Die beiden übergeordneten Gruppen SpTx POD 0 und SpTx POD -28 wurden jeweils noch in drei Untergruppen unterteilt: Beide Gruppen beinhalteten eine Kontrollgruppe, welche zwar zum entsprechenden Zeitpunkt dem Donor-Antigen ausgesetzt wurde, jedoch keine begleitende Induktionstherapie erhielt (KoGru SpTx POD 0/-28). Außerdem waren die Arten der Induktion innerhalb der Gruppen unterschiedlich. Ein Teil der Tiere in jeder Gruppe wurde für die Induktion bestrahlt (IRR+SpTx POD 0/-28), der übrige Teil erhielt zur Induktion Anti-Lymphozyten-Antikörper (mAb+SpTx POD 0/-28).
Gruppe Protokoll Anzahl der Tiere
KoGru SpTx POD 0 perioperativ SpTx 4
IRR+SpTx POD 0 IRR 12 Stunden präOP, perioperativ SpTx 9
mAb+SpTx POD 0 perioperativ mAb +SpTx 4
KoGru SpTx POD -28 SpTx POD -28 5
IRR+SpTx POD -28 IRR POD -28, SpTx POD -27 3
mAb+SpTx POD -28 mAb POD -28, SpTx POD -27 9
Table 3.2: ÜBERSICHT DER IM RAHMEN DIESER ARBEIT MITEINANDER VERGLICHENEN VERSUCHSGRUPPEN mit Benennung der einzelnen Gruppen, dem jeweils angewandten Protokoll und der untersuchten Tierzahl.
3.8.1 Isolation peripherer Blutlymphozyten
Zur Isolation der mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) wurde eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Hierbei trennen sich die in Lösung befindlichen Zellen aufgrund ihrer Größe und ihres spezifischen Gewichts. Dafür wird die zu untersuchende Probe auf die Oberfläche eines Lösungsmittels mit definierter Dichte gegeben (z.B. Ficoll). Durch diese diffundieren die Blutbestandteile hindurch, die eine höhere Dichte als das Lösungsmittel haben (z.B. Erythrozyten). Bestandteile mit geringerer Dichte (z.B.
Leukozyten) verbleiben an dessen Oberfläche. Nach der durch Zentrifugation beschleunigten Auftrennung können nun die voneinander abgetrennten Zellfraktionen einzeln entnommen werden (156). In unserem Labor wurden je 20 ml heparinisiertes Vollblut im Verhältnis 1:1 mit steriler, 4°C kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, Invitrogen Limited, Paisley, Schottland) verdünnt und das Gemisch auf 10 ml Ficoll (Ficoll PaqueTM PLUS, Biotech, Uppsala, Schweden) in einem 50 ml Falcon-Tube (Sarstedt AG und Co., Nümbrecht, Deutschland) überschichtet. Im Anschluss an eine 20-minütige Zentrifugation bei 2000 rpm und 20°C (Allegra X-15R, Beckmann Coulter, München, Deutschland) konnte der Leukozytenrasen auf der oberen Grenze der Ficollschicht abgenommen und in ein 15 ml Falcon-Tube überführt werden. Zweimaliges Waschen mit 15 ml PBS entfernte vorhandene Ficoll-Reste. Nach Dekantieren wurden die isolierten Zellen mit PBS auf ein definiertes Volumen von 1 ml aufgefüllt. 10 μl der so gewonnenen Leukozytenfraktion wurden in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt AG und Co., Nümbrecht, Deutschland) überführt und mit 990 μl 0,05-prozentigem Trypan-Blau (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) gefärbt. Die Bestimmung der Zellzahl pro ml Eluat erfolgte manuell mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer (eine gezählte Zelle entsprach in der verwendeten Verdünnung einer Million Zellen pro ml). Die Zellsuspension wurde bis zur Weiterverarbeitung bei 4°C gelagert. Zu konservierende Zellen wurden im Verhältnis 1:1 mit 10 % fetalem Kälberserum (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) und Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in 1,8 ml Cryoröhrchen (Nunc Cryo TubeTM Vials, Wiesbaden, Deutschland) bei -80°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
