Organtransplantation

Die Spenderniere wurde zunächst rechts der Aorta platziert und die Aorta der Spenderniere mit einem 10/0 Faden am oberen und unteren Rand der Öffnung an der Aorta des Empfängers fixiert. Anschließend wurde auf der linken Seite von oben nach unten fortlaufend vernäht. Daraufhin legte man die Niere auf die linke Seite der Aorta und anastomosierte die rechte Seite mit einer fortlaufenden Naht. Die Nahtenden wurden kurz abgeschnitten und nicht verknotet. Bei der venösen Anastomose wurde gleichermaßen verfahren und die V. cava inf. des Spenders End-zu-Seit an die des Empfängers anastomosiert (siehe Abb. 7). Vor Freigabe der Blutzirkulation wurde zur Blutstillung 15-30 Sekunden (sec) mit einem Wattestäbchen auf die Anastomosen gedrückt. Anschließend wurden die Mikroklemmen entfernt.

Für die Anastomosierung des Ureters wurde zunächst die Harnblase aufgesucht und nach oben gezogen. Anschließend wurde die Blase mit einer 23 G Kanüle von rechts unten nach links oben durchstochen und der Ureter in das obere Ende der Kanüle eingefädelt. Die Kanüle wurde vollständig zurückgezogen und der Ureter an der Austrittsstelle mit einer Mikroklemme geklippt, um ein Zurückgleiten in die Blase zu verhindern. Schließlich wurde der Ureter an der Eintrittsstelle in die Blase mit einem 10/0 Faden anastomosiert. Das Ureterende wurde an seiner Austrittstelle kurz abgeschnitten und konnte sich in die Blase zurückziehen. Die Perforation in der Blasenwand wurde verschlossen. Abschließend wurde die Bauchdecke mit einem 4/0 Faden verschlossen.

Postoperativ erhielten die Empfängertiere eine Antibiotikaprophylaxe mit Cephazolin (100 mg/kg KG intramuskulär) und wurden bis zum Erwachen aus der Narkose beobachtet. Zur postoperativen Analgesie wurde das Trinkwasser der Tiere für drei Tage mit Metamizol (0,8 mg/ml) versetzt.

erfolgte durch retroorbitale Punktion und es wurden maximal sieben Tropfen pro Woche entnommen. Das Vollblut wurde nach 5 min bei Raumtemperatur für 10 min bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, das Serum abpipettiert und bei -19°C eingefroren. Das gefrorene Serum wurde auf Trockeneis in das Labor von Prof. Dr. Norbert Gretz, Zentrum für Medizinische Forschung, Fakultät für Klinische Medizin Mannheim der Universität Heidelberg versendet. Dort wurde die Bestimmung von Serumkreatinin und Harnstoff vorgenommen.

2.2.2.1 Serumkreatinin

Die Bestimmung des Serumkreatinins erfolgte mit Hilfe des Creatinin Plus-Tests der Firma Roche Diagnostics. Grundlage dieser enzymatischen Methode ist die Bestimmung von Sacrosin nach Umwandlung von Kreatinin durch die katalytische Wirkung von Kreatininase, Kreatinase und Sacrosinoxidase zu Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid. Durch weitere Reaktion des Wasserstoffperoxids mit 4-Aminophenazon und HTIB (2,4,6-Trijod-3-hydroxybenzoesäure), katalysiert durch das Enzym Peroxidase, entsteht ein Chinoniminfarbstoff, dessen Farbintensität direkt proportional der Kreatininkonzentration ist und fotometrisch gemessen werden kann.

2.2.2.2 Harnstoff

Zur Harnstoffbestimmung wurde der UREA/BUN-Test von der Firma Roche Diagnostics verwendet. Dabei handelt es sich ebenfalls um einen enzymatischen UV-Test, bei dem zunächst Harnstoff durch Urease zu Kohlenstoffdioxid und Ammoniak hydrolysiert wird. Das Ammoniak reagiert anschließend mit α-Ketoglutarat und NADH, katalysiert durch die GLDH (Glutamatdehydrogenase), zu Glutamat und NAD⁺. Der Verbrauch von NADH führt zu einer Extinktionsabnahme, die mit dem Fotometer erfasst werden kann.

