Der isoliert hämoperfundierte Rinderuterus als In-vitro-Modell zur Prüfung
antiinflammatorischer Substanzen
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Michael Heinrich Willi Braun aus Werneck
Hannover 2002
1. Gutachter: Prof. Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Prof. Dr. B. Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2002
Diese Arbeit wurde von der Zentralstelle zur Erfassung und Beurteilung von Ersatz- und Er- gänzungsmethoden zum Tierversuch (ZEBET) des BgVV gefördert (Projektnr.: WK1-1328- 160).
2 Literaturübersicht 10
2.1 Entzündung 10
2.1.1 Überblick 10
2.1.2 Regulation des akuten Entzündungsgeschehens 11
2.1.2.1 Eicosanoide 11
2.1.2.2 Stickstoffmonoxid 13
2.1.2.3 Freie Sauerstoffradikale 14
2.1.2.4 Proinflammatorische Cytokine 15
2.2 Cyclooxygenasen 16
2.2.1 Allgemeine Übersicht 16
2.2.2 Struktur 17
2.2.3 Physiologische Bedeutung der COX-2 18
2.3 Entzündungsmodelle 20
2.3.1 Pleuritismodell 20
2.3.2 Pfotenödem 21
2.3.3 Weitere Tiermodelle 21
2.3.4 In-vitro-Testsysteme 22
2.4 Antiphlogistika 23
2.4.1 Dexamethason 23
2.4.2 Flunixin 25
2.4.3 COX-2-Inhibitor (DFU) 26
2.5 Der isoliert perfundierte Rinderuterus 27
2.5.1 Anatomie des Rinderuterus 27
2.5.1.1 Allgemeiner Aufbau 27
2.5.1.2 Wandung des Uterus 28
2.5.1.3 Blutgefäße des Uterus 30
2.5.2 Bedeutung der Cyclooxygenase im Sexualzyklus des Rindes 31
3.1 Versuchsübersicht 35
3.2 Geräte und Reagenzien 37
3.2.1 Geräte für die Versuche am Uterus 37
3.2.2 Geräte zur Analytik 37
3.2.3 Reagenzien 38
3.2.3.1 Reagenzien für die Versuche am Uterus 38
3.2.3.2 Bestimmung der Vitalitätsparameter 38
3.2.3.3 Proteinbestimmung 38
3.2.3.4 Prostaglandinmessung 38
3.2.3.5 RT-PCR und Western Blot 39
3.3 Das Modell des isoliert hämoperfundierten Rinderuterus 40
3.3.1 Versuchsmaterial 40
3.3.2 Versuchsaufbau 40
3.4 Vitalität des Modells 42
3.4.1 Glucoseverbrauch 42
3.4.2 Lactatproduktion 42
3.5 Versuche zum akuten Entzündungsgeschehen 43
3.5.1 Versuchsdurchführung 43
3.5.1.1 Entzündungsmodell 43
3.5.1.2 Systemische Applikation von Antiphlogistika 44 3.5.2 Bestimmung der PGE2-Konzentration in Gewebestanzen 44
3.5.2.1 Aufarbeitung der Gewebestanzen 44
3.5.2.2 Bestimmung der PGE2-Konzentration 45
3.5.3 PGE2-Bestimmung im Mikrodialysat 45
3.5.4 RT-PCR von mRNA aus Gewebestanzen 46
3.5.4.1 Isolierung der RNA 46
3.5.4.2 Durchführung der RT-PCR 47
3.5.5 Western-Blot-Analyse von Gewebestanzen 48
3.5.5.4 Entwicklung der Nitrocellulose-Membranen 49
3.6 Statistische Auswertung 51
4 Ergebnisse 52
4.1 Vitalität des isoliert hämoperfundierten Rinderuterus 52
4.1.1 Glucoseverbrauch 52
4.1.2 Lactatproduktion 52
4.1.3 Gewichtszunahme der isoliert hämoperfundierten Rinderuteri 52 4.2 Lokale Applikation von phlogistischen Substanzen 55 4.2.1 Prostaglandin-E2-Gehalt im Myometrium 55 4.2.2 Messung von Prostaglandin E2 im Mikrodialysat 55 4.2.3 Bestimmung des mRNA-Gehalts im Myometrium 55
4.3 Einfluß der Hämoperfusion 61
4.3.1 Bestimmung des mRNA-Gehalts im Myometrium 61 4.3.2 Bestimmung des COX-2-Proteins im Myometrium 61 4.3.3 Prostaglandin-E2-Gehalt im Myometrium 63 4.4 Einfluß von Antiphlogistika auf das Modell des isoliert
hämoperfundierten Rinderuterus 66
4.4.1 Flunixin 66
4.4.2 DFU 66
4.4.3 Dexamethason 66
4.4.4 Statistischer Vergleich der Hemmung der PGE2-Synthese unter
Perfusion mit Antiphlogistika 76
5 Diskussion 77
5.1 Vitalität des isoliert hämoperfundierten Rinderuterus 77
5.1.1 Glucoseverbrauch 78
5.1.2 Lactatproduktion 78
5.2.1.1 Prostaglandin-E2-Gehalt im Myometrium 80 5.2.1.2 Prostaglandin-E2-Bestimmung im Mikrodialysat 81 5.2.1.3 Nachweis der mRNA von COX-1 und COX-2 im Myometrium 81
5.2.2 Einfluß der Hämoperfusion 82
5.2.2.1 Untersuchung der mRNA-Regulation von COX-1, COX-2 und iNOS
über die Perfusionsdauer 82
5.2.2.2 Bestimmung des COX-2-Proteins im Myometrium 83 5.2.2.3 Prostaglandin-E2-Gehalt im Myometrium 83 5.3 Beeinflussung der Reaktionen im Myometrium durch die Perfusion
mit Antiphlogistika 85
5.3.1 Flunixin 85
5.3.2 DFU 86
5.3.3 Dexamethason 87
5.4 Schlussfolgerung und Ausblick 89
6 Zusammenfassung 91
7 Summary 93
8 Literaturverzeichnis 95
9 Anhang 115
9.1 Anhangstabellen 115
9.2 Veröffentlichungen 119
9.3 Liste der verwendeten Abkürzungen 120
1 Einleitung
Nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID) gehören zu den am häufigsten eingesetzten Phar- maka weltweit. Allein in den USA werden jährlich mehrere Milliarden Dollar für diese Medi- kamente investiert (DUBOIS et al. 1998). Ihre Wirkung entfalten NSAID durch die Hem- mung der Cyclooxygenase (COX), einem Enzym, das unter anderem für die Produktion pro- inflammatorischer Prostaglandine verantwortlich ist (VANE 1971). Die Entdeckung einer durch Entzündungsreize induzierbaren Isoform, der COX-2 (MASFERRER et al. 1990, FU et al. 1990, XIE et al. 1991), führte Anfang der neunziger Jahre zu einer intensiven Forschung in diesem Bereich. Die Entwicklung neuer, COX-2-selektiver Substanzen könnte eine mit her- kömmlichen NSAID vergleichbare antiphlogistische Therapie bei einem wesentlich geringe- ren Nebenwirkungspotential ermöglichen. Allerdings zeigte sich, daß in verschiedenen Mo- dellen des akuten Entzündungsgeschehens zum Teil erhebliche Unterschiede bezüglich der COX-Spezifität der verwendeten Testsubstanzen vorhanden sind (ENGELHARDT et al.
1996a, 1996b). Im Hinblick darauf, ein ganzheitliches Bild über die Bedeutung der COX-2 und ihrer pharmakologischen Beeinflussung zu bekommen, erscheint es daher sinnvoll, diese Fragestellungen an weiteren Modellen zu untersuchen.
Isoliert perfundierte Organe werden bereits seit Jahrzehnten als Ersatz- und Ergänzungsme- thoden zum Tierversuch eingesetzt. Im Vergleich zu anderen In-vitro-Modellen besteht bei isoliert perfundierten Organen der Vorteil, daß das gesamte Organ mit seinen funktionellen Einheiten (Gefäßsystem, Nerven, Abwehrsystem) zur Verfügung steht. Dies ermöglicht es, daß Versuche unter mit In-vivo-Bedingungen vergleichbaren und standardisierbaren Voraus- setzungen durchgeführt werden können.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung des isoliert hämoperfundierten Rinderuterus als ein neues In-vitro-Entzündungsmodell. In diesem Zusammenhang soll auch geklärt werden, ob ein COX-2-mediiertes Entzündungsgeschehen dargestellt werden kann, um die Wirkung spe- zifischer COX-2-Inhibitoren zu evaluieren.
2 Literaturübersicht
2.1 Entzündung2.1.1 Überblick
Die Entzündung ist ein komplexer Prozeß, mit dem der Organismus auf einen exogenen oder endogenen Reiz reagiert (SCHÜPPEL 2000). Die auslösende Noxe kann sowohl physikalischer (z.B. Wärme, Strahlung), chemischer (z.B. Säuren, Laugen) als auch biologischer (z.B. bakteri- elle Infektionen) Natur sein. Im Allgemeinen wird eine Entzündung durch die fünf von Celsus (25 v. Chr. bis ca. 50 n. Chr.) und Galen (129 bis 199 n. Chr.) beschriebenen Kardinalsymptome begleitet: Rubor (Rötung), Calor (Wärme), Tumor (Schwellung), Dolor (Schmerz) und Functio laesa (Funktionsstörung). Hervorgerufen werden diese Symptome vor allem durch eine Altera- tion der Mikrozirkulation, die sich in Form von Vasodilatation der Arteriolen, Kapillaren und Venulen, einhergehend mit einer erhöhten Gefäßpermeabilität, manifestiert (TROWBRIDGE u.
EMLING 1997). Durch eine anfängliche Transudation und spätere Exsudation gelangen Plasma und Plasmaproteine in das Gewebe. Vasodilatation und Hämokonzentration aufgrund des Flüs- sigkeitsaustritts aus den Gefäßen bewirken eine Verlangsamung des Blutflusses. Leukozyten können an den Rand des Blutstroms gelangen (Margination), sich an der Oberfläche der En- dothelzellen anheften (Adhäsion) und schließlich in das Gewebe auswandern (Emigration).
