Die Bedeutung von p16 INK4a im Rahmen von STASIS

Die für das Protein p16^INK4a kodierende Region besteht aus zwei Exonen und ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 9 lokalisiert. Das Genprodukt p16^INK4a ist ein Prototyp der Cyklin-abhängigen Kinasen (CDK). Es inhibiert CDK 4 und 6 indem es mit Zyklin D um die CDK-Bindungsstelle konkurriert (85). Die Aufgabe der CDK 4 und 6 ist die Phosphorylierung des Rb-Proteins (86), das den Eintritt der Zelle von der postmitotischen Gap-Phase (G1-Phase) in die Synthese-Phase des Zellzyklus und damit die Replikation der DNA ermöglicht. Kommt es aber durch extrinsischen Stress zur Induktion von p16^INK4a, wird die Phosphorylierung des Rb-Proteins verhindert und die Zelle verbleibt in der G1-Phase (siehe Abb. 4).

P16^INK4a spielt sowohl bei der Zellalterung, als auch in der Tumorentstehung eine wesentliche Rolle (87). Melk et al. konnten die starke Korrelation von p16^INK4a -Expression mit Alterungsprozessen in menschlichen Nieren (85) und Nieren von Ratten (88) zeigen. P16^INK4a gehört zu den Tumorsuppressorgenen und der INK4-Genabschnitt ist in nahezu 50 % der humanen Krebszelllinien inaktiviert (56).

Shapiro et al. demonstrierten 1995, dass eine Wiedereingliederung des p16^INK4a -Gens in p16^INK4a-negativen NSCLC-Zellen durch retrovirale Infektion zu einer Verlangsamung des Tumorwachstums in vitro führt (57).

als mTERC (mouse telomerase rna component) bezeichnet wird, gelang die Züchtung von Mäusen, denen jegliche Telomeraseaktivität fehlte. Durch Kreuzen sukzessiver Generationen erhielt man mTERC^-/--Mäuse bis zur sechsten Generation, wobei es in jeder nachfolgenden Generation zu einer Telomerverkürzung um 4,8 +/- 2,4 kb kam. Da Mäuse verglichen mit Menschen über deutlich längere Telomere verfügen (40-150 kb vs. 5-20 kb) (12), zeigten sich in der ersten Generation (KO-G1) noch keine Folgen der aus dem Telomerase-Verlust resultierenden Telomerverkürzung (90). Die mTERC^-/--Mäuse späterer Generationen hingegen zeigten einen auffälligen Phänotyp und eine Reihe von Defekten, die mit der progredienten Telomerverkürzung in Verbindung gebracht werden können. In welcher Generation diese Veränderungen in Erscheinung treten, ist hingegen abhängig von dem genetischen Hintergrund und der Telomerlänge des untersuchten Inzuchtstammes (91). Bei den Tieren höherer Generationen mit kritisch kurzen Telomeren findet sich eine erhöhte embryonale Mortalität durch inkompletten Neuralrohrverschluss (92) sowie zunehmende Infertilität (91). Bei heranwachsenden und erwachsenen Tieren zeigen sich Alterserscheinungen, wie das vorzeitige Ergrauen des Fells, Alopezie und ulzerierenden Hautveränderungen (siehe Abb. 5), wobei eine inverse Korrelation der Telomerlänge mit den genannten Merkmalen besteht (93). Des Weiteren zeigen Tiere der späteren Generationen eine reduzierte Lebensspanne und eine geringere Größen- und Gewichtszunahme. Darüber hinaus finden sich zahlreiche Veränderungen in Geweben mit hohen Zellumsatzraten, was zu Milzatrophie, intestinaler Atrophie, verzögerter Wundheilung und einer Schwächung des Immunsystems durch geringere Proliferation von B- und T-Zellen führt (91, 93). Des Weiteren findet sich eine reduzierte Regenerationsfähigkeit der Leber nach akuter oder chronischer Schädigung (94, 95). Aktuelle Daten von Westhoff et al. zeigten eine ebenfalls eingeschränkte Regenerationsfähigkeit der Niere nach Ischämie-Reperfusionsschaden (96). Weitere Untersuchungen zeigten ein gehäuftes Auftreten maligner Tumoren bei den mTERC^-/--Mäusen. Es wird vermutet, dass ein Zusammenhang mit der ebenfalls zunehmenden chromosomalen Instabilität in Zellen mit kritisch kurzen Telomeren besteht (47). Die Auflösung der Telomerstruktur führt zu einer Zunahme chromosomaler End-zu-End-Fusionen, die wiederum mit spontaner Tumorentstehung in hochproliferierenden Organen

einen Schutz vor Tumoren bieten. So zeigen Telomerase-defiziente Mäuse beispielsweise eine geringere Anfälligkeit gegenüber epithelialen Hauttumoren (97).