3.8.2 Durchflusszytometrische Analyse
Die Durchflusszytometrie ist ein Verfahren, bei dem Zellen aufgrund ihrer Größe, Granularität und Färbung mit fluoreszierenden Farbstoffen unterschieden werden. Die in Lösung befindlichen Zellen werden durch eine Kapillare einzeln an einem Laserstrahl
Fluoreszenzimpulse werden gemessen. Anhand des Vorwärtsstreulichts (FSC, Forward Scatter) werden Zellen anhand ihrer Größe unterschieden. Das Seitwärtsstreulicht (SSC, Side Scatter) stellt ein Maß für die Granularität der Zellen dar. Diese beiden Parameter ermöglichen eine gute Differenzierung der Leukozyten von anderen mononukleären Zellen oder Zelltrümmern. Zur weitergehenden Unterscheidung werden die Zellen mit antikörpergebundenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Durch den Einsatz unterschiedlicher Farbstoffe sowie Laser unterschiedlicher Wellenlänge kann man mehrere Oberflächenantigene in einer Probe bestimmen (157).
Je 200.000 PBMC wurden in FACS-Röhrchen mit Rundboden (Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland) überführt und vor dem ersten Färbeschritt mit 15 μl porzinem Serum (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) bei 4°C für 10 Minuten inkubiert. Dadurch wurden unspezifische Bindungsstellen geblockt. Für Antikörperfärbungen, bei denen der Antikörper nicht mit seinem Fluoreszenzfarbstoff als Konjugat vorlag, erfolgte die Färbung mit antigenspezifischen Primär- und Sekundärantikörpern in zwei aufeinanderfolgenden Schritten. Der Primärantikörper wurde spezifisch für das zu charakterisierende Oberflächenantigen der Zelle gewählt. Der gewählte Sekundärantikörper entsprach in seiner Spezifität dem Ig-Subtyp des verwendeten Primärantikörpers. Jeder Färbeschritt beinhaltete eine 20 minütige Inkubation bei 4°C unter Lichtausschluss. Ungebundene Antikörper wurden nach Waschen mit 1,5 ml PBS und vierminütiger Zentrifugation bei 1600 rpm und 4°C mit dem Überstand dekantiert.
3.8.3 Verwendete Antikörper
Das Markieren von Zelloberflächenstrukturen durch spezifische Antikörper, welche wiederum mit bestimmten Farbstoffen markiert sind, macht es möglich, verschiedene Zell- und Zellsubpopulationen durchflusszytometrisch zu differenzieren und so den immunologischen Phänotyp zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Lymphozyten des peripheren Bluts mit Hilfe verschiedener Oberflächenantigene charakterisiert. Da CD3 auf allen T-Zellen vorkommt, wurde ein entsprechender Antikörper verwendet, um diese Zellen sichtbar zu machen. CD4 besitzt als spezifischer Rezeptor für MHC II Moleküle eine Schlüsselfunktion in der Antigenerkennung durch T-Helferzellen. CD8 ist Teil des spezifischen Rezeptors der zytotoxischen T-Zelle für MHC I Moleküle. Ein Marker für aktivierte T-Lymphozyten ist CD25, die α-Kette des IL-2 Rezeptors, welcher erst nach erfolgreicher Antigenerkennung
(158). Folgende Antikörper fanden Verwendung:
• CD3ε mAb, Klon: PPT3, mouse anti-pig, FITC-konjugiert (Abcam, Cambridge, UK)
• CD25 mAb, Klon: PGBL25A, mouse anti-pig (Kingfisher Biotech, MN, USA)
• CD4a mAb, Klon: 74-12-4, mouse anti-pig, FITC-konjugiert (Southern Biotech, AL, USA)
