Toll-like-Rezeptoren 2, 4, und 9 und Nierenfunktion nach allogener Nierentransplantation

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Aus der Abteilung Nephrologie des Zentrums für Innere Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover

Toll-like-Rezeptoren 2, 4, und 9 und Nierenfunktion nach allogener

Nierentransplantation

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Katharina Kuklik aus Braunschweig

Hannover 2008

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Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover Am 18.11.2008

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Professor Dr. med. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer: PD Dr. med. Kirsten de Groot Referent: Prof. Dr. med. Jochen Ehrich Korreferent: Prof. Dr. med. Michael Neipp Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2008 Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. med. Jürgen Klempnauer Prof. Dr. med. Rainer Nustede Prof. Dr. med. Johann Karstens

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Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG 1

1.1 Das Immunsystem 1

1.1.1 Das angeborene Immunsystem 1

1.1.2 Das adaptive/ erworbene Immunsystem 2 1.3 Toll-like-Rezeptoren 3

1.4 Allogene Nierentransplantation 6 1.4.1 Nierentransplantatüberleben und -versagen 7

1.5 Die Banff-Klassifikation für Nierentransplantat-Biopsien 9

1.6 Protokoll- und Indikationsbiopsien 11

2 PROBLEM- UND AUFGABENSTELLUNG 12

2.1 Problemstellung 12

2.1.1 Toll-like-Rezeptoren in der Niere 13

2.2 Aufgabenstellung 14

3 PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN 15

3.1 Patienten 15

3.2 Material und Methoden 16

3.2.1 Biopsien 16

3.2.2 Immunhistochemie 17

3.2.3 Auswertung 19

3.3 Statistikmethoden 19

4 ERGEBNISSE 21

4.1 Patientenkollektiv 21

4.2 TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression im Transplantatgewebe 22

4.3 TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression und Transplantatfunktion 25

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Inhaltsverzeichnis

5 DISKUSSION 31

5.1 Die Rolle von TLR-2 im Nierentransplantatgewebe 31

5.4 TLR-2, TLR-4 und TLR-9 und Infektionen nach Transplantation 35

5.5 Schlussfolgerung 36

6 ZUSAMMENFASSUNG 37

7 LITERATURVERZEICHNIS 39

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 43

9 ANHANG 45

9.1 Danksagung 45

9.2 Lebenslauf 46

9.3 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 PromO 48

9.4 Originalpublikation 49

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Einleitung

1 Einleitung

1.1 Das Immunsystem

Das Immunsystem ist ein hochkomplexes System, in das eine Vielzahl von Zellen und Molekülen involviert sind. Es schützt den Organismus sowohl vor Infektionen durch verschiedene Pathogene wie Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten als auch vor humanen körperfremden Strukturen wie z.B. transplantiertes Gewebe durch eine Transplantatabstoßungsreaktion.

Aufgrund der unterschiedlichen Aufgaben und Funktionen wird das Immunsystem in die angeborene und die adaptive/ erworbene Immunantwort unterteilt [1, 2].

1.1.1 Das angeborene Immunsystem

Das angeborene Immunsystem ist evolutionär sehr alt, es kommt daher auch bei sämtlichen Tieren, Pflanzen und niederen vielzelligen Organismen vor [1].

Die Abwehrmaßnahmen dieses Systems werden auch als unspezifisch bezeichnet, da sie unabhängig vom jeweils eindringenden Erreger aktiv werden [1, 2]. Hierzu zählen unter anderem der Säuremantel der Haut sowie die intakte Epidermis, das Komplementsystem und antimikrobielle Peptide (Defensine) in der Schleimschicht auf inneren Epithelien [1].

Zu den Zellen der unspezifischen Immunabwehr gehören z.B. Makrophagen/

Monozyten, dendritische Zellen und neutrophile Granulozyten, die alle zur Phago- zytose fähig sind [2]. Makrophagen und dendritische Zellen werden gleichzeitig zu den sog. Antigen präsentierenden Zellen (APZ) gerechnet, die wichtig für das adaptive (erworbene) Immunsystem sind [2, 3] (siehe Kapitel 1.2).

Das angeborene Immunsystem verfügt über zwei Arten von Immunantworten, welche schnell aktiviert werden, auch wenn der Körper vorher noch nie mit dem Erreger in Kontakt gekommen ist. Dies sind die Phagozytose von körperfremden Strukturen mit anschließender Zerstörung oder Präsentation an das erworbene Immunsystem (siehe Kapitel 1.2) und das Auslösen einer Entzündungsreaktion [1, 2].

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Einleitung

Für das angeborene Pathogenerkennungssystem sind die sog. Musterer- kennungsrezeptoren (PRRs, Pattern Recognition Receptors) von immenser Wichtigkeit [1, 2, 3]. Sie kommen als lösliche Rezeptoren im Blut (Komponenten des Komplementsystems) sowie als membran-gebundene Rezeptoren auf der Ober- fläche von Wirtszellen und Zellen des angeborenen Immunsystems (Rezeptoren der Toll-like-Familie) vor [1, 2, 3]. Diese Oberflächenrezeptoren (TLRs) stimulieren in den Wirtszellen Gentranskriptionsprogramme, um Entzündungsreaktionen oder die Phagozytose als angeborene Immunantworten hervorzurufen [1, 2, 3].

1.1.2 Das adaptive/ erworbene Immunsystem

Dieses System ist evolutionär jünger und auf die Klasse der Wirbeltiere beschränkt [1]. Im Gegensatz zu der angeborenen Immunantwort ist das erworbene Abwehrsystem darauf programmiert, körperfremde Moleküle (Antigene) spezifisch zu erkennen und zu eliminieren [2]. Aus diesem Grund wird es auch als spezifisches Immunsystem bezeichnet [1, 2]. Die maßgeblichen Zellen der adaptiven Immunantwort sind B- und T-Lymphozyten (=B- und T-Zellen) [1, 2]. Dabei sind die B-Zellen für die Antikörper (AK) vermittelte oder auch humorale Immunität verantwortlich und die T-Zellen für die zellvermittelte Immunität [2]. Die durch die B-Lymphozyten gebildeten Immunglobuline (Ig, Antikörper) binden höchst spezifisch an das fremde Antigen, durch das ihre Bildung induziert wurde [1, 2]. Dadurch wird die Bindung des Antigens an Rezeptoren der Körperzellen inaktiviert, und erleichtert außerdem die Aufnahme durch phagozytierende Zellen [2]. Darüber hinaus agieren B-Zellen auch als Antigen präsentierende Zellen [2]. Ist die humorale Immunabwehr einmal mit einem bestimmten Antigen in Kontakt gekommen, bilden sich sog.

B-Gedächtniszellen für dieses Molekül, so dass bei einem erneuten Kontakt die adaptiven Immunantworten schneller hervorgerufen werden können [1, 2].

Die T-Lymphozyten werden in cytotoxische T-Zellen, die infizierte Zellen direkt töten können, und T-Helfer-Zellen unterteilt, die bei der Aktivierung von Makrophagen, B-Zellen und cytotoxischen T-Zellen helfen [2, 4].

Insgesamt dauern die Vorgänge des erworbenen Immunsystems jedoch deutlich länger als das Hervorrufen der angeborenen Immunantworten [2, 4].

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Einleitung

Damit die Lymphozyten des erworbenen Immunsystems aktiviert werden können, sind sie auf die APZ angewiesen, die ihnen über sog. Haupthisto- kompatibilitätskomplex-Moleküle (MHC-Moleküle, major histocompatibility complex) die Antigene präsentieren [2, 3]. Auf einigen von ihnen werden auch TLRs exprimiert (siehe Kapitel 1.3). Zu den APZ gehören dendritische Zellen, die am wirksamsten sind, sowie Makrophagen und Gedächtnis-B-Zellen [2]. Sie aktivieren nach Phagozytose und Präsentation des Antigens zwei Arten von T-Lymphozyten im Lymphknoten. Cytotoxische T-Zellen werden über MHC-Klasse I-Moleküle aktiviert, die auf fast allen kernhaltigen Körperzellen exprimiert werden. Anschließend wandern diese T-Zellen zum Infektionsherd und helfen, die Pathogene zu zerstören.

Dagegen werden T-Helfer-Zellen über MHC-Klasse II-Moleküle aktiviert, die nur auf den APZ exprimiert werden. Diese T-Lymphozyten regen schließlich z.B.

B-Lymphozyten zur spezifischen Antikörperbildung an [1, 2, 3].

Somit arbeiten also das angeborene und das erworbene Immunsystem Hand in Hand.

1.3 Toll-like-Rezeptoren

Die Proteine aus der Familie der Toll-like-Rezeptoren (TLRs) wurden Ende des letzten Jahrhunderts als Schlüsselmoleküle des ontogenetisch hoch konservierten Pathogenerkennungssystems bei Säugetieren definiert [1, 2], welches grundlegend für das angeborene Immunsystem ist (siehe Kapitel 1.1.1).

Sie gehören zu den PRRs, also Zelloberflächen-Mustererkennungsrezeptoren, die zur Erkennung von Pathogen assoziierten molekularen Mustern (PAMPs, Pathogen Associated Molecular Patterns) dienen [1, 2, 3]. Dies sind Strukturen, die aus- schließlich auf oder in Krankheitserregern vorkommen [3]. Durch diese Rezeptoren können Wirtszellen körperfremde Antigene von Eigengewebe unterscheiden [2].

