Immunologischer Phänotyp der regulatorischen T-Zelle

© modifiziert nach Schmidt et al. 2012

Abb. 2.1: ÜBERSICHT DER TREG-VERMITTELTEN MECHANISMEN ZUR SUPPRESSION VON T-EFFEKTORZELLEN. Die Abbildung stellt verschiedene Mechanismen zur Suppression durch Tregs dar, welche abhängig vom experimentellen Setup, Gewebetyp oder dem Aktivierungsstatus der zu supprimierenden Zellen zur Anwendung kommen. Konventionelle T-Zellen (Tcon) stellen hier die Effektor-T-Zellen dar. Tregs regulieren die Effektor-T-Zellen durch die Produktion von immunsupprimierenden Zytokinen (IL-10, TGF-β, IL-35) und durch den Verbrauch von exogenem IL-2. Außerdem induzieren sie den Tod der Effektorzellen duch Granzyme und Perforin. Darüber hinaus können sie die Effektor-T-Zellen indirekt durch die Antagonisierung von CD80 sowie CD86 auf APC wie DC durch CTLA-4 unterdrücken. Die durch cAMP regulierten endogenen Mechanismen in den Effektorzellen werden hier nicht näher beschrieben.

2.4.2.2.2 Immunologischer Phänotyp der regulatorischen T-Zelle

Bei den klassischen Tregs handelt es sich um CD4⁺CD8^- T-Zellen, die das Oberflächenmolekül CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors) koexprimieren (85). Im Rahmen der T-Zellaktivierung steigt durch die Expression der α-Kette die Affinität des Rezeptors für IL-2 deutlich an (106,107). Daher wurde CD25 lange Zeit hauptsächlich als Marker für aktivierte

T-Zellen angesehen. Bei menschlichen Lymphozyten wird von den CD4⁺CD25^low T-Zellen mit schwacher CD25 Expression zusätzlich eine CD4⁺CD25^high T-Zellsubpopulation mit starker CD25 Expression und ausgeprägter Suppressorfunktion abgegrenzt (90). Da Kaser et al. 2008 zeigen konnte, dass es in vitro hauptsächlich porzine CD4⁺CD25^low T-Zellen sind, welche das supprimierende Zytokin IL-10 produzieren (91), wird angenommen, dass diese Zellsubpopulation in Schweinen eine unspezifische immunmodulatorische Funktion besitzt.

Obwohl CD25 immer noch ein sehr guter Marker für CD4⁺CD25⁺ Tregs ist, bleibt eines der größten Probleme bei der Erforschung dieser Zellen die genaue Identifizierung durch Moleküle, welche exklusiv auf ihrer Zelloberfläche exprimiert werden. Zwar wurden neben CD25 verschiedene Oberflächenmoleküle, wie GITR (108,109) oder CTLA-4 (110) mit CD4⁺CD25⁺ Tregs assoziiert, jedoch findet man diese Moleküle auch auf verschiedenen Aktivierungs-, Differenzierungs- und Entwicklungsstadien von CD4⁺ Effektor-T-Zellen (111). Der Transkriptionsfaktor Forkhead-box p3 (Foxp3) wird, verglichen mit anderen CD4⁺ T-Zellen, vor allem von CD4⁺CD25⁺ Tregs exprimiert (112-114). Mäuse, welche eine natürlich auftretende Mutation im Foxp3-Gen tragen (Scurfy-Maus), entwickeln schwere Autoimmunerkrankungen, die sogar verheerender verlaufen als nach Depletion von CD4⁺CD25⁺ Tregs in naiven Mäusen (115). Zudem konnte gezeigt werden, dass in der Peripherie induzierte Foxp3⁺ Zellen wiederum noch naïve T-Zellen zu Foxp3⁺ Zellen umwandeln (113,116). Somit scheint Foxp3 ein wichtiger molekularer Schalter für die Entwicklung und Funktion von CD4⁺CD25⁺ regulatorischen T-Zellen zu sein.

