Quantitative Real-time-Polymerase Chain Reaction (q-RT-PCR)

Die q-RT-PCR dient wie die herkömmliche qualitative PCR der Amplifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen. Zusätzlich ermöglicht dieses Verfahren die relative Quantifizierung der Expression des Zielgens durch Fluoreszenzmessungen während des PCR-Zyklus.

Um zu gewährleisten, dass ausschließlich der gesuchte Genabschnitt vervielfältigt wird, setzt man zusätzlich zu den Primern am 5’- und 3’-Ende eine fluoreszenzmarkierte, sequenzspezifische Sonde ein, die innerhalb der gesuchten Sequenz liegt. Diese sogenannte TaqMan-Sonde ist an einem Ende mit einem Reporter- und am anderen mit einem Quencher-Fluoreszenzfarbstoff markiert.

Solange sich Reporter und Quencher in unmittelbarer Nähe befinden, unterdrückt der Quencher die Lichtemission des Reporters. Zur Sichtbarmachung der Fluoreszenz gibt man anschließend eine Taq-Polymerase hinzu. Dabei handelt es sich um eine spezielle hitzestabile DNA-Polymerase, die neben der Fähigkeit zur Verlängerung von DNA-Strängen eine Exonukleaseaktivität besitzt. Diese ermöglicht ein Abspalten der Sonde während der Elongation, wodurch sich Reporter und Quencher voneinander entfernen und die Emission des Reporter-Farbstoffes ansteigt. Diese steigt proportional zur Menge des gesuchten DNA-Abschnitts und kann mittels eines Detektiergerätes gemessen werden. Als Referenz wird außerdem die Expression eines möglichst stabil exprimierten, sogenannten housekeeping-Gens bestimmt.

Probe vom CT-Wert des Referenzgens, im vorliegenden Fall HPRT, subtrahiert. Von dem ermittelten Wert wurde wiederum der Mittelwert der als Kontrolle dienenden Pool-dC_T-Werte subtrahiert, um Delta-Delta-C_T zu erhalten. Abschließend wurde das Ergebnis logarithmiert und der Mittelwert aus dem Doppelbestimmungen ermittelt.

Formel nach Pfaffl:

dC_T = C_T-_Zielgen - C_T-Referenzgen

ddCT = dCT -Probe - dCT- Pool

Ratio = 2 ^{- ddC}_T

Bestimmung CT HPRT

CT

p21^WAF/CIP1 (p16^INK4a)

dCT ddCT 2^-ddCT MW

1 22,92 25,08 2,16 -1,04 2,0562

2,1224

2 23,04 25,11 2,07 -1,13 2,1886

Tabelle 2: Berechnung der relativen Genexpression nach Pfaffl

Beispielhafte Berechnung der relativen Expression von p21^WAF/CIP1 (p16^INK4a) bei dCT-Pool = 3,2

2.2.8 Statistik

Die Datenanalyse erfolgte mit Hilfe des Programms PASW 19.0 predictive analysis software (IBM, New York, USA). Die Prüfung der Normalverteilung erfolgte mittels Kolmogorov-Smirnov-Test. Im Falle der Normalverteilung wurden die Mittelwerte zwischen den einzelnen Gruppen mittels ANOVA (analysis of variance) verglichen und für die anschließenden Einzelvergleiche der Post-hoc-T-Test mit Korrektur nach Bonferroni angewandt. Für den Vergleich von transplantierten und nicht

wenn Daten desselben Tiers vorhanden waren. Diente ein anderes Kollektiv als Kontrollgruppe, wurde auf einen T-Test für unabhängige Stichproben zurückgegriffen. Da die Daten zu γ-H2AX keine Normalverteilung aufwiesen, wurden diese mittels Kruskal-Wallis-Test bei Vorliegen von mehr als drei Gruppen und mittels Mann-Whitney-U-Test bei zwei Einzelvergleichen getestet. Alle Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.

