Objektträger wurden mindestens zwei Schnitte platziert um bei den immunhistochemischen Färbungen eine Negativkontrolle erstellen zu können.

Schließlich wurden die Objektträger im Trockenschrank für mindestens 24 Stunden bei 37°C getrocknet.

2.2.5 Histologische Färbungen

Um einen Gewebeschnitt lichtmikroskopisch zu untersuchen, ist eine Färbung sinnvoll, da das Gewebe selbst nur einen geringen Eigenkontrast hat. Dabei macht man sich die physikochemischen Eigenschaften von Gewebe und Farbstoff zunutze.

Saure Farbstoffe binden an azidophile Zellbestandteile, beispielsweise Zytoplasma, basische Farbstoffe an basophile Strukturen wie z.B. Nukleinsäuren.

Damit die in der Regel wasserlöslichen Farbstoffe binden können, muss das Gewebe zunächst deparaffiniert werden. Dafür gab man die Schnitte in ein Xylolbad.

Anschließend wurden die Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe (100 %, 96 %, 70 %) rehydriert. Die so aufgearbeiteten Präparate wurden gefärbt. Nach dem Färben wurde die überschüssige Farbe gründlich mit Aqua dest. ausgewaschen und die Schnitte zur erneuten Dehydrierung einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 96

%, 100 %) und abschließend einem Xylolbad zugeführt. Schließlich wurden die Präparate mittels eines Deckglases und eines durchsichtigen Eindeckmediums (Eukit) eingedeckelt. Dieses Vorgehen gilt für alle im Folgenden beschriebenen Färbungen.

2.2.5.1 Periodic Acid Schiff (PAS)-Färbung

Die PAS-Färbung ist gut geeignet um kohlenhydrathaltige Strukturen anzufärben, wie zum Beispiel Glykogen, Glykoproteine und Muzine. Diese befinden sich insbesondere in Zellwänden, Basalmembran und Kollagenfasern. Die PAS-Reaktion beruht darauf, dass Perjodsäure oxidierend auf die freien Hydroxylgruppen der Saccharide wirkt. Die dabei entstehenden Aldehydgruppen können anschließend mit dem Schiff’s-Reagens (farblose fuchsinschweflige Säure) sichtbar gemacht werden, das dabei einen purpurroten Farbton annimmt.

Das Färben erfolgte nach dem unter 2.2.5 beschriebenen Entparaffinieren und Rehydrieren. Zunächst erfolgte eine fünfminütige Inkubation in 1 %iger Perjodsäure.

Nach sorgfältiger Spülung mit Aqua dest. wurden die Präparate für 25 min bei Raumtemperatur in ein Schiff’s-Reagens-Bad gegeben. Nach erneuter Spülung mit Leitungswasser und Aqua dest. wurden die Schnitte 40 min mit Hämatoxylin gegengefärbt, anschließend 10 min mit Leitungswasser gewässert, dehydriert und

2.2.5.1.1 Auswertung

In der vorliegenden Arbeit wurde die PAS-Färbung zur Beurteilung der Glomerulosklerose genutzt. Zur Orientierung im Präparat wurden die Gewebeschnitte zunächst unter 100facher Vergrößerung betrachtet. Anschließend wurden unter 400 facher Vergrößerung jeweils 40 Glomerula pro Schnitt beurteilt. Es wurde so vorgegangen, dass eine Überschneidung der Bildbereiche und damit doppelte Wertung einzelner Glomerula ausgeschlossen wurde. Die Auswertung der Bilder erfolgte verblindet, also ohne vorherige Kenntnis des Genotyps.

Der Glomerulosklerosescore wurde 1984 erstmals von Raij et al. beschrieben (98) und seitdem in vielen Arbeiten verwendet (99, 100). Definiert wird Glomerulosklerose darin als Verlust von Zellbestandteilen im glomerulären Schlingenkonvolut, Kollaps der Kapillarlumina und Faltung der Basasalmembran. Ebenfalls wurde die Expansion der mesangialen Matrix beurteilt, gemessen an PAS-positivem Material in den mesangialen Bereichen. In jedem Schnitt wurden mindestens 40 Glomerula nach einer Skala von 0 bis 4 beurteilt, wobei der Schweregrad der glomerulären Schädigung an der prozentual betroffenen Fläche pro Glomerulum gemessen wurde.

Die Einteilung des Score ist in Tabelle 1 beschrieben. Ausgewertet wurden sowohl die transplantierte (Tx-Niere) als auch die nicht transplantierte kontralaterale Niere (N-Niere) der Tiere mit den Genotypen WT, Het, KO-G1, KO-G3 und KO-G4.

Grad 0 normales Glomerulum

Grad 1

mesangiale Expansion oder Sklerose von bis zu 25 % der Fläche der Kapillarschlingen

Grad 2 Sklerose von 25-50 % der Fläche der Kapillarschlingen

Grad 3

Sklerose von 50-75 % der Fläche der Kapillarschlingen und/oder eine segmentale extrakapilläre Fibrose oder Proliferation

Grad 4

Glomerulum mit globaler Sklerose (>75 %) oder globaler extrakapillärer Fibrose und Proliferation oder vollständigem Kollaps des glomerulären Kapillargeflechts

Tabelle 1: Glomerulosklerosescore

In der Tabelle ist der Glomerulosklerosescore von Grad 0 bis 4 erläutert, wobei sich die Einteilung nach dem Anteil der geschädigten glomerulären Fläche richtet.

2.2.5.2 Masson-Trichrom (MT)-Färbung

Diese Färbung dient insbesondere der Darstellung von Kollagenfasern mit dem Farbstoff Anilinblau. Das außerdem enthaltene Eisenhämatoxylin färbt Zellkerne schwarz und Säurefuchsin hebt Zytoplasmabestandteile rot hervor.

Zunächst wurden die Präparate wie oben beschrieben entparaffiniert, rehydriert und gespült. Daraufhin gab man die Schnitte zur Intensivierung der Farbreaktion eine Stunde bei 60°C in ein Bad mit Bouin-Lösung und spülte diese anschließend mit Leitungswasser und Aqua dest. wieder ab. Anschließend färbte man die Zellkerne 2 min mit Hämatoxylin, spülte erneut und färbte das Zytoplasma 5 sec mit Säurefuchsin. Damit sich ausschließlich das Zytoplasma rot färbt, wurde daraufhin