Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente fanden alle im Großtiermodell statt oder wurden in Abhängigkeit davon ausgeführt. Sowohl aufgrund von Aspekten des Tierschutzes, als auch von finanziellen, beschränkt sich die Stichprobengröße in dieser Art von Versuchen im Allgemeinen auf niedrige Zahlen. Hierdurch ist es zwar möglich, eine statistische Analyse des wesentlichen Endpunktes der Untersuchung, also des Transplantatüberlebens, durchzuführen, die Auswertung von Kovariablen, insbesondere wenn Datenlücken auftreten, ist allerdings oft nicht mehr valide durchführbar. Um Originaldaten nicht verfälscht darzustellen, wurde bewusst auf eine aufwändige und möglicherweise schwer nachvollziehbare Transformierung der Daten verzichtet. So ist zum Beispiel, bedingt durch die kleine Stichprobengröße und fehlende Normalverteilung, ein relativ großer Unterschied zwischen dem durchschnittlichen und medianen Transplantatüberleben zu erkennen. Auch die Darstellung der Mittelwerte in Abb. 4.1 ist eigentlich nicht repräsentativ, da die Darstellung eines Mittelwertes mit Standardabweichung eine Normalverteilung voraussetzt.
6 Schlussfolgerungen
Die Konditionierung mit Spenderantigen (SpTx) nach vorangegangener immunmodulierender Induktion war im perioperativen Zeitraum sicherer als präoperativ. Die Inzidenz der hyperaktuten Abstoßungsreaktionen, nicht nur in der KoGru SpTx POD -28, sondern auch in der Gruppe mAb+SpTx POD -28, sowie die bis zum Zeitpunkt der Transplantationen anhaltende erhöhte Blutungsneigung in der Gruppe IRR+SpTx POD -28 zeigten, dass eine zytoreduktive Induktionstherapie sowohl durch Bestrahlung, als auch durch Antikörpergabe in Verbindung mit der Administration von Spenderantigen 28 Tage vor der Transplantation keinerlei Vorteile brachte gegenüber einer Induktionstherapie im direkten perioperativen Zeitraum. Diese Feststellung wird durch den aus dem trans vivo Modell resultierenden, extrem hohen ‚Rejection Score‘ untermauert, der sich in der Mausgruppe ergab, welche mit PBMC rekonstituiert worden war, die aus mit Antikörpern und Splenozyten vorbehandelten Schweinen stammten.
Außerdem zeigte sich, dass unabhängig vom Zeitpunkt der Induktion die Administration der Anti-Lymphozyten-Antikörper Klon 74-12-4 (anti-CD4 mAb) sowie Klon 76-2-11 (anti-CD8 mAb) keinen positiven Einfluss auf das Überleben der Lungentransplantate hatte und somit keinen Ersatz zur bisher angewandten Bestrahlung darstellen konnte. Tiere, die mit Hilfe dieser Antikörper induziert worden waren, stießen ihre Transplantate signifikant schneller ab als solche, die einer Bestrahlung unterzogen worden waren. Auch das Transplantatüberleben der jeweiligen Kontrollgruppen lag über dem der mit Antikörpern behandelten Gruppen, wenngleich dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war. Dies zeigt, dass die verwendeten Antikörper nicht nur keinen suffizienten Effekt hatten, sondern dass ihre Verabreichung möglicherweise die Abstoßung der allogenen Transplantate sogar förderte. Es kann auch nicht ausgeschlossen werden, dass dieser Effekt durch die in der Antikörperinfusion enthaltenen Lipopolysaccharide mitverursacht wurde. Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse, welche zeigten dass nach der Induktionstherapie in der Gruppe mAb+SpTx POD -28 das Verhältnis von putativen regulatorischen T-Zellen zu putativen Effektorzellen T-Zellen stark zugunsten der putativen Effektorpopulation verschoben war, sowie der Anstieg der Gesamtleukozytenzahl infolge der Antikörpergabe und erneut nach Lungentransplantation könnten diese Vermutung unterstützen.
Um die Belastung der Transplantation und die unwägbaren Mehrbelastungen einer Induktionstherapie, mit ihren möglicherweise nachteilhaften Nebenwirkungen, entzerren zu können, und eine vorgezogene Induktion unter Einbezug von Spenderantigen ja die Gefahr von hyperakuten Abstoßungsreaktionen birgt, wäre eine denkbare zukünftige Strategie für weitere Untersuchungen, die Induktionstherapie erst einige Tage postoperativ durchzuführen.
Diese Experimente werden zum Zeitpunkt der Erstellung der hier vorliegenden Promotionsarbeit durchgeführt.