2.2.9 Beteiligte Personen

An diesem umfangreichen Projekt war eine Vielzahl von Personen beteiligt. Die Transplantation erfolgte durch Herrn Dr. med. R. Song. Die Durchführung der histologischen und immunhistochemischen Färbungen der Gewebeschnitte sowie der molekularbiologischen Untersuchungen erfolgte durch Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter der AG Melk. Die Auswertung der Glomerulosklerose oblag Herrn Dr.

med. C. Jacobi. Die Verfasserin erhielt eine Einweisung in die oben genannten Methoden und führte die Auswertung der interstitiellen Fibrose, der immunhistochemischen Färbungen sowie die statistische Auswertung der Ergebnisse durch. Alle durch die Verfasserin erhobenen Daten wurden durch Herrn Dr. med. C. Jacobi gegengelesen und in unklaren Fällen mit Frau Prof. Dr. med. A.

Melk diskutiert. Die Begutachtung der Gewebeproben erfolgte in enger Kooperation mit Frau Dr. med. V. Bröcker aus dem Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover.

3 Ergebnisse

Für dieses Tiermodell erhielten insgesamt 37 Mäuse eine isogene Nierentransplantation. Als Spendertiere dienten 13 Tiere mit normaler Telomeraseaktivität und 24 Tiere ohne Telomerasefunktion. Die Anzahl der einzelnen Genotypen ist in Tabelle 3 aufgeführt.

In der Annahme, dass bezüglich der Telomerlänge zwischen Wildtypen und Heterozygoten kein für diese Untersuchungen relevanter Unterschied besteht, wurden diese zu einer Gruppe zusammengefasst. Diese Vorgehensweise wurde in der weiteren Auswertung beibehalten.

Genotyp Anzahl der Tiere

mTERC^+/+ 6

mTERC^+/- 7

mTERC^-/- (KO-G1) 11

mTERC^-/- (KO-G3) 8

mTERC^-/- (KO-G4) 5

Tabelle 3: Genotypen der Spendertiere

Die Tabelle zeigt die Verteilung der Genotypen der Spendertiere.

3.1 Überleben der Versuchstiere

Innerhalb der ersten Woche nach Transplantation starben vier Tiere, davon zwei Wildtypen, ein Tier der Generation KO-G1 sowie ein Tier der Generation KO-G3. Der Tod dieser Tiere ist auf perioperative Komplikationen, wie beispielsweise Blutungen bei Anastomoseinsuffizienz oder Infektionen zurückzuführen. Es ergibt sich eine perioperative Mortalität von 10,8 %. Zwei weitere Tiere der Generation KO-G1 starben in der fünften Woche im Rahmen einer Blutentnahme. Bei keinem der Tiere

3.3 Nierenfunktion nach Transplantation

Zur Beurteilung der Nierenfunktion erfolgten bis zur Tötung der Empfängertiere wöchentliche Bestimmungen von Serumkreatinin und Harnstoff. Es wurde für jede Gruppe und jeden Zeitpunkt ein Mittelwert erstellt.

3.3.1 Serumkreatinin

Es bestehen keine signifikanten Unterschiede in der Höhe des Serumkreatinins zwischen den Gruppen, auch lässt sich kein Anstieg des Serumkreatinins von Woche eins bis Woche sechs verzeichnen (siehe Abb. 10).

Abbildung 10: Serumkreatinin

Abgebildet ist die Höhe des mittleren Serumkreatinins in den verschiedenen Genotypen von Woche eins bis Woche sechs nach Transplantation. Es bestehen keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen.

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

1 2 3 4 5 6

Serumkreatinin [mg/dl]

postoperative Wochen

Serumkreatinin

WT + Het KO-G1 KO-G3 KO-G4

3.3.2 Harnstoff

Bei den Harnstoffwerten lässt sich keine klare Tendenz erkennen. Insgesamt bleiben die Werte nach einem dezenten Anstieg in Woche eins und zwei weitgehend konstant. In der vierten Woche ist der Harnstoff bei den KO-G3-Tiere signifikant höher (p = 0,05) verglichen mit Tieren der Generation KO-G1(siehe Abb. 11).