2.5 Die Bedeutung von Tregs für die Transplantattoleranz

Für die Toleranzentwicklung in der Transplantationsmedizin scheinen sowohl natürlich vorkommende als auch induzierte Tregs eine Bedeutung zu haben (117,118). Obwohl inzwischen bekannt ist, dass die nTregs in ihrer Aufgabe Autoimmunität und chronische Entzündungen zu verhindern durch die iTregs unterstützt werden, ist nicht bekannt wie hoch der relative Beitrag dieser beiden Subpopulationen zur Transplantationstoleranz ist. Schuld daran ist der Mangel an bis heute bekannten, verlässlichen Markern zur Unterscheidung dieser Zellsubpopulationen (119). Das vermehrte Vorkommen von Foxp3⁺ Tregs im peripheren Blut von Leber- oder Nierentransplantierten Menschen, die gegenüber ihrem Transplantat tolerant geworden sind zeigt die Bedeutung der Tregs für die Induktion und

Aufrechterhaltung des Toleranzstatus in der Transplantationsmedizin. In Patienten, die eine chronische Abstoßung zeigten, waren diese Zellen vermindert zu finden (120). Im Mausmodell verhindert die Übertragung von CD4⁺CD25⁺ T-Zellen die Abstoßung von allogenen Haut- und Organtransplantaten (121,122). Die CD4⁺CD25⁺ T-Zellen konnten nach der Transplantation nicht nur in lymphatischen Geweben der Empfänger, sondern auch gehäuft im Transplantat nachgewiesen werden (123-125), wo sie vermutlich dazu beitragen, dem Transplantat einen immunologisch privilegierten Status zu verleihen und so eine Toleranz aufrechtzuerhalten (92). In einem Setting, in dem in immundefiziente Mäuse kleine Aorten- oder Bronchusstücke aus Menschen oder Schweinen transplantiert wurden und diese anschließend mit allogenen PBMC rekonstituiert worden waren, konnte durch die gezielte Übertragung von CD4⁺CD25⁺ Treg die Bildung von Arteriosklerose bzw. die Entwicklung von sogenannten BOS-like lesions signifikant reduziert werden (126,127).

2.6 Die Bedeutung des Leukozyten-Chimärismus für die Transplantattoleranz

Chimärismus bezeichnet das Vorhandensein fremder hämatopoetischer Zellen in einem Individuum. Dabei wird vom sogenannten Makrochimärismus, mit einem Spenderzellanteil zwischen 1 % und 100 %, der Mikrochimärismus gegenübergestellt, bei dem der Anteil hämatopoetischer Spenderzellen weniger als 1 % beträgt (128). 1945 konnten Owen et al.

zwei verschiedene Arten von Erythrozyten in bovinen Zwillingen mit gemeinsamer intrauteriner Blutversorgung entdecken (129). Dieses Phänomen wurde als natürlich vorkommender gemischter Chimärismus bezeichnet. Interessanterweise waren diese Tiere tolerant gegenüber Hauttransplantaten des entsprechenden Zwillings (36,130). Kurze Zeit später gelang es erstmals im experimentellen Ansatz eine Toleranz durch Injektion hämatopoetischer Zellen in Mausembryonen oder neonatale Mäuse zu erzeugen (131). Damit wurde der Grundstein zum Einsatz hämatopoetischer Zellen zur Induktion einer spenderspezifischen Transplantattoleranz gelegt. Dem Nachweis, dass hämatopoetische Zellen in Tieren ohne immunologisch ausgereiftes Immunsystem Toleranzen erzeugen können, folgten erste Bemühungen einen vergleichbaren Zustand in adulten Individuen mit vollständig entwickeltem Immunsystem herzustellen (132,133). Abhängig von der Art der Konditionierung entstehen in einem Empfängerorganismus nach Spenderzelltransfusion unterschiedliche Formen von Makrochimärismus: In vollen Chimären wird das

