FACS-Ergebnisse der mit Splenozyten vorbehandelten Gruppen

4.6 Durchflusszytometrische Analyse der peripheren Blutlymphozyten

4.6.2 FACS-Ergebnisse der mit Splenozyten vorbehandelten Gruppen

Im Gegensatz zu den perioperativ mit Splenozyten behandelten Tieren war bei den an POD -28 behandelten Tieren in der mAb Gruppe keine so deutliche Verminderung der CD3⁺ Zellen erkennbar (Abb. 4.9 A). Zwar fielen sie bis nach der Splenozyteninfusion an POD -27 kurzfristig stark ab, stiegen aber schon an POD -26 wieder an, in den absoluten Zahlen sogar über ihren Ausgangswert hinaus. Somit verhielten sie sich bis vLTx sowohl relativ also auch absolut sehr ähnlich zur Kontrollgruppe. Tiere der IRR POD -28 Gruppe zeigten analog zur IRR POD 0 Gruppe relativ bis LTx keine Verminderung der CD3⁺ Zellen, wohl aber absolut.

Hier lagen sie signifikant unter den beiden anderen Gruppen. Nach LTx fiel sowohl die relative als auch die absolute Zahl an CD3⁺ Zellen in der mAb Gruppe zunächst noch einmal stark ab, um bis zum postoperativen Tag 28 deutlich über ihr Ausgangsniveau hinaus zu steigen. In der Kontrollgruppe und IRR Gruppe hingegen stiegen im postoperativen Verlauf die CD3⁺ Zellen zunächst an und näherten sich später wieder ihrem Ausgangswert, beziehungsweise fielen sogar darunter ab (Gruppe IRR).

Auch bei den CD8⁺ Zellen war, ähnlich wie in den CD3⁺ Zellen, in der Gruppe mAb+SpTx POD-28 im Gegensatz zu den perioperativ mit mAb induzierten Tieren kein starker Abfall zu erkennen (Abb. 4.9 B). Absolut war präoperativ sogar ein geringgradiger Anstieg zu sehen.

Interessant ist hier das Verhalten der CD8⁺ Zellen in der Gruppe IRR+SpTx POD-28.

Während sich im präoperativen Zeitraum nach der Induktion die Zellzahl dieser Gruppe prozentual nicht von den übrigen beiden unterschied, stiegen die CD8⁺ Zellen im direkten postoperativen Zeitraum bis zum Ende der Immunsuppression so stark an, dass sie signifikant über der Zahl der beiden anderen Gruppen lagen. Absolut zeigte sich ein gänzlich anderes Bild. Hier fiel die Zahl der CD8⁺ Zellen nach der Bestrahlung präoperativ signifikant unter das Niveau der anderen beiden Gruppen, postoperativ waren keine eindeutigen Unterschiede mehr zu erkennen.

In der mAb Gruppe reduzierten sich die CD4⁺ Zellen (Abb. 4.9 C) nach Antikörpergabe zunächst, erreichten aber bis vLTx wieder ihren Ausgangswert. Eine Stunde nach der Transplantation war ein erneuter Abfall in dieser Gruppe zu beobachten. Nach Beendigung der Immunsuppression an POD 28 stieg die Zellzahl aber sowohl relativ als auch absolut deutlich über ihren Ausgangswert hinaus an. Interessanterweise lag das relative Niveau der