2.2.3 Organentnahme

Zur Entnahme des Transplantats sechs Wochen postoperativ wurden die Tiere zunächst erneut wie unter 2.2.1.1 beschrieben einer Narkose mit Isofluran unterzogen und fixiert. Anschließend wurden durch retroorbitale Punktion 10 bis 20 Tropfen Vollblut entnommen. Die Bauchwand wurde V-förmig eingeschnitten und lateral auf beiden Seiten bis oberhalb des Zwerchfells eröffnet, das Zwerchfell durchtrennt und die Thoraxwand nach kranial verlagert. Daraufhin wurde der linke Ventrikel mit einer 24G Kanüle punktiert und mit 10 ml eiskalter 0,9 %iger Kochsalzlösung perfundiert sowie nach 2 min die Leber mehrfach verletzt um einen ausreichenden venösen Abfluss zu ermöglichen. Nach der Perfusion wurde der Darm mittels eines angefeuchteten Wattestäbchens auf die linke Seite geschoben, um einen optimalen Blick auf die retroperitonealen Organe zu ermöglichen.

Anschließend folgten die makroskopische Beurteilung der transplantierten Niere sowie deren Entnahme und die Entnahme von Herz, Leber und Milz. Die Organe wurden gewogen und Leber, Herz und Milz jeweils in zwei Teile geteilt, von denen je ein Stück auf Alufolie in flüssigen Stickstoff gegeben und eines in Formalin fixiert wurde. Die Niere teilte man nach der Entkapselung in vier Teile und legte die Pole zur Gewinnung von DNA und RNA umgehend auf Alufolie in flüssigen Stickstoff ein.

Des Weiteren wurde je eine Gewebescheibe jeder Niere in flüssigem Stickstoff und eine in Formalin fixiert.

2.2.4 Organaufarbeitung

Für die feingewebliche Untersuchung des Nierenparenchyms wurden Paraffinschnitte angefertigt. Dies umfasst die Fixierung, das Schneiden, Einbetten und Färben des Gewebes.

2.2.4.1 Fixierung

Die Fixierung dient dazu, der unmittelbar nach der Entnahme einsetzenden Autolyse entgegenzuwirken und ermöglicht die Erhaltung der Gewebe- und Zellmorphologie.

Zunächst wurde das Gewebe bei Raumtemperatur für 24 Stunden in einer

PBS-Vernetzung der Proteine durch Bildung von Hydroxymethylenbrücken untereinander bewirkt. Die Aufbewahrung bis zur Einbettung erfolgte in 70 %igem Ethanol, das wöchentlich ausgetauscht wurde. Anschließend wurde das Gewebe einer aufsteigenden Alkoholreihe zugeführt, zunächst 96 %igem Ethanol, dann 99 %igem Ethanol und schließlich Xylol.

2.2.4.2 Einbettung

Die Einbettung dient dazu dem Gewebe die notwendige Konsistenz zu verleihen, um es in wenige µm dünne Scheiben zu schneiden. In der Lichtmikroskopie wird üblicherweise Paraffin verwendet.

Die für die Einbettung vorgesehenen Metallschälchen wurden auf 55°C vorgewärmt und auf die 60°C warme Heizplatte des Einbettungsgerätes gestellt. Anschließend wurde eine kleine Menge Paraffin in die Schälchen gegeben, die den Boden bedeckte. Diese ließ man kurz erkalten, platzierte die Organe darin und füllte die Schälchen vollständig. Schließlich wurde der Block auf Eis gekühlt, aus dem Schälchen gelöst und anschließend bei 4°C gelagert.