Empfängerknochenmark vor der Zelltransfusion komplett zerstört (Myeloablation) und im Anschluss zu (fast) 100 % mit Spenderzellen wiederbesiedelt. Gemischte Chimären enthalten hämatopoetische Zellen von Empfänger- und Spenderseite und entstehen durch Transplantation von Spenderzellen nach milderer Konditionierung, beispielsweise bei nicht kompletter Myeloablation. Der Spenderzellanteil beträgt dabei zwischen 1 und 100 % (132,133). Ein Mikrochimärismus mit Spenderzellanteilen unter 1 % tritt in einigen Transplantatempfängern im Langzeitverlauf spontan auf und kann durch persistierende hämatopoetische Spenderzellen, die ursprünglich dem Transplantat entstammten, hervorgerufen werden (134,135). Die Gewinnung von hämatopoietischen Stammzellen in klinisch verwendbarer Zahl ist in einem klinischen Transplantationssetting in der Kadaverspende verhältnismäßig aufwändig, und daher nur bedingt durchführbar (136). Die in der klinischen Knochenmarktransplantation eingesetzten Apheresetechniken sind aus Zeitgründen nicht möglich. Es bliebe nur die Entnahme möglichst vieler Spenderknochen zur direkten Extraktion des Knochenmarks. Des Weiteren ist die notwendige myeloablative Konditionierung des Empfängers zum Zeitpunkt der soliden Organtransplantation mit kaum akzeptablen Risiken verbunden (136). Nicht zuletzt aus diesen Gründen konnte sich die Technik der Induktion zentraler Toleranz durch Spenderknochenmark-Ko-Transplantation klinisch bisher nicht durchsetzen.

2.7 Toleranzinduktion

Oberflächlich kann immunologische Toleranz lediglich als die spezifische Abwesenheit einer Immunantwort betrachtet werden. Neuere Untersuchungen zeigen aber, dass zumindest im Bereich der Transplantationstoleranz diese auch durch eine aktive immunologische Antwort regulatorischer Natur induziert werden kann. Aus diesem Grund wird auf Basis des derzeitigen Wissensstandes die Transplantationstoleranz als „die spezifische Abwesenheit einer destruktiven Immunantwort gegenüber einem transplantierten Gewebe in Abwesenheit von Immunsuppression” definiert. „Spezifisch” bedeutet, dass der Empfänger in der Lage dazu bleibt auf Dritt-Antigene mit einer vollen Immunantwort zu reagieren (137). Die Mechanismen, welche zur Transplantationstoleranz führen, können in zwei Kategorien eingeteilt werden, von denen die eine in einer zentralen und die andere in einer peripheren Toleranz mündet.

2.7.1 Induktion zentraler Toleranz

Die Induktion zentraler Toleranz zielt darauf ab, alloreaktive Lymphozyten schon im Stadium und am Ort ihrer Entwicklung zu zerstören. Für die B-Lymphozyten wäre das im Knochenmark und für die T-Lymphozyten im Thymus (138). Grundlage hierfür ist es, einen stabilen hämatopoetischen Chimärismus zu erzeugen, welcher durch eine prä- oder perioperative Knochenmarkstransplantation erreicht werden kann. Um eine Immunreaktion des Empfängerorganismus gegen die transplantierten Zellen zu verhindern, bedarf es jedoch einer aggressiven Konditionierung. Durch Bestrahlung oder knochenmarksuppressive Medikation im Vorfeld der Übertragung lässt sich die Zahl sowie die Potenz der immunkompetenten Zellen reduzieren (139). Die transplantierten Stammzellen proliferieren im Knochenmark, wandern in den Thymus des Empfängers ein, und besiedeln ihn schließlich gleichermaßen mit den Empfängerzellen. So weitet sich die negative Selektion autoreaktiver Zellen im Thymus auch auf die gegen Spendergewebe gerichteten Lymphozyten aus (140). In einem Nagermodell konnte gezeigt werden, dass in Mäusen, welche nach Bestrahlung mit einer Mischung von Eigen- und Spenderknochenmark rekonstituiert wurden, für den Rest ihres Lebens ein gemischter lymphohämatopoetischer Chimerismus aufrechterhalten werden konnte (132). Nachfolgend transplantierte Hauttransplantate desselben Spenders wurden ohne ein Zeichen einer Abstoßung toleriert. Allerdings mussten sowohl aus dem Spender- als auch aus dem Empfängerknochenmark vor der Transplantation die T-Zellen depletiert werden, da ansonsten sich die Empfänger-T-Zellen gegen das Knochenmark bzw. die Spender-T-Zellen sich gegen den Empfänger (GVHD) richteten. Die Gruppe um D.H. Sachs konnte weiterhin zeigen, dass die Induktion eines lebenslangen gemischten Chimerismus über MHC-Barrieren hinweg in Mäusen möglich war, wenn eine nicht-myeloablative Bestrahlung mit der Verabreichung von anti-T-Zell-Antikörpern kombiniert wurde. In Affen führte dieses Protokoll dagegen nur zu einem vorrübergehenden Chimerismus, Schweine zeigten beide Phänomene. Wurde in den beiden genannten Großtiermodellen allerdings während der Phase des gemischten Chimerismus eine Niere desselben Donors transplantiert, so wurde diese dauerhaft akzeptiert, unabhängig vom späteren Verlust des Chimerismus. Untersuchungen des zugrunde liegenden Mechanismus wiesen darauf hin, dass für die Aufrechterhaltung der Toleranz periphere Mechanismen wie regulatorische Zellen und nicht zuletzt die Anwesenheit