induzierten Gruppen, zu der durch Bestrahlung induzierten Gruppe im präoperativen Zeitraum sogar signifikant. Es ist allerdings zu beachten, dass der Ausgangswert in dieser Gruppe schon sehr gering war. Auch bei den vorbehandelten Tieren waren absolut die wenigsten CD4⁺ Zellen in der IRR Gruppe zu beobachten. Abgesehen von einem kurzfristigen Anstieg der CD4⁺/CD25^high Zellen (Abb. 4.9 D) eine Stunde nach Splenozyteninfusion am POD -27 bewegten sich die relativen und absoluten Zellzahlen der mAb Gruppe lediglich im Rahmen ihres Ausgangswertes, zeigten aber ab POD 28 einen Abwärtstrend. Insgesamt lag das relative Niveau in dieser Gruppe deutlich unter dem der anderen beiden Gruppen. In der IRR Gruppe war absolut zunächst wieder eine deutliche Zelldepletion zu erkennen, allerdings war der postoperative Trend in dieser Gruppe eher nach oben orientiert. Relativ unterschied sich die Kontrollgruppe kaum von der IRR Gruppe, absolut jedoch stieg in der Kontrollgruppe nach Splenozytengabe die Zahl der CD4⁺/CD25^high Zellen zunächst an und hielt sich bis zum POD -20 deutlich über dem Niveau der anderen beiden Gruppen, gefolgt von einem erheblichen Abfall eine Stunde nach Reperfusion. Während der pharmakologischen Immunsuppression stiegen die CD4⁺/CD25^high Zellen dann wieder, zeigten aber wie in der mAb Gruppe nach Absetzen der immunsupprimierenden Medikamente ab POD 28 einen fallenden Trend. Bei den relativen Zellzahlen der CD4⁺/CD25^low Population (Abb. 4.9 E) war nach Induktion/Splenozyteninfusion bis zur LTx zwischen den Gruppen kein wesentlicher Unterschied zu erkennen. Absolut lagen Tiere der IRR Gruppe wieder unter den nicht-bestrahlten Gruppen, welche im Zeitraum zwischen der Splenozytengabe und der Transplantation einen Anstieg dieser Zellen zeigten. Während sowohl die mAb Tiere, als auch die IRR Tiere postoperativ etwa auf ihr Ausgangsniveau zurückfanden und es auch konstant hielten, war in der Kontrollgruppe, wie auch bei den CD4⁺/CD25^high Zellen, ein erneuter Anstieg bis zum Ende der Immunsuppression zu verzeichnen.

Abb. 4.9 A-E: ERGEBNISSE DER DURCHFLUSSZYTOMETRISCHEN ANALYSE DER MIT SPLENOZYTEN VORBEHANDELTEN TIERE. Da diese Tiere bereits 28 Tage vor der Transplantation mit Splenozyten behandelt wurden, ist hier im Gegensatz zu Abb. 4.8 zusätzlich der Verlauf zwischen POD -28 (vmAb/vIRR) und POD -18 aufgezeigt. Auch hier kam eine one way ANOVA mit Dunn’s multiple comparisons test zur Verwendung.

4.7.1 Spenderzellgehalt im peripheren Blut

Bei der Analyse des relativen Anteils von Spenderzellen im peripheren Blut der weiblichen Empfängerschweine durch den Nachweis des männlichen Y-Chromosoms in der Real Time PCR fiel auf, dass sowohl innerhalb der perioperativ behandelten Gruppen, als auch innerhalb der vorbehandelten Gruppen, die mit Bestrahlung induzierten Tiere die höchsten Chimärismuslevel aufwiesen (Abb. 4.10).

Die Tiere der Gruppe IRR+SpTx POD 0 (area under the curve, AUC= 96) zeigten einen signifikant höheren Spenderzellanteil als Tiere der Kontrollgruppe SpTx POD 0 (AUC= 20,2;

p**= 0,0071) oder der Gruppe mAb+SpTx POD 0 (AUC= 19,5; p**= 0,0055). Es ist bemerkenswert, dass in der IRR+SpTx POD 0 Gruppe, nach einem initialen postoperativen Anstieg des Chimärismus auf 13,3 % eine Stunde nach LTx, er bis zum postoperativen Tag 21 zwar wieder auf 4 % abfiel, am POD 42 aber das höchste Niveau mit fast 15 % erreicht wurde, und erst am postoperativen Tag 120 keinerlei männliche DNA anhand dieser Methode mehr im peripheren Blut nachweisbar war. Alle anderen Gruppen hatten am POD 1 lediglich noch einen Spenderzellanteil von 1-3 % nachzuweisen und nach dem POD 28 war bei keinem Tier mehr Y-chromosomale DNA detektierbar.