In Vorarbeiten zu diesem Projekt verglichen wir den renalen Phänotyp von jungen (3-6 Monate) und alten (14-18 Monate) mTERC^+/+-Mäuse und mTERC^-/--Mäuse der Generationen KO-G1, KO-G4 und KO-G5 miteinander, welche keinem extrinsischen Stress ausgesetzt waren.

Im Vergleich mit Wildtyp-Tieren zeigen mTERC^-/--Mäuse späterer Generationen ein geringeres Körper- und Nierengewicht, verglichen mit Wildtypen und KO-G1-Tieren.

Bei den älteren Tieren kommt ein Gewichtsverlust mit fortschreitendem Alter hinzu.

Die Nierenfunktion zeigt sich mit höherem Alter und höherer Generation tendenziell abnehmend. Histologisch zeigen junge mTERC^-/--Mäuse späterer Generationen ähnliche Veränderungen wie alte Wildtyp-Tiere, insbesondere eine Zunahme der interstitiellen Fibrose und Tubulusatrophie. Die größte Menge auffälliger Glomeruli bei jungen Tieren zeigen mTERC^-/--Mäuse der Generation KO-G5. Mit zunehmendem Alter kommt es zu einer Zunahme auffälliger Glomeruli in allen Gruppen. Der größte Anstieg der p21^WAF/CIP1-Expression als Marker für den Telomer-abhängigen Seneszenzweg findet sich bei den jungen KO-G4-Tieren. Verglichen mit Wildtypen und KO-G1-Tieren zeigt sich in den jungen Tieren weiterhin eine Induktion von p16^INK4a in den KO-G4-Tieren mit einem Maximum bei den KO-G5-Tieren.

Während es bei Wildtypen und KO-G1-Tieren im Alter zu einem Anstieg von p16^INK4a als Marker des Telomer-unabhängigen Seneszenzweges kommt, zeigen KO-G4-Tiere diesen Anstieg nicht. In der Gruppe der alten KO-G4-Tiere kann bei den KO-G4-KO-G4-Tieren ebenfalls die stärkste Expression von p21^WAF/CIP1 beobachtet werde, eine weitere Induktion von p16^INK4a ist in dieser Gruppe ebenfalls nicht zu beobachten.

Einige der beobachteten Veränderungen, wie beispielsweise der Anstieg von Tubulusatrophie und interstitieller Fibrose, stehen in Einklang mit der milden Pathologie in nicht erkrankten alternden humanen Nieren. Die aktuellen Daten legen nahe, dass späte Generationen von mTERC^-/--Mäusen mit alternden humanen Nieren vergleichbar sind und ein gutes Modell zur weiteren Untersuchung der renaler Alterungsmechanismen darstellen (unveröffentlichte Daten).

1.9 Nierentransplantation bei mTERC

^-/-

-Mäusen

In weiteren Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass bei Nieren von Tieren mit kritisch kurzen Telomeren nach renaler Ischämie-Reperfusion eine höhere Anfälligkeit für akuten Zellschaden besteht und eine geringere Regenerationsfähigkeit nachweisbar ist. Eine Steigerung der Proliferationsrate, die bei Wildtyp-Tieren als Reaktion auf diese Belastung zu erwarten wäre, fällt bei den mTERC^-/--Mäusen höherer Generationen wesentlich geringer aus (96). Dies und eine höhere Expression von Seneszenzmarkern, insbesondere p16^INK4a und p21^WAF/CIP1, sprechen für eine reduzierte Fähigkeit des Organs auf extrinsischen Stress zu reagieren (96), (unveröffentlichte Daten).