Abbildung 11: Harnstoff

Dargestellt ist die Höhe des mittleren Harnstoffs der einzelnen Gruppen von Woche eins bis Woche sechs nach Transplantation. Der signifikant höhere Harnstoff in den KO-G3-Tieren gegenüber den KO-G1-Tieren in Woche vier ist durch eine Klammer gekennzeichnet.

3.4 Histopathologische Veränderungen

3.4.1 Infiltrat

In einigen Nieren von Tieren aus allen Gruppen war in der PAS-Färbung ein mäßig

0

perivaskulär um größere arterielle Gefäße im medullären Anteil der Gewebeschnitte und erreichte eine maximale Ausdehnung von drei Glomerulabreiten. Bei den vorherrschenden Zellen handelte es sich um Lymphozyten.

3.4.2 Glomerulosklerose

Die nicht transplantierten (N)-Nieren der einzelnen Gruppen zeigten keine

Unterschiede bezüglich der Glomerulosklerose. Auch bei den transplantierten (Tx)-Nieren lässt sich zwar eine Tendenz zu mehr Glomerulosklerose in den höheren Generationen erkennen, es bestehen aber keine signifikanten Unterschiede.

Vergleicht man aber N-Niere und Tx-Niere einer Gruppe, findet man hoch

signifikante Unterschiede bei Wildtypen und Heterozygoten (p < 0,001) sowie bei den Nieren der KO-G1-Tiere (p < 0,001) vor und nach der Transplantation. Auch die Nieren der KO-G3-Tiere zeigen sechs Wochen nach der Transplantation signifikant mehr Glomerulosklerose (p = 0,002), ebenso bei den KO-G4-Tiere (p = 0,005) (siehe Abb. 12 - 13).

a) b)

Abbildung 12: Glomerulosklerose (PAS-Färbung)

Dargestellt sind PAS-gefärbte Schnitte von mTERC^-/--Mäusen der vierten Generation vor (a) und nach der Transplantation (b). Vor der Transplantation findet sich keine Glomerulosklerose, während bei Tieren derselben Generation nach Transplantation ein höherer Sklerosescore vorliegt. In Abb. 12b) ist ein Glomerulum mit Score 2 dargestellt (Sklerose von 25-50 % der Fläche des Glomerulums).

KO-G4 vor Tx KO-G4 nach Tx

Abbildung 13: Glomerulosklerose

Diese Abbildung zeigt den Glomerulosklerosescore für die einzelnen Gruppen. Dabei wird die Sklerose vor der Transplantation, dargestellt durch die weißen Diagrammbalken, der Sklerose nach der Transplantation, dargestellt durch die schwarzen Diagrammbalken, gegenübergestellt. Die signifikanten Unterschiede werden durch Klammern hervorgehoben.

3.4.3 Interstitielle Fibrose

Die N-Nieren zeigten eine Zunahme der interstitiellen Fibrose in den späteren Generationen, dies zeigt sich insbesondere am signifikant höheren Anteil Fibrose in den KO-G4-Tieren, verglichen mit Wildtypen und Heterozygoten (p = 0,02).

Die Tx-Nieren zeigen ebenfalls eine signifikante Zunahme der interstitiellen Fibrose in den KO-G4-Tieren, verglichen mit KO-G1- (p = 0,02) und KO-G3-Tieren (p = 0,005).

Im direkten Vergleich der N- und Tx-Nieren einer Gruppe fand man in den Tx-Nieren jeder Generation mehr Fibrose, dieser Unterschied wurde bei den KO-G1-Tieren signifikant (p = 0,05) (siehe Abb. 14 - 15).