Jedoch können einige TLRs auch bestimmte endogene Strukturen erkennen, wie z.B. solche aus nekrotische Zellen (siehe Tabelle 1) [2, 3, 5].

Der Name „Toll-like-Rezeptor“ wurde von einem Rezeptor namens „Toll“ bei Drosophila melanogaster (gemeine Fruchtfliege) abgeleitet, welcher den TLRs sehr ähnlich ist [1, 2]. TLRs besitzen eine große extrazelluläre Domäne, bestehend aus

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Einleitung

mehreren aufeinander folgenden Leucin reichen Abschnitten und einem intrazellulären Bereich, der dem Interleukin-1-Rezeptor ähnelt. Beide Domänen sind über ein Transmembranteil miteinander verknüpft. [1, 2].

Seit der Entdeckung der ersten TLRs Mitte der 1990er Jahre sind jedes Jahr neue Varianten in Säugetieren entdeckt worden [5, 6]. Bis Dato wurden 11 verschiedene TLRs gefunden (TLR-1-11), wovon bisher alle bis auf TLR 11 auch in menschlichem Gewebe nachgewiesen werden konnten [4, 5, 6]. Für die meisten TLRs konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Funktion bei der angeborenen Immunerkennung von bestimmten Pathogen assoziierten Immunstimulanzien (s. o.) haben (=Liganden), wie z.B. Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Peptidoglykane, Zymosan, Bakteriengeißeln und CpG-DNS [2, 3, 5]. In Tabelle 1 sind die bisher bekannten 11 TLRs mit ihren dazugehörigen Liganden aufgeführt [2, 3, 4, 5, 6].

TLRs kommen z.B. auf der Oberfläche von dendritische Zellen, Makrophagen/

Monozyten, B-Zellen, neutrophile Granulozyten, vaskulären Endothelzellen, Adipozyten, kardialen Myozyten, Fibroblasten, Keratinozyten und auf Epithelzellen des respiratorischen, Intestinal- und Urogenitaltrakts vor [2, 3]. Taucht im menschlichen Körper ein sog. PAMP auf, locken die Chemotraktorproteine C3a und C5a des Komplementsystems z.B. die dendritischen Zellen und Makrophagen an [1, 7], so dass nach Erkennung über die TLRs die in Kapitel 1.1.1 erklärten Vorgänge ablaufen können. Die extrazelluläre Domäne der TLRs erkennt und bindet dabei das Antigen und leitet das Signal an die intrazelluläre Domäne weiter, welche ihrerseits eine Signalkaskade in der Trägerzelle auslöst [1, 2]. Die TLRs benutzen verschiedene Signaltransduktionswege, die meisten jedoch den MyD88 abhängigen Signalweg, da MyD88 (Myeloid Differentiation factor 88, Myeloid-Unter- scheidungsfaktor 88) das zentrale Adaptermolekül der meisten TLRs darstellt [1, 2, 3]. Dies führt am Ende der Signalkaskade zur Aktivierung von NF(nukleärer Faktor)-kappaB, worunter verschiedene induzierbare Transkriptions- faktoren zusammengefasst werden. Diese translozieren daraufhin in den Kern der Trägerzelle und leiten die Gentranskription zur Bildung verschiedener Substanzen wie entzündliche Zytokine, z.B. Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) und IL-12 oder kostimulatorische Moleküle für die Aktivierung des erworbenen Immunsystems ein [2, 3, 4, 5].

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Einleitung

Tabelle 1: Toll-like-Rezeptoren 1 bis 11 mit ihren jeweiligen Liganden.

Rezeptor Ligand

TLR-1 Triacylierte Lipopeptide

TLR-2

bakterielle Lipoproteine, Peptidoglykane gram-positiver Bakterien, Lipoteichonsäure, Pilz spezifische Zuckerstrukturen (Zymosane, Mannane), endogene Liganden wie Heat-Shock-Proteine und andere Strukturen aus nekrotische Zellen

TLR-3 virale Doppelstrang-RNS

TLR-4

Lipopolysaccharide gram-negativer Bakterien, endogene Liganden wie extrazelluläre Matrix-Moleküle (z.B. Hyaluronsäure, Fibrinogen), Heat-Shock-Proteine

TLR-5 Flagellin gram-positiver und gram-negativer Bakterien TLR-6 Zymosan, diacylierte Lipopeptide, Lipoteichonsäure TLR-7 Imidazolquinoline, Einzelstrang-RNS

TLR-8 Imidazolquinoline, Einzelstrang-RNS

TLR-9 bakterielle und virale unmethylierte CpG-DNS TLR-10 unbekannt

TLR-11 uropathogene Bakterien-Anteile (noch nicht näher bekannt), Profilin ähnliche Proteine von Toxoplasma gondii

Zusammengefasst induzieren die TLRs eine Art Alarmsystem für entstehende Infektionen (exogene Liganden) und schon bestehende Zellschäden (endogene Liganden) im menschlichen Körper, wobei sie diverse Signaltransduktionswege aktivieren, was zur Expression verschiedenster Gene führt, dessen Produkte z.B.

eine Entzündungsreaktion auslösen und letztendlich auch die Einleitung der erworbenen spezifischen Immunantwort bewirken können [1, 2, 3, 4].

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Einleitung

1.4 Allogene Nierentransplantation

Die Nierentransplantation stellt eine Form der Nierenersatztherapie für Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz dar [8] und führt meistens zu einer höheren Lebens- erwartung, einer besseren Lebensqualität und Leistungsfähigkeit im Vergleich zur Dialyse [9].

Als Spenderorgane kommen Lebendspenden oder Leichennieren in Betracht [8, 9], hier wird jedoch nur auf die Nichtlebendspenden Bezug genommen.

Ein chronisches Nierenversagen bezeichnet die aufgrund von Nierenerkrankungen langfristig bestehende, irreversible Abnahme der glomerulären Filtrationsrate (GFR), die mit einer progressiven Reduktion von funktionsfähigem Nierengewebe einhergeht [9]. Ab einer GFR von unter 15ml/min/1,73m² in Kombination mit einer urämischen Symptomatik oder einer schwerwiegenden Elektrolyt- oder Säure-Base-Haushalt- Verschiebung (Stadium V) besteht die Notwendigkeit einer Nierenersatztherapie in Form einer Hämo- oder Peritonealdialyse [9].

Die häufigsten Ursachen einer chronischen Niereninsuffizienz sind Diabetes mellitus, Hypertonie (vaskuläre Nephropathie), Glomerulonephritis, Zystennieren und interstitielle Nephritis [9, 10]. Dabei sind die wichtigsten Faktoren einer Progression der Nierenerkrankung der schlecht eingestellte Bluthochdruck und die schwere Proteinurie [9].

Patienten, die auf eine Spenderniere warten, werden unter Einschaltung regionaler Transplantationszentren im Eurotransplant-Zentrum in Leiden/ Niederlande registriert und bekommen unter Berücksichtigung von Übereinstimmung (Histokompatibilität), Wartezeit und regionalen Gesichtspunkten ein Spenderorgan zugewiesen [8]. Die durchschnittliche Wartezeit beträgt in Deutschland mittlerweile etwa 6 Jahre, da die Zahl der verfügbaren Leichennieren bei weitem nicht ausreicht, um den derzeitigen Bedarf an Transplantationen zu decken [8, 10].

Bei der Operation wird die Spenderniere extraperitoneal in die linke oder rechte Fossa iliaca transplantiert, die Nierenarterie und -vene werden End zu Seit an die Arteria et Vena iliaca angeschlossen, und der Ureter wird direkt in die Blasenwand implantiert [11].

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Einleitung

1.4.1 Nierentransplantatüberleben und –versagen

Überleben und Versagen eines Nierentransplantats hängen von vielen verschiedenen immunologischen und nicht-immunologischen Faktoren ab, wovon die meisten schon vor der Transplantation abgeklärt werden müssen. Hierzu zählen z.B.

die Blutgruppen (AB0)- und HLA-Haupthistokompatibilitätskomplex-Typisierung von Spender und Empfänger [8, 11, 12]. HLA-Antigene sind MHC-Moleküle und werden auch Transplantations- oder Gewebeverträglichkeits- (Histokompatibilitäts-) Antigene genannt [8, 11]. Diese werden bei akuten T-Zell vermittelten Abstoßungsreaktionen als „fremde“ Versionen von Oberflächenmolekülen erkannt [8, 11]. Da sie beim Menschen zuerst auf Leukozyten entdeckt wurden, werden sie humane Leukozyten- Antigene (HLA-Antigene) genannt [8, 11]. Ebenso muss präoperativ der Kreuztest von Empfängerserum mit T-Lymphozyten des Spenders durchgeführt werden [8, 11, 12]. Ist dieser positiv, so weist er beim Empfänger auf das Vorhandensein von präformierten Antikörpern gegen HLA-Antigene des Spenders hin [8], deren Bildung hauptsächlich auf einer früheren Exposition gegenüber HLA-Antigenen von Leukozyten während einer Bluttransfusion beruht [8]. Durch diese Antikörper kommt es in der Regel zu einer hyperakuten Abstoßung des Transplantats aufgrund eines akuten vaskulitischen Ereignisses [8, 11].

Des Weiteren ist die häufigste Ursache einer verzögerten oder fehlenden Funktionsaufnahme direkt nach der Transplantation die ischämische akute Tubulusnekrose [8, 11], die durch verlängerte kalte Ischämiezeiten (Zeit zwischen Entnahme des Transplantats und Einpflanzung in den Empfänger), Ischämie-Reperfusionsschäden und vaskuläre Vorschäden (Sklerose) von Spender und Empfänger begünstigt wird [11].