2.2.4.3 Erstellen von Paraffinschnitten

Zum Schneiden diente ein Mikrotom, ein Gerät, das die Erstellung von Schnitten definierbarer Dicke ermöglicht. Es wurden 3 µm dicke Schnitte erstellt und mit einem Pinsel in ein Warmwasserbad überführt. Diese Maßnahme dient dazu, die Bildung von Falten im Gewebe zu verhindern.

Anschließend wurden die Schnitte auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger gezogen. Auf jedem Objektträger wurden mindestens zwei Schnitte platziert um bei den immunhistochemischen Färbungen eine Negativkontrolle erstellen zu können.

Schließlich wurden die Objektträger im Trockenschrank für mindestens 24 Stunden bei 37°C getrocknet.

2.2.5 Histologische Färbungen

Um einen Gewebeschnitt lichtmikroskopisch zu untersuchen, ist eine Färbung sinnvoll, da das Gewebe selbst nur einen geringen Eigenkontrast hat. Dabei macht man sich die physikochemischen Eigenschaften von Gewebe und Farbstoff zunutze.

Saure Farbstoffe binden an azidophile Zellbestandteile, beispielsweise Zytoplasma, basische Farbstoffe an basophile Strukturen wie z.B. Nukleinsäuren.

Damit die in der Regel wasserlöslichen Farbstoffe binden können, muss das Gewebe zunächst deparaffiniert werden. Dafür gab man die Schnitte in ein Xylolbad.

Anschließend wurden die Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe (100 %, 96 %, 70 %) rehydriert. Die so aufgearbeiteten Präparate wurden gefärbt. Nach dem Färben wurde die überschüssige Farbe gründlich mit Aqua dest. ausgewaschen und die Schnitte zur erneuten Dehydrierung einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 96

%, 100 %) und abschließend einem Xylolbad zugeführt. Schließlich wurden die Präparate mittels eines Deckglases und eines durchsichtigen Eindeckmediums (Eukit) eingedeckelt. Dieses Vorgehen gilt für alle im Folgenden beschriebenen Färbungen.

2.2.5.1 Periodic Acid Schiff (PAS)-Färbung

Die PAS-Färbung ist gut geeignet um kohlenhydrathaltige Strukturen anzufärben, wie zum Beispiel Glykogen, Glykoproteine und Muzine. Diese befinden sich insbesondere in Zellwänden, Basalmembran und Kollagenfasern. Die PAS-Reaktion beruht darauf, dass Perjodsäure oxidierend auf die freien Hydroxylgruppen der Saccharide wirkt. Die dabei entstehenden Aldehydgruppen können anschließend mit dem Schiff’s-Reagens (farblose fuchsinschweflige Säure) sichtbar gemacht werden, das dabei einen purpurroten Farbton annimmt.

Das Färben erfolgte nach dem unter 2.2.5 beschriebenen Entparaffinieren und Rehydrieren. Zunächst erfolgte eine fünfminütige Inkubation in 1 %iger Perjodsäure.

Nach sorgfältiger Spülung mit Aqua dest. wurden die Präparate für 25 min bei Raumtemperatur in ein Schiff’s-Reagens-Bad gegeben. Nach erneuter Spülung mit Leitungswasser und Aqua dest. wurden die Schnitte 40 min mit Hämatoxylin gegengefärbt, anschließend 10 min mit Leitungswasser gewässert, dehydriert und

2.2.5.1.1 Auswertung

In der vorliegenden Arbeit wurde die PAS-Färbung zur Beurteilung der Glomerulosklerose genutzt. Zur Orientierung im Präparat wurden die Gewebeschnitte zunächst unter 100facher Vergrößerung betrachtet. Anschließend wurden unter 400 facher Vergrößerung jeweils 40 Glomerula pro Schnitt beurteilt. Es wurde so vorgegangen, dass eine Überschneidung der Bildbereiche und damit doppelte Wertung einzelner Glomerula ausgeschlossen wurde. Die Auswertung der Bilder erfolgte verblindet, also ohne vorherige Kenntnis des Genotyps.