• CD8a mAb, Klon: 76-2-11, mouse anti-pig, PE- konjugiert (Abcam, Cambridge, UK)
Da CD25 mAb nicht mit seinem Farbstoff als Konjugat erhältlich war, wurde er mit folgendem Sekundärantikörper gefärbt:
• R-Phycoerythrin-(PE) konjugierter rat anti-mouse IgG1 mAb, Klon: A85-1 (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)
Die Induktionstherapie einiger Tiere erfolgte in diesem Experiment durch selbst produzierten anti-CD4 mAb (Klon 74-12-4) beziehungsweise anti-CD8 mAb (Klon 76-2-11). Um sicherzugehen, dass bei einem fehlenden Signal diese Zellen tatsächlich durch die vorangegangene Antikörpergabe aus dem Organismus eliminiert worden waren, und nicht nur die Bindungsstellen für die Antikörper schon besetzt waren, wurden die Zellen dieser Schweine zusätzlich mit einem jeweils unterschiedlichen Klon für CD4 bzw. CD8 Moleküle angefärbt:
• CD4a mAb, Klon: MIL-17, mouse anti-pig, FITC-konjugiert (AbD Serotech, Puchheim, Deutschland)
• CD8a mAb, Klon: MIL-12, mouse anti-pig, PE/Cy5-konjugiert (AbD Serotech, Puchheim, Deutschland)
In Tabelle 3.3 sind die Antikörper und deren verwendete Mengen aufgeführt. Einige Antikörper fanden in einer 1:10er Verdünnung Verwendung, der Sekundärantikörper war im Verhältnis 1:5 mit PBS verdünnt. Um ausschließen zu können, dass der Sekundärantikörper unspezifisch an die PBMC bindet, wurde eine Isotypkontrolle mitgeführt.
10 µl IgG1 PE
Tabelle 3.3: BEISPIEL FÜR EIN FÄRBEPROTOKOLL ZUR DURCHFLUSS-ZYTOMETRISCHEN ANALYSE. Nach jedem Färbeschritt erfolgte ein Waschschritt mit 1,5 ml PBS. Tube (Röhrchen) 1 beinhaltet die Isotypkontrolle des Sekundärantikörpers für CD25.
Die Datenauswertung erfolgte mit Hilfe der Software FACSDiva (BD, New Jersey, USA) und Windows XP. Zur Ermittlung der absoluten Zellzahl wurde der durch FACSDiva ermittelte prozentuale Anteil der analysierten Lymphozytensubpopulationen in Bezug gesetzt zur absoluten Lymphozytenzahl aus dem Differentialblutbild.
3.9 Untersuchungen zum Spenderzellchimärismus
Zum Nachweis Y-chromosomaler Spenderlymphozyten im peripheren Blut des Empfängers wurde eine SybrGreen R Real Time Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) durchgeführt. Des Weiteren wurde mithilfe der RT-PCR der Anteil Y-chromosomaler DNA in den Spenderlungen sowie in den rechten autologen Lungen zum Zeitpunkt der elektiven Euthanasie bestimmt. Y-Chromosom-spezifische Sequenzen ermöglichen nach Transplantationen die Detektion verbleibender männlicher Zellen in einem weiblichen Empfängerorganismus (159). Da für die Durchführung der Real Time PCR die Proben gepoolt wurden und die Messung erst nach Versuchsende stattfand, wurden zunächst, wie unter 3.8.1 beschrieben, von jedem Tier an den Kontrolltagen (siehe Abb. 3.3), 1x106 PBMC gewonnenen und die Zellen in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Deutschland) bei -80°C als Pellet eingefroren. Auch die Lungengewebeproben wurden als etwa 0,8 cm3 große Biopsien bei -80°C kryokonserviert. Die spätere chromatographische Isolation der dsDNA (Doppelstrang-DNA) erfolgte gemäß Herstellerangaben mit dem NucleoSpin Tissue Kit (Machery&Nagel, Düren, Deutschland). Zur Bestimmung von Reinheit und Konzentration der DNA Lösungen wurde deren optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 und 280 nm photometrisch bestimmt (Eppendorf Bio-Photometer No.