0 0,5 1 1,5 2 2,5

WT + Het KO-G1 KO-G3 KO-G4

Score [1 bis 4]

Genotyp

Glomerulosklerose

N-Nieren Tx-Nieren p < 0,001

p < 0,001 p < 0,05

p = 0,05

a) b)

Abbildung 14: Interstitielle Fibrose (MT-Färbung)

Abgebildet sind MT-gefärbte Schnitte des renalen Kortex von mTERC^-/--Mäusen der Generationen KO-G1 (a) und KO-G4 (b) zur Beurteilung der interstitiellen Fibrose. Blau gefärbte fibrotische Areale in Abb. 14b) sind mit einem Pfeil markiert.

Abbildung 15: Interstitielle Fibrose

Dargestellt ist die interstitielle Fibrose in N- und Tx-Nieren der Spendertiere. Die N-Nieren sind als weiße Diagrammbalken aufgetragen, die Tx-Nieren als schwarze Diagrammbalken. Signifikante Unterschiede sind mit Klammern gekennzeichnet.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

WT + Het KO-G1 KO-G3 KO-G4

Fibrose [%]

Genotyp

Interstitielle Fibrose

N-Nieren

Tx-Nieren p = 0,005

p = 0,02

p = 0,02 p = 0,05

KO-G4

KO-G1

3.4.4 Apoptose

Es zeigten sich insgesamt sehr wenig TUNEL-positive Zellen in den ausgewerteten Tx-Nieren. Bei den glomerulären und vaskulären Zellen fanden sich nur vereinzelt apoptotische Zellen und die verschiedenen Gruppen unterschieden sich bezüglich der Apoptoserate auch in den interstitiellen Zellen nicht. Lediglich bei den Tubuluszellen konnte bei den KO-G4-Tieren eine Tendenz zu mehr Apoptose festgestellt werden, verglichen mit Wildtypen und Heterozygoten (siehe Abb. 16-17).

Auf die Auswertung der N-Nieren wurde verzichtet, da bei jungen Tieren ohne den Einfluss äußerer Stressfaktoren nahezu keine apoptotischen Zellen nachweisbar sind.

a) b)

Abbildung 16: Apoptose (TUNEL-Färbung)

Die obigen Abbildungen zeigen TUNEL-gefärbte Schnitte des renalen Kortex von Mäusen mit normaler Telomeraseaktivität (WT) sowie von mTERC^-/--Mäusen der Generationen KO-G4, der Pfeil in Abbildung 16 b) kennzeichnet eine TUNEL-positive Tubuluszelle.

WT KO-G4

a) b)

Abbildung 18: Proliferation (Ki-67Antikörper-Färbung)

Dargestellt sind Ki67-Antikörper-gefärbte Schnitte des renalen Kortex einer Maus mit normaler Telomeraseaktivität (WT) sowie einer mTERC^-/--Maus der vierten Generation (KO-G4). Während sich in der WT-Maus (a) zahlreiche Ki67-Antikörper-positive Zellen zeigen (Pfeil), findet man diese bei dem Tier mit verkürzten Telomeren nur vereinzelt (b).

Abbildung 19: Ki67-positive kortikale Zellen in Tx-Nieren

Diese Abbildung zeigt den Anteil Ki67-positiver Zellen im Kortex der transplantierten Nieren.

Glomeruläre, vaskuläre und tubuläre und interstitielle Zellen werden getrennt aufgeführt.

0 2 4 6 8 10 12

glomerulär vaskulär tubulär interstitiell

Ki67-positive Zellen [%]

Zelltyp

Ki67-positive kortikale Zellen in Tx-Nieren

WT + Het KO-G1 KO-G3 KO G4

KO-G4

WT

Im korticomedullären Übergang fanden sich keine Ki67-positiven vaskulären und nur wenige tubuläre Zellen. Unterschiede zwischen den Gruppen bestanden hier nicht.

Im Interstitium dagegen konnten reichlich proliferierende Zellen festgestellt werden, wobei die höchste Proliferationsrate bei den KO-G1-Tieren lag. Diese zeigten signifikant (p = 0,007) mehr Proliferation, verglichen mit den KO-G3-Tieren (siehe Abb. 20).