Bei einer akuten Abstoßungsreaktion handelt es sich hauptsächlich um einen durch T-Zellen vermittelten Vorgang. Aber auch die humorale Immunantwort hat ihren Anteil an der akuten Abstoßungsreaktion, bei der es zu einer durch Antikörper und Komplement vermittelten Endothelzellschädigung mit nachfolgenden Gefäßthromben kommt [11, 13]. Ebenso ist das angeborene Immunsystem, und damit auch die TLRs, vermutlich zu einem erheblichen Teil in die akute Abstoßungsreaktion involviert [3, 5].

Um nach erfolgreicher Transplantation solche Abstoßungsepisoden zu vermeiden, wird eine immunsuppressive Therapie eingeleitet, was eine gute Compliance des

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Einleitung

Patienten voraussetzt. In Deutschland wird im Allgemeinen zur Induktionstherapie ein Interleukin-2-Antikörper (Basiliximab oder Daclizumab) oder Antithymozytenglobulin gegeben [8]. Zur Erhaltungstherapie bekommen die Patienten in der Regel eine Kombination aus einem Calcineurininhibitor (Cyclosporin A oder Tacrolimus, jedoch auch nierentoxisch), einem Glukokortikoid (Prednisolon oder Methylprednisolon) und Mycophenolatmofetil (Purinsynthese-Hemmer) oder auch Sirolimus (mTOR-Kinase-Inhibitor) [8].

Eine Immunsuppression beeinträchtigt damit auch die Immunabwehr und begünstigt so opportunistische Infektionen, die das Transplantat gefährden können. Perioperativ innerhalb des ersten Monats gehören hierzu z.B. Wundinfektionen, Herpes-Viren, orale Candidiasis und Harnwegsinfektionen (HWIs) [8, 11]. Innerhalb der ersten 6 Monate sind es in der Regel Infektionen mit Pneumocystis jiroveci (ehem. carinii), Cytomegalie-Virus (CMV), Legionellen und Listerien [8, 11], während nach 6 Monaten und später opportunistische Infektionen hauptsächlich durch Aspergillus, Nokardia, Polyoma-Viren und Herpes Zoster ausgelöst werden [8, 11].

Eine durch immunologische und nicht-immunologische Faktoren entstehende Transplantatdysfunktion kann in eine akute und eine chronische (>1 Jahr) unterteilt werden [11]. Gründe für eine akute Transplantatdysfunktion sind im Wesentlichen akute Abstoßungsreaktionen, eine Calcineurintoxizität, bakterielle Pyelonephritiden, interstitielle Nephritiden, eine zu niedrige Immunsuppression, Noncompliance und von den Infektionen vor allem die durch Polyoma-Viren und CMV verursachten [8, 11]. Charakteristisch für eine chronische Transplantatdysfunktion bzw. einen chronischen Transplantatschaden [14] ist eine sich ständig leicht verschlechternde Nierenfunktion mit begleitender Hypertonie [11]. Zusätzlich zu den Faktoren, die auch zu einer akuten Transplantatdysfunktion führen, zählen hier noch eine geringe HLA-Übereinstimmung, eine vorhandene Vorsensibilisierung, eine verzögerte Funktionsaufnahme des Transplantats, eine reduzierte Zahl an Nephronen, eine Hypertonie, eine Hyperlipidämie und die rekurrierende renale Grunderkrankung [8, 11]. Letztendlich kommt es dadurch zu einer interstitiellen Fibrose und einer progressiven tubulären Atrophie [11, 15]. Therapeutische Optionen bei einer akuten Abstoßungsreaktion sind, abhängig vom Schweregrad nach der Banff-Klassifikation [15], zunächst der Versuch einer Steroidbolus-Gabe, und bei einer schweren

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Einleitung

Abstoßungsreaktion die Umstellung von Cyclosporin A auf Tacrolimus oder der Einsatz von Mycophenolatmofetil bzw. Sirolimus [8, 11].

Bei einer akuten Calcineurintoxizität kann mit einer Reduktion oder dem Pausieren des Medikaments eine Besserung der Nierenfunktion erreicht werden [11]. Jegliche Infektionen sollten sofort konsequent therapiert werden [8]. Des Weiteren sind eine gute Blutdruckeinstellung und die Behandlung einer Hyperlipidämie wichtige Begleitmaßnahmen [8, 11].

Bei der chronischen Transplantatdysfunktion ist eine spezifische Therapie nicht bekannt [11]. Eine Intensivierung der Immunsuppression mit einem vorübergehenden Steroidbolus hilft meistens nur bei nachgewiesener frischer Abstoßung [11]. In vielen Fällen ist der Verlauf jedoch progredient, und alle Interventionsversuche bleiben frustran, so dass ein Transplantatverlust nicht mehr verhindert werden kann [11].

In Deutschland liegt die Nierentransplantat-Halbwertszeit zurzeit bei durchschnittlich 19 Jahren für Nichtlebendspenden [9].

1.5 Die Banff-Klassifikation für Nierentransplantat-Biopsien

Die Banff-Klassifikation ist ein international anerkanntes Schema für Pathologen, um Abstoßungsreaktionen und andere akute und chronische histopathologische Veränderungen in renalen Transplantat-Biopsien standardisiert interpretieren zu können [16]. Sie wurde Anfang der 1990er Jahre entwickelt [16] und bisher alle 2 Jahre überarbeitet und aktualisiert. Die neueste Fassung wurde 2007 entworfen (Banff ’07) [15].

Die Klassifikation basiert auf der Einteilung verschiedener Arten von Abstoßungsreaktionen und ist in 6 Kategorien aufgeteilt, die teilweise noch mehrere Gruppen mit Untergruppen beinhalten [15, 16]. In die Banff-Kategorie 1 sind normale Biopsien ohne histopathologische Veränderungen einzuordnen [15, 16].

In die Kategorie 2 gehören Biopsien mit Antikörper vermittelten Veränderungen/

Abstoßungsreaktionen, das heißt es müssen zirkulierende Anti-Spender-Antikörper (gegen HLA-Klasse I/II-Antigene; =Spender spezifische Antikörper) und eine positive C4d-Ablagerung/ Anfärbung (Marker für eine humorale Abstoßungsreaktion) in der Biopsie vorhanden sein [15]. Unterteilt wird diese Kategorie weiterhin in

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Einleitung

„C4d-Ablagerung ohne morphologischen Beweis für eine akute Abstoßungsreaktion“,

„akute Antikörper vermittelte Abstoßungsreaktion“ und „chronisch aktive Antikörper vermittelte Abstoßungsreaktion“ [15]. Morphologisch ist das Vorhandensein von Entzündungszellen, wie z.B. neutrophile Granulozyten, im kapillären Randbereich und peritubulär wichtig [14].

Die Banff-Kategorie 3 ist für die Borderline-Abstoßungsreaktionen vorgesehen [15, 16]. Dabei handelt es sich um histopathologische Veränderungen, die „ver- dächtig“ auf eine akute T-Zell vermittelte Abstoßungsreaktion sind, das heißt einige, aber nicht alle Merkmale für eine solche Abstoßungsepisode besitzen (keine Intima-Arteriitis, aber milde Tubulitis und milde interstitielle Entzündungsinfiltration, siehe Kategorie 4) [15]. Borderline-Abstoßungsreaktionen sind daher auch nur im klinischen Kontext interpretierbar [16].

In die Kategorie 4 werden T-Zell vermittelte Abstoßungsreaktionen eingeordnet, nochmals unterteilt in akute (mit 3 Untergruppen je nach Schweregrad) und chronisch aktive [15]. Morphologische Grundlagen sind hierbei die interstitielle Entzündungsinfiltration durch mononukleäre Zellen (z.B. Monozyten), die Tubulitis und die Arteriitis, die in separaten Score-Tabellen in 4 Ausprägungen zu unterscheiden sind (teils semi-quantitativ) [15, 16].

Die 5. Banff-Kategorie beinhaltet chronische morphologische Veränderungen, die zu einer chronischen Transplantatdysfunktion führen [15]. Dazu gehören die interstitielle Fibrose und die tubuläre Atrophie in kortikalen Arealen, welche in 3 Schweregrade eingeteilt werden [15].

Die letzte Kategorie ist schließlich für Biopsien mit Veränderungen vorgesehen, die nicht auf eine akute und/ oder chronische Abstoßungsreaktion zurückzuführen sind [15, 16]. Als Beispiele seien hier zu nennen: nichtspezifische Veränderungen, wie z.B. eine fokale Entzündungsinfiltration ohne Tubulitis, eine akute Tubulusnekrose, eine akute interstitielle Nephritis, eine Papillennekrose und die rekurrierende renale Grunderkrankung [16].

In die aktuelle Banff ’07-Klassifikation wurde außerdem neben der bestehenden Einteilung für die interstitielle Entzündungsinfiltration [15, 16] noch ein neuer, ebenfalls semi-quantitativer Score für die „totale interstitielle Entzündungsinfiltration“

aufgenommen, der auch bisher als unspezifisch geltende Einzelinfiltrate und Infiltrate im subkapsulären Kortex, in perivaskulären Arealen und in Arealen mit interstitieller

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Einleitung

Fibrose und tubulärer Atrophie einbezieht [15]. Dieser neue Score spielt in der vorliegenden Arbeit eine Rolle.