pro Reaktionsansatz 100 ng dsDNA benötigt wurden, wurde zur Vereinfachung die Konzentration direkt auf 100 ng/10 μl eingestellt. Zum Nachweis Y-chromosomaler dsDNA wurde ein Primerpaar verwendet, das eine 185 Basenpaare (bp) lange, Eberspezifische Sequenz (Male Specific Repeat, MSR) auf dem Y-Chromosom detektiert:
Male Specific Repeat (MSR)
5’ - CCA TCG GCC ATT GTT TTC CTG TTC A - 3’
5’ - CCT CTG TGC CCA CCT GCT CTC TAC A - 3’
Zur Quantifizierung und Qualitätskontrolle der dsDNA wurde ein 184 bp langes Intron aus dem porzinen S100C Gen amplifiziert. Zur relativen Quantifizierung wurde die Menge Y-chromosomaler DNA auf den S100C Gehalt in derselben Probe bezogen. Folgendes Primerpaar wurde verwendet:
S 100C
5’ - ATG CTG GAA GGG ACG GTA ACA ACA - 3’
5’ - GCT CAG CTG CTG TCT TTC ACT CGT - 3’
Alle Primer wurden von der Firma Invitrogen life technologies (Paisley, Großbritannien) synthetisiert und in einer Endkonzentration von 10 pmol/μl eingesetzt. Alle Reaktionen erfolgten im Zweifachansatz. Zur Minimierung von Pipettierfehlern wurde aus IQTM SYBR®Green Supermix (BIORAD, Hercules, CA, USA), Wasser und den beiden Primerpaaren im Parallelansatz ein Mastermix vorgemischt.
Ein Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:
Anzahl der benötigten Reaktionen n zu ermitteln wurde eine Verdünnungsreihe aus rein männlicher dsDNA in folgenden Verdünnungsstufen erstellt: 100 %, 50 %, 20 %, 10 %, 1 %, 10-1 %, 10-2 %, 10-3 %. Diese wurden in der anschließenden PCR als Template eingesetzt. Anhand der erstellten
bestimmt. Abb. 3.5 zeigt eine so ermittelte Standardeichkurve.
Abb. 3.5: BIORAD ICYCLER-SOFTWARETM ERMITTELTE STANDARDEICHKURVE FÜR DEN MSR-PRIMER. Punkte in Blau stellen den definierten Standard dar, entlang der Y-Achse sind die Verdünnungsstufen angetragen (10-3 bis 102). Auf der daraus resultierenden Regressionsgeraden sind die analysierten Werte der vorher unbekannten Proben (Unknowns) in Rot angesiedelt.
Die optimalen PCR-Bedingungen wurden von Bianca Kruse im Rahmen ihrer Dissertation zu diesem Thema ermittelt (142). Nach der PCR-Reaktion erfolgte die Auswertung unter Benutzung der BIORAD iCycler-SoftwareTM Version 3.1 (BIORAD, Hercules, CA, USA).
Das Mittel der durch die Software analysierten Ausgangskonzentration (Starting Quantity = SQ Mean) des Housekeepinggens S100C, sowie des nachzuweisenden MSR, wurde mit Excel zueinander in Bezug gesetzt. Der daraus resultierende Mittelwert der Positivkontrollen wurde als 100% angenommen und die Ergebnisse der zu messenden Proben darauf bezogen.