Obwohl der Unterschied der Gruppe IRR+SpTx POD -28 (AUC= 44,1) zur Gruppe mAb+SpTx POD -28 (AUC= 28,1), sowie zur entsprechenden Kontrollgruppe (AUC= 8,1) nicht statistisch signifikant war, war in dieser Gruppe sowohl präoperativ nach Transfusion der Spendersplenozyten, als auch eine Stunde nach LTx der größte Anteil an männlicher DNA im weiblichen Empfängertier zu finden.

Abb. 4.10: RELATIVER SPENDERZELLANTEIL IN DEN EMPFÄNGERMINIPIGS. In der Gruppe IRR+SpTx POD 0 ist signifikant mehr männliche DNA zu finden als in den übrigen Gruppen. Auch bei den vorbehandelten Tieren ist das Chimärismusniveau in den bestrahlten Tieren nach SpTx sowie nach LTx höher als in der Antikörper- und Kontrollgruppe, wenn auch nicht statistisch signifikant (one way ANOVA, Dunn's multiple comparisons test).

4.7.2 Spenderzellgehalt im Lungengewebe

Sowohl die rechte (eigene), als auch die linke (transplantierte) Lunge wurden im Anschluss an die Euthanasie und Autopsie der Empfängertiere auf ihren Gehalt an männlicher DNA hin untersucht (Abb. 4.11). In den transplantierten Lungen war zum Todeszeitpunkt im Mittel noch ein Spenderzellgehalt zwischen 13 und 25 % nachzuweisen. Auch in den Eigenlungen schienen sich Zellen, die ursprünglich aus dem Spender kamen, dauerhaft angesiedelt zu haben. Korrelierend zum hohen Spenderzellgehalt im peripheren Blut der Gruppe IRR+SpTx POD 0, war auch in deren rechten Lungen der höchste Gehalt an Spender-DNA aufzufinden (im Mittel 0,84%).

KoGru SpTx POD 0 TODESZEITPUNKT EXPLANTIERTEN LUNGEN AUS DEN WEIBLICHEN EMPFÄNGERMINIPIGS. Die Diskrepanz in der Anzahl der Experimente in der Gruppe IRR+SpTx POD 0 beruht auf beim Isolieren der dsDNA aufgetretenen Verunreinigungen. In der Folge konnten diese zwei der neun Proben nicht korrekt durch die RT-PCR amplifiziert werden. Statistisch waren hier keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zu finden (one way ANOVA, Dunn’s multiple comparisons test).

4.8 Antikörper

4.8.1 Lipopolysaccharidnachweis in den aufgereinigten Antikörpern

Trotz regelmäßiger Spülungen des Hochleistungsflüssigkeitschromatographen mit Salzsäure und Natronlauge nach Herstellerinstruktionen, wurden mikrobiologisch im gewonnenen Eluat vor der anschließenden Sterilfiltration immer wieder bakterielle Kontaminationen festgestellt.

Unter ihnen befanden sich auch die Gram-negativen Endotoxinbildner Pseudomonas sp.. Aus diesem Grund wurde wiederholt ein Endotoxin-ELISA mit dem produzierten Antikörper-Endprodukt, so wie es den Tieren appliziert wurde, durchgeführt. Obwohl dieses (nach verschiedenen Sterilfitrationsschritten) mikrobiologisch als steril bewertet wurde, konnten mithilfe des EndoLISA^®-Kits Lipopolysaccharide nachgewiesen werden. Der Gehalt schwankte zu verschiedenen Messzeitpunkten zwischen 13 bis 62417 EU/ml.