1.6 Protokoll- und Indikationsbiopsien

Protokollbiopsien werden heute in Form von Protokollbiopsie-Programmen von vielen Nierentransplantat-Zentren, wie auch der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH), zum Monitoring nach Nierentransplantation durchgeführt [17]. Dabei werden die Biopsien prospektiv zu vordefinierten festen Zeiten, meist in den ersten Monaten nach Transplantation, unabhängig von der Nierentransplantatfunktion entnommen [18]. Der Hauptzweck dieser Biopsien ist der Versuch des wissenschaftlichen Verstehens der immunologischen Vorgänge im Transplantat über die Zeit, indem man diese mit der Nierenfunktion korreliert. Daraus lassen sich später eventuell therapeutische Maßnahmen ableiten [17, 18, 19]. Ebenso können schon vorhandene akute Abstoßungsreaktionen zu einer Zeit erkannt werden, in der eine therapeutische Intervention noch am effizientesten ist [17].

Im Gegensatz dazu werden Indikationsbiopsien bei bestimmten, meist vordefinierten, Indikationen vorgenommen [18], wie z.B. ein Kreatininanstieg im Serum oder der klinische Verdacht auf eine akute Abstoßungsreaktion.

Eine Biopsieentnahme dauert ungefähr 30 Minuten und wird ambulant durchgeführt, so dass die Patienten nach einem Beobachtungszeitraum von 4 Stunden wieder entlassen werden können [18, 19].

Die Durchführung einer Nierentransplantat-Biopsie gilt heute als weitgehend risikoarm [17, 18, 19]. Dies wird durch eine Ultraschall gesteuerte Punktion mit dünneren Biopsienadeln und das Verwenden von immer moderneren Biopsiegeräten erreicht [17, 19]. Dabei gelten automatische Biopsie-Schussgeräte als sicherer als die manuelle Nadel-Biopsie [18]. Des Weiteren liegt das Nierentransplantat näher an der Körperoberfläche als im Normalfall [17]. Ernste Komplikationen treten nur in ca.

0,4 bis 1% auf [17], wie z.B. schwere Blutungen, Makrohämaturie, Peritonitis, AV-Fisteln oder ein Transplantatverlust [18, 19]. Jedoch rechtfertigt nach heutiger Meinung der Erkennungsgewinn einer Protokollbiopsie die Inkaufnahme solcher Risiken und Komplikationen [18, 19].

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Problem- und Aufgabenstellung

2 Problem- und Aufgabenstellung

2.1 Problemstellung

Die progressive tubuläre Atrophie und die interstitielle Fibrose in einem Nierentransplantat als Ausdruck eines chronischen Transplantatschadens [14] sind die wichtigsten Hauptursachen für ein chronisches Organversagen nach erfolgreicher Nierentransplantation [20, 21]. Abgesehen von einer Vielzahl nicht-immunologischer Faktoren wie Hypertonie und vaskuläre Sklerose, werden ebenso die persistierende (sub-) klinische Entzündung und Abstoßungsreaktion für eine der Hauptursachen gehalten [13, 22].

Auch eine renale Ischämie wird als ein wichtiger Initiator für eine verzögerte Initialfunktion des Nierentransplantats und für akute Abstoßungsreaktionen gesehen [23]. Ebenso wird ein Ischämie-Reperfusionsschaden im Nierentransplantat, der nach Transplantation auftreten kann, in Zusammenhang mit anderen Faktoren auf lange Sicht für einen Trigger des chronischen Transplantatschadens gehalten [24].

Es wird ebenfalls angenommen, dass virale (z.B. CMV) als auch bakterielle (z.B. HWIs) Infektionen als Trigger für immunologische Episoden von Abstoßungs- reaktionen in Frage kommen, die dadurch einen chronischen Transplantatschaden aufrecht erhalten [3, 5].

Jedoch sind diese Wirkmechanismen bisher noch nicht hinreichend geklärt. Solche Infektionen und ischämische Schäden (letztere z.B. durch freie Radikale) könnten theoretisch persistierende endotheliale (vaskuläre) Mikroentzündungen verursachen, die nicht nur zu schneller eintretenden Schäden in den großen Gefäßen wie der Aorta führen könnten, sondern auch zur Arteriosklerose kleinerer Gefäße, wie z.B. in der transplantierten Niere, so dass ein chronischer Transplantatschaden begünstigt wird [3, 24].

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2.1.1 Toll-like-Rezeptoren in der Niere

Es wird vermutet, dass die Aktivierung der angeborenen Immunantwort durch die TLRs in die Entstehung und Progression renaler Transplantatabstoßungsreaktionen involviert ist [3, 5]. Einerseits eventuell durch exogene TLR-Liganden bei bakteriellen oder viralen Infektionen oder andererseits möglicherweise durch endogene TLR-Liganden wie Heat-Shock-Proteine, die z.B. nach ischämischen Schäden freigesetzt werden [5].

In der menschlichen Niere konnten bisher alle 10 humanen TLRs nachgewiesen werden [5, 6]. Dabei werden bis auf TLR-7 und TLR-9 alle auf renalen Epithelzellen exprimiert [5]. TLR-7 und TLR-9 sind nur auf systemischen infiltrierenden Zellen, wie z.B. Makrophagen, im Nierengewebe zu finden [5].

In der vorliegenden Arbeit wurden die Toll-like-Rezeptoren 2, 4 und 9 gewählt, da sie einerseits hierfür ein sehr passendes Ligandenprofil besitzen (TLR-2/4 besonders für Bakterien/ HWIs und endogene Strukturen, TLR-9 besonders für CMV und HWIs [6]) und andererseits über diese TLRs in Bezug auf die Lokalisation in der Niere und deren Assoziation zu besonders den in Kapitel 2.1 genannten renalen Erkrankungen bzw. Schäden bisher am meisten Daten vorhanden sind, welche nachfolgend kurz zusammengefasst werden.

Experimentelle Studien haben gezeigt, dass TLR-2 und TLR-4 auf tubulären Epithelzellen die Induktion einer Zytokin-Expression, wie z.B. TNF-α, als Ausdruck einer Entzündungsreaktion zu vermitteln scheinen, während TLR-9 in der Niere nur auf infiltrierenden Antigen präsentierenden Zellen während einer Immunbe- schädigung exprimiert zu werden scheint [5].

Bei Mäusen konnte die Expression von TLR-2, -4 und -9 mit akutem Nierenversagen (TLR-2 und -4), interstitieller Fibrose (TLR-2 und -4) und renaler Manifestationen systemischer Autoimmunerkrankungen (TLR-9, z.B. systemischer Lupus erythematodes) in Verbindung gebracht werden [3, 5, 23, 25].

In einem anderen Mausmodell wurde eine wesentliche renale Expression von TLR-2- und TLR-4-mRNS im Epithel von proximalen und distalen Tubuli in gesunden Nieren beobachtet und lokalisiert [26]. In dem gleichen Mausmodell war diese tubuläre Expression bei renalen sterilen Entzündungsreaktionen, ausgelöst durch eine induzierte Ischämie mit anschließender Reperfusion, deutlich gesteigert, und sie war

(18)

dabei prominenter als auf infiltrierenden Zellen (Makrophagen) in der Niere [26].

Ebenso war das TLR-4-Protein nach Reperfusion erhöht [26].

In einer anderen Studie wurde eine renale TLR-2-Expression als ein wichtiger Initiator entzündlicher Prozesse identifiziert, die zu Nierendysfunktion nach einem Ischämie-Reperfusionsschaden führten [23].

In einem Lupus-nephritis-Mausmodell führte eine Injektion des TLR-9-Liganden (bakterielle CpG-DNS) zu einer erhöhten renalen Expression von TLR-9 mit einer anschließenden Freisetzung inflammatorischer Chemokine [25]. Dies war mit progressiver Glomerulonephritis, interstitieller Fibrose und Proteinurie assoziiert [25], also Phänomenen, die teilweise auch bei einem chronischen Transplantatschaden beobachtet werden [15].

2.2 Aufgabenstellung

In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen einer TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression in unterschiedlichen Nierengewebskompartimenten und dem Infektionsstatus, der Transplantatfunktion und akuten Abstoßungsreaktionen nach Leichennierenspenden untersucht.

Es wurden von 206 Patienten 257 Protokollbiopsien, die 6 Wochen, 3 und 6 Monate nach Transplantation erfolgten, und zusätzlich 108 Indikationsbiopsien, die zwischen Transplantation und 12 Monate nach der Transplantation durchgeführt wurden, ausgewertet.

Die TLR-Expression wurde mit der Langzeitfunktion des Nierentransplantats anhand des Serum-Kreatinins, mit akuten zellulären Abstoßungsreaktionen nach der Banff-Klassifikation und mit Harnwegsinfektionen (HWIs) sowie Infektionen durch Cytomegalie-Viren (CMV) korreliert. Zusätzlich wurde ein möglicher Zusammenhang mit dem Auftreten initialer Nichtfunktionen des Transplantats, der kalten Ischämiezeit, dem Vorhandensein/ Fehlen von Spender spezifischen Antikörpern und der Art der durchgeführten Behandlung mit Calcineurin-Inhibitoren getestet. Das Ziel war die Untersuchung eines möglichen Zusammenhangs zwischen einer TLR-Expression im Gewebe des Transplantats und dessen Funktion.

(19)

Patienten, Material und Methoden

3 Patienten, Material und Methoden

3.1 Patienten

Im Transplantationszentrum der Medizinischen Hochschule Hannover werden seit 12/2000 Nierentransplantat-Protokollbiopsien in standardisierter Weise 6 Wochen (K1), 3 (K2) und 6 (K3) Monate nach Nierentransplantation durchgeführt.

Das Kollektiv für die vorliegende Arbeit bestand aus Patienten mit folgenden Merkmalen:

• Teilnahme am Protokollbiopsie-Programm

• Alter zwischen 18 und 75 Jahren bei Nierentransplantation (NTx)

• alleinige Nierentransplantation (keine kombinierten Transplantationen) an der MHH innerhalb der letzten 2 Jahre

• Follow-up-Zeit nach NTx ≥ 24 Monate vorhanden.

Von diesen Patienten, die an dem Programm teilnahmen, wurden nach deren Aufklärung und Einwilligungserklärung klinische und demographische Daten aus der Zeit vor und zum Zeitpunkt der Transplantation erhoben. Klinische Daten und die Laborergebnisse nach Transplantation wurden prospektiv zu den drei Probeentnahmezeitpunkten sowie jährlich danach erhoben.

Alle Daten wurden in eine Datenbank (Oracle Enterprises, Version 8.0.5) eingegeben. Die Erhebung und Verwendung der Daten wurde von den Patienten durch deren Einwilligung sowie von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt.

Für die vorliegende Arbeit wurde eine Untergruppe von Patienten ausgewählt, bei denen jeweils 6, 12 und 24 Monate nach Transplantation ein Kreatininwert im Serum vorhanden war oder Information über ein mögliches Transplantatversagen vorlag.

Darüber hinaus wurde folgender Satz an klinischen Daten/ Parametern analysiert:

(20)

• Geschlecht

• Alter

• renale Grunderkrankung

• letztes chronisches Dialyseverfahren

• Anzahl der Nierentransplantationen

• CMV-Konstellation Spender/ Empfänger

• kalte Ischämiezeit

• Initialfunktion des Transplantats ja/ nein

• Induktionstherapie und Immunsuppression zum Zeitpunkt der NTx

• Anzahl der Harnwegs- und CMV-Infektionen

• Vorhandensein/ Fehlen Spender spezifischer Antikörper

• Anzahl und Art der durch Biopsien nachgewiesenen Abstoßungsreaktionen, totale interstitielle Entzündungsinfiltration im Kortex des Transplantats (beides nach der Banff-Klassifikation)

Weitreichende Vergleiche zwischen der ausgewählten Patientengruppe und der Gesamtheit der in der Datenbank erfassten Patienten in Hinblick auf demographische Daten und jene Parameter, die für die späteren Analysen benutzt wurden, bestätigten, dass diese Untergruppe repräsentativ für die Grundgesamtheit war.

3.2 Material und Methoden 3.2.1 Biopsien

Analysiert wurden 257 Protokollbiopsien, die 6 Wochen [K1; n = 75], 3 Monate (K2; n = 91) und 6 Monate (K3; n = 91) nach der Transplantation durchgeführt wurden, sowie 108 aus definierten Gründen entnommene Indikationsbiopsien (I). Zu diesen Gründen gehörte z.B. ein unklarer Anstieg des Kreatinins im Serum >15% seit der vorangegangenen Vorstellung und/ oder der Verdacht auf eine akute Abstoßungsreaktion.

(21)

Am Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten und semidünn geschnittenen Material wurden drei Färbemethoden angewendet, die in der Routine der histopathologischen Untersuchung von Nierenbiopsien üblich sind [15, 16]. Dies waren die Hämatoxylin- Eosin- (Übersichtsfärbung), die PAS- (perjodic acid Schiff-Reaktion, Nachweis von Kohlenhydraten) und die C4d-Färbung (Komplement-Spaltprodukt, diagnostischer Marker für eine humorale Abstoßungsreaktion [15]). Bei letzterer wurde ein marktübliches polyklonales antihumanes Antiserum eines Kaninchens [13]

verwendet.

3.2.2 Immunhistochemie

Der immunhistochemische Nachweis der TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Rezeptoren wurde am Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten und semidünn geschnittenen Material durchgeführt.

Für die Antigendemaskierung (TLRs) wurden die Serienschnitte vorab entweder einer Hitzebehandlung (Mikrowelle, 30min, mit Citratpuffer, pH 7.2) oder einer enzymatischen Vorbehandlung (Protease XXIV, 10min) unterzogen.

Zum Einsatz kamen anschließend primäre Antikörper gegen TLR-2 (1:150), gegen TLR-4 (1:100) und gegen TLR-9 (1:70) (polyklonale Kaninchen-Antiseren; alle Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA). Diese wurden mit den Serienschnitten über Nacht bei 4°C inkubiert und am nächsten Tag durch ein Tyramin amplifiziertes und auf Avidin/ Biotin basierendem Protokoll [27, 28]

detektiert.

Bei der Avidin-Biotin-Enzymkomplex-Technik bindet das Glykoprotein Avidin (z.B. im Hühnereiweiß enthalten) an Biotin (wasserlösliches Vitamin H), welches seinerseits an einen sekundären Anti-Antikörper gegen den primären TLR-Antikörper gebunden ist [27]. Mit Zusatz des Substrates Fuchsin entsteht schließlich enzymatisch eine Farbreaktion [27] (siehe Abbildung 1).

Die Tyramin-Amplifikationstechnik dient dabei der Signalverstärkung, da das zuvor biotinylierte (biotinmarkierte) Tyramin (biogenes Amin der Aminosäure Tyrosin) durch die Reaktion von Peroxidase, gebunden an den sekundären TLR-Anti-Antikörper, mit Wasserstoffperoxid „radikalisiert“ bzw. „bindungswillig“ wird und daraufhin kovalent

(22)

an Gewebemoleküle in der Nähe dieser zuvor markierten Antikörpern bindet [27, 28].

Dabei dient das Biotin auf dem im Gewebe gebundene Tyramin als Tracermolekül, welches von der Avidin-Biotin-Enzymkomplex-Technik zusätzlich mit sichtbar gemacht und somit das Signal verstärkt werden kann bzw. es kleinere Mengen von Antikörpern verwendet werden und damit unspezifische Bindungen gegebenenfalls reduziert werden können [27].

Um diese beiden Techniken zusammen nutzen zu können, wird das Gewebematerial (TLR-Antigene) zunächst mittels Inkubation mit dem primären TLR-AK gekoppelt.

Anschließend wird mit dem biotinylierten sekundären TLR-Anti-AK, der an den Primär-AK bindet, und einem Peroxidase markierten Avidin-Komplex, der wiederum an den Sekundär-AK bindet, inkubiert [27]. Nachfolgend schließt sich die Inkubation mit dem biotinylierten Tyramin und Wasserstoffperoxid an, und zuletzt wird das Substrat für die Farbreaktion hinzugesetzt [27] (siehe Abbildung 1).

Fuchsin Farbreaktion

Abbildung 1: Zusammenwirken der Tyramin-Amplifikationstechnik und der Avidin-Biotin-Enzymkom- plex-Technik zur Erzeugung einer Farbreaktion als Nachweis der TLRs. Rot: TLR-Antigen, braun:

primärer TLR-AK, grau: sekundärer TLR-Anti-AK, gelb: Tyramin, pink: Peroxidase, blau: Biotin, grün:

Avidin.

Die Negativkontrollen für alle immunhistochemischen Färbungen wurden durchgeführt, indem der Primärantikörper weggelassen und stattdessen nur mit Citratpuffer inkubiert wurde.

H₂O₂

Gewebe- oberfläche

(23)

3.2.3 Auswertung

Die Auswertung erfolgte semiquantitativ nach der Banff-Klassifikation [14], siehe Kapitel 1.5.

Zur Bewertung der gefärbten Schnitte wurden die folgenden morphologischen Kompartimente der Nierentransplantatbiopsien getrennt auf das Vorhandensein (das heißt positiv) oder Fehlen (das heißt negativ) von TLR-2, TLR-4 und TLR-9 untersucht. Proximale und distale Tubuli mit einem granulären Zytoplasma-Färbungsmuster und Arteriolen mit einer granulären Färbung in der Gefäßwand.

Bei den Tubuli musste mindestens ein Bildausschnitt von drei benachbarten tubulären Anschnitten eine granuläre zytoplasmatische TLR-2-, TLR-4- oder TLR-9-Färbung zeigen, um einen Fall als positiv zu definieren, während aufgrund der geringen Frequenz ein einzelner Anschnitt einer Arteriole mit einer granulären Färbung ausreichend war.

3.3 Statistikmethoden

Das statistische Softwareprogramm SPSS wurde in Version 12.0.1 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) für die statistische Analyse benutzt.

Zunächst erfolgte mittels SPSS eine Plausibilitätskontrolle der Variablen (Parameter, Daten) aus der Datenbank, die für die vorliegende Arbeit benötigt und zuvor ausgesucht wurden. Dazu wurden Regeln und statistische Bedingungen für die einzelnen Variablen aufgestellt, so dass fehlende und nicht plausible bzw. fehlerhafte Werte von Patienten in der Datenbank ausfindig gemacht werden konnten, z.B.