3.10 Gewinnung monoklonaler Antikörper für die Induktionstherapie
Die Kultivierung der Hybridoma-Zelllinien ATCC® HB-147™ (für den CD4 mAb 74-12-4), sowie ATCC® HB-143™ (für den CD8 mAb 76-2-11), welche die Antikörper exprimierten und sezernierten, erfolgte in Zellkulturflaschen für Suspensionszellen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) unter sterilen Bedingungen in serumfreiem ISF-1 Medium (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) in einem Brutschrank (Modell MCO-20AIC, SANYO Electric Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japan) bei 37°C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit. Alle drei Tage bzw. bei Verfärbung des Mediums wurde die Suspension in ein 50 ml Falcon (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) überführt und bei 1500 rpm vier Minuten lang abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde gedrittelt, erneut in Zellkulturflaschen mit Medium überführt und weiterhin
Vakuumfilter mit einer Porengröße von 0,22 µm (TPP, Trasadingen, Schweiz) sterilfiltriert und im Verhältnis 1:1 mit einem Bindungspuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7; Merck, Darmstadt, Deutschland) versetzt. Eine definierte Menge dieses Gemisches wurde dann mit Hilfe eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC; Äkta Prime Plus, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) durch eine Säule geleitet, welche mit einer Protein G-haltigen Gelmatrix gefüllt war (HiTrap Protein G HP, ebenfalls GE Healthcare). Dabei banden die Immunglobuline an das Protein G und wurden zurückgehalten, während die restliche Flüssigkeit abgeleitet wurde. Mithilfe eines Elutionspuffers (0,1 M Glycin-HCl, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland), dessen pH-Wert sich im sauren Bereich (2,0-2,8) befand, wurden anschließend die Immunglobuline vom Protein G gelöst und ausgewaschen.
Zur Schonung der Antikörper war in den Auswurfröhrchen für das Eluat 1 M Tris-Puffer (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) vorgelegt, sodass der saure Elutionspuffer auf einen pH von 7 abgepuffert wurde. Nach erneuter Sterilfiltration des Eluats wurde aus dem Pool einer Tagesproduktion jeweils ein Aliquot zur Quantifizierung abgenommen und mittels Bradford Assay (Quick StartTM Bradford Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, CA, USA) photometrisch bei OD 595 nm gemessen. Abhängig von der Produktivität der Hybridoma-Zellen und dem daraus resultierenden Ausgangsgehalt an Antikörpern im Überstand, schwankte der gemessene Proteingehalt zwischen 0,1 und 0,4 mg/ml. Bis zu ihrer Verwendung wurden die gewonnenen Antikörper bei -20°C gelagert.
Bevor sie den Tieren verabreicht wurden, wurde die komplette Produktion gepoolt, der pH-Wert mit Hilfe von 2 molarer Natronlauge (TitriPUR®, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) an einem pH-Meter (Labor-pH-Meter 765, Knick, Berlin, Deutschland) auf 7,35 eingestellt und ein letztes Mal sterilfiltriert.
3.10.1 Qualitätskontrolle der gewonnenen Antikörper
Da die Gewinnung der Antikörper unter Laborbedingungen (S2 Gen-Labor, keine Reinräume) stattfand, war trotz gewissenhaften Arbeitens die Gefahr von Kontaminationen des Eluats nicht auszuschließen. Darum wurden regelmäßige Qualitätskontrollen durchgeführt. Die Kontrolle zur Reinheit der Antikörper wurde mittels SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) durch das Institut für zelluläre Chemie der MHH durchgeführt. Außerdem wurden Aliquots der gewonnenen Antikörper vor, sowie nach der finalen Sterilfiltration im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der MHH auf ihren mikrobiellen Status untersucht.
Starnberger See, Deutschland) ein Assay etabliert, um Endotoxine nachweisen zu können.
Dafür wurden 100 µl der zu untersuchende Probe in den Verdünnungsstufen unverdünnt, 1:1, 1:4, 1:8, 1:16 und 1:32 (jeweils verdünnt mit endotoxinfreiem Wasser) zusammen mit 20 µl Bindungspuffer auf eine mit Phagen-Protein beschichtete Mikrotiter-Platte pipettiert. Durch dieses Protein wurden die vermeintlichen Endotoxine spezifisch an eine Mikrowell-Festphase gebunden. Neben der zu untersuchenden Probe wurde zusätzlich eine Standardreihe in folgenden Konzentrationen mit pipettiert: 50 EU/ml, 5 EU/ml, 0,5 EU/ml, 0,05 EU/ml, 0,005 EU/ml, 0 EU/ml (EU=Endotoxin Units). Alle Ansätze erfolgten in Zweifachbestimmung.
