Beeinflussung der Reaktionen im Myometrium durch die Perfusion mit Antiphlogistika

Nachdem ein akutes Entzündungsgeschehen im isoliert hämoperfundierten Rinderuterus dar-stellbar ist, soll dieses in den weiteren Versuchen durch die Zugabe von antiphlogistischen Substanzen in das Perfusionsmedium beeinflußt werden. Als Modellsubstanzen werden Flunixin als unspezifischer Cyclooxygenase-Inhibitor, DFU als spezifischer COX-2-Inhibitor und Dexamethason als steroidales Antiphlogistikum eingesetzt.

5.3.1 Flunixin

Flunixin führt binnen 180 und 300 Minuten sowohl im unbehandelten als auch im arachido-noylethanolamid- bzw. arachidonsäurebehandelten Gewebe zu einer signifikanten Hemmung der PGE2-Synthese im Vergleich zu Kontrolluteri. Die inhibierende Wirkung von Flunixin ist so stark, daß die PGE2-Konzentration im unbehandelten Gewebe nach 180 Minuten sogar unter den Ausgangswert in der Nullkontrolle sinkt. Diese Ergebnisse entsprechen Beobach-tungen von ESPINASSE et al. (1994) und LANDONI et al. (1995) für das „tissue-cage“-Modell bei Rindern. Sie zeigen eine deutliche Reduktion der PGE2-Konzentration im ent-zündlichen Exsudat während eines Zeitraums von drei bis 24 Stunden nach intravenöser oder intramuskulärer Applikation von Flunixin. Weiterhin beschreiben BÄUMER und KIETZ-MANN (2001) eine mit den in den eigenen Untersuchungen vergleichbare Wirkungspotenz von Flunixin auf die arachidonsäure-induzierte PGE2-Synthese in der Haut des isoliert per-fundierten Rindereuters. Auch CAMPBELL und BLIKSLAGER (2001) zeigen im

In-vitro-Modell der I/R-Schädigung des Pferdejejunums eine deutliche Hemmung der PGE2 -Produktion durch Flunixin.

Wie erwartet zeigt sich auf mRNA-Ebene keine Beeinflussung der COX-1- und COX-2-Regulation durch die Perfusion mit Flunixin. Dieses Ergebnis spricht dafür, daß die hemmen-de Wirkung auf die Prostaglandin-Synthese aus einer alleinigen Reduktion hemmen-der Cyclooxyge-nase-Aktivität beider Isoformen resultiert. Überraschend ist dagegen die Beeinflussung der iNOS auf der mRNA-Ebene, wo eine Reduktion des Transkripts nach 300 Minuten vorhanden ist. Für Vertreter der Gruppe der Anthranilsäurederivate, zu denen Flunixin zählt, liegen in der Literatur keine diesbezüglichen Informationen vor. Jedoch beschreiben MARIOTTO et al.

(1995), daß Flurbiprofen und Nitroflurbiprofen, NSAID aus der Gruppe der Arylpropionsäu-rederivate, eine signifikante Reduktion der iNOS-mRNA im LPS-stimulierten Rattenmagen induzieren.

5.3.2 DFU

Wie Flunixin führt DFU nach 180 und 300 Minuten zu einer signifikanten Reduktion des PGE2-Anstiegs im Myometrium, jedoch in einem geringeren Ausmaß. Im Gewebe, das mit Arachidonsäure in hoher Konzentration behandelt wurde, fällt die Hemmung der PGE2 -Synthese durch DFU nach 300 Minuten signifikant schwächer aus als die Hemmung durch Flunixin. Dieser Unterschied resultiert wahrscheinlich aus der COX-2-Spezifität des DFU.