Um die Ursachen der schlechteren Transplantatfunktion älterer Organspender weiter zu untersuchen und die Bedeutung der oben genannten Erkenntnisse im Rahmen einer Nierentransplantation zu beurteilen, wurde ein Transplantationsmodell an mTERC^-/--Mäusen entwickelt. Dafür wurden isogene Nierentransplantationen an mTERC^-/--Mäusen verschiedener Generationen vorgenommen und das Gewebe a) b)

Abbildung 5: mTERC^-/--Mäuse verschiedener Generationen

Die Abbildung zeigt mTERC^-/--Mäuse verschiedener Generationen. In Abb. 5a) sind eine mTERC^-/- -Maus der ersten Generation (KO-G1) sowie eine mTERC^-/--Maus der vierten Generation (KO-G4) einander gegenüber gestellt. Während bei dem KO-G1-Tier noch keine wesentliche Telomerverkürzung stattgefunden hat, verfügt das KO-G4-Tier lediglich über stark verkürzte Telomere. Dies äußert sich phänotypisch in einer geringeren Körpergröße, einem geringeren Gewicht und dem vorzeitigen Ergrauen des Fells, wie in Abb. 5b) deutlich wird (Mit herzlichem Dank an C.

Schildhorn für das Überlassen der Bilder).

KO-G1

KO-G4

KO-G4

nach Entnahme sechs Wochen nach Transplantation histologisch, immunhistochemisch und molekularbiologisch untersucht.

1.10 Zielsetzung der Arbeit

Die wachsende Lebenserwartung in Industrienationen und der zunehmende Bedarf an transplantierbaren Organen führen zu einem gesteigerten Interesse an der Physiologie und Pathophysiologie alternder Nieren. Zur Untersuchung von Transplantaten mit eingeschränkter Regenerationsfähigkeit sowie zur Entwicklung therapeutischer Interventionen ist ein Tiermodell notwendig. Das Ziel dieser Arbeit ist die Evaluation eines Transplantationsmodells sowie die Untersuchung des Einflusses kritisch kurzer Telomere auf die Funktion von Nierentransplantaten.

Die zu überprüfende Hypothese lautet, dass Nieren von mTERC^-/--Mäusen höherer Generationen mit kritisch kurzen Telomeren nach Transplantation aufgrund der höheren Anzahl seneszenter Zellen über eine eingeschränkte Regenerationsfähigkeit verfügen. Dies müsste sich bei den Tieren mit kritisch kurzen Telomeren durch eine schlechtere Nierenfunktion, eine geringere Proliferationsrate, eine erhöhte Apoptoserate sowie einer gesteigerten Expression von Seneszenzmarkern wie p16^INK4a und p21^WAF/CIP1 manifestieren, verglichen mit Wildtypen mit intakter Telomerasefunktion. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sollen weiterhin dem besseren Verständnis des zellulären Seneszenz-Mechanismus dienen, welchem eine entscheidende Bedeutung bei der Alterung wie auch der Entstehung alters-assoziierter Erkrankungen zukommt. Mit einem aussagekräftigen Transplantationsmodell können therapeutische Interventionen erprobt werden, wie zum Beispiel die Verwendung von gegen Seneszenzmarker gerichtete si-RNAs (small interfering RNA), die schließlich zur Verbesserung der Funktion von Transplantaten älterer Spender führen könnten.

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Versuchstiere

In den Versuchen wurde ein mTERC-Knockout-Stamm B6.Cg-Terc^tm1Rdp/J mit C57BL/6-Hintergrund von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) verwendet.

Durch Kreuzen heterozygoter Tiere (mTERC^+/-) erhielt man unter anderem mTERC^-/- -Mäuse der ersten Generation (KO-G1). Durch weiteres Kreuzen der KO-G1-Tiere und den daraus entstehenden Generationen erhielt man Knockout-Mäuse höherer Generation (KO-G3 und KO-G4). Um eine optimale Durchmischung des Genpools zu erreichen und einen „genetischen Drift“ mit Unterschied zwischen Wildtypen und KO -Tieren zu vermeiden, erfolgten außerdem regelmäßige Rückkreuzungen zwischen heterozygoten (Het) und Wildtyp (WT)-Tieren.

Vier Monate alte weibliche Tiere desselben Stammes, die vor dem Umzug der Arbeitsgruppe nach Hannover in Tierräumen des Zentrums für Medizinische Forschung in Mannheim unter denselben Bedingungen gezüchtet wurden, dienten als Kontrollgruppe für die Expression von p16^INK4a- und p21^WAF/CIP1-mRNA.