Auf die Auswertung der N-Nieren wurde verzichtet, da bei jungen Tieren, welche keinem Stress ausgesetzt waren, nahezu keine proliferierenden Zellen zu erwarten sind.

Abbildung 20: Ki67-positive kortikomedulläre Zellen in Tx-Nieren

Dargestellt ist der Anteil Ki67-positiver tubulärer und interstitieller Zellen im korticomedullären Übergang. Der signifikante (p = 0,007) Unterschied zwischen KO-G1- und KO-G3-Tieren ist durch

3.5 Expression von Seneszenzmarkern

3.5.1 Expression von p21

^WAF/CIP1

In den N-Nieren konnte eine signifikant höhere Expression der p21^WAF/CIP1-mRNA in den G4-Tiere verzeichnet werden, verglichen mit G1- (p = 0,031) und KO-G3-Tieren (p = 0,029).

Auch bei den Tx-Nieren konnte eine vermehrte p21^WAF/CIP1-mRNA-Expression in den KO-G4-Tieren beobachtet werden, Signifikanzniveau wurde jedoch nicht erreicht.

Im direkten Vergleich zeigte sich in allen Generationen signifikant höhere p21^WAF/CIP1 -mRNA-Expression in den Tx-Nieren. Dieser Unterschied war bei KO-G1- (p = 0,002) und KO-G3-Tieren (p = 0,008) signifikant (siehe Abb. 21).

Abbildung 21: Expression von p21^WAF/CIP1

Diese Abbildung zeigt die relative Expression von p21^WAF/CIP1 in den N-Nieren, dargestellt als weiße Diagrammbalken, und Tx-Nieren, dargestellt als schwarze Diagrammbalken. Signifikante Unterschiede sind durch Klammern hervorgehoben.

3.5.2 Expression von p16

^INK4a

Die N-Nieren der KO-G4-Tiere zeigen vermehrte Expression von p16^INK4a-mRNA gegenüber den übrigen Generationen, signifikante Unterschiede bestehen aber nicht.

Auch zwischen den Tx-Nieren der unterschiedlichen Gruppen bestehen keine signifikanten Unterschiede in der p16^INK4a-mRNA-Expression. Vergleicht man aber N- und Tx-Nieren einer Generation, findet sich in jeder Gruppe eine Hochregulation nach Transplantation. Dieser Unterschied ist bei Wildtypen und Heterozygoten sowie den KO-G1- und KO-G3-Tieren signifikant (siehe Abb. 22).

Abbildung 22: Expression der p16^INK4a

Dargestellt ist die relative Expression von p16^INK4a als Marker für den extrinsischen Weg zellulärer Seneszenz. N-Nieren sind als weiße Diagrammbalken abgebildet, Tx-Nieren als schwarze Diagrammbalken. Signifikante Unterschiede werden durch Klammern hervorgehoben.

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07

WT + Het KO-G1 KO-G3 KO-G4

rel. Expression von p16INK4a

Genotyp

Expression von p16

^INK4a

N-Nieren Tx-Nieren p = 0,031

p = 0,001

p = 0,004

3.6 Entstehung von DNA-Schäden und Reparaturfähigkeit

Sowohl im Kortex als auch im korticomedullären Übergang fanden sich nur vereinzelt γ-H2AX-positive glomeruläre und vaskuläre Nuklei, daher werden im Folgenden nur tubuläre und interstitielle Zellen eingehend beschrieben (siehe Abb. 23).

a) b)

Abbildung 23: DNA-Schaden (γ-H2AX-Antikörper-Färbung)

Abgebildet sind mit γ-H2AX-Antikörper behandelte Schnitte des renalen Kortex einer Maus mit normaler Telomerasefunktion (WT) sowie der einer mTERC^-/--Maus der vierten Generation (KO-G4).

Ein Pfeil markiert die γ-H2AX-positiven Nuklei in Abb. 23b).