Der Glomerulosklerosescore wurde 1984 erstmals von Raij et al. beschrieben (98) und seitdem in vielen Arbeiten verwendet (99, 100). Definiert wird Glomerulosklerose darin als Verlust von Zellbestandteilen im glomerulären Schlingenkonvolut, Kollaps der Kapillarlumina und Faltung der Basasalmembran. Ebenfalls wurde die Expansion der mesangialen Matrix beurteilt, gemessen an PAS-positivem Material in den mesangialen Bereichen. In jedem Schnitt wurden mindestens 40 Glomerula nach einer Skala von 0 bis 4 beurteilt, wobei der Schweregrad der glomerulären Schädigung an der prozentual betroffenen Fläche pro Glomerulum gemessen wurde.

Die Einteilung des Score ist in Tabelle 1 beschrieben. Ausgewertet wurden sowohl die transplantierte (Tx-Niere) als auch die nicht transplantierte kontralaterale Niere (N-Niere) der Tiere mit den Genotypen WT, Het, KO-G1, KO-G3 und KO-G4.

Grad 0 normales Glomerulum

Grad 1

mesangiale Expansion oder Sklerose von bis zu 25 % der Fläche der segmentale extrakapilläre Fibrose oder Proliferation

Grad 4

Glomerulum mit globaler Sklerose (>75 %) oder globaler extrakapillärer Fibrose und Proliferation oder vollständigem Kollaps des glomerulären Kapillargeflechts

Tabelle 1: Glomerulosklerosescore

In der Tabelle ist der Glomerulosklerosescore von Grad 0 bis 4 erläutert, wobei sich die Einteilung nach dem Anteil der geschädigten glomerulären Fläche richtet.

2.2.5.2 Masson-Trichrom (MT)-Färbung

Diese Färbung dient insbesondere der Darstellung von Kollagenfasern mit dem Farbstoff Anilinblau. Das außerdem enthaltene Eisenhämatoxylin färbt Zellkerne schwarz und Säurefuchsin hebt Zytoplasmabestandteile rot hervor.

Zunächst wurden die Präparate wie oben beschrieben entparaffiniert, rehydriert und gespült. Daraufhin gab man die Schnitte zur Intensivierung der Farbreaktion eine Stunde bei 60°C in ein Bad mit Bouin-Lösung und spülte diese anschließend mit Leitungswasser und Aqua dest. wieder ab. Anschließend färbte man die Zellkerne 2 min mit Hämatoxylin, spülte erneut und färbte das Zytoplasma 5 sec mit Säurefuchsin. Damit sich ausschließlich das Zytoplasma rot färbt, wurde daraufhin

wurden die Objektträger in die Anilinblaulösung überführt. Nach Ablauf der fünfzehnminütigen Inkubationszeit wurden die Schnitte zum Entfärben für 10 sec in Essigsäure getaucht. Abschließend wurde das Gewebe in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und mit Eukit eingedeckelt.

2.2.5.2.1 Auswertung

In der vorliegenden Arbeit wurde die MT-Färbung zur quantitativen Beurteilung der interstitiellen Fibrose in den einzelnen Gruppen benutzt.