Während Rötung, Wärme und Schwellung direkte Folgen der vaskulären Veränderungen dar- stellen, entsteht der Schmerz sekundär aufgrund eines erhöhten Gewebedrucks. Weiterhin sind einige Entzündungsmediatoren dazu in der Lage, neben der Beeinflussung der Blutgefäße eine Sensibilisierung von Nervenendigungen zu induzieren (HINZ u. BRUNE 2000). Als Ursache für die gestörte Funktion kann neben der Schwellung und dem Schmerz häufig auch eine direkte Schädigung durch die einwirkende Noxe verantwortlich gemacht werden (TROWBRIDGE u.
EMLING 1997).
Anhand ihres zeitlichen Verlaufs läßt sich die Entzündung in eine akute und in eine chronische Form einteilen. Im akuten Entzündungsgeschehen steht die Alteration der Mikrozirkulation im Vordergrund, hervorgerufen durch zahlreiche Mediatoren, die zunächst von Endothelzellen und Zellen des umliegenden Gewebes (z.B. Mastzellen) freigesetzt werden. Später werden diese Bo- tenstoffe fast ausschließlich von den eingewanderten Entzündungszellen (überwiegend neutro-
phile Granulozyten und Makrophagen) gebildet, die sich im betroffenen Gebiet anreichern. Sind die akkumulierten Leukozyten in der Lage, das auslösende Agens zu eliminieren, so kommt es zur Heilung.
Bei einem persistierenden Reiz wandelt sich die akute in eine chronische Entzündung, bei der proliferative Vorgänge wie das Einsprossen von Blutgefäßen oder bindegewebige Demarkie- rung im Vordergrund stehen. Da diese Veränderungen an dem in dieser Arbeit verwendeten Modell des isoliert perfundierten Rinderuterus aufgrund seiner limitierten Lebensdauer nicht darstellbar sind, wird auf sie in den nachfolgenden Betrachtungen nicht näher eingegangen.
2.1.2 Regulation des akuten Entzündungsgeschehens
Eine Entzündung kann durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren ausgelöst werden, jedoch ist die Reaktion des Organismus meist identisch. Das einheitliche Bild des akuten Entzün- dungsgeschehens wird durch eine Vielzahl von Mediatoren hervorgerufen, die zu unter- schiedlichen Zeitpunkten in Erscheinung treten und in enger Beziehung zueinander agieren.
2.1.2.1 Eicosanoide
Unter dem Begriff Eicosanoide werden die Produkte der Arachidonsäure (all-cis-5,8,11,14- Eicosatetraensäure) zusammengefaßt. Es handelt sich um eine heterogene Gruppe von Mediato- ren mit einer C20-Fettsäurestruktur. Arachidonsäure wird durch die Phospholipase A2 aus Mem- branphospholipiden freigesetzt (ROSENTHAL et al. 1995) und kann über die Cyclooxygenasen (COX) oder die Lipoxygenasen weiter verstoffwechselt werden. Hierbei bestimmt die Enzy- mausstattung der jeweiligen Zellen, welche Eicosanoide bevorzugt gebildet werden (SAMUELSSON et al. 1975, JÄGER u. KROEGEL 1998).
Die Cyclooxygenasen katalysieren zwei Reaktionen, die Arachidonsäure über Prostaglandin (PG) G2 in PGH2 überführen (vgl. Abschnitt 2.2). PGH2 kann nun über nachgeschaltete Enzyme in PGE2 (PGH-E-Isomerase), PGD2 (PGH-D-Isomerase), Prostacylin (Prostacyclin-Synthase), Thromboxan (Thromboxan-Synthase) oder PGF2α (PGF-Synthase) umgewandelt werden (Abb. 1).
Abb. 1: Stoffwechselwege der Arachidonsäure (nach RUZICKA 1984)
Im akuten Entzündungsgeschehen ist vor allem PGE2 von Bedeutung, da es stark vasodilatato- risch wirkt und die Ödembildung durch Bradykinin und den Komplementfaktor C5a potenziert (WILLIAMS u. PECK 1977, WEDMORE u. WILLIAMS 1981). Weiterhin sensibilisiert es Nozizeptoren gegenüber Histamin und Bradykinin (RUZICKA 1984). Aufgrund seiner zentralen Rolle wird PGE2 in vielen Entzündungsmodellen als Meßparameter benutzt (vgl. Abschnitt 2.3).
Physiologische Bedeutung besitzt PGE2 bei der Regulation der renalen Durchblutung und der Sekretion von Magensäure. Gemeinsam mit Prostacyclin (PGI2) fördert es die Hydrogencarbo- nat- und Schleimsekretion im Magen-Darmtrakt und wirkt somit zytoprotektiv.
Ähnlich wie PGE2 besitzt auch PGI2 eine direkte vasodilatatorische Wirkung und induziert eine Hyperalgesie. Außerdem gilt es als ein direkter Gegenspieler von Thromboxan (TX) A2, da es die Plättchenaggregation verhindert (RUZICKA 1984, ZIBOH 1996). TXA2 wiederum ist der potenteste Vasokonstriktor im menschlichen Organismus (FRÖLICH 1997). PGF2α und PGD2
zeigen eine vaso- und bronchokonstriktorische Wirkung, sind aber im Entzündungsgeschehen Membranphospholipide
Arachidonsäure
Phospholipase A2
12- bzw. 15-HPETE 12- bzw. 15-HETE
12- bzw. 15 Lipoxygenase
5-Lipoxygenase Cyclooxygenase
PGG2 5-HPETE
Thromboxane LTC4
LTD4 LTE4
LTC4-Synthetase
LTA4
LTB4
LTA4- Hydrolase
PGH2 5-HETE
PGD2 PGE2 PGF2α Prostacyclin
PGH-D- Isomerase
PGH-E- Isomerase
PGF- Synthase
Prostacyclin- Synthase
Thromboxan- Synthase
weniger von Bedeutung, obwohl ihre Gewebekonzentration durch Irritation mit Arachidonsäure erhöht werden kann.
Der zweite Stoffwechselweg der Arachidonsäure läuft über die Lipoxygenasen (Abb. 1). Es wer- den die Enzyme 5-Lipoxygenase, 12-Lipoxygenase und 15-Lipoxygenase unterschieden. Wäh- rend die Produkte der letzten beiden, 12- und 15-Hydroxyeicosatetraensäure, eine untergeordnete Rolle spielen, sind die über den 5-Lipoxygenaseweg entstehenden Leukotriene (LT) maßgeblich am Entzündungsgeschehen beteiligt (STANKOVA u. ROLA-PLESZCZYNSKI 2001).
Das durch die 5-Lipoxygenase gebildete LTA4 wird über die LTA4-Hydrolase rasch in LTB4
umgewandelt. LTB4 wirkt stark chemotaktisch und aktivierend auf neutrophile Granulozyten und, in geringerem Ausmaß, andere Leukozyten (z.B. eosinophile Granulozyten und B-Lymphozyten) (JÄGER u. KROEGEL 1998). Die Wirkung ist rezeptorvermittelt, wobei zwei Subtypen unterschieden werden. Die Stimulation des hoch-affinen Rezeptors induziert Chemo- taxis und Aggregation, wohingegen über den niedrig-affinen Rezeptor Degranulation und Steige- rung des oxidativen Metabolismus vermittelt werden (STANKOVA u. ROLA-PLESZCZYNSKI 2001).
Die Metabolisierung des LTA4 durch die LTC4-Synthetase führt durch die Anlagerung eines Glutathionrestes zur Bildung von LTC4, welches durch Dipeptidasen weiter in LTD4 und LTE4 umgewandelt werden kann. Zusammengefaßt werden LTC4/D4/E4 auch als Peptido- oder Cy- steinyl-Leukotriene bezeichnet. Die Peptidoleukotriene sind vor allem im Zusammenhang mit dem Asthma bronchiale von Bedeutung, da sie Bronchospasmus, Schleimhautödem und Hyper- sekretion auslösen. Aus diesem Grund wurden sie früher auch „slow reacting substances of anaphylaxis“ genannt (JÄGER u. KROEGEL 1998).
2.1.2.2 Stickstoffmonoxid
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein kleines Molekül, dessen Freisetzung aus Endothelzellen erstmals 1987 beschrieben wurde (PALMER et al. 1987). Es konnte gezeigt werden, daß NO mit dem seit Anfang der 80er Jahre bekannten „endothelium-derived relaxing factor“ identisch ist (MONCADA et al. 1991). NO ist sehr reaktiv, da es aufgrund seiner ungeraden Elektronenzahl Radikalcharakter besitzt. In wäßrigen Lösungen wird es in Gegenwart von Sauerstoff rasch zu Nitrit (NO2-) und Nitrat (NO3-) oxidiert. Die Halbwertszeit in oxygenierten physiologischen Lö- sungen beträgt nur wenige Sekunden (GRIFFITH et al. 1984, COCKS et al. 1985).
Die im Cytosol liegenden NO-Synthasen (NOS) wandeln L-Arginin unter der Freisetzung von NO in L-Citrullin um. Es werden zwei Formen der NOS unterschieden, die konstitutive, von der intrazellulären Calcium-Konzentration abhängige cNOS und die auf Reiz hin induzierbare, cal- ciumunabhängige iNOS. Die konstitutive Form wurde neben den Endothelzellen auch in Thrombozyten und im Nervengewebe nachgewiesen (MONCADA et al. 1991). Im vaskulären System dient eine kontinuierliche Freisetzung von NO im femtomolaren Bereich der Aufrechter- haltung des vaskulären Tonus und der Inhibition der Plättchen-Aggregation (MONCADA et al.