7 Zusammenfassung
Katharina Jansson
Untersuchung alternativer zytoreaktiver Protokolle in der Induktion von Transplantationstoleranz bei porziner allogener Lungentransplantation
Die Transplantation von soliden Organen ist mittlerweile chirurgisch und perioperativ hoch entwickelt, die chronischen Komplikationen der lebenslangen Immunsuppression bleiben aber eine schwere Limitation. Seit langer Zeit gilt es daher als „heiliger Gral“ der Transplantationsmedizin Protokolle zu entwickeln, die in Abwesenheit von pharmakologischer Immunsuppression in einer dauerhaften Toleranz allogenener Transplantate münden. Hierfür gibt es inzwischen einige, überwiegend im Nagermodell getestete, hoffnungsvolle Ansätze, welche vor ihrem Einsatz in der Klinik jedoch in einem präklinischen Großtiermodell evaluiert werden müssten. Die experimentelle Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover verfügt über ein solches, schon seit 1999 etabliertes Modell, bei dem linksseitige Einzellungentransplantationen im Miniaturschwein durchgeführt werden. Aus diesem Modell sind durch ein zytoreaktives Protokoll, welches eine nicht-myeoloablative Bestrahlung (IRR) kurz vor der Transplantation, gefolgt von einer spenderspezifischen Splenozyteninfusion (SpTx) im direkten perioperativen Zeitraum beinhaltet, bereits einige langzeitüberlebende Tiere hervorgegangen. Jedoch stellen Bestrahlungen, selbst bei gering gewählten Strahlendosen, durch ihre zum Teil schwer vorhersehbaren und auch spät auftretenden Nebenwirkungen eine hohe Belastung für den Patienten dar. Deshalb sollte im Rahmen dieser Arbeit, in Anlehnung an ein vielversprechendes Nagermodell, der Erfolg des Einsatzes von anti-Lymphozyten-Antikörpern als Alternative zu einer induktiven Bestrahlung untersucht werden. Zudem wurde der Versuch diese beiden Arten der Induktionstherapie schon 28 Tage vor der Transplantation durchzuführen, um die Mehrbelastungen im perioperativen Zeitraum zu minimieren und die Lunge in eine bereits tolerogene Umwelt zu verpflanzen, verglichen mit dem Erfolg einer perioperativen Induktion.
In 34 weiblichen Minipigs wurde eine linksseitige Einzellungentransplantation von MHC I- und Geschlechts-inkompatibel ausgewählten Spendern durchgeführt. Die Toleranzinduktion erfolgte in allen Tieren durch eine zytoreduktive Induktionstherapie entweder in Form einer
Tiere wurde schon 28 Tage vor der Transplantation mit dieser Therapie behandelt (SpTx POD -28, n=17), der andere Teil erhielt seine Behandlung im direkten perioperativen Zeitraum (SpTx POD 0, n=17). In beiden Gruppen wurde jeweils eine Kontrollgruppe mitgeführt, welche zwar eine SpTx, nicht aber eine vorangegangene zytoreduktive Induktion erhielt.
Alle Tiere erhielten infolge der Transplantation eine 28-tägige pharmakologische Immunsuppression bestehend aus Tacrolimus und Methylprednisolon. Das Transplantatüberleben wurde anhand von regelmäßigen Thoraxröntgenkontrollen und Bronchoskopien überwacht. Zu diesen Kontrollzeitpunkten wurde das periphere Blut der Tiere differentialdiagnostisch sowie durchflusszytometrisch untersucht, Serum diente zur Messung der Zytokinexpression. Außerdem wurde zur Quantifizierung des Spenderzellchimärismus DNA aus den PBMC isoliert und eine Real Time PCR durchgeführt.
Des Weiteren wurden die klinischen Beobachtungen in den Schweinen in einem porzinisierten trans vivo Mausmodell verifiziert.
Es stellte sich heraus, dass die Administration von anti-Lymphozyten-Antikörpern in den Experimenten nicht in einem verlängerten Transplantatüberleben resultierte. Im Gegenteil, Tiere aus den Gruppen mAb+SpTx POD -28, sowie mAb+SpTx POD0 zeigten sogar ein niedrigeres medianes Überleben als die jeweiligen Kontrollgruppen. Die durchflusszytometrischen Analysen ließen auf eine Aktivierung des Effektor- anstatt des Regulatorarms des adaptiven Immunsystems in diesen Gruppen schließen. Dieses Phänomen könnte allerdings auch auf Verunreinigungen der Antikörper mit LPS beeinflusst sein.
Außerdem zeigte sich, dass eine Spenderantigen beinhaltende Induktionstherapie schon 28 Tage vor der Transplantation die Gefahr einer Präsensibilisierung barg. Dies führte in sieben von 17 Tieren zu einer hyperakuten Abstoßungsreaktion, das Transplantatüberleben der übergeordneten Gruppe SpTx POD -28 war signifikant schlechter als in der Gruppe SpTx POD 0 (p*=0,02). Dieses Ergebnis konnte gut im hohen Rejection Score der entsprechenden Gruppe des trans vivo Modells nachvollzogen werden. Der Spenderzellchimärismus, welcher positiv mit dem Transplantatüberleben korreliert, war am höchsten in den bestrahlten Tieren.