Zunächst wurde der gesamte Schnitt unter dem Lichtmikroskop bei 100facher Vergrößerung durchgemustert und anschließend bei 200facher Vergrößerung fotografiert. In zwei Serien wurden sowohl der gesamte Kortex als auch der gesamte korticomedulläre Übergang zirkulär abgelichtet. Dabei wurde so vorgegangen, dass eine Überlappung der Bildabschnitte ausgeschlossen wurde. Je nach Qualität des Gewebeschnitts entstanden dabei 18-30 Bilder des Kortex sowie 10-20 vom korticomedullären Übergang. Anschließend wurden jeweils 10-16 gleichmäßig über den Schnitt verteilte Bilder beurteilt, sodass alle Organabschnitte berücksichtigt wurden. Die Auswertung der Bilder erfolgte verblindet, also ohne vorherige Kenntnis des Genotyps

Die Bewertung der interstitiellen Fibrose erfolgte mithilfe des Leica QWin-Programms Version 3.0. Dabei markierte man zunächst die vom Auswertenden visuell als MT-positiv betrachteten Blautöne. Anschließend konnten alle Bildbereiche, die nicht der tubulo-interstitiellen Fläche zugeordnet werden, durch Umfahren des Areals herausgeschnitten werden. Daraufhin detektierte die Software den Anteil der entsprechend gefärbten Pixel am Gesamtbild und ermöglichte so die Berechnung des prozentualen Fibroseanteils. Ausgewertet wurden alle transplantierten Nieren der Spendertiere sowie die kontralaterale nicht transplantierte Niere der Genotypen WT, KO-G1 und KO-G4.

2.2.6 Immunhistochemische Färbungen

Immunhistochemische Färbungen ermöglichen den spezifischen Nachweis von Proteinen und beruhen auf dem Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion. Der zu

untersuchende Gewebeschnitt wird dabei mit einer Lösung bedeckt, die den gegen das nachzuweisende Protein gerichteten Antikörper enthält. Zum Nachweis des Antigen-Antikörper-Komplexes unterscheidet man eine direkte Methode, bei der der gegen das Antigen gerichtete Antikörper selbst markiert ist und eine indirekte Methode, bei der nach Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes ein weiterer markierter Antikörper hinzu gegeben wird, der gegen den ersten Antikörper gerichtet ist. Die letztgenannte indirekte Methode dient dazu, die Empfindlichkeit des Nachweises zu steigern und wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet.

2.2.6.1 Ki67-Antikörper-Färbung

Das Antigen Ki67 ist ein häufig angewandter Proliferationsmarker. Es handelt sich dabei um ein im Zellkern lokalisiertes Epitop, das ausschließlich von in der Wachstumsphase befindlichen Zellen exprimiert wird, also in der G1-, S-, G2- und M-Phase des Zellzyklus. In ruhenden Zellen, die sich in der G0-M-Phase befinden, kann man Ki67-Antigen nicht nachweisen (101). Der Ki67-Antikörper wurde 1983 erstmals von Gerdes et al. beschrieben (102).

Vor der Färbung wurden die Schnitte wie oben beschrieben entparaffiniert, in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert und mit Aqua dest. gespült. Um eine Demaskierung des Antigens zu erreichen, wurden die Präparate zunächst 5 min in Citratpuffer auf 125°C in einem Dampfdrucktopf erhitzt. Um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden gab man die Schnitte nach dem Abkühlen zur Inaktivierung endogener Proteasen für die Dauer von 20 min in ein Gemisch aus 3 %igem Wasserstoffperoxid und Methanol und spülte anschließend gründlich mit Leitungswasser. Nach dem Trocknen wurde mit einem Fettstift ein Ring um die Schnitte auf dem Objektträgern gezogen, um getrennte Reaktionsbereiche für die spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion sowie die Isotypenkontrolle zu erhalten. Für die Isotypenkontrolle wurde ein unspezifischer Maus-Antikörper der Subklasse IgG2a verwendet, der nicht binden sollte und so als Negativkontrolle fungiert. Anschließend wurden die Schnitte kurz mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) rehydriert und für 20 min in einer feuchten Kammer mit Universal Blocking Reagent (BioGenex) geblockt, um die Bindung unspezifischer Antikörper zu verhindern. Daraufhin wurde

Stunde auf den Schnitt gegeben sowie die Isotypenkontrolle in gleicher Konzentration und für denselben Zeitraum auf den gegenüberliegenden Schnitt.