3.6.1 γ -H2AX-positive Nuklei im Kortex

Die Tubuluszellen im Kortex der N-Nieren zeigten keine Unterschiede bezüglich der Anzahl γ-H2AX-positiver Zellen. In den Tx-Nieren der KO-G4-Tiere hingegen fand man eine signifikante Zunahme γ-H2AX-positiver tubulärer Zellen gegenüber Wildtypen und Heterozygoten (p = 0,002), KO-G1-Tieren (p = 0,018) und KO-G3-Tieren (p = 0,03). Nach Transplantation zeigte sich in allen Gruppen eine Vervielfachung des Anteils γ-H2AX-positiver Zellkerne, dieser Unterschied war bei Wildtypen und Heterozygoten (p = 0,006) sowie KO-G4-Tieren (p = 0,016) signifikant (siehe Abb. 24).

KO-G4

WT

Abbildung 24: γ-H2AX-positive Nuklei in Tubuluszellen im Kortex

Diese Abbildung zeigt den Anteil γ-H2AX-positiver Nuklei in den korticalen Tubuluszellen von N-Nieren, dargestellt als weiße Diagrammbalken, und Tx-Nieren, dargestellt als schwarze Diagrammbalken.

Signifikante Unterschiede sind durch Klammern hervorgehoben.

Bei den interstitiellen Zellen im Kortex der N-Nieren waren die meisten γ -H2AX-positiven Nuklei bei den Wildtypen und Heterozygoten zu finden, signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen bestanden aber nicht. Auch zwischen den Tx-Nieren verschiedener Generationen konnten keine signifikanten Unterschiede verzeichnet werden. N- und Tx-Nieren unterschieden sich ebenfalls nicht (siehe Abb. 25).

0 5 10 15 20 25

WT + Het KO-G1 KO-G3 KO-G4

Anteil γ-H2AX-positiver Nuklei [%]

Genotyp

γ -H2AX-positive Nuklei in Tubuluszellen im Kortex

N-Nieren Tx-Nieren p = 0,03

p = 0,018 p = 0,002

p = 0,006

p = 0,016

Abbildung 25: γ-H2AX-positive Nuklei in interstitiellen Zellen im Kortex

Dargestellt ist der Anteil γ-H2AX-positiver Nuklei in den interstitiellen Zellen der N- und Tx-Nieren der Spendertiere, dargestellt durch weiße (N-Nieren) und schwarze (Tx-Nieren) Diagrammbalken.

Signifikante Unterschiede bestehen hier nicht.

3.6.2 γ -H2AX-positive Nuklei im korticomedullären Übergang

Im korticomedullären Übergang bestanden keine signifikanten Unterschiede bei den Tubuluszellen der N-Nieren. In den Tx-Nieren zeigt sich ein wesentlich höherer Anteil γ-H2AX-positiver Nuklei bei den KO-G4-Tieren, der Unterschied erreicht jedoch keine statistische Signifikanz. Im direkten Vergleich von N- und Tx-Nieren konnten jedoch signifikante Unterschiede bei Wildtypen und Heterozygoten (p = 0,003) sowie bei den KO-G1- (p = 0,024) und KO-G4-Tieren (p = 0,032) festgestellt werden (siehe Abb. 26).

0 0,5 1 1,5 2 2,5

WT + Het KO-G1 KO-G3 KO-G4

Anteil γ-H2AX-positiver Nuklei [%]

Genotyp

γ-H2AX-positive Nuklei in interstitiellen Zellen im Kortex

N-Nieren Tx-Nieren

Abbildung 26: γ-H2AX-positive Nuklei in tubulären Zellen im kortikomedullären Übergang

Dargestellt ist die Anzahl γ-H2AX-positiver Nuklei in den korticomedullären Tubuluszellen der Spendertiere. N-Nieren werden durch weiße Diagrammbalken dargestellt, Tx-Nieren durch schwarze Diagrammbalken. Signifikante Unterschiede sind durch Klammern gekennzeichnet.

Der Anteil γ-H2AX-positiver Nuklei in den interstitiellen Zellen der N-Nieren war im korticomedullären Übergang nicht signifikant verschieden zwischen den Gruppen.