der transplantierten Niere selbst eine Rolle spielten (137). Diese Ergebnisse decken sich mit vorangegangenen Beobachtungen aus dem hier bearbeiteten Minipig-Modell. Auch hier konnte in früheren Studien gezeigt werden, dass sich durch die perioperative Verabreichung von Spendersplenozyten, der eine nicht-myeloablative Bestrahlung vorausgegangen war, eine zuverlässige Toleranz gegenüber dem Transplantat induzieren ließ (9,141). Die Bedeutung des Leukozyten-Chimärismus für das immunologische Schicksal der allogenen Lungentransplantate wurde 2007 von Bianca Kruse im Rahmen ihrer Dissertation untersucht (5,142). Sie stellte dabei fest, dass erhöhte Spenderzellanteile im direkten postoperativen Zeitraum mit einer verbesserten Transplantatakzeptanz korrelierten. Somit schien der Chimärismus zwar für die Induktion, nicht aber die Aufrechterhaltung einer Transplantattoleranz in lungentransplantierten Minipigs von Bedeutung zu sein.

2.7.2 Induktion peripherer Toleranz

Periphere Toleranz bedeutet eine Toleranzentwicklung außerhalb der primären lymphatischen Organe, welche durch bereits beschriebene Mechanismen wie Deletion und Anergie, aber vor allem durch die Generierung oder Übertragung von regulatorischen T-Zellen erreicht werden kann (86,143). Auf die Bedeutung von Tregs für die Transplantationstoleranz wurde unter dem Punkt 2.5 eingehend eingegangen. Es konnte außerdem bereits gezeigt werden, dass ein stabiler, gemischter Chimärismus positiv mit dem Transplantatüberleben korrelierte (5,142).

Da, wie unter 2.6 beschrieben, die routinemäßige Entahme von hämatopoetischen Stammzellen im klinischen Transplantationsetting nicht möglich ist, wurden in unserer Arbeitsgruppe alternative Protokolle untersucht, bei welchen Zellen aus der Milz des Spenders gewonnen und in den Empfänger übertragen wurden (9).

2.7.3 Bestrahlung zur Toleranzinduktion bei porziner allogener Lungentransplantation Wie bereits demonstriert, scheint ein zumindest vorrübergehender Spenderzellchimärismus im peripheren Blut des Empfängers eine wesentliche Rolle bei der Induktion einer peripheren Transplantattoleranz in der porzinen allogenen Lungentransplantation zu spielen (142). Um den Spenderzellen die Möglichkeit zur Koexistenz im Empfängerorganismus zu geben, muss dieser jedoch zuvor durch Bestrahlung oder knochenmarksuppressive Medikation konditioniert werden. So lässt sich die Menge sowie die Potenz der immunkompetenten

Zellen reduzieren (139). Im vorliegenden Großtier-Modell ist es gelungen ein Protokoll zu etablieren, welches zuverlässig langzeitüberlebende Minipigs hervorgebracht hat. Diese wurden 12-18 Stunden vor der Transplantation mit 1,5 Gy auf den ganzen Körper, sowie mit 7 Gy auf den Thymus bestrahlt. Perioperativ erhielten die Tiere intravenös die Milzzellen des jeweiligen Spenders (Splenozyteninfusion, SpTx), um den postoperativen Spenderzellanteil im Empfängertier zu erhöhen. Obwohl es sich hierbei um eine nicht-myeloablative Bestrahlung handelte, waren die Nebenwirkungen wie Übelkeit und daraus resultierende Fressunlust, Abgeschlagenheit und erhöhte Blutungsneigung immer noch erheblich.