Zum Nachweis überschüssiger anti-CD4 und/oder anti-CD8-Antikörper im peripheren Blut der Tiere, welche mit ebendiesem Antikörper induziert worden waren, wurde in regelmäßigen Abständen nach der Antikörpergabe Serum entnommen. PBMC eines naïven Minipigs wurden mit diesem Serum inkubiert. Nach Zweitfärbung mit dem entsprechenden, an FITC gekoppelten IgG Isotyp, wurde durchflusszytometrisch auf die An- oder Abwesenheit eines zu detektierenden Fluoreszenzsignals geachtet. Dabei war festzustellen, dass sowohl in der mitgeführten Isotypkontrolle, als auch zum Zeitpunkt POD -28 (vor Antikörpergabe), kein Fluoreszenzsignal detektiert werden konnte. Vom Zeitpunkt POD -27 (24 Stunden nach Antikörpergabe) bis POD -20 (acht Tage nach Antikörpergabe) war, nach der Inkubation mit Serum von Tieren welche nur CD4 mAb bekommen hatten, bei etwa 30 % der sich im Lymphozytengate befindlichen Zellen ein positives Fluoreszenzsignal zu sehen. Bei dem Tier

#214207, welches CD4- und CD8 mAb erhalten hatte, waren entsprechend bis zu 54 % FITC-positive Zellen zu detektieren. Allerdings zeigten hier am Tag acht nach Antikörpergabe nur noch knapp 26 % der Zellen ein positives Signal. Da es sich hierbei um eine rein qualitative Analyse handelte, kann keine Aussage zum genauen Gehalt an überschüssigem Antikörper im peripheren Blut getroffen werden. Wohl aber steht fest, dass für mindestens acht Tage nach einmaliger intravenöser Antikörperadministration in einer Dosierung von 1mg/kg KG für alle zirkulierenden Lymphozyten ausreichend Antikörper für die Bindung zur Verfügung stand.

Abb. 4.12 zeigt die Bilder der durchflusszytometrischen Analyse des Tieres #214207 (welches anti-CD4 und -CD8 mAb erhalten hatte) und des Tieres #214301 stellvertretend für alle analysierten Tiere, die nur anti-CD4 mAb erhalten hatten.

Abb. 4.12: FACS-BASIERTE DETEKTION VON ÜBERSCHÜSSIGEM ANTIKÖRPER IM SERUM. Im linken Block à drei Bildern pro Reihe ist das Tier #214207 abgebildet; der rechte Block zeigt Tier 214301. Das erste Bild jeder Reihe zeigt die Lymphozytenpopulation, im zweiten Bild sind die mit Antikörper besetzten Zellen (in blau) als Dotplot gegen den Side Scatter aufgetragen. Bild drei zeigt das entsprechende Histogramm. Hier ist der prozentuale Anteil der im FITC-Kanal detektierten Zellen (zweiter Peak) aufgeführt. Jede Reihe steht für einen gemessenen Zeitpunkt.

Um unterscheiden zu können, ob die verabreichten Antikörper auf ihre Zielzellen eine depletierende oder lediglich eine maskierende Wirkung haben, wurden die nach der in vitro Bebrütung geernteten PBMC des Antikörperplattenstimulationsassays für die durchflusszytometrische Analyse zum einen mit demselben CD4- (74-12-4) bzw. anti-CD8- (76-2-11) Klon (und dem daran gekoppelten fluoreszierenden Farbstoff) gefärbt, mit dem sie zuvor behandelt worden waren. Des Weiteren wurden die Zellen mit einem alternativen anti-CD4- (MIL-17) bzw. CD8- (MIL-12) spezifischen Klon, der idealerweise an ein anderes Epitop der T-Zellen binden sollte, für die Durchflusszytometrie sichtbar gemacht.

Hierdurch sollte verhindert werden, dass man bei einem fehlenden oder reduzierten Fluoreszenzsignal fälschlicherweise von einer Depletion der entsprechenden Zellen ausging, wenngleich eigentlich nur die Bindungsstelle des entsprechenden Epitops schon besetzt war.

Eine weitere Kontrolle hierfür stellte die Färbung der CD3⁺ Zellen dar. Im Falle einer tatsächlichen Depletion von T-Helferzellen oder zytotoxischen T-Zellen wäre auch eine relative Reduktion aller CD3⁺ T-Zellen zu erwarten. Außerdem sollte anhand des Verhaltens der CD4⁺CD25^high bzw. CD4⁺CD25^low Zellen ein Rückschluss auf den Aktivierungsstatus der T-Zellen nach Konfrontation mit den Antikörpern gezogen werden. Aufgrund der geringen Stichprobengrößen war es nicht möglich, diesen Assay statistisch abzusichern, er dient lediglich dazu einen qualitativen Hinweis auf die Wirkung der Antikörper zu geben.

Da sich bei den Ergebnissen der durchflusszytometrischen Analyse die Ansätze mit Zugabe von Interleukin-2 sehr ähnlich zu denen ohne verhielten und nicht konsequent in die eine oder andere Richtung abwichen, konnte gefolgert werden, dass eine zusätzliche Stimulation der T-Zellen durch IL-2 nicht notwendig war. Deshalb wurden in der Auswertung die Ergebnisse dieser beiden Ansätze zusammengefasst. Da die Ergebnisse der Negativkontrollen (nur PBMC, PBMC+F(ab´)2 und PBMC+F(ab´)2+Isotypkontrolle) untereinander äußerst homogen waren, wurden sie zusammengefasst und insgesamt als Negativkontrolle verwendet.

Die Auswertung der durchflusszytometrischen Analyse (schematische Darstellung als Balkendiagramm, Abb. 4.13 A) ergab, dass im Mittel 69 % der nach Bebrütung geernteten PBMC in den Negativkontrollen CD3⁺ T-Zellen waren. In den Wells welche mit anti-CD4 mAb beimpft worden waren, waren nach der Bebrütung im Mittel 10 % weniger CD3⁺ Zellen zu finden als in der Negativkontrolle, in den mit anti-CD8 mAb behandelten Wells sogar 13

% weniger. In den mit anti-CD4 mAb bebrüteten Wells reduzierte sich das Fluoreszenzsignal für den CD4-Klon 74-12-4 gegenüber der Negativkontrolle im Mittel um 9 %, für den Klon MIL-17 sogar um 12 %. Auch in den mit anti-CD8 mAb inkubierten Wells war das Signal für

Abb. 4.13 B). Offensichtlich schienen also die anti-CD8 Antikörper auch einen Einfluss auf CD4⁺ Zellen zu haben, möglicherweise durch Depletierung von, bei Schweinen regelmäßig vorkommenden, CD4⁺/CD8⁺ doppelt positiven T-Zellen (162). Das Fluoreszenzsignal für CD8⁺ Zellen zeigte in den mit anti-CD8 mAb versetzten Wells für den Klon 76-2-11 erwartungsgemäß eine Verminderung um 22 %, beim Färben mit dem Klon MIL-12 war immer noch eine Verringerung um 18 % gegenüber der Negativkontrolle festzustellen. Hier schien der Einfluss des anti-CD4mAb auf die CD8⁺ Zellen deutlich geringer zu sein, in den mit anti-CD4 mAb bebrüteten Wells reduzierte sich das Fluoreszenzsignal für den Klon MIL-12 um lediglich 2 %. Zwar war für den Klon 76-2-11 im Mittel eine Verringerung des Signals um 14 % zu erkennen, da sich dieses Ergebnis aber lediglich aus 2 Ansätzen zusammensetzte und ein großer Standardfehler abzulesen ist, könnte es sich hierbei auch um eine Messungenauigkeit handeln (Abb. 4.13 C). Aufgrund der starken Verminderung der CD4⁺ Zellen in allen mit Antikörpern bebrüteten Ansätzen war eine Evaluierung der CD4⁺CD25^high bzw. CD4⁺CD25^low Zellen nicht möglich.