Zucht und Haltung der Versuchstiere erfolgte in zentralklimatisierten Tierräumen der PHENOS GmbH in Hannover. Die Mäuse wurden basierend auf einer Standarddiät mit Trinkwasser ad libitum und konstanten Licht-Dunkelheit-Phasen von jeweils zwölf Stunden gehalten und verpaart.

Das Aktenzeichen des Tierversuchsantrags lautet 433.9-42502-04-08/1513.

2.1.2 Chemikalien und Enzyme

Substanz Hersteller

Universal Blocking Reagenz BioGenex, Fremont (CA) Antibody diluting Buffer with Background

reducing components

Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

Ki-67 monoclonal Mouse anti-Rat IgG_2a Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

Mouse IgG2a BD Biosciences Clontech, Palo alto (CA)

EnVision+, liquid Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

3,3-Diaminobenzidin (DAB) liquid Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

Ethanol Merck, Darmstadt (D)

Methanol J.T. Baker, Griesheim (D)

Xylol Merck, Darmstadt (D)

Phosphate-buffered saline (PBS) Biochrom AG, Berlin (D) Wasserstoffperoxid J.T. Baker, Griesheim (D)

Eukit O. Kindler GmbH & Co., Freiburg (D)

Formalin 4 % Merck, Darmstadt (D)

Paraffin Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe (D)

Gill’s Hämatoxylin Nr. 3 Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Bouin’s Solution Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Scarlet Acid Fuchsin Solution Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Phosphotungstic Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Phosphomolybdic Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Aniline blue Solution Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Essigsäure J.T. Baker, Griesheim (D)

Perjodsäure Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Schiff’s Reagenz Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Proteinase K Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Equilibration Buffer Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB) TdT Enzyme “working strength” Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Reaction Buffer Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Stop/Wash Buffer Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Bovines Serumalbumin (BSA) 1 % Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB) Anti Digoxigenin Peroxidase Conjugate Chemicon Europe LTD, Hampshire (GB)

Methylenblau-Lösung Merck, Darmstadt (D)

Biotinylated Anti Rabbit igG Reagent Vectastain Vector Laboratories, Burlingame (CA)

AB Complex Reagent Vectastain Vector Laboratories, Burlingame (CA)

Ammoniak Merck, Darmstadt (D)

Ultra pure DNAse/RNAse-freies Wasser Invitrogen, Darmstadt (D) First Strand Buffer Invitrogen, Darmstadt (D) Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP) Invitrogen, Darmstadt (D) Dithiothreitol (DTT) 0,1 M Invitrogen, Darmstadt (D) Random hexamer primer Invitrogen, Darmstadt (D)

RNAsin plus RNAse-Inhibitor Promega Corporation, Madison (WI) Reverse Transkriptase (MMLV-RT) Invitrogen, Darmstadt (D)

Agarosepulver Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe (D)

Formaldehyd Merck, Darmstadt (D)

BlueJuice, Gel Loading Buffer Invitrogen, Darmstadt (D) Ethidiumbromid E1385 Sigma-Aldrich, Hamburg (D)

Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe (D) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA),

pH 8,0

Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe (D)

Ficoll 400 15 % GE Healthcare, München (D)

Primer MWG Biotech AG, Ebersberg (D)

Magnesiumchlorid Merck, Darmstadt (D)

TaqMan Universal PCR Mastermix Applied Biosystems, Darmstadt (D)

Trizol Reagenz Invitrogen, Darmstadt (D)

Chloroform Merck, Darmstadt (D)

Isopropyl Alkohol Merck, Darmstadt (D)

CREA plus Reagenz Roche Diagnostics GmbH, Wien (A)

UREA/BUN Reagenz Roche Diagnostics GmbH, Wien (A)

Isofluran Baxter Deutschland GmbH,

Unterschleißheim (D)

Ampuwa-Spüllösung Fresenius Kabi AG, Bad Homburg (D)

2.1.3 Pufferlösungen und Reagenzien aus eigener Herstellung

Hämalaun nach P. Mayer (Hämatoxylin):

1 g Hämatoxylin in 1000 ml dest. Wasser lösen 0,2 g Natriumjodat hinzufügen

50 g chemisch reines Kalialaun (Kaliumaluminiumsulfat-12-hydrat) dazugeben und erwärmen

Nach dem Erkalten 50 g Chloralhydrat und 1 g kristalline Citronensäuremonohydrat dazugeben und lösen, danach filtrieren.