Versuche, bei ansonsten gleichbleibendem Protokoll, die Dosis der Bestrahlung weiter zu reduzieren, führten jedoch zu unbefriedigenden Ergebnissen hinsichtlich des Transplantatüberlebens (Dreckmann et al. in Vorbereitung).

2.7.4 Toleranzinduktion durch monoklonale anti-T-Lymphozyten-Antikörper

Aus diesem Grund muss nach alternativen zytoreaktiven Protokollen gesucht werden, welche dazu in der Lage sind, den Empfängerorganismus spezifischer zu konditionieren, sodass gezielt die alloreaktiven Zellen in ihrer Funktion gehemmt werden, während die Nebenwirkungen minimal gehalten werden. Eine Möglichkeit hierfür stellt die gezielte Depletion von T-Zellen dar. CD4⁺ T-Zellen orchestrieren sowohl die humorale als auch die zelluläre Immunantwort, anti-CD4 mAb sollen somit die Interaktion zwischen T-Zellen und APC verhindern (58). Zytotoxische CD8⁺ T-Zellen mit einem Gedächtnisphänotyp sind bezüglich der Transplantate hoch aggressiv und resistent gegenüber einigen immunregulatorischen Protokollen (144,145), entsprechende Antikörper sollten idealerweise diese Zellen gezielt eliminieren (58). In einigen Tiermodellen ist es bereits gelungen, durch eine Induktionstherapie mit Antikörpern gegen CD4⁺ und/oder CD8⁺ T-Zellen eine zuverlässige Toleranz gegenüber dem Transplantat zu erreichen, ohne dass eine dauerhafte weitere chemische Immunsuppression nötig war. Die Gruppe um Chen konnte 1992 in einem Nagermodell durch eine einleitende Therapie mit anti-CD4 und anti-CD8 monoklonalen Antikörpern (mAb) an den drei präoperativen Tagen -2, -1 und 0 das Transplantatüberleben von Herzen in MHC I-inkompatiblen Mäusen verbessern. Auch Rattenherzen wurden durch diese Induktionstherapie in Mäusen besser akzeptiert. Darüber hinaus zeigte diese Arbeitsgruppe, dass die Gabe von anti-CD4 mAb alleine genauso effektiv war wie die

kombinierte Gabe mit anti-CD8 mAb, während anti-CD8 mAb alleine in diesen Mäusen zu einer anti-IgG-Antwort führte (welche bei der kombinierten Gabe durch den anti-CD4 mAb verhindert wurde) (146). Er zog daraus den Schluss, dass für eine Abstoßung sich beide T-Zellsubtypen so beeinflussen, dass es ausreichend sein könnte einen der beiden in ihrer Funktion zu hindern um eine Abstoßung zu verhindern. 1995 etablierten Bushell und Kollegen ein Protokoll, bei dem durch die Gabe eines depletierenden anti-CD4 mAb 28 Tage vor Transplantation eines allogenen Herzens, gefolgt von einer Vollbluttransfusion des Donors am postoperativen Tag (POD) -27, eine andauernde Toleranz induziert werden konnte. Es konnte beobachtet werden, dass ein kleiner Rest von zirkulierenden CD4⁺ T-Zellen, welche der Depletion entgangen waren, für das Überleben des Transplantats essentiell waren. Bushell stellte daraufhin die Hypothese auf, dass ein nicht-depletierender Antikörper auch wirksam sein könnte (147). In NIH-Miniaturschweinen wurden der anti-CD4 mAb Klon 74-12-4 sowie der anti-CD8 mAb Klon 76-2-11 auf ihre Funktionalität und Verträglichkeit hin geprüft. Während der anti-CD8 mAb die entsprechenden Zellen tatsächlich depletierte, schien der anti-CD4 mAb eine nicht-depletierende, maskierende Wirkung auf die Zellen zu haben (148). Daran anschließende Versuche, bei denen mit Hilfe dieser Antikörper über MHC I Klassen hinweg eine Toleranz gegenüber Haut- oder Nierentransplantaten generiert werden sollte, waren jedoch nicht erfolgreich (58). In diesen Versuchen wurden die Antikörper 24 Stunden vor der Transplantation intravenös verabreicht. Das Versagen einer Toleranzinduktion schrieben die Autoren der nicht-depletierenden Wirkung des anti-CD4 mAbs zu.