Männer mit mehr als 0 Schwangerschaften, das Geburtsdatum ist größer als das Tx-Datum oder nicht plausible kalte Ischämiezeiten (außerhalb bestimmter Grenzwerte). Diese Fälle (Patienten) wurden daraufhin eliminiert und gingen somit nicht in die eigentliche Datenanalyse/ Korrelation ein, die nachfolgend durchgeführt wurde.

(24)

Der Vergleich der kategorischen Daten zwischen den Gruppen (Variablen) und den unterschiedlichen Biopsie-Entnahmezeitpunkten wurde mit dem Chi-Quadrat-Test für zwei oder mehr Proben durchgeführt. Die numerischen Daten wurden mit Hilfe des t-Tests (Hypothesentest mit t-verteilter Testprüfgröße) und einer einfachen Varianzanalyse oder mit dem u-Test nach Mann-Whitney und dem Kruskal-Wallis-Test verglichen, je nach Ergebnis der Analyse auf Normalverteilung.

Numerische Daten wurden, soweit nicht anders aufgeführt, als Mittelwerte mit der Standardabweichung angegeben.

Die Korrelationsanalyse wurde mit dem Spearman-Rank-Test durchgeführt.

Unterschiede mit p<0.05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

(25)

Ergebnisse

4 Ergebnisse

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden im American Journal of Nephrology veröffentlicht [29] (siehe 9.4 im Anhang).

4.1 Patientenkollektiv

Insgesamt wurden 365 Nierenbiopsien von 206 Nierentransplantat-Empfängern (Nichtlebendspenden) untersucht, unterteilt in 257 Protokoll- und 108 Indikations- biopsien. Letztere wurden im Mittel nach 8 Monaten durchgeführt.

Das Durchschnittsalter der Kohorte lag bei 48.9 ± 13.8 Jahre, davon waren 125 (61%) Patienten männlich.

Die renale Grunderkrankung, die zur terminalen Niereninsuffizienz führte, war bei 63 (31%) Patienten eine Glomerulonephritis/ Vaskulitis, bei 27 (13%) eine tubulo- interstitielle Erkrankung, bei 24 (12%) Patienten eine kongenitale Erkrankung, bei 14 (7%) eine hypertensive/ diabetische Nephropathie und bei 12 (6%) Patienten eine sonstige nicht näher bezeichnete Erkrankung. Bei 64 (31%) Patienten war die renale Grunderkrankung nicht bekannt.

Das Nierenersatzverfahren vor der Transplantation war bei 188 (91%) Patienten die Hämodialyse, die übrigen Patienten wurden mit der Peritonealdialyse behandelt.

Für 182 (88%) Patienten war es die erste, für 23 (11%) die zweite und für einen Patienten die dritte Nierentransplantation.

100 (63%) Patienten erhielten die Niere eines CMV positiven Spenders, 117 (57%) Empfänger waren selbst CMV positiv. Im ersten Jahr nach Transplantation hatten 66 (32%) Patienten eine oder mehrere CMV-Infektionen und 65 (31.6%) einen oder mehrere Harnwegsinfektionen (HWIs). Davon hatten 23 (11%) Patienten beide Infektionen zusammen und insgesamt 98 (48%) weder die eine noch die andere.

Die mittlere kalte Ischämiezeit war 16.2 ± 2.1 Stunden, bei 68 (33%) Patienten bestand eine initiale Nichtfunktion des Transplantats.

Als immunsuppressive Induktionstherapie erhielten 171 (83%) Patienten Interleukin-2-Antikörper (Basiliximab, Daclizumab), während 20 (10%) Patienten Antithymozytenglobulin erhielten. Zur Erhaltungstherapie bekamen 203 Patienten (99%) Steroide, 183 (89%) Patienten erhielten zusätzlich Cyclosporin A

(26)

Ergebnisse

oder Tacrolimus und 101 (49%) Patienten als drittes Immunsuppressivum Mycophenolatmofetil bzw. 4 (2%) Sirolimus.

4.2 TLR-2-, TLR-4-, und TLR-9-Expression im Transplantatgewebe

TLR-2 TLR-4 TLR-9

Abbildung 2: Immunhistochemische Darstellung von TLR-2, TLR-4 und TLR-9 in einer Protokoll- biopsie in verschiedenen Nierengewebskompartimenten: proximale Tubuli (A = TLR-2, B = TLR-4, C = TLR-9), distale Tubuli (D = TLR-2, E = TLR-4, F = TLR-9) und Nierenarteriolen (G = TLR-2, H = TLR-4, J = TLR-9). Zu erkennen ist ein diffuses granuläres Zytoplasmafärbungsmuster mit variabler Intensität (Pfeile). Vergrößerung 400fach.

(27)

Ergebnisse

Die Expression aller drei TLRs konnte im Nierengewebe der transplantierten Organe nachgewiesen werden: in den proximalen Tubuli (Abbildung 2, A-C), den distalen Tubuli (Abb. 2, D-F), sowie in den Arteriolen (Abb. 2, G-J). Die TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression variierte jedoch hinsichtlich der drei verschiedenen untersuchten Nierengewebskompartimente.

Über die Zeit (K1-3, I) konnte dagegen für TLR-2 eine relativ konstante Expression festgestellt werden, was in Tabelle 2 dargestellt ist.

Tabelle 2: TLR-2-Expression in proximalen Tubuli, distalen Tubuli und in Arteriolen zu verschiedenen Entnahmezeitpunkten der Protokollbiopsien, das heißt 6 Wochen (K1), 3 Monate (K2) und 6 Monate (K3) nach Transplantation und in Indikationsbiopsien (I).

K1-Biopsien (6 Wochen)

K2-Biopsien (3 Monate)

I-Biopsien

Prox. Tubuli - TLR-2 positiv - TLR-2 negativ

44.0%

56.0%

44.0%

56.0%

51.6%

48.4%

42.6%

57.4%

Distale Tubuli - TLR-2 positiv - TLR-2 negativ

50.7%

49.3%

42.9%

57.1%

39.6%

60.4%

46.3%

53.7%

Arteriolen - TLR-2 positiv - TLR-2 negativ

54.7%

45.3%

60.4%

39.6%

56.0%

44.0%

50.0%

(28)

Ergebnisse

Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen wurde eine sehr konstante Expression der untersuchten TLRs über die Zeit bei denjenigen Patienten festgestellt, von denen zu allen drei Protokollbiopsiezeitpunkten Biopsien vorhanden waren (n = 44). Als reprä- sentatives Beispiel wird hier die TLR-2-Expression in den proximalen Tubuli zu unterschiedlichen Entnahmezeitpunkten bei einem Nierentransplantat-Empfänger gezeigt (Abbildung 3).

Abbildung 3: Immunhistochemische Darstellung von TLR-2 in proximalen Tubuli von aufeinander folgenden Protokollbiopsien eines nierentransplantierten Patienten. Protokollbiopsien nach A = 6 Wochen (K1), B = 3 Monaten (K2) und C = 6 Monaten (K3). Pfeile = Färbung. Vergrößerung 400fach.

Wie oben erwähnt und in Tabelle 3 dargestellt, variierte die individuelle positive Korrelation der TLR-2-, TLR-4- oder TLR-9-Expression in den verschiedenen Nierengewebsarealen untereinander (also in den proximalen und distalen Tubuli sowie den Nierenarteriolen) zu unterschiedlichen Zeitpunkten, das heißt zu allen drei Protokollbiopsien und den Indikationsbiopsien.

Für die TLR-2-Expression wurde eine hohe konstante positive Korrelation zwischen den proximalen und den distalen Tubuli und zwischen beiden Tubuli und den Nierenarteriolen festgestellt (p<0.001 bis p<0.0001). Dies galt jedoch nicht für die TLR-4- und TLR-9-Expression (am häufigsten p<0.05 bzw. nicht signifikant). Diese Ergebnisse bestanden für alle Protokollbiopsiezeitpunkte wie auch für die Indikationsbiopsien.

(29)

Ergebnisse

Tabelle 3: Korrelation der TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression zu allen Biopsieentnahme- zeitpunkten in verschiedenen Nierengewebskompartimenten, das heißt in proximalen (P) und distalen (D) Tubuli und in der Nierenarteriolen (A).

* = p<0.05, ** = p<0.001, *** = p<0.0001, n. s. = nicht signifikant.

K1- Biopsien (6 Wochen)

K2- Biopsien (3 Monate)

K3- Biopsien (6 Monate)

Alle

K-Biopsien I-Biopsien

TLR-2

P-D ** *** *** *** ***

TLR-2

P-A ** ** *** *** **

TLR-2

D-A ** *** *** *** ***

TLR-4

P-D * n. s. * ** n. s.

TLR-4

P-A n. s. n. s. * n. s. n. s.

TLR-4

D-A * * ** *** n. s.

TLR-9

P-D ** * * *** **

TLR-9

P-A n. s. n. s. ** ** n. s.

TLR-9

D-A n. s. * *** *** n. s.

4.3 TLR-2-, TLR-4, und TLR-9-Expression und Transplantatfunktion

Die kombinierte tubuläre TLR-2-Expression, also proximale und distale Tubuli zusammen (jedoch ohne vaskuläre TLR-2-Expression), stand in den Protokoll- biopsien zu allen Entnahmezeitpunkten in signifikantem Zusammenhang (p<0,01) mit einer besseren Nierentransplantatfunktion. Dies beinhaltet eine niedrigere Kreatininkonzentration im Serum 6, 12, und 24 Monate nach Transplantation im Vergleich zu Transplantaten, in denen keine TLR-2-Expression nachweisbar war.