Nach einer 18-stündigen Inkubation (Universal-Wärmeschrank UNB 400, Memmert, Schwabach, Deutschland) bei 37°C auf einem Schüttler mit 45 rpm (Stuart® Mini Gyro-rocker SSM3, Bibby Scientific Ltd., Staffordshire, UK) erfolgte ein Waschschritt, bei dem potentiell störende Substanzen der Probenmatrix entfernt wurden. Im Anschluss wurde jedes Well mit 100 µl eines sogenannten Assay-Reagents versehen, welches den rekombinanten Faktor C und ein fluoreszierendes Substrat enthielt, und in einen Fluoreszenzdetektor (PARADIGM™ Detection Platform, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) verbracht, der auf 37°C vorgeheizt war. Bis auf das eingesetzte Probenmaterial entstammten alle verwendeten Reagenzien dem EndoLISA®-Kit. Im Fluoreszenzdetektor wurden die relativen Fluoreszenz-Einheiten (RFU) bei einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Ausgabewelle von 465 nm detektiert. Für jedes Well erfolgten direkt nach Verbringung in den Detektor (Null-Zeitpunkt) zehn Messungen. Nach 90-minütiger Pause fand ein zweites Reading statt, bei dem erneut jedes Well zehnmal gemessen wurde. Zur Berechnung des Endotoxingehaltes wurden die zehn Messungen des jeweils ersten und zweiten Readings gemittelt und im Anschluss die Werte des Null-Zeitpunktes von den entsprechenden Werten der Messung nach 90 Minuten abgezogen. Danach wurde noch von allen Werten der für den Blank der Standardreihe ermittelte Wert abgezogen. Aus diesen RFU wurde nun der Logarithmus berechnet. Der log(Signal-Blank) des eingesetzten Standards (Y-Achse) wurde gegen den Logarithmus der bekannten Konzentrationen log(EU/ml) des Standards aufgetragen (X-Achse). Dadurch konnte mit Hilfe von Graph Pad Prism (Version 6.04 for Windows, GraphPad Software Inc., San Diego, CA 92121, USA) die Standardkurve berechnet werden. Anhand der ermittelten Regressionsformel konnte dann der log(EU/ml) der Proben berechnet werden, was nach Umkehrung des Logarithmus zum endgültigen Ergebnis der Proben (EU/ml) führte.
- 2 .3 - 1 .3 - 0 .3 0 .7 1 .7
Abb. 3.6: BEISPIEL EINER ERMITTELTEN STANDARDKURVE AUS DEM ENDOLISA®. Das Bestimmtheitsmaß (r2) liegt hier bei 95%. Die sich daraus ergebende Regressionsgleichung musste wie folgt umgestellt werden, um den log(EU/ml) der jeweiligen Probe zu erhalten: x=(y-7,456)/1,066.
3.10.2 Nachweis von überschüssigen Antikörpern im peripheren Blut
Da die ausreichende, zu verabreichende Menge der selbst produzierten Antikörper auf Schätzungen bzw. den wenigen dazu vorhandenen Veröffentlichungen beruhte (148), wurde im Anschluss an die Experimente das Serum der Tiere vor sowie bis zu 10 Tage nach Verabreichung der Antikörper, auf sich darin befindliche, freie Antikörper untersucht. Dazu wurden jeweils 100 µl Serum der Tiere #214207, #214301, #216042 und #216108 zu den Zeitpunkten POD -28 (vor Antikörpergabe), POD -27 (24 Stunden nach mAb-Gabe), POD-26 (2 Tage nach nach mAb-Gabe), POD -24 (4 Tage nach mAb-Gabe), POD -22 (6 Tage nach mAb-Gabe), POD -20 (8 Tage nach mAb-Gabe) sowie POD -18 (10 Tage nach mAb-Gabe) mit 2 x 105 PBMC eines naïven Minipigs für 20 Minuten bei 4°C unter Lichtausschluss in einem Rundboden FACS-Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) inkubiert. Die Zellen waren zuvor wie unter 3.8.1 beschrieben aus heparinisiertem Vollblut isoliert und unspezifische Bindungsstellen mit porzinem Serum (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) geblockt worden. Nach einem Waschschritt mit PBS (Invitrogen Limited, Paisley, Schottland) wurde den Zellen der an den Farbstoff FITC gekoppelte Isotyp des im Serum vermuteten Antikörpers hinzugefügt. Für Tiere, welchen nur CD4 mAb verabreicht wurde, war das Rat Anti-Mouse IgG2b, Klon 12-3 (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). Für Tier #214207, welches zusätzlich CD8 mAb erhalten hatte, wurden die Zellen außerdem mit dem Isotyp Anti-Mouse IgG2a, Klon R19-15 (ebenfalls BD) bei 4°C für 20 Minuten unter Lichtausschluss inkubiert. Pro Röhrchen wurden 10 µl des Isotyps in einer 1:10 Verdünnung
mit dem Isotyp ohne vorherige Inkubation mit Serum) mitgeführt. Im Anschluss an einen letzten Waschschritt wurden die Zellen durchflusszytometrisch untersucht. Da der FITC-gekoppelte Isotyp nur an den CD4 bzw. CD8 mAb bindet, konnte nur im Falle einer vorherigen Antikörperbindung an die Zellen im FACS ein positives Fluoreszenzsignal detektiert werden. Somit lieferte dieser Test eine qualitative Aussage über das Vorhandensein von freiem CD4 bzw. CD8 mAb im untersuchten Serum. Abb. 3.7 zeigt wie es zu solch einem positiven Signal kommen konnte.
Abb. 3.7: BINDUNG VON FREIEM MONOKLONALEN CD4 ANTIKÖRPER AN SEINE SPEZIFISCHE BINDUNGSSTELLE AUF DER MINIPIG-ZELLE. In einem zweiten Schritt wurde der für die Fc-Region des CD4 mAb spezifische Zweitantikörper, konjugiert an einen Fluoreszenzfarbstoff, hinzugegeben. Dieser band nun an CD4 mAb und konnte anschließend durch seinen Farbstoff FITC durchflusszytometrisch sichtbar gemacht werden.
3.10.3 Effekt der verabreichten Antikörper auf mononukleäre Zellen in vitro
Um die Wirkung der generierten Antikörper in vitro überprüfen und nachvollziehen zu können, wurde ein Antikörperplattenstimulationsassay durchgeführt. Dazu wurde eine 96-Well Rundbodenplatte (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) über Nacht bei 4°C mit 0,16 µg/Well Goat F(ab´)2 Fragment anti-Maus IgG (Beckman Coulter, FL, USA) inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS (Invitrogen Limited, Paisley, Schottland) wurden im Dreifachansatz jeweils 0,8 µg der in den Versuchen eingesetzten anti-CD4 bzw. anti-CD8 Antikörper in die mit F(ab´)2 Fragment benetzten Wells gegeben und für mindestens 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Um später unspezifische Reaktionen von spezifischen
Dreifachansatz) angelegt. Die benötigten PBMC wurden, wie unter 3.8.1 beschrieben, aus dem Blut eines noch nicht behandelten Göttinger Minipigs isoliert und in Zellkulturmedium (RPMI 1640 mit 2 mM L-Glutamin, GIBCO life technologies, Carlsbad, CA, USA) mit 1 % Fetalem Bovinen Serum (Biochrom, Berlin, Deutschland) auf eine Konzentration von 1x106 PBMC pro ml Medium eingestellt. Anschließend wurden in jedes Well 200 µl (≙ 2x105 Zellen/Well) der Zellsuspension überführt. Als Negativkontrollen dienten ein Ansatz mit F(ab´)2 Fragment und PBMC ohne Zweitantikörper, sowie ein weiterer Ansatz, bei dem die PBMC in Wells pipettiert wurden, die zuvor nicht mit F(ab´)2 Fragment inkubiert worden waren. Derselbe Ansatz wurde unter Zusatz von 2 U/Well rekombinantem porzinem IL-2 (Biosource, Camarillo, CA, USA) ein weiteres Mal pipettiert. Dadurch sollten falls nötig die T-Zellen zusätzlich stimuliert werden. Abb. 3.8 zeigt das hier verwendete Pipettierschema.