Die Bildung von Prostaglandin-E2-Ethanolamid aus AEA und PGE2 aus der niedrigen Ara-chidonsäure-Dosis wird vorwiegend durch die COX-2 katalysiert (YU et al. 1997, SHI-TASHIGE et al. 1998, KOZAK et al. 2001). Im Gegensatz dazu ist die COX-1 an der Pro-duktion von PGE2 aus der hohen Arachidonsäure-Dosis maßgeblich beteiligt. Somit ist es wahrscheinlich, daß die unter DFU-Perfusion erfolgende PGE₂-Bildung im mit 5 mg Arachi-donsäure behandelten Gewebe auf die Aktivität der COX-1 zurückzuführen ist. Diese Beob-achtung entspricht Ergebnissen von CAMPBELL und BLIKSLAGER (2001) im I/R-geschädigten Pferdejejunum. Vergleichbar zu den eigenen Untersuchungen zeigen sie eine vollständige Hemmung der Eicosanoid-Synthese durch Flunixin, während der spezifische COX-2-Inhibitor Etodolac eine wesentlich geringere Inhibition der PGE₂-Produktion hervor-ruft. Auch für das Modell der arachidonsäureinduzierten Entzündung des Mäuseohrs werden ähnliche Ergebnisse beschrieben (PUIGNERÓ u. QUERALT 1997). Hier führt eine topische

Applikation von Indometacin zu einer Reduktion der Prostaglandin-Konzentration um 80 %, während durch die spezifischen COX-2-Inhibitoren Flosulid und L-745,337 lediglich eine Verminderung um 34 bzw. 43 % erreicht wird. Die Ergebnisse der RT-PCR sprechen dafür, daß DFU auf mRNA-Ebene keinen Einfluß auf die Regulation der Cyclooxygenasen und der iNOS hat.

5.3.3 Dexamethason

Auch unter der Perfusion mit Dexamethason zeigt sich eine signifikante Hemmung des PGE₂ -Anstiegs im unbehandelten und arachidonoylethanolamid- bzw. arachidonsäurebehandelten Myometrium nach 180 und 300 Minuten. In Gewebe, das mit AEA und der hohen Dosis Ara-chidonsäure behandelt wurde, ist die Hemmung im Vergleich zu flunixinperfundierten Uteri signifikant schwächer ausgeprägt. Gegenüber der DFU-Perfusion ist eine ebenfalls signifikant geringere Inhibition der Cyclooxygenase-Aktivität lediglich nach 180 Minuten im AEA-behandelten Myometrium zu verzeichnen.

In Tiermodellen des akuten Entzündungsgeschehens wird für Dexamethason eine mit den eigenen Untersuchungen vergleichbare Wirkung auf die Prostaglandin-Synthese beschrieben (MASFERRER et al. 1990, UTSUNOMIYA et al. 1994, HARADA et al. 1996, ZHANG et al. 1997, KAWAMURA et al. 2000). Hervorgerufen wird sie hierbei vor allem durch eine über intrazelluläre Rezeptoren mediierte Herunterregulation der COX-2 auf mRNA- und Protein-Ebene. Diese Wirkung auf die COX-2-Expression kann in den eigenen Untersuchun-gen weder in der RT-PCR noch im Western Blot gezeigt werden. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Latenz, mit der die Wirkung von Glucocorticoiden eintritt. Diese Tatsache be-gründet sich darin, daß eine Hemmung der Transkription und Translation über eine vermin-derte Synthese von biologischen Makromolekülen (Nukleinsäuren und Proteine) erfolgt.

Wurden die Makromoleküle bereits vor dem Wirkungseintritt der Glucocorticoide gebildet, so ist eine Beeinflussung erst nach ihrer Degradation erkennbar. In Abhängigkeit von der Stabi-lität von RNA und Protein geht der Abbau unterschiedlich schnell von statten.

In den eigenen Untersuchungen werden Antiphlogistika mit dem Beginn der Blutperfusion, im Prinzip also zeitgleich mit dem inflammatorischen Stimulus verabreicht. Da die I/R-Schädigung zu einer sehr schnellen und massiven Hochregulation der COX-2 auf der mRNA-Ebene führt (MARICIC et al. 1999, DOMOKI et al. 1999, BRZOZOWSKI et al. 1999, DÉGI

et al. 2001) ist es wahrscheinlich, daß vor dem Wirkungseintritt von Dexamethason eine aus-reichende Kumulation des Transkripts stattfindet, so daß dieses nach 300 Minuten in noch unveränderter Menge vorhanden ist. Bei einer längeren Versuchsdauer könnte es möglich sein, einen Effekt der Dexamethasonperfusion auf die Regulation der COX-2-mRNA zu zei-gen. Es jedoch fraglich, ob eine ausreichende Verlängerung der Versuche am isoliert hä-moperfundierten Rinderuterus hinsichtlich der Vitalität des Modells praktikabel ist. Aus die-sem Grund ist eine Vorinkubation mit Dexamethason während der ersten Äquilibrierungspha-se zur Klärung dieÄquilibrierungspha-ser Fragestellung erfolgversprechender.