Abb. 4.13 A-C: AUSWERTUNG DER DURCHFLUSSZYTOMETRISCHEN ANALYSE DER PBMC AUS DEM ANTIKÖPERPLATTENSTIMULATIONSASSAY ALS BALKENDIAGRAMM. Die Y-Achse quantifiziert prozentual den jeweils gemessenen Zelltyp, entlang der X-Achse sind die miteinander verglichenen Reaktionsansätze aufgetragen. In grau die zusammengefassten Negativkontrollen (NegKo) aus insgesamt acht Ansätzen, in rot PBMC die mit den hergestellten anti-CD4-Antikörpern inkubiert worden waren, mit anti-CD8-Antikörpern inkubierte Wells sind in grün dargestellt (zusammengesetzt aus jeweils zwei Ansätzen, einmal mit und einmal ohne IL-2). Die über den Balken angegebenen Prozentwerte zeigen die Reduzierung des gemessenen Zelltyps gegenüber der jeweiligen Negativkontrolle.

Anhand von immundefizienten NRG-Mäusen, welche mit PBMC der Empfängerminipigs rekonstituiert worden waren (‚porziniserte Mäuse‘), wurde die Auswirkung der verwendeten Behandlungsprotokolle auf das Transplantat noch einmal verifiziert. Dafür wurde den Mäusen ein Stück Bronchus des Spenderminipigs unter die Haut implantiert, nach 28 Tagen wieder explantiert und aus verschiedenen histologischen Merkmalen ein ‚Rejection Score‘ gebildet, welcher als Maß für den Schweregrad der Abstoßung herangezogen wurde. Je schwerwiegender sich die Abstoßung des Bronchus-Stücks histologisch darstellte, desto höher war der resultierende Rejection Score.

Im Balkendiagramm (Abb. 4.14) ist zu erkennen, dass in der negativen Kotrollgruppe leichte morphologische Veränderungen zu erkennen waren, welche im Mittel in einem Rejection Score von 1,7 mündeten. Diese Veränderungen wurden als unspezifische Hintergrundaktivität eingestuft und der mittlere Score der übrigen Gruppen daran gemessen. Bei Mäusen, welche nur CD4 mAb oder CD8 mAb und keine allogenen PBMC erhalten hatten, war der Rejection Score des Bronchus nach Explantation sogar geringgradig kleiner als in der negativen Kontrollgruppe. Erwartungsgemäß war der Rejection Score in Mäusen, welche mit alloreaktiven naïven PBMC rekonstituiert worden waren, höher als in den negativen Kontrollen (um 0,5 Punkte). Analog zur akzelerierten Abstoßung der transplantierten Lungen, welche in Minipigs die mit Splenozyten vorbehandelt worden waren zu beobachten war, zeigten die Bronchi aus den Mäusen, welche mit PBMC aus Minipigs rekonstituiert worden waren, die durch die vorgezogene Antikörper-Induktionstherapie schon einmal Antigenkontakt hatten (geprimte PBMC), einen deutlich höheren Abstoßungs-Score (3,3 Punkte). Interessanterweise waren auch in diesem trans vivo Modell die zusammen mit den alloreaktiven PBMC verabreichten anti-CD4- und anti-CD8- Antikörper nicht dazu in der Lage, die durch die Zellen getriggerte Abstoßung zu verhindern oder zu vermindern. Der Rejection Score in der naïve PBMC+CD8mAb Gruppe war mit 2,1 Punkten quasi identisch mit dem Score in der naïven PBMC Gruppe, der Rejection Score der naïve PBMC+CD4mAb Gruppe lag mit 2,6 Punkten sogar noch darüber. Anhand einer one-way ANOVA für nicht parametrische Tests konnten keine statistischen Signifikanzen ermittelt werden, was wohl den kleinen Stichprobengrößen zulasten gelegt werden muss.

Abb. 4.14: HISTOLOGISCHE QUANTIFIZIERUNG DES NACH 28 TAGEN EXPLANTIERTEN BRONCHUS AUS DEN PORZINISIERTEN MÄUSEN. Der ‚Rejection Score‘ setzt sich zusammen aus dem Epithelverlust der Bronchien, der Infiltration des Bronchus mit Lymphozyten bzw. Plasmazellen und dem luminalen Verschluss des Bronchus aufgrund von bindegewebigen Veränderungen.