Folgende Isotypkontrollen fanden Verwendung:
• Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody, Klon: MPC-173 (BioLegend, CA, USA), für anti-CD8 mAb 76-2-11
• Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody, Klon: MPC-11 (BioLegend, CA, USA), für anti-CD4 mAb 74-12-4
Für die nächsten 48 Stunden wurde die so fertiggestellte Platte in einen Brutschrank verbracht und bei 37°C, 5 % CO2 und einer Luftfeuchtigkeit von 100 % bebrütet. Um mikrobiellem Befall vorzubeugen befand sich die Platte während der gesamten Zeit in einer sterilen Metallkiste. Nach 24 Stunden wurde aus jedem Well 100 µl Überstand abgenommen und durch den Zusatz von 100 µl frischem Medium substituiert. Nach 48 Stunden wurden schließlich die PBMC geerntet, die Dreifachansätze gepoolt und durchflusszytometrisch nach dem unter 3.8.3 beschriebenen Protokoll untersucht.
Abb.3.8: PLATTENBELEGUNG DES ANTIKÖRPERPLATTENSTIMULATIONS-ASSAYS IN EINER 96-WELL RUNDBODENPLATTE MIT DECKEL. Zum Schutz vor Verdunstung wurden die sich am Rand befindlichen Wells mit PBS befüllt.
3.11 In Vivo Untersuchung der immunologischen Mechanismen anhand von porzinisierten Mäusen
Um das Schicksal der transplantierten Lungen in den Miniaturschweinen mechanistisch besser untersuchen zu können, ließen wir in einem adoptiven Transfer-Modell den Versuch parallel noch einmal „in kleiner“ ablaufen. Dazu wurde ein kleines Stück Bronchus der rechten, nicht verwendeten Lunge des Spender-Minipigs subkutan in die linke Halsunterseite einer NOD.rag-/-γc-/- (NRG) Maus transplantiert. Die heterotope Verpflanzung von Bronchus in Mäuse eignet sich gut für immunologische Studien, da sie relativ einfach durchzuführen ist und histopathologische Veränderungen, die denen der Bronchiolitis obliterans von Lungentransplantaten ähneln, sich innerhalb weniger Wochen entwickeln. NRG Mäuse
Um das Schicksal der transplantierten Lungen in den Miniaturschweinen mechanistisch besser untersuchen zu können, ließen wir in einem adoptiven Transfer-Modell den Versuch parallel noch einmal „in kleiner“ ablaufen. Dazu wurde ein kleines Stück Bronchus der rechten, nicht verwendeten Lunge des Spender-Minipigs subkutan in die linke Halsunterseite einer NOD.rag-/-γc-/- (NRG) Maus transplantiert. Die heterotope Verpflanzung von Bronchus in Mäuse eignet sich gut für immunologische Studien, da sie relativ einfach durchzuführen ist und histopathologische Veränderungen, die denen der Bronchiolitis obliterans von Lungentransplantaten ähneln, sich innerhalb weniger Wochen entwickeln. NRG Mäuse