Da eine verminderte Expression der COX-2 als Ursache der Hemmung der PGE2-Synthese ausgeschlossen werden kann, muß Dexamethason seine Wirkung über einen anderen Mecha-nismus entfalten. Eine dexamethason-induzierte Modulation der Phospholipase A₂ könnte einen Einfluß auf die PGE2-Konzentration im unbehandelten Gewebe zeigen, da ihre Aktivität zu einer erhöhten Freisetzung von Arachidonsäure aus der Zellmembran führt. Jedoch kann eine solche Wirkung für das mit AEA und Arachidonsäure behandelte Myometrium ausge-schlossen werden, da die exogene Zufuhr der Substrate diese Stufe in der Eicosanoidsynthese umgeht.

Einen möglichen Erklärungsansatz liefert das Ergebnis der RT-PCR hinsichtlich der Regula-tion der iNOS. Während nach 180 Minuten eine mit Kontrolluteri vergleichbare Hochregula-tion der mRNA beobachtet werden kann, führt Dexamethason nach 300 Minuten zu einer Reduktion des Transkripts. NO wird in der Literatur als ein wichtiger Cofaktor der Cyclooxy-genase-Aktivität beschrieben (SALVEMINI et al. 1993, 1995). Tatsächlich könnte dieser Zu-sammenhang eine große Bedeutung für die Prostaglandin-Produktion im Rahmen der I/R-Schädigung haben. Der Hintergrund ist hierbei der Umstand, daß in der Reperfusionsphase aus NO und dem Superoxidradikal große Mengen Peroxynitrit gebildet werden (CARDEN u.

GRANGER 2000, CHAN 2002). Das sehr reaktive Peroxynitrit stellt wiederum einen poten-ten Aktivator der Cyclooxygenase dar, da es zur Bildung des Tyrosinradikals im aktiven Zen-trum des Enzyms führt (LANDINO et al. 1996), was allgemein als Auslöser der Cyclooxyge-nase-Reaktion angesehen wird (HINZ u. BRUNE 1999, MARNETT et al. 1999). Es muß je-doch bedacht werden, daß – für den Fall, daß den eigenen Ergebnissen ein solcher Mechanis-mus zugrunde liegt – dies höchstwahrscheinlich nicht die alleinige Erklärung für die Wirkung

von Dexamethason sein kann, zumal nach 180 Minuten keine Beeinflussung der iNOS vor-handen ist.

Somit müssen weitere posttranslationelle Mechanismen bestehen, mit denen sich die Inhibi-tion der PGE2-Synthese durch die Perfusion mit Dexamethason erklären läßt. Eine direkte Wirkung der Glucocorticoide auf die COX-2-Aktivität wird von UNGEMACH (1999) und AMMON (2000) zwar erwähnt, jedoch finden sich diesbezüglich keine eindeutigen Hinweise in der Literatur. Dagegen stellen NEWTON et al. (1998) fest, daß die dexamethason-induzierte Hemmung der COX-2-Expression und PGE2-Freisetzung in IL-1β-stimulierten, menschlichen A549-Zellen nicht allein über transkriptionelle Mechanismen erfolgen kann.

Sie vermuten weitere, posttranskriptionelle oder posttranslationelle Einflüsse. Bestätigt wird diese Annahme durch Untersuchungen von STICHTENOTH et al. (2001), die zeigen, daß in primären rheumatoiden Synovialzellen neben der COX-2 auch die Expression der PGE-Synthase durch Dexamethason gehemmt wird. Obwohl die Beeinflussung der PGE-PGE-Synthase im isoliert hämoperfundierten Rinderuterus nicht untersucht wurde, ist eine vergleichbare Wirkung denkbar. So zeigen verschiedene Autoren, daß im Uterus des Rindes eine Co-Expression von COX-2 und PGE-Synthase sowohl unter physiologischen Bedingungen (Se-xualzyklus) als auch auf einen Reiz hin induziert erfolgt (PARENT et al. 2002, AROSH et al.

2002).