RNA-Laufpuffer (10x):

20 mM MOPS (pH 7,0) 1 mM EDTA

5 mM Natriumacetat

TAE Buffer (10x) 0,4 M TRIS

0,01 M EDTA-Na²⁺-Salz 0,2 M Essigsäure

pH 8,5+/- 0,2

Agarosegel:

1,19 g Agarosepulver 7,5 ml (10x)RNA-Laufpuffer 13,5 ml Formaldehyd

75 ml Ampuwa-Spüllösung

0,01 M Citratpuffer pH 6,0 2,1 g Citronensäuremonohydrat 900 ml destilliertes Wasser

ca. 13 ml von 2 M NaOH, bis pH = 6,0

mit destilliertem Wasser bis auf 1000 ml auffüllen

Ammoniumwater:

2 ml Ammoniaklösung (32 %) 1l 95 % Aqua dest.

Alcoholacid:

4 ml Ammoniaklösung (32 %) 1l 95 % Ethanol

2.1.4 Oligonukleotide HPRT

forward primer 5´ TGACACTGGTAAAACAATGCAAACT 3´

reverse primer 5´ AACAAAGTCTGGCCTGTATCCAA 3´

Sonde 5´ TCCACCAGCAAGCTTGCAACCTTAACC 3´

p21^WAF/CIP1

forward primer 5´ CAGCCACAGGCACCATGTC 3´

reverse primer 5´ ACGGCGCAACTGCTCACT 3´

Sonde 5´ ATGTCCGACCTGTTCCGCACAGGA 3´

p16^INK4a

forward primer 5´ AACCTTGCCCATCATCATC 3´

reverse primer 5´ GGGCACTGCTGGAAGCC 3´

Sonde 5´ CCGAACTCTTTCGGTCGTA 3´

2.1.5 Geräte und Software

Gerät oder Software Hersteller

Mikroskop DM LB2 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Mikroskop DM 5500B Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Kamera DFC 320 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Kamera DFC 360FX Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Software Qwin, Version V3.0 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D) Software ImageJ 1.37c National Institutes of Health, Bethesda (MD)

Software LASAF Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

RTD-PCR Applied Biosystems, Darmstadt (D)

Dampfdrucktopf "Pascal" Dako Cytomation GmbH, Hamburg (D)

Kühlzentrifuge M. u. S. Laborgeräte GmbH, Wiesloch (D)

TissueLyser Qiagen, Hilden (D)

Waage Kern und Sohn GmbH,

Balingen-Frommern (D)

Thermomixer Eppendorf AG, Hamburg (D)

Mikrowelle Sharp, Osaka (J)

Photometer Eppendorf AG, Hamburg (D)

UV-Kamera Applied Biosystems, Darmstadt (D)

Elektrophoresekammer Biorad, Hercules (CA)

Ausgießstation EG 1150 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Mikrotom RM 2165 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Mikrotomklingen Feather, Osaka (J)

Wärmeplatte HI 1220 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Brutschrank Memmert GmbH & Co KG, Schwabach (D)

PCR-Cycler („MyCycler Personal Thermal Cycler“)

Biorad, Hercules (CA) Magnetrührgerät Polymax MR 3002 Heidolph Instruments,

Schwabach (D)

Taumler Polymax 1040 Heidolph Instruments, Schwabach (D)

Vortexgerät, Heidolph Reax top Heidolph Instruments, Schwabach (D)

pH-Meter, pH M62 Standard Firma Kurt Hillerkus, Krefeld (D)

Mini Vannas Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Vannas Tübingen Fine Science Tools, Heidelberg (D) Extra fine “Bonn” Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Dumont forceps Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Eye dressing forceps Fine Science Tools, Heidelberg (D) Sterilizing container Fine Science Tools, Heidelberg (D) Surgical scissors Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Silicon mat Fine Science Tools, Heidelberg (D)

Knüpfpinzette Aesculap, Tuttlingen (D) Mikro-Nadelhalter FD243R Aesculap, Tuttlingen (D) Mikro-Schere OC498R Aesculap, Tuttlingen (D)

Membranspatel Geuder AG, Heidelberg (D)

Skalpell B. Braun AG, Melsungen (D)

Nahtmaterial Ethicon, Norderstedt (D)

MERSILENE 4/0 EH7147H PROLENE 10/0 EH7595G

Mikro-Klemme FE690K Aesculap, Tuttlingen (D)

Stereomikroskop (M3) Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D) Narkosegerät Isofluran Table System Univentor, Zejtun (M)