1991), während es im Nervensystem als Neurotransmitter und „second-messenger“ fungiert. Die induzierbare Isoform wurde zunächst in Abwehrzellen (v.a. aktivierte Makrophagen und neu- trophile Granulozyten) nachgewiesen. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß sie auch in Zel- len, die nicht dem retikuloendothelialen System angehören (z.B. glatte Muskelzellen der Ge- fäßwände), exprimiert werden kann. Als Induktionsreiz dienen z.B. Endotoxine, Sauerstoffra- dikale und Cytokine, während Glucocorticoide die Expression hemmen. Im Gegensatz zur cNOS produziert die iNOS Stickstoffmonoxid in wesentlich größeren Mengen (nanomolarer Bereich). Diese hohen, zytotoxischen Konzentrationen dienen vor allem der Zerstörung von phagozytiertem Material. Zur Bekämpfung von nicht phagozytierbarem Material (z.B. Para- siten und Tumorzellen) kann NO sezerniert werden, wobei auch gesundes Gewebe in Mitlei- denschaft gezogen werden kann. Im akuten Entzündungsgeschehen vermittelt NO durch seine direkte Wirkung am Endothel die durch Bradykinin induzierte Vasodilatation (MONCADA u.
HIGGS 1991).
2.1.2.3 Freie Sauerstoffradikale
Neben Stickstoffmonoxid und lysosomalen Enzymen nutzen Phagozyten auch die hohe Re- aktivität von freien Sauerstoffradikalen aus, um aufgenommene Mikroorganismen abzutöten.
Die NADPH-Oxidase in den Phagozyten katalysiert die Bildung von Superoxid-Radikalen (O2•-), welche spontan zu Wasserstoffperoxid (H2O2) und den extrem reaktiven Hydroxylra- dikalen (OH•) weiterreagieren können. H2O2 besitzt nur eine geringe bakterozide Wirkung, kann jedoch unter Einfluß der Myeloperoxidase, einem Bestandteil der Granula neutrophiler Granulozyten, in unterchlorige Säure (HOCl) umgesetzt werden. Unterchlorige Säure ist wie- derum ein starkes Oxidationsmittel, das eine Vielzahl von organischen Molekülen angreift.
Diese Reaktionskette läuft als sogenannter „respiratory burst“ bei der Degranulation neutro-
philer Granulozyten ab (TROWBRIDGE u. EMLING 1997). Bei einer überschießenden Ra- dikalbildung können auch umliegende Zellen betroffen und das Entzündungsgeschehen ver- stärkt werden. So führt z.B. die Destabilisierung der Membranen von Endothelzellen zu einer erhöhten Extravasation (FLOHÉ u. GIERTZ 1987). Der „respiratory burst“ kann durch ver- schiedene Faktoren wie Komplementfaktor C5a, Arachidonsäure und Endotoxine ausgelöst werden (BOCHSLER et al. 1992, FOSTER u. CUNNINGHAM 1997).
Eine besondere Rolle spielen die reaktiven Sauerstoffspezies in der Pathogenese des Ischä- mie-Reperfusions-Schadens. Aufgrund eines massiven „respiratory burst“ in den Endothel- zellen entsteht eine große Menge freier Radikale, die durch die endogenen Radikalfänger (Su- peroxid-Dismutase, Glutathion-Peroxidase, Glutathion und NO) nicht kompensiert werden kann (CARDEN u. GRANGER 2000). Auslösender Faktor ist hierbei die hypoxiebedingte Konversion der endothelialen Xanthin-Oxidase (GRANGER 1988), bei der aus der NAD- reduzierenden Dehydrogenase eine sauerstoff-reduzierende Oxidase entsteht. Die erneute Sauerstoffzufuhr während der Reperfusion führt dazu, daß das Enzym eine massive Produk- tion von Superoxid-Radikalen katalysiert (CHAN 2002). Zunächst resultiert daraus ein loka- les Entzündungsgeschehen, vor allem aufgrund des akuten Mangels an NO als physiologi- schen Vasodilatator. Im protrahierten Zustand führt die Freisetzung von Entzündungsmediato- ren meist zu einer systemischen Entzündungsreaktion, die mit dem klinischen Bild einer Sep- sis vergleichbar ist (CARDEN u. GRANGER 2000).
2.1.2.4 Proinflammatorische Cytokine
Die Cytokine stellen eine sehr große, heterogene Gruppe von wasserlöslichen Proteinmediato- ren dar, deren Aufgabe es ist, über para- und autokrine Mechanismen das Zusammenspiel der Zellen im Organismus zu regulieren. Proinflammatorische Cytokine werden überwiegend von Zellen des Immunsystems (z.B. Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten) produziert, jedoch können auch andere Zelltypen wie Keratinozyten und Endothelzellen auf einen Reiz hin zahlreiche dieser Mediatoren sezernieren (ENK u. KATZ 1992, KRISHNASWAMY et al.
1999, SAADEDDIN et al. 2002). Die beiden wichtigsten Cytokine im akuten Entzündungsge- schehen sind Interleukin (IL) 1β und Tumornekrosefaktor (TNF) α, deren Freisetzung durch eine Vielzahl von Stimuli (z.B. Endotoxine, Hypoxie) induziert werden kann (VAN MIERT 1995, KRISHNASWAMY et al. 1999, SAADEDDIN et al. 2002). TNFα und IL-1β zeigen in
ihrer proinflammatorischen Wirkung viele synergistische Effekte (DAYER u. BURGER 1994). Sie stimulieren die Synthese und Sekretion weiterer Cytokine, wie z.B. IL-6, IL-8 und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), aus Makrophagen, Monozyten und Lymphozyten. Weiterhin erhöhen sie durch Induktion der Phospholipase A2
und der COX-2 (vgl. Abschnitt 2.2) die Eicosanoid-Produktion im entzündeten Gewebe (DRAY u. BEVAN 1993). Durch die Hochregulation von Adhäsionsmolekülen im Endothel (ICAM-1, VCAM-1) und auf Leukozyten (E- und P-Selektine) steigern sie die Adhäsion und Migration von Entzündungszellen.
Sekundäre Cytokine, wie z.B. IL-6, IL-8 und GM-CSF, führen durch ihre Wirkung auf Leu- kozyten zu einer weiteren Verstärkung der Entzündungsreaktion (VAN MIERT 1995, KRI- SHNASWAMY et al. 1999, SAADEDDIN et al. 2002). IL-6 stimuliert die Proliferation und Reifung von B- und T-Lymphozyten und stellt damit einen bedeutenden Regulator der humo- ralen und zellulären Abwehr dar. IL-8 ist ein sehr starkes Chemotaxin, das zur Ansammlung von neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und T-Zellen führt. Desweiteren kann es, wie auch TNFα und IL-1β, den „respiratory burst“ aktivieren. GM-CSF induziert eine gesteigerte Differenzierung und Aktivierung von Granulozyten und Makrophagen.
2.2 Cyclooxygenasen
2.2.1 Allgemeine Übersicht
Die Cyclooxygenase oder Prostaglandin-H-Synthase ist ein membrangebundenes Enzym, das 1967 erstmals von HAMBERG und SAMUELSSON beschrieben wurde. Obwohl bereits be- kannt war, daß die durch die COX gebildeten Prostaglandine neben anderen Mediatoren maß- geblich an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer Entzündung beteiligt sind, erkannte VA- NE (1971) als erster, daß die Wirkung der nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAID) auf eine Hemmung des Enzyms zurückzuführen ist. Hierdurch konnten auch die Nebenwirkungen (Ma- genulzera, Nierenperfusionsstörung, Hemmung der Thrombozytenaggregation), die bei der An- wendung dieser Medikamente auftreten, erklärt werden, da PGs neben ihrer proinflammatori- schen Wirkung auch in zahlreichen physiologischen Regulationsprozessen von Bedeutung sind.
Anfang der neunziger Jahre konnten verschiedene Autoren feststellen, daß das Enzym in zwei unterschiedlichen Isoformen im Organismus vorkommt (MASFERRER et al. 1990, FU et al.
1990, XIE et al. 1991). Sie unterschieden eine nahezu ubiquitär vorkommende, konstitutive COX-1, der sie als sogenanntes „house-keeping-enzyme“ eine überwiegend regulierende Funktion zusprachen, und eine auf einen Reiz hin induzierbare COX-2, die an pathophysiolo- gischen Vorgängen beteiligt ist. Eine Vielzahl von Faktoren ist in der Lage, die Expression der COX-2 zu stimulieren, z.B. proinflammatorische Cytokine (TNFα, IL-1β, Interferon (IFN) γ), Wachstumsfaktoren (epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor (TGF) β), Endotoxine, Stickstoffmonoxid und Sauerstoffradikale. Weiterhin kann PGE2 selbst über nukleäre Rezeptoren (peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR), die bei Ligan- denbindung direkt als Transkriptionsfaktoren fungieren, die COX-2-Expression induzieren (FORMAN et al. 1996).
2.2.2 Struktur
Die beiden Isoformen der Cyclooxygenase weisen eine Strukturanalogie von 60 % auf (XIE et al. 1991, O'BANION et al. 1991, KUJUBU et al. 1991), weshalb die nachfolgende Beschreibung sowohl für COX-1 als auch für COX-2 gilt.
Die Cyclooxygenase ist ein Homodimer aus 70 kDa-Untereinheiten, die jeweils eine EGF- Domäne, eine Membran-Bindungs-Domäne und eine katalytische Domäne enthalten. In der ka- talytischen Domäne liegen die beiden aktiven Zentren des Enzyms, die durch eine Hämgruppe voneinander getrennt sind (PICOT et al. 1994). Die Aufgabe der COX ist die Umwandlung von Arachidonsäure (AA) zu Prostaglandin H2. Diese Reaktion läuft in zwei Schritten ab. Zunächst erfolgt durch die Cyclooxygenase-Aktivität des Enzyms die Synthese von PGG2, welches dar- aufhin durch die Peroxidase-Aktivität zu PGH2 reduziert wird (KATORI u. MAJIMA 2000).