(30)

Ergebnisse

Wie in Tabelle 4 gezeigt, war dieses besonders für die TLR-2-Expression in den distalen Tubuli evident (p = 0.006, 0.017, 0.022), während der Zusammenhang zwischen der TLR-2-Expression in den proximalen Tubuli und der Transplantat- funktion grenzwertig signifikant war (p = 0.052, 0.051, 0.067).

Tabelle 4: TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression in Protokollbiopsien und Nierentransplantatfunktion, das heißt Serum-Kreatininkonzentration 6, 12 und 24 Monate nach Transplantation (Tx).

6 Monate nach Tx 12 Monate nach Tx 24 Monate nach Tx Serum-

Kreatinin

(µmol/L) p-Wert

Serum- Kreatinin

(µmol/L) p-Wert

Serum- Kreatinin

(µmol/L) p-Wert TLR-2 prox.

- positiv - negativ

141 ± 60 164 ± 64

0.052 136 ± 46 159 ± 55

0.051 149 ± 76 166 ± 54

0.067

TLR-2 distal - positiv - negativ

129 ± 44 167 ± 68

0.006 132 ± 49 157 ± 51

0.017 136 ± 52 171 ± 73

0.022

TLR-4 prox.

- positiv - negativ

165 ± 58 148 ± 62

0.185 173 ± 67 139 ± 44

0.045 179 ± 97 149 ± 53

0.271

147 ± 52 153 ± 65

0.960 152 ± 61 144 ± 46

0.731 159 ± 88 154 ± 53

0.507

TLR-9 prox.

- positiv - negativ

151 ± 68 152 ± 59

0.722 148 ± 60 146 ± 47

0.799 157 ± 89 156 ± 54

0.571

149 ± 55 153 ± 66

0.997 148 ± 56 146 ± 48

0.969 162 ± 85 152 ± 85

0.975

(31)

Ergebnisse

Ebenso wurde ein signifikant (p<0.05) geringeres Auftreten initialer Nichtfunktionen von Transplantaten mit nachgewiesener TLR-2-Expression in den proximalen Tubuli gefunden, jedoch nicht in den distalen Tubuli (p = 0.22).

Des Weiteren wurde in den Protokollbiopsien 6 Wochen nach Transplantation (K1) ein signifikanter Zusammenhang zwischen der tubulären TLR-2-Expression im Transplantatgewebe und bioptisch nachgewiesenen akuten zellulären Abstoßungsreaktionen (einschließlich aller Fälle mit mindestens einer Borderline-Abstoßungsreaktion nach der Banff-Klassifikation) gefunden (p = 0.037), das heißt eine nachweisbare TLR-2-Expression stand mit einer niedrigeren Inzidenz akuter zellulärer Abstoßungsreaktionen in der selben Biopsie in Zusammenhang (siehe Tabelle 5).

Tabelle 5: Beziehung zwischen der TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression in proximalen und distalen Tubuli und der Inzidenz von akuten zellulären Abstoßungsreaktionen zu allen Biopsie- entnahmezeitpunkten, wobei mindestens eine Borderline-Abstoßungsreaktion vorlag.

I-Biopsien

TLR-2 prox. p = 0.063 p = 0.139 p = 0.436 p = 0.575

TLR-2 distal p = 0.037 p = 0.219 p = 0.058 p = 0.214 TLR-4 prox. p = 0.267 p = 0.218 p = 0.509 p = 0.283 TLR-4 distal p = 0.350 p = 0.294 p = 0.777 p = 0.508 TLR-9 prox. p = 0.118 p = 0.450 p = 0.777 p = 0.469

TLR-9 distal p = 0.447 p = 0.159 p = 0.177 p = 0.215

(32)

Ergebnisse

Da akute zelluläre Abstoßungsreaktionen nach der Banff-Klassifikation unter anderem anhand von semi-quantitativen (prozentualen) Schwellenwerten für interstitielle Entzündungsinfiltrationen im Kortex diagnostiziert werden, wobei nicht das gesamte Nierengewebe einbezogen wird (ohne Einzelinfiltrate, Infiltrate im subkapsulären Kortex, in perivaskulären Arealen und in Arealen mit interstitieller Fibrose und tubulärer Atrophie), werden diese Werte in Protokollbiopsien von stabilen allogenen Nierentransplantaten häufig nicht überschritten. Daher wurde die TLR-Expression hier zusätzlich noch mit dem Prozentsatz an totaler interstitieller Entzündungsinfiltration im Kortex (siehe Kapitel 1.5) verglichen. Dabei zeigte sich in den frühen Protokollbiopsien nach 6 Wochen (K1), dass Biopsien mit einer TLR-2-Expression in den proximalen Tubuli signifikant mehr entzündliche Infiltrate aufwiesen (durchschnittlicher Prozentsatz des entzündlich infiltrierten Nierenkortex 3.33% in TLR-2 negativen gegen 8.75% in TLR-2 positiven Biopsaten; p=0.004;

siehe Tabelle 6).

Tabelle 6: Korrelation zwischen der TLR-2-Expression in proximalen und distalen Tubuli zu K1-K3 und dem durchschnittlichen Prozentsatz an totaler interstitieller Entzündungsinfiltration im Kortex.

K3-Biopsien (6 Monate) totale

interstit.

entzündl.

Infiltration (%)

p-Wert

totale interstit entzündl.

Infiltration (%)

p-Wert

totale interstit.

entzündl.

Infiltration (%)

p-Wert

TLR-2 proximal

positiv

8.75 0.004 8.68 0.372 6.34 0.496

negativ

3.33 6.86 5.73

TLR-2 distal positiv

4.95 0.124 7.95 0.953 7.03 0.213

TLR-2 distal negativ

6.41 7.42 5.40

(33)

Ergebnisse

Es sei jedoch angemerkt, dass die durchschnittliche interstitielle Entzündungs- infiltration in beiden Gruppen unter dem Banff-Schwellenwert für die Diagnose einer Borderline-Abstoßungsreaktion lag. Alle anderen getesteten Zusammenhänge zwischen einer TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression und einer totalen interstitiellen entzündlichen Infiltration im Kortex zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede.

Auch konnte keine Korrelation zwischen der TLR-2-Expression in jeglichen Kompartimenten und der kalten Ischämiezeit, dem Vorhandensein/ Fehlen von Spender spezifischen Antikörpern, der Art der durchgeführten Behandlung mit Calcineurin-Inhibitoren (Cyclosporin A oder Tacrolimus) aufgrund einer möglichen Calcineurintoxizität oder dem Infektionsstatus, wie Harnwegs- oder CMV-Infektionen, festgestellt werden.

Für TLR-4 und TLR-9 wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Expression in den proximalen und distalen Tubuli und der Transplantatfunktion, initialen Nichtfunktionen, akuten zellulären Abstoßungsreaktionen und CMV- sowie Harnwegsinfektionen gefunden. Ebenso gab es keine Beziehung zwischen TLR-4 und TLR-9 und den oben genannten getesteten Parametern für TLR-2.

Genauso wenig gab es einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Expression der drei untersuchten TLRs und einer C4d-Ablagerung (humorale Abstoßungs- reaktion [15]) im Transplantatgewebe.

Die TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression in den Nierenarteriolen zeigte weder mit der Transplantatfunktion noch mit akuten bioptisch gesicherten zellulären Abstoßungsreaktionen eine signifikante Korrelation. Dies lag wahrscheinlich an der begrenzten Anzahl auswertbarer Proben, da in 30-47% der immunhistochemisch gefärbten Schnitte keine Arteriolen vorhanden waren.

In Tabelle 7 wird als Beispiel die oben genannte Beziehung zwischen der TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression und dem Infektionsstatus zum Zeitpunkt K3 gezeigt (keine signifikanten p-Werte, p>0.05). „Zu K3“ bedeutet eine CMV-Infektion im Intervall seit dem letzten Besuch (K2) und eine Harnwegsinfektion aktuell zum Biopsieentnahmezeitpunkt (nicht im Intervall).

(34)

Ergebnisse

Tabelle 7: Korrelation zwischen der TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression in proximalen und distalen Tubuli und dem Infektionsstatus (CMV, HWI) zum Biopsieentnahmezeitpunkt K3.

CMV HWI

positiv negativ positiv negativ

n 7 40 4 30

% 14.9 85.1 11.8 88.2

positiv

p-Wert 0.760 1.000

n 7 29 1 23

% 19.4 80.6 4.2 95.8

p-Wert 0.207 0.251

n 2 15 2 7

% 11.8 88.2 22.2 77.8

positiv

p-Wert 1.000 0.260

n 2 23 3 14

% 8 92 17.6 82.4

p-Wert 0.497 0.427

n 4 23 2 15

% 14.8 85.2 11.8 88.2

positiv

p-Wert 0.746 1.000

n 5 29 5 22

% 14.7 85.3 18.5 81.5

p-Wert 1.000 0.248

(35)

Diskussion

5 Diskussion

5.1 Die Rolle von TLR-2 im Nierentransplantatgewebe

In der vorliegenden Arbeit wurde bei nierentransplantierten Patienten die TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Expression in verschiedenen Nierengewebskompartimenten in seriellen Transplantat-Biopsien untersucht, die in einem standardisierten Verfahren während eines Protokollbiopsie-Programms nach 6 Wochen, 3 und 6 Monaten nach Nierentransplantation oder aufgrund von vordefinierten Indikationen gewonnen wurden.