In der Gruppe IRR+SpTx POD 0 konnte sogar ein langanhaltender Makrochimärismus gemessen werden, während in den mAB-Gruppen, ähnlich wie in den Kontrollgruppen, schon wenige Tage nach der SpTx bzw. der LTx keine Spenderzellen mehr im peripheren Blut zu finden waren.
Die Wirkung der in diesen Experimenten verwendeten anti-Lymphozyten-Antikörper schien nicht suffizient genug, um eine Nische für das Spenderantigen zu schaffen und regulatorische
Auch die Idee einer vorgezogenen Induktionstherapie erwies sich nicht als Erfolg, sondern führte in einigen Fällen sogar zu einer HAR. Folglich bleibt die nicht-myeloablative IRR in Kombination mit einer SpTx im perioperativen Zeitraum zunächst die sicherste und erfolgreichste Toleranzinduktionstherapie in diesem Modell.
8 Summary
Katharina Jansson
Examination of alternative cytoreductive protocols to induce transplantation tolerance in an allogeneic lung transplantation model in miniature swine
Solid organ transplantation is far developed, the chronic complications of pharmacologic immunosuppression, however, remain a major limitation. Thus, the development of protocols inducing long term allograft acceptance in the absence of maintenance immunosuppression are deemed the ‘holy grail’ of transplantation medicine. Scientists all over the world have been working on this for many years, and several promising protocols, mainly in rodent models, have been established. These tolerance induction protocols nevertheless need to be evaluated in preclinical large animal models before they could be transferred into clinical medicine. The Department of Cardiac-, Thoracic-, Transplantation- and Vascular Surgery from Hannover Medical School performs a lung transplantation model in miniature swine since 1999 and was already able to establish a protocol that induced long term allograft acceptance in a majority of animals by preoperative non-myeloablative irradiation (IRR) and a perioperatively administered donor specific splenocyte infusion (SpTx). As irradiation, even in low dosages, may cause, sometimes unpredictable, severe side effects, this protocol lacks in clinical feasibility. Therefore, the aim of this work was to examine the potential of anti-lymphocyte monoclonal antibodies (mAb) as a possible alternative to IRR as induction therapy. This had been successfully shown in rodent models before. Additionally, the success of tolerance induction 28 days in advance of transplantation, to minimize the additional stress during the perioperative period and to provide an already tolerogenic environment during the ensuing lung transplantation, was compared to that of a perioperative induction regimen.
Left sided single lung transplantation (LTx) from MHC I and gender mismatched donors was performed in 34 female minipigs. Cytoreductive regimens for tolerance induction were either IRR or mAb-administration followed by a donor specific SpTx. Half of the animals received this therapy already 28 days before LTx (SpTx POD -28, n=17), the other half was treated perioperatively (SpTx POD 0, n=17). Both these super ordinated groups carried a control
group that did get SpTx but no previous cytoreductive induction. Following transplantation, all animals received a 28-day course of tacrolimus and methylprednisolone as pharmacologic immunosuppression. Allograft survival was monitored by sequential chest x-rays and bronchoscopies. At these control days, differential blood cell counts and flow cytometric analyses were performed on peripheral blood. Serum samples were taken for cytokine expression analysis. For quantification of donor cell chimerism, DNA from PBMCs was isolated for real time PCR. Above that, the clinical results of the minipigs were verified in a porcinised trans vivo mouse model.
Administration of mAb did not lead to prolonged allograft survival in our experiments in miniature swine. On the contrary, animals from the mAb+SpTx POD -28 as well as the mAb+SpTx POD0 group did even show decreased allograft survival as compared to the respective control groups. Flow cytometric analyses in these groups indicated activation of the effector, rather than the regulator arm of the adaptive immune system. However, this phenomenon could have been confounded by LPS contamination of the mAb-infusions.
Moreover, it became apparent that an induction therapy 28 days in advance of transplantation might even lead to presensitization. This lead to hyperacute rejection in seven out of 17 pretreated animals. Survival in the SpTx POD -28 group was significantly worse than in the SpTx POD 0 group (p*=0,02). These results were also reflected in the relatively high rejection scores of the respective groups in the trans vivo model. The highest levels of chimeric donor cells could be detected in the IRR groups. Group IRR+SpTx POD 0 even revealed long lasting macrochimerism, whereas in the mAb groups, similar to the control groups, no donor cells could be detected in peripheral blood beyond a few days after LTx.
The effect of the anti-lymphocyte antibodies used in these experiments did not seem to be sufficient to create space for donor antigen and to initiate regulatory mechanisms.
Consequently, they do not qualify as alternatives to irradiation in this setting. Also the idea of a preponed induction therapy did neither improve outcomes nor predictability of tolerance, but led to hyperacute rejection in many animals. Taken together, non-myeloablative IRR combined with perioperative SpTx remains the safest and most successful tolerance induction protocol in our model so far.
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