Zentrales Element dieser Umwandlung ist die an Position 385 liegende Aminosäure Tyrosin, die als Radikal die Oxidation von AA einleitet (KARTHEIN et al. 1988). Die Bildung dieses Tyro- sin-Radikals kann durch organische Hydroperoxide und Fettsäure-Peroxide hervorgerufen wer- den (DIETZ et al. 1988). LANDINO et al. (1996) stellen fest, daß Peroxynitrit (ein Produkt aus NO und dem Superoxid-Radikal) selbst in Gegenwart von Glutathion und der Glutathion- Peroxidase in der Lage ist, die COX zu aktivieren. Ein Zusammenhang zwischen der NO- und
der PG-Synthese wird auch von SALVEMINI et al. (1993, 1995) beschrieben, die zeigen kön- nen, daß eine Inhibition der induzierbaren NO-Synthase zu einer verminderten PGE2-Synthese führt. Die Reduktion von PGG2 durch die Peroxidase-Reaktion ermöglicht im zweiten Schritt der PGH2-Synthese eine Regenerierung des Tyrosin-Radikals. So bewirkt eine einmalige Aktivie- rung der COX ein mehrfaches Durchlaufen der Reaktionskette und somit eine Akkumulation des Produkts (NUGTEREN u. HAZELHOF 1973, HAMBERG et al. 1974).
Trotz der strukturellen Analogie der beiden Isoformen bestehen große Unterschiede bezüglich ihrer Substratspezifität. Während die COX-1 nur einige ungesättigte Fettsäuren verstoffwech- seln kann (HINZ u. BRUNE 1999, MARNETT et al. 1999), ist das Spektrum an potentiellen Substraten der COX-2 wesentlich größer und umfaßt auch Derivate der Arachidonsäure, wie die endogenen Cannabinoide Arachidonoyl-Ethanolamid (AEA, Anandamid) und Arachido- noyl-Glycerol (YU et al. 1997, KOZAK et al. 2001). Weiterhin ist die COX-2 in der Lage, kleinste Mengen Arachidonsäure umzusetzen, wohingegen die COX-1 einen wesentlich grö- ßeren Substratpool benötigt (SHITASHIGE et al. 1998, MURAKAMI et al. 1999). Ein mög- licher Grund für diese Unterschiede könnte die leichtere Zugänglichkeit der katalytischen Zentren der COX-2 sein. In beiden Isoformen liegen diese Bereiche am Ende eines hydropho- ben Tunnels, der jedoch bei der COX-2 ein etwa 17 % größeres Lumen aufweist (PICOT et al. 1994, LUONG et al. 1996). Zusätzlich besitzt die COX-2 noch einen zweiten Kanal (sog.
„side-pocket“), der bei der COX-1 durch einen Isoleucin-Rest an Position 523 verschlossen wird. Diese strukturelle Besonderheit wird auch bei der Entwicklung von spezifischen COX- 2-Inhibitoren ausgenutzt.
2.2.3 Physiologische Bedeutung der COX-2
Die Entdeckung der induzierbaren Isoform der Cyclooxygenase schürte die Hoffnung, daß durch die Entwicklung spezifischer COX-2-Inhibitoren neue Arzneimittel geschaffen werden können, die eine vergleichbare antiinflammatorische Wirkung wie herkömmliche NSAID besitzen, zu- gleich aber ein wesentlich geringeres Nebenwirkungspotential aufweisen. Die intensive For- schung in diesem Bereich zeigte allerdings, daß die COX-2 auch von physiologischer Bedeutung ist und in manchen Geweben konstitutiv gebildet wird (KATORI u. MAJIMA 2000, HINZ u.
BRUNE 2002).
In der Niere von Säugetieren besitzen Prostaglandine eine wichtige Funktion als Regulatoren des renalen Blutflusses und der Wasser- und Elektrolyt-Homöostase durch eine Steigerung der Renin-Sekretion (DUBOIS et al. 1998). Verschiedene Studien zeigten, daß in der Macula densa eine konstitutiv exprimierte COX-2 für die Bildung der Prostaglandine verantwortlich ist (HARRIS et al. 1994, NANTEL et al. 1999b). HARRIS et al. (1994, 2000) beschreiben weiter- hin, daß Salz- und Wasserentzug sowie die Gabe von ACE-Hemmern eine vermehrte Expression der COX-2 in der Niere induzieren. Einen weiteren Hinweis für die physiologische Bedeutung der COX-2 in der Niere erbrachten Studien mit COX-2-knock-out-Mäusen, in denen gezeigt wurde, daß diese Tiere prä- und postnatal schwere, meist letale Nephropathien entwickeln (MORHAM et al. 1995, DINCHUK et al. 1995).
Eine geringe konstitutive Expression der COX-2 konnte im Magen von Ratten, Kaninchen und Menschen nachgewiesen werden (ISEKI 1995, ZIMMERMANN et al. 1998). Allerdings wird vermutet, daß eine physiologische Zytoprotektion des oberen Gastrointestinaltrakts überwiegend durch die von der COX-1 gebildeten Prostaglandine gewährleistet wird. Unterstützt wird diese Annahme dadurch, daß bei der Langzeitanwendung von spezifischen COX-2-Inhibitoren im Vergleich zu konventionellen NSAID signifikant weniger Ulzerationen des oberen Gastrointe- stinaltrakts ausgelöst werden (SILVERSTEIN et al. 2000, BOMBARDIER et al. 2000). Eine wichtige Rolle wird der COX-2 allerdings in der sogenannten „adaptiven Zytoprotektion“ zuge- sprochen, da eine vermehrte Expression des Enzyms als Reaktion auf eine milde Irritation des Magens beobachtet werden kann (GRETZER et al. 1998). Bestätigt wird dies dadurch, daß bei empfindlichen Patienten (z.B. bei bereits vorhandenen Erosionen in der Magenschleimhaut) vermehrt gastrointestinale Störungen bei COX-2-Inhibition auftreten. Zudem demonstrierten SCHMASSMANN et al. (1998), daß spezifische COX-2-Inhibitoren die Heilung von Magenge- schwüren verzögern können.
Weiterhin wird die konstitutive Expression der COX-2 im Nervensystem und dem weiblichen Genitaltrakt beschrieben. Physiologische Bedeutung besitzt sie zudem bei Stoffwechselvor- gängen im Knochengewebe, der Angiogenese und der Wundheilung (DUBOIS et al. 1998, KATORI u. MAJIMA 2000, HINZ u. BRUNE 2002). Auf die Rolle der COX-2 im Zyklusge- schehen des Rindes wird im Abschnitt 2.5.2 näher eingegangen.
2.3 Entzündungsmodelle
Um die pathophysiologischen Vorgänge der Entzündung zu erforschen und die antiphlogisti- sche Wirksamkeit neuer Testsubstanzen zu ermitteln, werden zahlreiche Modelle des akuten Entzündungsgeschehens verwendet. Hierbei werden Tiermodelle und In-vitro-Testsysteme unterschieden. Der nachfolgende Abschnitt gibt einen kurzen Überblick über einige dieser Modelle.
2.3.1 Pleuritismodell
Eines der häufig angewendeten Tiermodelle ist die carrageenin-induzierte Pleuritis der Ratte (UTSUNOMIYA et al. 1994, TOMLINSON et al. 1994, TRACEY et al. 1995, HARADA et al. 1996, HATANAKA et al. 1999, KAWAMURA et al. 2000). Hier wird den Tieren λ-Carrageenin in die Pleuralhöhle injiziert, was zu einer raschen Exsudation und Leuko- zyteninfiltration führt. In bestimmten Zeitabständen wird das Exsudat gewonnen und sein Volumen bestimmt. Die vorhandenen Zellen werden gezählt und differenziert und ihre Akti- vität durch Bestimmung der Konzentration von Entzündungsmediatoren ermittelt. Weiterhin kann die Induktion proinflammatorischer Enzyme und Cytokine auf mRNA- und Protein- Ebene nachgewiesen werden. Bereits in den ersten fünf Stunden nach der Injektion kann im Exsudat ein starker Anstieg von PGE2, PGI2 und TXB2 (HARADA et al. 1982, 1983, TOM- LINSON et al. 1994) beobachtet werden. Parallel hierzu kann die Expression der COX-2 nach ca. einer Stunde nachgewiesen werden. Sie erreicht nach drei Stunden ein Plateau, das etwa vier Stunden aufrechterhalten wird (HARADA et al. 1996). Interessanterweise zeigen HA- RADA et al. (1996) in derselben Studie, daß die selektiven COX-2-Inhibitoren NS-398 und SC-58125 zwar die PGE2-Produktion hemmen, jedoch kaum Einfluß auf die TXB2 und 6-keto-PGF1α-Konzentration im Exsudat haben.
TOMLINSON et al. (1994) und TRACEY et al. (1995) können für die iNOS einen mit der COX-2 vergleichbaren zeitlichen Verlauf zeigen. In ihren Studien ist die Aktivität des En- zyms sechs Stunden nach der Injektion von Carrageenin am größten und zeigt dann einen langsamen Abfall. Ein Anstieg der Nitrit- und Nitrat-Konzentration im Exsudat ist bis nach 24 Stunden zu verzeichnen und kann durch den NOS-Inhibitor L-NG-Monomethylarginin (L-NMA) unterbunden werden (TRACEY et al. 1995).
2.3.2 Pfotenödem
Die Injektion von phlogistischen Substanzen in die Hinterpfote von Ratten kann je nach Ver- suchsdesign als Entzündungs- oder Hyperalgesie-Modell verwendet werden (NANTEL et al.
1999a). Zum Auslösen des Reizes werden meist Carrageenin, Lipopolysaccharide (LPS) oder plättchenaktivierender Faktor (PAF) eingesetzt (PEERS 1988, HENRIQUES et al. 1992, BOUGHTON-SMITH et al. 1993, SALVEMINI et al. 1996). Das induzierte Ödem wird durch Messung der Zunahme der Pfotendicke oder des Pfotenvolumens quantifiziert und ist nach drei bis fünf Stunden maximal ausgebildet. Als weitere Parameter werden Entzün- dungsmediatoren, proinflammatorische Enzyme und Cytokine im Gewebe bestimmt.
Verstärkte Expression der COX-2 in der Pfote kann bereits eine Stunde nach Injektion von Carrageenin registriert werden, gefolgt von einem Anstieg der PGE2-Konzentration nach zwei Stunden (ZHANG et al. 1997, NANTEL et al. 1999a). Parallel hierzu zeigen SALVEMINI et al. (1996) einen zeitabhängigen Anstieg der Nitrit- und Nitratkonzentration und den immunhi- stochemischen Nachweis von iNOS im entzündeten Gewebe. Die Behandlung der Tiere mit Glucocorticoiden, NSAIDs, COX-2- oder NOS-Inhibitoren führte in allen Fällen zu einer do- sisabhängigen Reduktion des Pfotenödems.
2.3.3 Weitere Tiermodelle
Im „air-pouch“-Modell wird bei Ratten durch subcutane Injektion von steriler Luft ein Luft- sack unter der seitlichen Rückenhaut produziert. In diesen wird nach 24 Stunden ein phlogi- stisches Agens (Carrageenin, LPS, PAF) verbracht und somit eine Entzündung ausgelöst (WONG et al. 1992, MILLER et al. 1997, GHOSH et al. 2000). Vergleichbar dem Pleuritis- modell wird das sich ansammelnde Exsudat gewonnen und analysiert (SEIBERT et al. 1994, WALLACE et al. 1999).
Ein sehr verbreitetes Modell zur Messung des antiinflammatorischen Potentials eines Wirk- stoffes stellt das durch topische Arachidonsäureapplikation entzündete Mäuseohr dar (YOUNG et al. 1983, OPAS et al. 1985, LLORET u. MORENO 1995, ESCRIG et al. 1997).
Als Parameter werden hier das Ödem in Form der Ohrdickenzunahme, eine gesteigerte Per- meabilität und verschiedene Entzündungsmediatoren (überwiegend Eicosanoide) im Gewebe
bestimmt. Die Wirkung von Antiphlogistika kann sowohl topisch als auch systemisch getestet werden (ESCRIG et al. 1997).
Zur Evaluierung der antiinflammatorischen Wirkung von veterinärmedizinisch relevanten NSAID dient das sogenannte „tissue-cage“-Modell, das bei Pferden (HIGGINS et al. 1984, 1987, CLARKE 1989), Rindern (ESPINASSE et al. 1994, LANDONI et al. 1995, LEES et al.
1996) und Hunden (ZECH et al. 1993, SCHERKL et al. 1996) angewendet wird. Hierbei werden den Tieren multiperforierte Polypropylen-Gewebekäfige subcutan implantiert. Nach einer Abheilungsphase von drei Wochen wird Carrageenin in diese Käfige verbracht, um eine akute Entzündung auszulösen. Als Parameter werden hierfür Ödematisierung und Schwellung sowie die Eicosanoid-Konzentration im Exsudat herangezogen (ESPINASSE et al. 1994, LANDONI et al. 1995, LEES et al. 1996).
2.3.4 In-vitro-Testsysteme
Im Arzneimittelscreening hat sich zur Einschätzung der Wirkungspotenz neuer Testsubstan- zen der Einsatz von In-vitro-Systemen bewährt. Der Vorteil dieser Systeme ist die Möglich- keit, eine große Anzahl von Substanzen mit vergleichsweise geringem Zeit- und Kostenauf- wand zu prüfen. Häufig werden Assays mit aufgereinigten Enzymen oder Mikrosomen- Präparationen verwendet, in denen der Einfluß auf die Enzymaktivität sowie die Enzymspezi- fität der Stoffe überprüft werden kann (ENGELHARDT et al. 1996a, RIENDEAU et al.
1997a, 1997b). Diese Assays kommen auch bei enzymkinetischen Studien zum Einsatz.
In der Zellkultur werden meist Makrophagen als Primärkulturen (ENGELHARDT et al.
1996a) oder Zellinien (SCHMIDT et al. 1992, PATEL et al. 1999, BERG et al. 1999, OGA- WA et al. 2000) verwendet. Durch Zugabe von phlogistischen Substanzen (z.B. Endotoxine) in das Kulturmedium wird die Expression proinflammatorischer Enzyme (COX-2, iNOS) und die Freisetzung von Entzündungsmediatoren (Eicosanoide, NO, Cytokine) induziert. RIEN- DEAU et al. (1997a, 1997b) beschreiben die Verwendung transfizierter Hamster- Ovarialzellen, die humane COX-1 und COX-2 exprimieren, zur Prüfung spezifischer COX-2- Inhibitoren.
Zur Evaluierung der Cyclooxygenase-Selektivität nichtsteroidaler Antiphlogistika wird häufig auch der von PATRIGNANI et al. (1994) beschriebene Vollblutassay eingesetzt. Hierbei wird heparinisiertes, humanes Vollblut mit LPS inkubiert, um die Expression der COX-2 in Mono-
zyten zu induzieren. Die Aktivität des Enzyms wird durch die Bestimmung der Prostaglandin- E2-Konzentration ermittelt. Eine Aktivierung der COX-1 in den Thrombozyten wird durch Blutgerinnung erreicht, wobei eine Quantifizierung durch die Messung der Thromboxan-B2- Konzentration im Serum erfolgt (PATRIGNANI et al. 1994, 1997, PANARA et al. 1999, DALLOB et al. 1999, VAN HECKEN et al. 2000, DEPRÉ et al. 2000). Eine Modifikation des Vollblutassays wird von GIULIANO und WARNER (1999) beschrieben, die das Plasma von NSAID-behandelten Ratten an stimulierten Epithelzellen (COX-2-Aktivität) und Throm- bozyten (COX-1-Aktivität) testen. Weiterhin übertragen sie diesen Ex-vivo-Test erfolgreich auf den Menschen, indem sie das Plasma von vorbehandelten Testpersonen benutzen, um die Prostanoidsynthese in Epithelzellen und Blutplättchen zu hemmen (GIULIANO et al. 2001).
2.4 Antiphlogistika
Die in den beschriebenen Modellen induzierte Entzündung kann durch eine Vielzahl von Sub- stanzen beeinflußt werden. Im folgenden Abschnitt werden die in dieser Arbeit verwendeten Antiphlogistika hinsichtlich ihrer pharmakologischen Eigenschaften und klinischen Bedeu- tung kurz umrissen.
2.4.1 Dexamethason
Da Glucocorticoide an verschiedenen Punkten im Entzündungsgeschehen eingreifen, stellen sie äußerst potente antiinflammatorische Wirkstoffe dar. Eine der wichtigsten Wirkungen der Glucocorticoide ist die Hemmung der Phospholipase A2, wodurch sie durch eine verminderte Freisetzung von Arachidonsäure die Eicosanoidsynthese verringern (RUZICKA 1984). Eine weitere Reduktion der Prostaglandinsynthese wird durch die Inhibition der COX-2- Expression auf mRNA- und Proteinebene hervorgerufen (MASFERRER et al. 1992). Eine vergleichbare Wirkung zeigen die Glucocorticoide auf die Expression der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (SALVEMINI et al. 1995). Außerdem bewirken sie eine ver- minderte Freisetzung proinflammatorischer Cytokine (IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, TNFα und INFγ) über eine direkte Hemmung der Sekretion oder eine reduzierte Genexpression (MICHEL et al. 1995, WHELAN et al. 1999).
Aus der Gruppe der stark wirksamen Corticoide ist Dexamethason (9α-Fluor-16α- methylprednisolon, Abb. 2) ein häufig eingesetzter Wirkstoff in der veterinärmedizinischen Praxis. Im Vergleich zu Cortisol ist die glucocorticoide Wirkung von Dexamethason 30fach stärker, und es besitzt nahezu keine mineralocorticoide Wirkung (UNGEMACH 1999). Als galenische Formulierungen zur Injektion werden neben wäßrigen Suspensionen von freiem Dexamethason meist gut wasserlösliche Esterverbindungen wie 21-Isonicotinat und 21-hydrogenphosphat-Dinatrium verwendet. Hierbei wird für die intravenöse Applikation beim Rind eine Dosis von 0,02 bis 0,08 mg/kg Körpergewicht empfohlen, wodurch initiale Plasmakonzentrationen von 59 bis 75 ng/ml erreicht werden (TOUTAIN et al. 1982, TAIN- TURIER et al. 1982). Für das Rind beträgt die Halbwertszeit im Plasma 290 bis 390 Minuten.
Beim Menschen wurde eine Plasmaproteinbindung von 70 % ermittelt (UNGEMACH 1999).
O
CH3 HO
CH3
CH3 C
CH2OH
OH
F
O
Abb. 2: Strukturformel von Dexamethason
Neben der Anwendung bei entzündlichen Erkrankungen wird Dexamethason beim Rind auch zur Geburtseinleitung eingesetzt. Zudem wird seine steigernde Wirkung auf den Blutglucose- spiegel zur Behandlung der primären Ketose des Rindes und zur Prophylaxe der Gebärparese ausgenutzt (GRÜNDER u. KLEE 1974, UNGEMACH 1999).
2.4.2 Flunixin
Das Anthranilsäurederivat Flunixin (Abb. 3) ist eines der wirksamsten nichtsteroidalen Anti- phlogistika. Seine IC50 bezüglich der Cyclooxygenase-1-Aktivität liegt je nach Testsystem im Bereich von 1 bis 20 nM (RIENDEAU et al. 1997a). In galenischen Formulierungen liegt es meist als Megluminsalz vor. Flunixin ist als Granulat zur oralen Gabe und als wäßrige Lösung zur Injektion bei Pferd und Rind zugelassen. Zur intravenösen Applikation wird beim Rind eine Dosis von 2,2 mg/kg Körpergewicht empfohlen, wodurch eine initiale Plasmakonzentra- tion von ca. 25 µg/ml erreicht wird. Für das Rind beträgt die Halbwertszeit im Plasma zwi- schen 7 (Kalb) und 10 Stunden (adulte Tiere) mit einer Proteinbindung von über 99 % (HARDEE et al. 1985, LANDONI et al. 1995).