Ziel der Arbeit

Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Administration des Anti-T-Zell Antikörpers 74-12-4 (anti-CD4 mAb) alleine oder in Kombination mit dem Antikörper 76-2-11 (anti-CD8 mAb) im etablierten porzinen Modell der allogenen Lungentransplantation in Kombination mit einer Splenozyteninfusion, sowie einer vier-wöchigen pharmakologischen Immunsuppression, eine Alternative zur Bestrahlung darstellen und zu einer stabilen peripheren spenderspezifischen Toleranz führen könnte. Dazu wurden Tiere, welche präoperativ mit Antikörpern und Spenderantigen in Form einer Splenozyteninfusion behandelt wurden, hinsichtlich des Transplantatüberlebens verglichen mit Tieren welche

dasselbe Protokoll, allerdings mit Bestrahlung und Spenderantigen durchliefen. Diese Protokolle wurden zu zwei verschiedenen Zeitpunkten miteinander verglichen. In einigen Tieren wurde die Induktionstherapie schon 28 Tage vor der Lungentransplantation durchgeführt, andere Tiere wurden im unmittelbar perioperativen Zeitraum (POD 0) induziert.

3 Material und Methoden

3.1 Versuchsaufbau

In den hier beschriebenen Untersuchungen wurden in Göttinger Minipigs linksseitige Einzellungentransplantationen durchgeführt. Die Spender-Empfänger-Paare waren MHC Klasse-I inkompatibel ausgewählt. Es wurden zwei übergeordnete Tiergruppen hinsichtlich ihres Transplantatüberlebens miteinander verglichen, die beide zur Toleranzinduktion entweder eine präoperative Bestrahlung (IRR) oder anti-CD4 und/oder anti-CD8 monoklonale Antikörper (mAb) in Kombination mit donorspezifischem Antigen in Form von Spendersplenozyten erhielten. Ergänzt wurde dies durch eine pharmakologische Immunsuppression über einen postoperativen Zeitraum von 28 Tagen. Der Unterschied in den zu vergleichenden Gruppen lag im Zeitpunkt der Induktion durch IRR oder mAb zusammen mit donorspezifischem Alloantigen. Während eine Gruppe von Tieren perioperativ eine donorspezifische Splenozyteninfusion (SpTx) erhielt, nachdem sie 12 bis 18 Stunden vor der Transplantation (IRR) bzw. direkt perioperativ (mAb) zytoreduktiv induziert worden war (Abb. 3.1 A), erhielt die zweite Gruppe ihre Induktionstherapie schon 28 Tage vor der Lungentransplantation gefolgt von der donorspezifischen Splenozyteninfusion am Tag -27 (Abb. 3.1 B). Zur Kontrolle wurden in beiden Gruppen Tiere mitgeführt, die zwar mit donorspezifischen Splenozyten, aber, abgesehen von der pharmakologischen Immunsuppression die alle Tiere in den ersten 28 postoperativen Tagen erhielten, nicht mit einem weiteren zytoreduktiven Protokoll behandelt worden waren. Anschließend wurde das Schicksal des Transplantats beobachtet. Zeigten die Tiere länger als 120 Tage nach Transplantation keine Anzeichen für eine Abstoßung, und damit verglichen mit Kontrollen ein verlängertes Transplantatüberleben, so wurde dies dem tolerogenen Effekt des angewandten Protokolls zugeschrieben. Abbildung 3.1 zeigt schematisch den Versuchsaufbau dieser beiden übergeordneten Gruppen.