Nach dem Waschen mit PBS wurde die Lösung mit dem Sekundärantikörper EnVision+ (DAKO EnVision™) aufgetragen und die Schnitte für 30 min in der feuchten Kammer inkubiert. Nach einem weiteren Waschgang mit PBS folgte zur Sichtbarmachung der Antikörper eine fünfminütige Inkubation mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB), welches ein braunes Endprodukt bildet. Der Überschuss wurde mit Wasser abgewaschen und die Schnitte 5 min mit Hämatoxylin gegengefärbt, anschließend wieder unter fließendem Wasser gewaschen, in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und mit Eukit eingedeckelt.

2.2.6.1.1 Auswertung

Die Ki67-Färbung diente der Bestimmung der Proliferationsrate. Die Schnitte wurden wie unter 2.2.5.1.1 beschrieben fotografiert und sämtliche Bilder verblindet ausgewertet. Man betrachtete glomeruläre, tubuläre, vaskuläre und interstitielle Zellen separat und ermittelte für jedes zelluläre Kompartiment die Anzahl Ki67-positiver Zellen in Bezug auf die absolute Zellzahl, um anschließend den prozentualen Anteil proliferierender Zellen zu errechnen.

2.2.6.2 γ-H2AX-Antikörper-Färbung

Die γ-H2AX-Antikörper-Färbung ist eine Methode zur Detektion von DNA-Doppelstrangbrüchen. Kommt es in einer Zelle zu DNA-Doppelstrangbrüchen, wird eine Signalkaskade in Gang gesetzt, deren Ziel die Aktivierung der zelleigenen DNA-Reparaturmechanismen ist. Ein Schritt in dieser Signalkaskade ist die Phosphorylierung des Histons H2AX. Das dabei entstehende Produkt wird als γ -H2AX bezeichnet und kann mittels immunhistochemischer Methoden sichtbar gemacht werden (103, 104). Es sind verschiedene Schädigungsmechanismen bekannt, die zu einem verstärkten Nachweis von γ-H2AX führen. Kommt es zur Reparatur des Schadens wird γ-H2AX wieder dephosphoryliert. D’Adda Di Faganga et al. konnten feststellen, dass die Phosphorylierung von H2AX auch in Zellen mit dysfunktionalen Telomeren stattfindet (105).

Vor der Färbung wurden die Schnitte wie unter 2.2.5 beschrieben entparaffiniert, in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert und mit Aqua dest. gespült. Um eine Demaskierung des Antigens zu erreichen, wurden die Präparate zunächst 5 min in Citratpuffer auf 125°C in einem Dampfdrucktopf erhitzt.

Nach einem erneuten Waschgang mit Aqua dest. folgte eine 30 minütige Inkubation mit Blocking Reagenz in der feuchten Kammer. Der Überstand wurde abgeklopft und die Lösung mit dem Primärantikörper (1:250, Phospho-Histone H2AX (Ser139) (20E3) Rabbit mAb #9718) auf die Schnitte gegeben. Anschließend wurden die Objektträger bei 4°C über Nacht inkubiert. Nach einem Waschgang mit PBS wurden die Schnitte für 30 min zur Blockade endogener Proteaseaktivität in 0,9 %iges Wasserstoffperoxid gegeben. Anschließend gab man das Anti-rabbit-IgG Reagenz auf die Schnitte und inkubierte diese für weitere 30 min. Nach einem erneuten Waschgang mit PBS wurde das Gewebe für 7 min in DAB/Nova-red-Lösung (VECTASTAIN Elite ABC Kit, #PK610) inkubiert. Anschließend wurde das Gewebe gründlich mit Aqua dest. gespült und eine Minute in Hämatoxylin gegengefärbt.