N
NH
COOH
CF3 H3C
Abb. 3: Strukturformel von Flunixin
In der Pferdepraxis stellt Flunixin aufgrund seiner hohen Wirkpotenz eines der wichtigsten Analgetika zur Behandlung von kolikbedingten Schmerzzuständen dar (KOHN u. MUIR 1988, CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000). Bei der durch intravenöse Gabe von Endoto- xinen ausgelösten Endotoxinämie führt Flunixin sowohl bei Kälbern als auch bei adulten Rin- dern zu einer Verbesserung des klinischen Bildes, wobei kein Einfluß auf die in diesem Zu- sammenhang auftretende Leukopenie gezeigt wird (MARGOLIS et al. 1987, SEMRAD 1993a, 1993b, ODENSVIK u. MAGNUSSON 1996). Weiterhin kann ein endotoxininduzier- ter Abort bei Kühen im ersten Trimester mit Flunixin unterbunden werden (GIRI et al. 1991).
Bei Kälbern hat sich eine unterstützende Therapie mit Flunixin zur Behandlung von akuten Bronchitiden als vorteilhaft gezeigt (BALMER et al. 1997).
2.4.3 COX-2-Inhibitor (DFU)
Die Testsubstanz DFU (5,5-dimethyl-3-(3-fluorophenyl)-4-(4-methylsulphonyl)-phenyl-2- (5H)-furanon, Abb. 4) ist ein strukturelles Analogon von Rofecoxib (VIOXX), einem seit kurzem zugelassenen spezifischen COX-2-Inhibitor (HINZ u. BRUNE 1999). Aufgrund sei- ner besseren Wasserlöslichkeit wurde es in der vorliegenden Arbeit dem Rofecoxib vorgezo- gen.
O
SO2CH3
O H3C
F CH3
Abb. 4: Strukturformel von DFU
Die COX-2-Selektivität von DFU wurde von RIENDEAU et al. (1997b) nachgewiesen. In vitro konnte in Versuchen mit rekombinanten, menschlichen Enzymen und in Vollblutassays eine mit Indometacin vergleichbare Effektivität gegenüber der COX-2 (IC50 (DFU) ca.
0,3 µM, IC50 (Indometacin) 0,7 – 0,9 µM) gezeigt werden. In vergleichbaren Ansätzen zur COX-1-Spezifität lag die IC50 für DFU über 100 µM. Ein ähnliches Ergebnis lieferten Unter- suchungen an transfizierten Hamster-Ovarialzellen, bei denen die IC50 gegenüber der COX-1 mehr als tausendfach höher war als die IC50 gegenüber der COX-2 (RIENDEAU et al.
1997b).
In vivo konnte sowohl für das carrageenin-induzierte Pfotenödem als auch für die durch intra- peritoneale Endotoxin-Injektion induzierte Endotoxinämie bei Ratten eine ED50 von 1 mg/kg Körpergewicht ermittelt werden (RIENDEAU et al. 1997b).
Spezifische COX-2-Inhibitoren spielen in der Veterinärmedizin noch eine untergeordnete Rolle. Das Interesse an antiphlogistisch und analgetisch wirksamen Substanzen mit einem potentiell geringeren Nebenwirkungspotential wird jedoch in der nächsten Zeit zunehmen.
Vor allem in der Pferdepraxis ist bei der Behandlung von chronischen Arthritiden und vis- zeralen, kolikbedingten Schmerzzuständen ein großes Indikationsfeld vorhanden. In diesem Zusammenhang beschreiben CAMPBELL und BLIKSLAGER (2000), daß die Regeneration ischämischer Darmabschnitte durch die Behandlung mit Flunixin im Vergleich zu unbehan- deltem und COX-2-Inhibitor-behandeltem Gewebe signifikant reduziert wird. Als Parameter bestimmen sie hierbei den Anstieg des transepithelialen Widerstands in postischämischen Darmabschnitten in der Ussing-Kammer.
2.5 Der isoliert perfundierte Rinderuterus
2.5.1 Anatomie des Rinderuterus
2.5.1.1 Allgemeiner Aufbau
Die weiblichen Geschlechtsorgane der Säugetiere werden in keimbereitende (Ovarien), keimlei- tende (Eileiter, Salpinx) und keimbewahrende (Uterus) Organe eingeteilt. Bei der Gebärmutter des Rindes handelt es sich um einen Uterus bicornis, der sich in die beiden Gebärmutterhörner (Cornua uteri), den Gebärmutterkörper (Corpus uteri) und den Gebärmutterhals (Cervix uteri) gliedert. Zusammen mit den Ovarien und dem Eileiter wird der Uterus über eine Gekröseplatte (Ligamentum latum uteri) in der Bauch- und Beckenhöhle fixiert (LEISER 1999). Die Uterus- hörner sind 35 bis 45 cm lange, rohrförmige Gebilde, die sich widderhornartig aufgerollt zur Spitze hin verjüngen und ohne erkennbare Grenze in den Eileiter übergehen. Caudal vereinigen sich die Hörner durch den gemeinsamen Bauchfellüberzug zu einem Doppelrohr, das in den ca.
3 cm langen Gebärmutterkörper mündet. Das Corpus uteri geht am inneren Muttermund (Ostium uteri internum) in den Gebärmutterhals über. Die Cervix ist ein je nach Alter des Tieres 6 bis 15 cm langes, derbes Rohr und endet mit dem äußeren Muttermund (Ostium uteri externum) in der Scheide. Die Ovarien des Rindes sind kleine (4 cm lang, 2 cm hoch und 1 bis 2 cm dick), seitlich abgeplattete Gebilde, deren Oberfläche überwiegend Keimdrüsenepithel (Follikel, Gelb- körper) trägt. Sie liegen den Uterushörnern an und sind über das Ligamentum ovarii proprium mit der gleichseitigen Hornspitze verbunden (LEISER 1999).
2.5.1.2 Wandung des Uterus
Im Bereich von Körper und Hörnern läßt sich die Wand der Gebärmutter in drei Schichten un- terteilen: Endometrium, Myometrium und Perimetrium (Abb. 5).
Im Endometrium läßt sich histologisch die Schleimhaut (Tunica mucosa), bestehend aus einem einschichtigen, zum Teil mehrreihigen Epithel (Epithelium pseudostratificatum columnare), von der darunterliegenden Bindegewebsschicht (Lamina propria mucosae) abgrenzen. Subepithelial sind im Bindegewebe zahlreiche spezifische und unspezifische Immunzellen (Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen, Mastzellen) zu finden, weshalb dieser Bereich als Stratum cellulare bezeichnet wird.
Das Stratum reticulare ist der sich myometriumwärts anschließende Teil des Endometriums. Mit Ausnahme des Bereichs der Karunkeln sind im gesamten endometrialen Stroma tubulär ver- zweigte Uterindrüsen zu finden. Die Karunkeln sind in vier Reihen angeordnete, stark vaskulari- sierte Vorwölbungen des Endometriums, die während der Trächtigkeit eine Verbindung mit den Kotyledonen des Chorions eingehen. Die so entstehenden Plazentome dienen der Versorgung des Embryos bzw. Fetus (LIEBICH 1999).
Das sich dem Endometrium nach außen hin anschließende Myometrium besteht überwiegend aus dem inneren Stratum circulare, das von zirkulär angeordneten glatten Muskelfaserbündeln gebildet wird. Die äußere Schicht wird vom Perimetrium gebildet, welches aus überwiegend longitudinal verlaufenden glatten Muskelfasern (Stratum musculare longitudinale) besteht. Zwi- schen den beiden Muskelschichten liegt eine Gefäßschicht (Stratum vasculare), die auch die Ver- sorgung des Endometriums gewährleistet. Das Perimetrium bildet mit dem einschichtigen Epi- thel der Tunica serosa die äußere Abgrenzung des Uterus (LIEBICH 1999).
Abb. 5: Histologische Übersicht der Wandung eines Uterushorns (Balken entspricht 100 µm).
Epithel
Endometrium
Myometrium (Stratum circulare) Uterin-
drüsen
2.5.1.3 Blutgefäße des Uterus
Die arterielle Blutversorgung des Uterus erfolgt über die A. ovarica, die A. vaginalis und die A.
uterina (Abb. 6).
Die direkt aus der Aorta abdominalis stammende A. ovarica verläuft durch den vorderen Teil des breiten Mutterbandes zum Eierstock. Scheide, Cervix, Harnblase und -röhre werden durch die aus der A. iliaca externa abzweigende A. vaginalis versorgt (DYCE et al. 1991, WAIBL et al.
1996a).
Die A. uterina entspringt als erstes aus der A. umbilicalis, die wiederum aus der A. iliaca interna hervorgeht, und stellt das stärkste zuführende Gefäß des Uterus dar. Sie teilt sich im breiten Mutterband in mehrere divergierende Äste auf, die mit den anderen Arterien über die Rami ute- rinae anastomosieren (GINTHER u. DEL CAMPO 1974). MERTENS (2001) konnte zeigen, daß die alleinige Perfusion der A. uterina ausreicht, alle Schichten des Uterus einschließlich der Ovarien zu versorgen.
Der venöse Abfluß aus dem Uterus erfolgt hauptsächlich über die V. ovarica, die der um ein viel- faches schwächeren A. ovarica eng anliegt. Von ihr zweigen Äste zum Gebärmutterhorn und dem Eileiter ab (Abb. 6).
Die Vv. vaginalis und vaginalis accessoria führen das Blut aus dem Bereich von Cervix und Scheide ab, während die funktionell unbedeutende, schwach ausgebildete V. uterina mitunter fehlt. Ein der V. vaginalis accessoria entsprechendes arterielles Gefäß ist nicht vorhanden (WAIBL et al. 1996b).