Während die Expression von TLR-4 und TLR-9 in allen drei untersuchten Nierengewebsbereichen und über die Zeit (K1-K3, I) hochvariabel war, konnte eine konstante TLR-2-Expression in den proximalen und distalen Tubuli und in den Nierenarteriolen sowie über die Zeit gezeigt werden. Diese Befunde könnten auf eine potentielle pathophysiologische Rolle von TLR-2 in der Immunantwort auf Nieren- transplantate hindeuten.

In der Tat wird TLR-2 für einen wichtigen Initiator entzündlicher Reaktionen gehalten, die zu Nierendysfunktion nach Ischämie-Reperfusionsschäden führen [23], wobei man annimmt, dass dieses über endogene Liganden (Heat-Shock-Proteine) von TLR-2 vermittelt wird [5, 23].

TLR-2 scheint außerdem in experimentellen Studien an Mäusen innerhalb der Niere die Zytokin-Expression, wie z.B. TNF-α, durch renale tubuläre Epithelzellen zu vermitteln [5]. Solche immunologischen Phänomene könnten zu Nierendysfunktion nach Transplantation beitragen und langfristig einen chronischen Transplantat- schaden verursachen [5, 30].

Im Gegensatz zu diesen Annahmen, die auf Daten aus experimentellen Studien basieren, wurde in der vorliegenden Arbeit jedoch festgestellt, dass eine TLR-2-Expression im humanen Nierentransplantatgewebe mit einem besseren Langzeitergebnis des Transplantats (anhand des Serum-Kreatinins) assoziiert ist.

Für diese Beobachtung kann bislang noch keine pathophysiologische Erklärung gegeben werden. Es handelt sich jedoch um einen validen Befund, der in einer

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relativ großen Population von Patienten mit Beobachtung der Nierentransplantat- funktion bis zu 24 Monate nach Transplantation gewonnen wurde.

Ein weiterer interessanter Befund, der möglicherweise darauf hinweist, dass TLR-2 die Immunantwort in Nierentransplantaten eher im günstigen Sinne moduliert, war der Zusammenhang zwischen der positiven TLR-2-Expression in den distalen renalen Tubuli und einem geringeren Auftreten von akuten zellulären Abstoßungs- reaktionen (signifikant in den frühen Biopsien nach 6 Wochen und fast signifikant in den späten Biopsien nach 6 Monaten). Auf diese Modulation könnte auch die niedrigere Inzidenz initialer Nichtfunktionen hindeuten, die in Transplantaten mit einer TLR-Expression in proximalen Tubuli nachzuweisen war. Bisher wurde jedoch die Meinung vertreten, dass eine renale Ischämie (über die TLRs) zu einem vermehrten Auftreten von initialen Nichtfunktionen führt [23]. Gegen diese Meinung könnte auch sprechen, dass keine Korrelation zwischen der TLR-2-Expression im Nieren- transplantatgewebe und der kalten Ischämiezeit festgestellt wurde.

Es wurde zwar beobachtet, dass die frühen Protokollbiopsien nach 6 Wochen mit einer TLR-2-Expression in den proximalen Tubuli mehr interstitielle Entzündungs- infiltrationen im gesamten Kortex aufwiesen als die TLR-2 negativen zu diesem Biopsiezeitpunkt, jedoch lag das Ausmaß an dieser totalen interstitiellen entzündlichen Infiltration in beiden Gruppen unterhalb des aktuellen diagnostischen Banff-Schwellenwertes [15] für eine Abstoßungsreaktion, z.B. einer Borderline- Abstoßungsreaktion. Somit kann diese Feststellung hier nicht als Beweis dafür angesehen werden, dass TLR-2 in die Entstehung und Progression von Abstoßungsreaktionen verwickelt ist, wie bisher angenommen [3, 5], sondern sie unterstützt eher die oben genannte Annahme.

Diese Befunde und das bessere Langzeitergebnis hinsichtlich der Funktion von TLR-2 exprimierenden Nierentransplantaten könnten darauf hindeuten, dass eine Expression von TLR-2 im Nierentransplantatgewebe die Immunantwort des Empfängers im positiven Sinne moduliert. Jedoch konnte nicht geklärt werden, ob die TLR-2-Expression die Ursache oder die Folge einer besseren Nierenfunktion ist.

Ebenso besteht auch weiterhin Uneinigkeit darüber, ob subklinische/ minimale Infiltrate in renalen Protokollbiopsien die gleiche Bedeutung (Qualität) besitzen wie solche, die in Biopsien von Transplantaten mit einer schlechten Funktion beobachtet werden [31, 32].

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Der Befund für TLR-4 ist insofern interessant, als dass kein signifikanter Zusammenhang zwischen der TLR-4-Expression im Nierentransplantatgewebe und akuten zellulären Abstoßungsreaktionen oder der Transplantatfunktion (anhand des Serum-Kreatinins) aufgezeigt werden konnte.

Die bisher zu diesem Thema veröffentlichten Ergebnisse sind eher rar sowie teilweise widersprüchlich und werden im Folgenden kurz zusammengefasst.

Für das TLR-4-Gen sind bislang zwei Einzelstrangnukleotid-Polymorphismen, Asp299Gly und Thr399Ile, bekannt [5, 33, 34]. Daraus ergeben sich funktionelle Konsequenzen für TLR-4, die sich in einer verminderten Kapazität bemerkbar machen, nach Ligandenkontakt eine entzündliche Reaktion zur Immunabwehr auslösen zu können [5, 33, 34].

In einer Studie [33] wurde das Vorhandensein dieser Polymorphismen bei Nierentransplantatempfängern in Bezug auf das Auftreten akuter Abstoßungs- reaktionen untersucht. Dabei wiesen von 238 Patienten 27 (11%) die TLR-Polymorphismen auf, bei denen gleichzeitig eine niedrigere Inzidenz akuter Abstoßungsreaktionen ermittelt werden konnte. Jedoch war bei diesen 27 Patienten auch ein deutlicher Anstieg von schweren Infektionen zu verzeichnen.

In einer anderen Studie [34] wurden 122 Nierentransplantatempfänger, die Transplantate von Spendern mit TLR-4-Polymorphismen bekamen, in Bezug auf das Auftreten akuter Abstoßungsreaktionen untersucht. Dabei erhielten 20 Patienten solche Transplantate und wiesen ebenso ein geringeres Auftreten von akuten Abstoßungsreaktionen auf. Ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten akuter Abstoßungsreaktionen und TLR-4-Polymorphismen bei den Empfängern konnte hier nicht aufgezeigt werden.

Da diese TLR-4-Polymorphismen jedoch in beiden Studien in der DNA aus Leukozyten des zirkulierenden Blutes, also aus systemischen infiltrierenden Immun- zellen nachgewiesen wurden (durch die Polymerasekettenreaktion), könnte dieser Ansatz weniger informativ sein als die direkte Untersuchung des Zielgewebes, das heißt die TLR-4-Anfärbung im Nierentransplantatgewebe.

In einer weiteren kleineren Studie [35] an 38 Herztransplantationspatienten wurde eine erhöhte TLR-4-Expression auf zirkulierenden Monozyten mit dem Auftreten

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endothelialer Dysfunktionen assoziiert, die die Entwicklung eines chronischen Transplantatschadens begünstigen.

Hier wird noch einmal darauf hingewiesen, dass diese Rolle von TLR-4 in der vorliegenden Arbeit durch eine direkte Färbung der TLR-4-Expression im Zielgewebe, nämlich im Nierentransplantat, nicht bestätigt werden konnte.

Gegen die Ergebnisse einiger Studien, in denen eine TLR-4-Expression ebenso wie TLR-2 (s. o.) mit einer renalen Ischämie bzw. mit einem renalen Ischämie-Reperfusionsschaden in Zusammenhang gestellt wird [5, 26], spricht hier die fehlende Korrelation der TLR-4-Expression mit der kalten Ischämiezeit und dem Vorliegen initialer Nichtfunktionen.

In bereits veröffentlichen Studien [5, 6] konnte eine Verbindung zwischen TLR-4 und der entzündlichen Immunantwort auf uropathogene, HWIs auslösende, gram- negative Bakterien (z.B. Escherichia coli) nachgewiesen werden. Dieser Zusammenhang wurde daher in der vorliegenden Arbeit als Grundlage für eine Untersuchung der Beziehung zwischen einer TLR-4-Expression im Nierentrans- plantatgewebe und Infektionen verwendet (siehe Kapitel 5.4).

Auch für TLR-9 konnte keine signifikante Korrelation zwischen der Expression im Nierentransplantatgewebe und der Transplantatfunktion oder akuten zellulären Abstoßungsreaktionen ermittelt werden. Bisher ist ein solcher direkter Zusammen- hang in der Literatur auch nicht beschrieben worden. In einer Studie [25] konnte TLR-9 lediglich mit progressiver Glomerulonephritis, interstitieller Fibrose und Proteinurie in Verbindung gebracht werden, was teilweise auch bei einem chronischen Transplantatschaden auftreten kann [15].

Da TLR-9 jedoch nicht direkt auf renalen Epithelzellen im Nierentransplantatgewebe, sondern nur auf infiltrierenden Antigen präsentierenden Zellen während einer Immunbeschädigung exprimiert zu werden scheint [5], könnte daraus geschlossen werden, dass die in der vorliegenden Arbeit getestete Beziehung (s. o.) für TLR-9 im Nierentransplantatgewebe auch nicht vorgesehen ist.