Der höchste Anteil war bei Wildtypen und Heterozygoten zu finden. In den Tx-Nieren zeigten sich ebenfalls viele γ-H2AX-positive Zellen bei den Wildtypen und Heterozygoten, in den KO-G1-Tieren hingegen nur vereinzelt. Der Unterschied erreichte das Signifikanzniveau (p = 0,001). Der größte Anteil γ-H2AX-positiver Nuklei war in den KO-G4-Tieren zu finden, hier zeigte sich ein signifikanter Unterschied gegenüber den KO-G1-Tieren (p = 0,003). Die γ-H2AX-positiven Zellen waren in jeder Gruppe in den Tx-Nieren häufiger, verglichen mit den N-Nieren. Ein signifikanter Unterschied zeigte sich bei den KO-G4-Tieren (p = 0,016) (siehe Abb.

27).

γ -H2AX-positive Nuclei in tubulären Zellen im korticomedullären Übergang

N-Nieren Tx-Nieren p = 0,003 p = 0,024

p = 0,032

Abbildung 27: γ-H2AX-positive Nuklei in interstitiellen Zellen im kortiko-medullären Übergang

Diese Abbildung zeigt den Anteil γ-H2AX-positiver interstitieller Zellen von N- und Tx-Nieren im korticomedullären Übergang. N-Nieren sind als weiße Diagrammbalken abgebildet, Tx-Nieren als schwarze Diagrammbalken. Ein signifikanter Unterschied ist durch die Klammer gekennzeichnet.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

WT + Het KO-G1 KO-G3 KO-G4

Anteilγ-H2AX-positiver Nuclei [%]

Genotyp

γ -H2AX-positive Nuclei in interstitiellen Zellen im korticomedullären Übergang

N-Nieren Tx-Nieren p = 0,003

p = 0.001

p = 0,016

4 Diskussion

4.1 Einordnung der Ergebnisse

4.1.1 Transplantatüberleben

Das life-supporting Transplantationsmodell eignet sich besonders gut für die Beurteilung des Transplantatüberlebens, da allein das transplantierte Organ für die Aufrechterhaltung der Nierenfunktion und damit für das Überleben des Versuchstieres verantwortlich ist. Bezüglich des Transplantatüberlebens während des Beobachtungszeitraumes von sechs Wochen konnten keine Unterschiede zwischen Tieren mit verkürzten und unverkürzten Telomeren festgestellt werden. Es ist anzunehmen, dass es bei einer stärkeren Schädigung der Niere, beispielsweise durch längere Ischämiezeiten, zu einem geringeren Überleben der Telomerase-Knockout-Mäuse kommen würde.

Durch die Wahl eines isogenen Transplantationsmodells werden immunologische Aspekte einer Organtransplantation eliminiert. Im Gegensatz zu allogenen Modellen muss hier die akute Transplantatabstoßung als häufiger Grund für Transplantatversagen nicht berücksichtigt werden. Eine Immunsuppression ist daher nicht notwendig. Insgesamt wird, verglichen mit einem allogenen Transplantationsmodell, ein milderer Schaden zugefügt, was auch ein besseres Überleben der Empfänger zurfolge hat.

4.1.2 Körpergewicht

In Übereinstimmung mit den Daten von Herrera et al. und Rudolph et al. aus dem Jahr 1999 (91, 93) konnten wir bei den Tieren mit kritisch kurzen Telomeren (KO-G4) ein im Vergleich zu den Tieren mit normaler Telomeraseaktivität signifikant niedrigeres Körpergewicht feststellen. Die Ursachen für diese Gewichtsabnahme sind noch nicht vollständig geklärt. Jedoch wird ein Zusammenhang mit der fortschreitenden intestinalen Atrophie vermutet, die sowohl während des

physiologischen Alterungsprozesses der Maus als auch bei jungen mTERC-KO-Mäusen höherer Generation zu beobachten ist (91). Es ist anzunehmen, dass der Verlust der normalen Zottenarchitektur zu einer verminderten Resorptionsfähigkeit und so zu einem Gewichtsverlust führt (93, 111). Des Weiteren verfügen mTERC-KO-Mäuse höherer Generation über ein nur gering ausgeprägtes Unterhautfettgewebe, was zum einen ein weiterer Grund für das geringere Körpergewicht der Tiere, zum anderen auch beim Menschen ein typisches Merkmal alternder Haut ist (93).