Abb. 6: Blutgefäße des Rinderuterus. 1: A. ovarica, 1‘: ihr Ramus uterinus, 2: A. uterina, 3: A.
vaginalis, 4: V. ovarica, 5: V. uterina, 6: V. vaginalis (DYCE et al. 1996)
2.5.2 Bedeutung der Cyclooxygenase im Sexualzyklus des Rindes
Das Rind ist asaisonal polyöstrisch mit einer physiologischen Zyklusdauer von etwa 21 Ta- gen. Der Sexualzyklus gliedert sich in vier Phasen: Östrus (Hochbrunst, 18 Stunden), Post- oder Metöstrus (Nachbrunst, zwei bis drei Tage), Inter- oder Diöstrus (Zwischenbrunst, ca. 16 Tage) und Prä- oder Proöstrus (Vorbrunst, zwei bis drei Tage). Die Deckbereitschaft kenn-
zeichnet den Östrus und wird als Tag null bezeichnet, während die Ovulation mit Tag eins des Zyklus zusammenfällt (GRUNERT 1999).
Die hormonelle Regulation des Zyklus wird hauptsächlich über die Freisetzung des Gona- dotropin-Releasing-Hormons (GnRH) aus dem Hypothalamus reguliert. Das GnRH stimuliert die Sekretion der Gonadotropine (follikelstimulierendes Hormon (FSH) und luteinisierendes Hormon (LH)) aus dem Hypophysenvorderlappen. Während durch FSH das Wachstum und die Reifung der Follikel induziert wird, ist das LH für die Ovulation und die darauffolgende Anbildung des Gelbkörpers (Corpus luteum) verantwortlich. Das Corpus luteum produziert Progesteron, welches neben der Vorbereitung des Endometriums auf die Implantation auch eine hemmende Wirkung auf die GnRH-Freisetzung im Hypothalamus hat (AURICH et al.
1996).
Für die weiteren Vorgänge im Zyklusgeschehen übernimmt der Uterus im Zusammenspiel mit dem Gelbkörper die regulatorische Schlüsselstellung. Bei fehlender Implantation wird im Endometrium PGF2α gebildet, das in die V. ovarica abgegeben wird und über ein Gegen- stromprinzip in die ihr eng anliegende A. ovarica und schließlich in den Eierstock gelangt (AURICH et al. 1996). In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, daß die Bildung des PGF2α durch eine vermehrte Expression der COX-2 im endometrialen Epithel ausgelöst wird (ASSELIN et al. 1997a, 1997b, XIAO et al. 1999, BINELLI et al. 2000). Die Ursache für die gesteigerte COX-2-Expression ist noch nicht völlig geklärt, jedoch konnte gezeigt werden, daß Oxytocin (OT) in vitro einen deutlich stimulierenden Effekt auf die PGF2α-Ausschüttung und den Gehalt an COX-2-mRNA und -Protein hat (LAFRANCE u. GOFF 1990, TYSSE- LING et al. 1998, XIAO et al. 1999). Bemerkenswerterweise stellten XIAO et al. (1998) fest, daß auch Progesteron in der Lage ist, einen Anstieg von COX-2-mRNA in Epithelzellen, je- doch nicht Stromazellen, des Endometriums zu induzieren. Im Corpus luteum induziert PGF2α neben der Luteolyse auch die Ausschüttung von OT, welches wiederum die pulsatile Aus- schüttung von PGF2α am Endometrium bewirkt (FUCHS et al. 1996, TYSSELING et al.
1998).
Bei einer erfolgreichen Befruchtung mit anschließender Implantation werden die Expression der COX-2 und die Bildung von PGF2α im Endometrium inhibiert. Als Ursache hierfür wird die Freisetzung von IFNτ vom Trophoblasten angesehen. IFNτ ist in vitro in der Lage, sowohl die OT-induzierte als auch die durch Phorbol-Ester induzierte COX-2-Expression und PGF2α-
Freisetzung im bovinen Endometrium zu hemmen (XIAO et al. 1998, 1999, BINELLI et al.
2000). Zudem nimmt es Einfluß auf die der COX-2 nachgeschalteten Enzyme, da sich das Verhältnis von freigesetztem PGF2α und PGE2 zu Gunsten des letzteren verschiebt (ASSELIN et al. 1997b, XIAO et al. 1998). mRNA- und Proteingehalt der konstitutiven COX-1 waren in allen Untersuchungen nicht verändert.
2.5.3 Untersuchungen am isoliert perfundierten Uterus
PEIRCE et al. (1970) beschreiben erstmals die Verwendung eines isoliert perfundierten Ute- rus als In-vitro-Modell. Sie führen ihre Untersuchungen an einem tragenden Schafuterus durch, der in einem künstlichen, thermostabilisierten Abdomen fixiert und mit heparinisiertem Vollblut des Muttertieres perfundiert wird. Mit Hilfe dieses Versuchsaufbaus untersuchen sie Blutzirkulation und Blutdruckverhältnisse in der fetoplazentaren Einheit sowie deren pharma- kologische Beeinflussung.
Untersuchungen am isoliert perfundierten menschlichen Uterus werden von TOJO et al.
(1972, 1976) beschrieben. Zur Perfusion verwenden sie 20 % Blut in einer physiologischen Salzlösung, das in einem geschlossenen System zirkuliert. Als Parameter für die Organvitali- tät bestimmen sie den pH-Wert, den Sauerstoff- und Kohlenstoffdioxid-Partialdruck, sowie die Lactat- und Pyruvatkonzentration im Perfusat über einen Versuchszeitraum von fünf Stunden. Desweiteren wird die Perfusion des menschlichen Uterus über einen Zeitraum von 12 bis 48 Stunden von BULLETTI et al. (1986, 1987, 1993) beschrieben. In diesen Untersu- chungen wird eine oxygenierte Krebs-Ringer-Bicarbonat-Glucose-Pufferlösung als Perfu- sionsmedium eingesetzt. Dieses Modell wird benutzt, um den Einfluß von Sexualhormonen auf das Endometrium und die elektromechanische Aktivität des Uterus zu untersuchen (BULLETTI et al. 1987, 1993).
Für physiologische und pharmakologische Untersuchungen werden auch isoliert perfundierte Uteri von anderen Spezies genutzt. SUZUE (1992, 1994) beschreibt die Verwendung von tragenden Ratten- und Mäuseuteri zur Durchführung embryologischer Studien. LANGER et al. (1993) setzen den tragenden Rattenuterus zur Untersuchung von vasokonstriktorischen Substanzen ein. Ein Vergleich des tragenden und des nicht-tragenden Kaninchenuterus hin- sichtlich ihrer basalen Prostaglandin-Synthese wird von BLOCH et al. (1983) beschrieben.
Weiterhin untersuchen sie die Stimulation der Prostaglandin-Synthese durch OT unter Be- rücksichtigung des Hormonmilieus.
Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Modell des isoliert perfundierten Rinderuterus wurde von MERTENS (2001) etabliert. Er untersucht am tyrodeperfundierten Organ die Schleimhautirritation des Endometriums durch antiseptische Lösungen sowie die Gewebe- verteilung von intrauterin appliziertem Benzylpenicillin (MERTENS 2001, BÄUMER et al.
2002).
3 Material und Methoden
3.1 VersuchsübersichtDie vorliegende Arbeit diente dem Zweck, ein Hämoperfusionsmodell des isolierten Rinder- uterus zu etablieren. Weiterhin sollte geklärt werden, ob dieses als In-vitro-Modell zur Unter- suchung des akuten Entzündungsgeschehens und dessen pharmakologischer Beeinflussung einsetzbar ist.
Die Prostaglandin-Konzentration in Gewebestanzen des Myometriums und die Regulation proinflammatorischer Enzyme dienten hierfür als Parameter. Entzündungsreize wurden durch lokale Applikation von Arachidonsäure, Arachidonoyl-Ethanolamid (Anandamid), LPS und Carrageenin gesetzt.
Als Testsubstanzen zur pharmakologischen Beeinflussung der genannten Parameter wurden das steroidale Antiphlogistikum Dexamethason, das COX-unspezifische, nichtsteroidale An- tiphlogistikum Flunixin-Meglumin sowie der COX-2-spezifische Inhibitor DFU (5,5- dimethyl-3-(3-fluorophenyl)-4-(4-methylsulphonyl)-phenyl-2-(5H)-furanon) verwendet. Zur Simulation einer systemischen Applikation wurden die Substanzen in ihrer mittleren Plasma- konzentration dem Perfusionsmedium zugesetzt. In Tabelle 1 sind die durchgeführten Versu- che zusammengefaßt dargestellt.
Tab 1: Versuchsübersicht. Die Versuchsgruppen IV-VI wurden ebenfalls mit Arachidonsäure (5 bzw. 0,1 mg) und Arachidonoyl-Ethanolamid (0,1 mg) behandelt.