Kanülen 20G 1/1/2 0,9 X 40mm Becton Dickinson GmbH, Franklin Lakes (NJ)

Einbettungsschälchen Eppendorf AG, Hamburg (D)

Filterspitzen Eppendorf AG, Hamburg (D)

Pipetten (2-1000 µl) Eppendorf AG, Hamburg (D)

Pipetten (5, 10 und 25 ml) Sarstedt, Nürnberg (D)

Probenröhrchen Eppendorf AG, Hamburg (D)

Küvetten Eppendorf AG, Hamburg (D)

Gewebeinfiltrationseinheit Leica Microsystems GmbH, Wetzlar (D)

Objektträger Superfrost Plus Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig (D) Deckgläser 0101232 Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig (D)

2.2 Methoden

2.2.1 Das Transplantationsmodell

Für das Transplantationsmodell dienten männliche vier bis sechs Monate alte Mäuse des Inzuchtstammes B6.Cg-Terc^tm1Rdp/J als Spendertiere: mTERC^+/+-Mäuse (WT), mTERC^+/- -Mäuse (Het), mTERC^-/--Mäuse der 1. Generation (KO-G1), mTERC^-/- -Mäuse der 3. Generation (KO-G3) und mTERC^-/--Mäuse der 4. Generation (KO-G4).

Als Empfängertiere wurden drei bis fünf Monate alte Weibchen mit dem Genotyp WT oder Het desselben Stammes verwendet.

Es handelt sich um ein sogenanntes „life-supporting“-Nierentransplantationsmodell.

Dieses zeichnet sich dadurch aus, dass beide Eigennieren des Empfängertieres entnommen werden, sodass das transplantierte Organ allein für die Aufrechterhaltung der Nierenfunktion und somit auch für das Überleben des Empfängertieres verantwortlich ist.

Da es sich um isogene Transplantationen handelt, besteht aufgrund der genetischen Identität von Spender und Empfänger keine Gefahr einer akuten Abstoßung.

Demzufolge ist auch keine Immunsupression notwendig.

Nach sechs Wochen wurde das Empfängertier getötet, die transplantierte Niere entnommen und das Gewebe einer histologischen, immunhistochemischen sowie molekularbiologischen Untersuchung zugeführt.

2.2.1.1 Vorbereitung des Spenders

Vor Beginn der Operation wurde der Spender gewogen und anschließend mit einer Isofluran-Sauerstoff-Narkose (4,6% Isofluran; Air 200 ml/min) anästhesiert. Das Anästhetikum wurde über einen direkt über der Schnauze angebrachten Spritzenkonus appliziert. Im Verlauf wurde der Isoflurangehalt zur Aufrechterhaltung der Narkose auf 2 % reduziert. Nachdem die Narkose eingetreten war, wurde das Tier in Rückenlage auf einer Heizplatte fixiert, um ein Absinken der Körpertemperatur während des Eingriffs zu verhindernd (siehe Abb. 6). Es folgte eine Desinfektion der Hautoberfläche mit 70 % Ethanol. Anschließend wurde das Abdomen des

eröffnet und Magen, Darm und Milz mit einem angefeuchteten Wattestäbchen auf die linke Seite geschoben. Anschließend wurden das Ligamentum triangulare sinistrum und das Ligamentum phrenico splenicum durchtrennt und die linke Niere, Aorta abdominalis und Vena cava inferior (V. cava inf.) sowie der linke Ureter freigelegt. Es folgte das Freipräparieren der Niere einschließlich des Gefäßstiels sowie der Aorta abdominalis und der V. cava inf. mithilfe einer Mikropinzette. Alle größeren Gefäßabgänge wurden mit dem Elektrokauter koaguliert und durchtrennt. Zunächst erfolgte das Absetzen des Ureters. Anschließend wurde die Aorta durch eine Mikroklemme oberhalb der rechten Nierenarterie abgeklemmt. Mit einer weiteren Mikroklemme wurden 3 mm unterhalb der Nierengefäße Aorta und V. cava inf.

gemeinsam abgeklemmt und mit einem Faden umschlungen. Die V. cava inf. wurde cranial des Abgangs der Nierenvene abgesetzt. Anschließend wurde die Aorta von kaudal zwischen Mikroklemme und Faden punktiert und die Niere mit mindestens 200 µl 0,9 % Natriumchloridlösung perfundiert. Anschließend wurden Aorta und V. cava inf. mit der vorbereiteten Ligatur abgebunden und unterhalb des Fadens abgesetzt. Das Organ wurde bis zur Transplantation in ein Behältnis mit 4°C kalter physiologischer Kochsalzlösung gegeben und bei 4°C gelagert. Die Dauer der kalten Ischämie betrug 30 min. Abschließend wurde auch die kontralaterale Niere entnommen und wie unter 2.2.4. beschrieben für die weitere Untersuchung aufgearbeitet. Das Spendertier wurde im narkotisierten Zustand durch cervikale Dislokation getötet.