4.1.3 Nierengewicht vor und nach Transplantation

Die Gewichte der Spenderorgane unterschieden sich vor der Transplantation nicht signifikant. Bei Organentnahme sechs Wochen nach Transplantation zeigten sich tendenziell niedrigere Organgewichte bei den mTERC-KO-Mäusen höherer Generationen. Dies lässt sich wahrscheinlich mit dem atrophischen Umbau des Nierengewebes als Ausdruck des durch den Transplantationsstress hervorgerufenen chronischen Schadens erklären, der in den Organen mit kritisch kurzen Telomeren stärker ausgeprägt ist als bei den übrigen Tieren.

4.1.4 Nierenfunktion

Die Aussagekraft der hier gemessenen Nierenfunktionsparameter muss kritisch betrachtet werden. Ein starker Anstieg des Serumkreatinins würde zwar auf eine starke Schädigung des Organs hindeuten, ein leichter Anstieg spiegelt das Ausmaß der Nierenschädigung jedoch nicht adäquat wieder (112). Auf die Bestimmung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) musste verzichtet werden. Dies hätte zwar eine genauere Beurteilung der Nierenfunktion ermöglicht als die alleinige Bestimmung von Kreatinin und Harnstoff, erfordert aber die Gewinnung eines 24-Stunden-Sammelurins der Mäuse in einem metabolischen Käfig, was technisch schwierig ist und durch den Stress zum Tod der Tiere und Verlust der Organe für die histologische

milden Schadens in dem hier untersuchten Modell in den sechs Wochen nach Transplantation keine wesentlichen Unterschiede bei der Organfunktion zwischen Transplantaten mit verkürzten und unverkürzten Telomeren bestehen. Die Ursache für den Harnstoffanstieg in der ersten und zweiten Woche nach Transplantation in allen Gruppen könnte die postoperative katabole Stoffwechsellage sein.

4.1.5 Glomerulosklerose

Glomerulosklerose ist ein typisches histologisches Merkmal alternder Nieren (113).

Der bindegewebige Umbau, der unter normalen Umständen langsam abläuft, kann durch Krankheiten oder andere Belastungen beschleunigt werden und stellt die Hauptursache für chronisches Nierenversagen während des Alterungsprozesses dar (114). 2004 wiesen Melk et al. eine Korrelation zwischen einer erhöhten Expression des Seneszenzmarkers p16^INK4a und dem Auftreten von Glomerulosklerose und interstitieller Fibrose in alternden humanen Nieren nach (85). Unsere Daten zeigen, dass die nicht transplantierten Nieren der Spender bezüglich der Glomerulosklerose keine Unterschiede aufweisen. In früheren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe an jungen Telomerase-Knockout-Mäusen zeigte sich ein dezenter Anstieg der

Der bindegewebige Umbau, der unter normalen Umständen langsam abläuft, kann durch Krankheiten oder andere Belastungen beschleunigt werden und stellt die Hauptursache für chronisches Nierenversagen während des Alterungsprozesses dar (114). 2004 wiesen Melk et al. eine Korrelation zwischen einer erhöhten Expression des Seneszenzmarkers p16^INK4a und dem Auftreten von Glomerulosklerose und interstitieller Fibrose in alternden humanen Nieren nach (85). Unsere Daten zeigen, dass die nicht transplantierten Nieren der Spender bezüglich der Glomerulosklerose keine Unterschiede aufweisen. In früheren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe an jungen Telomerase-Knockout-Mäusen zeigte sich ein dezenter Anstieg der

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