Versuchs- gruppe
Anzahl
der Uteri Art der Versuche Parameter
I 14
lokale Applikation von Arachidon- säure (5 mg), Carrageenin (2 %)
und LPS (0,2 mg)
PGE2-Konzentration mRNA von COX-1 & COX-2
Vitalität
II 4
Messung von PGE2 im Mikrodia- lysat von carrageeninbehandeltem
und unbehandeltem Gewebe
PGE2-Konzentration Vitalität
III 6
lokale Applikation von Arachidon- säure (5 bzw. 0,1 mg) und Arachi-
donoyl-Ethanolamid (0,1 mg)
PGE2-Konzentration mRNA von COX-1, COX-2 &
iNOS COX-2-Protein
Vitalität
IV 5 Perfusion mit Flunixin (1 µg/ml)
PGE2-Konzentration mRNA von COX-1, COX-2 &
iNOS Vitalität
V 6 Perfusion mit DFU (0,36 µg/ml)
PGE2-Konzentration mRNA von COX-1, COX-2 &
iNOS Vitalität
VI 6 Perfusion mit Dexamethason
(0,1 µg/ml)
PGE2-Konzentration mRNA von COX-1, COX-2 &
iNOS COX-2-Protein
Vitalität
3.2 Geräte und Reagenzien
3.2.1 Geräte für die Versuche am Uterus
Wasserbad: Type 1004, GFL, Hannover Vinnhorst
Peristaltik-Schlauchpumpe: Type 103, Ole Dich, Hividovre, Dänemark
Dialysat-Pumpe: Type 2013, EHEIM, Deizisau
Dialysator: Diacap SMC 1.0 SD, Braun AG, Melsungen
Flow-Meter: Flo-Meter 111, McMilan Co., Pittsburgh, USA
Magnetrührer: MR 3001 K, Omnilab, Gehrden
Mikrodialyse:
Spritzenpumpe: Mod. Infusion 540100, Technical & Scientific Equipment GmbH, Bad Homburg
Mikrodialyseschlauch: K.J. Petersen, Department of Dermatology, Bispjeberg Hospital, Kopenhagen, Dänemark
3.2.2 Geräte zur Analytik
Microplate Reader: MRX, Dynatech Deutschland GmbH, Denken- dorf
Homogenisator: Ultra Turrax, Janke und Kunkel, Staufen Kühlzentrifuge: Centrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg Tischzentrifuge: Centrifuge 5415 L, Eppendorf, Hamburg
Rundschüttler: Reax 2000, Heidolph, Kelheim
Hybridisierungsofen: Type 7601, GFL, Hannover Vinnhorst RT-PCR:
Thermocycler: Personal Cycler, Biometra, Göttingen Agarosegelelektrophorese:
Stromversorgung: PS304, Gibco BRL, Karlsruhe Elektrophoresekammer: Agagel Mini, Biometra, Göttingen
UV-Lampe: Transilluminator TI 1, Biometra, Göttingen Western Blot:
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese:
Elektophoresekammer: Penguin Water-Cooled Dual-Gel Electrophore- sis System, Peqlab, Erlangen
Gelgießstand: Multiple Gradient Caster, Peqlab, Erlangen Transfereinheit: 2117 Multiphor II, Pharmacia LKB GmbH, Frei-
burg
Stromversorgung: Unit 1200/200, Desaga, Heidelberg
3.2.3 Reagenzien
3.2.3.1 Reagenzien für die Versuche am Uterus
Tyrodelösung: NaCl: 136 mM
NaHCO3: 11,9 mM
D-(+)-Glucose × H2O: 5,5 mM
KCl: 2,7 mM
CaCl2 × 2H2O: 1,8 mM MgCl2 × 6H2O: 1,05 mM
NaH2PO4: 0,416 mM
(Merck, Darmstadt)
Heparin: Euro OTC Pharma GmbH, Kamen
Arachidonsäure: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Arachidonyl-Ethanolamid: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Lipopolysaccharid (E.coli 0111:B4): Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim λ-Carrageenin: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Pharmaka:
Flunixin-Meglumin: Finadyne RP, Essex Tierarznei, München Dexamethason: Dexa 4 mg inject, Jenapharm, Jena
DFU: Merck, Rahaway N.J., USA
Tinte: Herlitz AG, Berlin
Dulbeccos Phosphatpuffer: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim 3.2.3.2 Bestimmung der Vitalitätsparameter
Glucose:
Glucose-Oxidase: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Peroxidase Type I: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim o-Dianisidin: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Lactat: Lactat-Testsatz, Roche, Mannheim
3.2.3.3 Proteinbestimmung
CuSO4 wasserfrei: Merck, Darmstadt
C4H4KNaO6 x 4H2O: Merck, Darmstadt Na2CO3 x 10H2O: Merck, Darmstadt Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz: Merck, Darmstadt
BSA (Fraktion V): Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim 3.2.3.4 Prostaglandinmessung
PBS (0,01M, pH 7,4): NaCl: 137 mM
KCl: 2,7 mM
KH2PO4: 1,5 mM Na2HPO4 x 2H2O: 6,5 mM (Merck, Darmstadt)
NaOH (2 N): Riedel-de Haën AG, Seelze
HCl (37 %): Merck, Darmstadt
Prostaglandin E2-Immunoassay: R&D Systems, Minneapolis, USA 3.2.3.5 RT-PCR und Western Blot
Probenaufarbeitung:
peqGold TRIFAST: Peqlab, Erlangen
peqGold OptiPure: Peqlab, Erlangen
Chloroform (+ 0,75 % Ethanol): Mallinckrodt-Baker D.V., Deventer, Holland 2-Propanol (Isopropanol): Merck, Darmstadt
Ethanol: Mallinckrodt-Baker D.V., Deventer, Holland
Laurylsulfat (SDS): Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim C2H3NaO2 wasserfrei: Merck, Darmstadt
DEPC (Diethylpyrocarbonat): Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Guanidinhydrochlorid: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim RT-PCR:
Superscript One-Step RT-PCR with
Platinum Taq: Invitrogen, Karlsruhe
RNase-Inhibitor: Roche Applied Biosystems, Mannheim
Agarose: Life Technologies, Paisley, Schottland
Ethidiumbromid: Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe SDS-PAGE:
Polyacrylamid-Stammlösung: rotiphorese Gel 30, Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan: Merck, Darmstadt Ammoniumperoxodisulfat: Merck, Darmstadt
Temed: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Glycin: Merck, Darmstadt
EDTA: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
NaN3: Merck, Darmstadt
Bromphenolblau: Merck, Darmstadt
Glycerin: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
DL-Dithiothreitol (DTT): Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Methanol: Labscan, Dublin, Irland
Essigsäure (100 %): Merck, Darmstadt
Coomassie Brillantblau G 250: Merck, Darmstadt
Molekulargewichtstandard: Amersham Biosciences, Freiburg Western Blot:
Nitrocellulosemembran: Immobilon-NC HAHY, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Blockierungslösung: Amersham cell proliferation ELISA system, Amersham Biosciences, Freiburg
Tween 20: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Ponceau S: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim BCIP/NBT-Substrat: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Primäre Antikörper:
Anti-β-Actin-IgG (Maus); Klon AC-15: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Anti-COX-2-IgG (Kaninchen);
affinitätsgereinigt: Biotrend Chemikalien GmbH, Köln Sekundäre Antikörper:
Alkalische-Phosphatase-konjugiertes Anti-
Kaninchen-IgG (Ziege); affinitätsgereinigt: Rockland, Gilbertsville, USA Alkalische-Phosphatase-konjugiertes Anti-
Maus-IgG (Schaf): Chemicon International, Hofheim/Ts
3.3 Das Modell des isoliert hämoperfundierten Rinderuterus
3.3.1 Versuchsmaterial
Die in den Versuchen eingesetzten Organe stammten von schwarzbunten Milchkühen, die am Schlachthof Gleidingen geschlachtet wurden. Die Entnahme der Uteri fand etwa 15 Minuten nach dem Entbluten statt. Es wurden nur Organe verwendet, deren Hörner zwei- bis dreifin- gerstark waren und die ein Ovar mit einem deutlich ausgeprägten Gelbkörper besaßen. Wei- terhin mußten die zu kanülierenden Gefäße unversehrt sein. Die Uteri durften bei adspektori- scher und palpatorischer Untersuchung keine Anzeichen einer Endometritis oder Trächtigkeit aufweisen.
Unmittelbar nach dem Absetzen vom Darmkonvolut wurden die Organe über die beiden Arte- riae uterinae mit 350 ml einer heparinisierten (120 IE/ml) Tyrode-Lösung infundiert, um die Blutgefäße zu spülen und eine Blutgerinnung zu verhindern.
Für die Hämoperfusion wurden direkt beim Entbluten der Tiere zehn Liter Blut aufgefangen und mit Heparin (18 IE/ml) stabilisiert. Da es aus logistischen Gründen erst nach der Organ- entnahme aufgefangen werden konnte, handelte es sich um homologes Blut.
3.3.2 Versuchsaufbau
Im Labor wurden das Gewicht der Uteri bestimmt und erste Gewebeproben genommen (Null- kontrolle). Nach Kanülierung der Aa. uterinae erfolgte über Silikonschläuche die Verbindung
des Organs mit einem Vorratsbehälter für das Perfusionsmedium. Der Durchmesser der Schläuche entsprach dem der kanülierten Gefäße. Eine Peristaltik-Schlauchpumpe sorgte für einen konstanten Fluß des Perfusionsmediums von einem Liter pro Horn und Stunde. Vor der Pumpe war ein Dialysator zwischengeschaltet, der eine ausreichende Sauerstoffsättigung des Perfusionsmediums gewährleistete. Bei der Dialysatflüssigkeit handelte es sich um acht Liter Tyrode-Lösung (pH 7,4), die in einem zweiten Kreislauf über eine Kreiselpumpe mit einer Flußrate von 0,5 l/min bewegt wurden. Die Begasung der Tyrode mit 100 % Sauerstoff sorgte für eine optimale Sauerstoffsättigung. Die Kanülierung der Venae ovaricae ermöglichte die Entnahme von Proben für die Bestimmung von Vitalitätsparametern. Sobald alle Gefäße ka- nüliert waren, wurde das Organ in ein auf 39 °C erwärmtes, tyrodehaltiges Wasserbad ver- bracht. Die Silikonschläuche für den arteriellen Zufluß liefen durch das Wasserbad, um die Temperatur des Perfusionsmediums an die des Uterus anzugleichen. Der Aufbau der Ver- suchsapparatur ist in Abbildung 7 schematisch dargestellt.
Um sicherzustellen, daß das Blut vollständig aus dem Gefäßsystem entfernt wurde, wurde der Uterus für 30 bis 45 Minuten mit Tyrode perfundiert, bevor ein Tyrode-Blut-Gemisch (1:5) verwendet wurde. Nach dem Wechsel des Perfusionsmediums war eine weitere Äquilibrie- rung von 20 Minuten nötig.
Abb. 7: Der Versuchsaufbau des isoliert hämoperfundierten Rinderuterus