Abbildung 6: Lagerung des Spendertiers

Die Abbildung zeigt eine auf der Heizplatte fixierte Maus. Der über der Schnauze angebrachte

Spritzenkonus dient zur Applikation des Anästhetikums (Mit herzlichem Dank an C. Schildhorn für das Überlassen des Bildes).

2.2.1.2 Vorbereitung des Empfängers

Die Empfänger wurden gewogen, wie unter 2.2.1.1 beschrieben anästhesiert und auf der Heizplatte fixiert. Nach der Desinfektion wurde die Bauchdecke durch eine mediane Längslaparotomie eröffnet und an beiden Seiten Haken zur besseren Darstellung des OP-Feldes angebracht. Der Darm wurde mit einem feuchten Wattestäbchen in die rechte Bauchhöhle geschoben und mit feuchten Kompressen abgedeckt.

Zunächst wurde die linke Eigenniere freipräpariert, der Gefäßstiel ligiert und durchtrennt und die Niere entnommen. Anschließend wurden Aorta abdominalis und V. cava inf. freipräpariert und der Blutfluss mittels Gefäßklemmen kranial und kaudal des Abgangs der Nierengefäße unterbrochen.

Zur Vorbereitung der Gefäßanastomosen wurde die Aorta mit einem 10/0 Faden perforiert, etwas nach oben gezogen und mit einer gebogenen Mikroschere 1mm lang eingeschnitten. Die V. cava inf. wurde mit der Mikropinzette etwas hochgezogen und mit der Mikroschere 2 mm inzidiert. Anschließend wurden beide Gefäße mit Kochsalzlösung gespült.

2.2.1.3 Organtransplantation

Die Spenderniere wurde zunächst rechts der Aorta platziert und die Aorta der Spenderniere mit einem 10/0 Faden am oberen und unteren Rand der Öffnung an der Aorta des Empfängers fixiert. Anschließend wurde auf der linken Seite von oben nach unten fortlaufend vernäht. Daraufhin legte man die Niere auf die linke Seite der Aorta und anastomosierte die rechte Seite mit einer fortlaufenden Naht. Die Nahtenden wurden kurz abgeschnitten und nicht verknotet. Bei der venösen Anastomose wurde gleichermaßen verfahren und die V. cava inf. des Spenders End-zu-Seit an die des Empfängers anastomosiert (siehe Abb. 7). Vor Freigabe der Blutzirkulation wurde zur Blutstillung 15-30 Sekunden (sec) mit einem Wattestäbchen auf die Anastomosen gedrückt. Anschließend wurden die Mikroklemmen entfernt.

Für die Anastomosierung des Ureters wurde zunächst die Harnblase aufgesucht und nach oben gezogen. Anschließend wurde die Blase mit einer 23 G Kanüle von rechts unten nach links oben durchstochen und der Ureter in das obere Ende der Kanüle eingefädelt. Die Kanüle wurde vollständig zurückgezogen und der Ureter an der Austrittsstelle mit einer Mikroklemme geklippt, um ein Zurückgleiten in die Blase zu verhindern. Schließlich wurde der Ureter an der Eintrittsstelle in die Blase mit einem 10/0 Faden anastomosiert. Das Ureterende wurde an seiner Austrittstelle kurz abgeschnitten und konnte sich in die Blase zurückziehen. Die Perforation in der Blasenwand wurde verschlossen. Abschließend wurde die Bauchdecke mit einem 4/0 Faden verschlossen.

Postoperativ erhielten die Empfängertiere eine Antibiotikaprophylaxe mit Cephazolin

Postoperativ erhielten die Empfängertiere eine Antibiotikaprophylaxe mit Cephazolin

Im Dokument Nierentransplantation bei Telomerase-Knockout-Mäusen (Seite 20-0)