4.10 Expression von Zytokinen im Serum

Es stellte sich heraus, dass ein Großteil der in den humanen Bio-Plex Pro™ Assays beinhalteten Antikörper nicht mit Minipig-Zytokinen kreuzreagierte. Es konnten entweder keine bzw. nur lückenhaft Werte ermittelt werden, oder die Ergebnisse waren nicht in einen plausiblen Kontext zu bringen. Für die Zytokine IL-10, IL-17, IFN-γ sowie IP-10 (CXCL10) konnten allerdings Werte ermittelt werden. Die durch den Bio-Plex Manager 6.0 errechneten Werte sind in pg/ml angegeben. Die dargestellten Ergebnisse dienen lediglich dazu einen Trend in der Zytokinexpression zu zeigen, da die Stichprobengrößen in einigen Parametern zu gering waren, um sie statistisch absichern zu können.

4.10.1 Analyse des Maus-Serums aus dem trans vivo Modell

Aus dem Kollektiv der gesammelten Maus-Seren standen letztendlich, außer aus der Gruppe geprimte PBMC, von allen Gruppen genügend Proben zur weitergehenden Untersuchung zur Verfügung, wenngleich nicht in jeder Gruppe alle Proben messbar waren. In Abb. 4.15 A-D

entsprechenden Balken angegeben. Da all diese Proben in ein und demselben Durchlauf gemessen worden waren, waren die ermittelten absoluten Konzentrationen uneingeschränkt untereinander vergleichbar. Bei allen vier der analysierten Zytokine war die Expression im Serum von Mäusen, die keine Antikörper erhalten hatten (negative Kontrollgruppe sowie naïve PBMC), am geringsten. Interessanterweise war der Zytokinspiegel in Tieren die mit naïven allogenen PBMC rekonstituiert worden waren hier sogar geringgradig niedriger als in der negativen Kontrollgruppe. In Mäusen welche zwar anti-CD8 mAb erhalten hatten, jedoch nicht mit porzinen Zellen rekonstituiert worden waren (Gruppe CD8 mAb), war die Zytokinkonzentration im Serum annähernd gleich wie in der negativen Kontrolle. In der Gruppe CD4 mAb jedoch war in allen Parametern ein Anstieg zu erkennen, der etwa dem der Gruppe naïve PBMC+CD8mAb entsprach. Eine deutlich vermehrte Zytokin-Expression gegenüber der negativen Kontrolle war in der Gruppe naïve PBMC+CD4mAb zu erkennen.

Abb. 4.15 A-D: ABSOLUTE ZYTOKIN-EXPRESSION IM SERUM POZINISIERTER MÄUSE. Tiere der in schwarzen Balken dargestellten Gruppen wurden mit porzinen allogenen PBMC rekonstituiert, die Tiere der in grauen Balken dargestellten Kontrollgruppen erhielten anstatt Zellen physiologische Kochsalzlösung. Entlang der X-Achse ist aufgetragen, welche Gruppen zusätzlich am Tag der Bronchusverpflanzung noch monoklonale Antikörper erhielten.

Die Auswertung der Minipig-Seren gestaltete sich methodisch aufwendig, da die Experimente über den Zeitraum einiger Jahre hinweg stattfanden und folglich die Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf unterschiedlich Platten gemessen worden waren. Das Problem hierbei lag darin, dass die ermittelten Standardkurven aus verschiedenen Messungen voneinander abwichen. Somit waren die absoluten Konzentrationen aus verschiedenen Messungen untereinander nicht ohne weiteres vergleichbar. Um dieses Problem zu lösen, wurde der Mittelwert des ‚Null-Zeitpunkts‘, also der Zeitpunkt zu welchem die Tiere weder medikamentös, noch durch Bestrahlung oder mit Spenderantigen behandelt worden waren,

Im Dokument Untersuchung alternativer zytoreaktiver Protokolle in der Induktion von Transplantationstoleranz bei porziner allogener Lungentransplantation (Seite 98-0)