Daraufhin wurden die Schnitte ein weiteres Mal mit Leitungswasser gewaschen, für 5 sec in 2 %iges Salzsäure-Ethanol gegeben und erneut mit Wasser gewaschen. Es folgten 20 sec im Ammoniumwasserbad und ein weiterer Waschgang mit Wasser.

Schließlich wurden die Schnitte wie oben beschrieben in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und eingedeckelt.

2.2.6.2.1 Auswertung

In der vorliegenden Arbeit diente die γ-H2AX-Antikörper-Färbung zur Sichtbarmachung von DNA-Schäden und Beurteilung der Reparaturfähigkeit der Zellen. Wie unter 2.2.5.1.1 beschrieben wurde für jeden Schnitt Kortex und korticomedullärer Übergang fotografiert und jeweils 10-12 Bilder von Kortex und korticomedullärem Übergang jedes Organs ausgewertet. Dabei wurden glomeruläre, vaskuläre, tubuläre und interstitielle Zellen getrennt betrachtet und für jedes Kompartiment der prozentuale Anteil γ-H2AX-positiver Zellen ermittelt. Als weitere Kontrollgruppe wurden je 10 Bilder der nicht-transplantierten kontralateralen Nieren der Genotypen WT, KO-G1 und KO-G4 ausgewertet. Die Auswertung der Bilder

2.2.6.3 TUNEL-Färbung (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling)

Die TUNEL-Färbung wird zur Ermittlung der apoptotischen Zellfraktion genutzt. Sie wurde erstmals 1992 von Gavrieli et al. beschrieben (106) und später in anderen Arbeiten weiterentwickelt (107,108). Während der Apoptose kommt es im Zellkern zur Fragmentierung der DNA durch Endonukleasen. Dabei entstehen sowohl DNA-Doppelstrangbrüche als auch Einzelstrangbrüche, die so genannten „nicks“. Diese weisen an den Enden freie Hydroxylgruppen auf. Das Enzym Terminale desoxynucleotidyl Transferase (TdT) bindet spezifisch an die freien Hydroxylgruppen und integriert biotinyliertes Desoxyuridin (dUTP). Dies kann mit immunhistochemischen Methoden nachgewiesen werden.

Zunächst wurde das Gewebe wie unter 2.2.5 beschrieben entparaffiniert und rehydriert. Nach einem Waschgang mit PBS wurde in einer feuchten Kammer die Proteinkinase K (20μg/ml) für 10 min auf die Schnitte gegeben. Nach einem weiteren Waschgang mit PBS wurden die Objektträger für 5 min in 3 %iger Wasserstoffperoxidlösung inkubiert, um eine Demaskierung des Antigens zu bewirken. Anschließend wurde das Gewebe erneut mit PBS gewaschen und für 5 min Equilibration buffer zugegeben. Daraufhin wurde das Enzym TdT auf die Schnitte gegeben und diese für eine Stunde bei 37°C in der feuchten Kammer inkubiert. Auf die Kontrollschnitte gab man ausschließlich PBS. Nach Ablauf der Zeit wurde das Gewebe für weitere 30 min bei 37°C im vorgewärmtem Stop/Wash-Puffer inkubiert. Es folgte ein weitere Waschgang mit PBS sowie das Blocken mit 1 %iger BSA/PBS-Lösung für 20 min, danach ein weiterer Waschgang mit PBS.

Anschließend wurden die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur in Anti-Digoxigenin-Peroxidase-Conjugate inkubiert und erneut mit PBS gewaschen. Daraufhin wurde für 6 min DAB-Lösung auf das Gewebe gegeben, mit Leitungswasser und Aqua dest.

Anschließend wurden die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur in Anti-Digoxigenin-Peroxidase-Conjugate inkubiert und erneut mit PBS gewaschen. Daraufhin wurde für 6 min DAB-Lösung auf das Gewebe gegeben, mit Leitungswasser und Aqua dest.

Im Dokument Nierentransplantation bei Telomerase-Knockout-Mäusen (Seite 37-0)