Abbildung 3.1: EXPERIMENTELLES DESIGN. Die MHC I inkompatiblen Schweine erhielten bis zum postoperativen Tag (POD) 28 immunsuppressive Medikamente. Tiere die hier schematisch der Gruppe A zugeordnet sind, erhielten ihre Induktionstherapie (IRR oder mAb + SpTx) perioperativ bzw. am Vortag der Transplantation. Schweine der Gruppe B wurden schon 28 Tage vor der Transplantation induziert. Postoperativ wurde das Schicksal des Transplantats, neben der klinischen Beobachtung der Tiere, durch regelmäßige Röntgenkontrollen und Bronchoskopien beurteilt.

3.2 Versuchstiere

Die Behandlung der Tiere erfolgte nach den Grundsätzen des Deutschen Tierschutzgesetzes.

Die Genehmigung zur Durchführung der Tierversuche wurde nach §8 des Tierschutzgesetzes in der Fassung der Bekanntmachung vom 18. Mai 2006 (BGBl. I S. 1206, 1313), zuletzt geändert durch Art. 20 des Gesetzes vom 9. Dezember 2010 (BGBl. I S. 1934, 1940f), in der derzeit geltenden Fassung am 10.08.2012 für den Zeitraum vom 14.08.2012 bis zum 13.08.2015 vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit erteilt (Aktenzeichen: 33.9-42502-04-12/0881).

Für die Versuche wurden speziell für die experimentelle Medizin gezüchtete Göttinger Minipigs verwendet (Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Dalmose, Dänemark), welche zum Zeitpunkt der Transplantation im Durchschnitt 12 ± 2 Monate alt waren. Diese Schweine sind auch im Erwachsenenalter mit einem Gewicht von maximal 50 kg gut zu handhaben und ihre Haltung in einem spezifisch pathogenfreien (SPF) Bereich, bei dem die Tiere nach den Richtlinien der FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Association) regelmäßig mikrobiologisch untersucht werden, ermöglicht eine mikrobiologisch definierte Lieferung. Dies reduziert bei kleinen Versuchsgruppen das Risiko der Verfälschung der Ergebnisse durch Infektionen (149). Die Firma Ellegaard begründete ihre Zucht 1992 mit Tieren aus der Universität Göttingen (Prof. Dr. P. Glodeck, Institut für Genetik und Tierzucht, Universität Göttingen). Auf Grundlage eines vollständigen Stammbaums wird die Verpaarung der Zuchttiere dort so bestimmt, dass der Inzuchtkoeffizient unter 10 % gehalten wird. So war es möglich aus den verschiedenen Zuchtlinien Spender/Empfänger-Paare zu bilden, die sich phänotypisch soweit unterschieden, dass sie MHC inkompatibel waren.

3.2.2 Charakterisierung des genetischen Phänotyps

Im Vorfeld wurde mithilfe einer durchflusszytometrischen Untersuchung von Blutproben einiger Tiere aus Dänemark die MHC I Inkompatibilität anhand des SLA I Haplotyp d spezifischen Antikörpers 74-11-10 überprüft. Dieser Antikörper bindet Epitope einiger Individuen in Abhängigkeit ihres SLA I Genotyps, und von anderen nicht. SLA steht für

‚Swine Lymphocyte Antigen‘ und enspricht im Schwein dem MHC. Darüber hinaus ermöglichte die serologische Typisierung der MHC I Haplotypen DC12, DC45, DC80, DC89, FJ13W9, FJ33W12, H04 und W12 durch B. Kristensen (Vet. Med., bis 2015 Vethud Klinik, Dänemark) eine größtmögliche Diversität der Spender/Empfängerpaare. Zusätzlich wurde ein Geschlechtermismatch vorgenommen, indem die Spendertiere männlich und die Empfängertiere weiblich ausgewählt wurden.

3.2.3 Unterbringung

Die Unterbringung der Tiere erfolgte im zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen

Die Unterbringung der Tiere erfolgte im zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen