Untersuchung alternativer zytoreaktiver Protokolle in der Induktion von Transplantationstoleranz bei porziner allogener
Lungentransplantation
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Katharina Jansson
Hannover
Hannover 2016
Tierärztliche Hochschule Hannover
PD Dr. med. Gregor Warnecke
Institut für Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie
Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Marion Hewicker-Trautwein und PD Dr. med. Gregor Warnecke
2. Gutachter: Univ.-Prof. Ingo Nolte
Tag der mündlichen Prüfung: 11.05.2016
Die vorliegende Arbeit wurde durch Mittel des Deutschen Zentrums für Lungenforschung (DZL/BREATH) gefördert.
Allen Kreaturen die mich auf diesem Weg begleitet
und ihren Beitrag geleistet haben
SALMAN, C. HAFER, J. HECKER, G. BUECHLER, J.H. KARSTENS, D. JONIGK, F. LÄNGER, V.
KÄVER, C.S. FALK, M. HEWICKER-TRAUTWEIN, H. UNGEFROREN, A. HAVERICH, M. STRÜBER, G.
WARNECKE
Augmentation of Transient Donor Cell Chimerism and Alloantigen-Specific Regulation of Lung Transplants in Miniature Swine.
American Journal of Transplantation, 2015 Nov 25. doi: 10.1111/ajt.13629. [Epub ahead of print]
W. SOMMER, A.-K. KNÖFEL, N. MADRAHIMOV, M. AVSAR, D. JONIGK, J. SALMAN, K.
DRECKMANN, K. JANSSON, G. SALGUERO, U.A. MAUS, T. WELTE, A. HAVERICH, G. WARNECKE Allogeneic CD4+ CD25high T Cells Regulate Obliterative Bronchiolitis of Heterotopic Bronchus Allografts in Both Porcinized and Humanized Mouse Models
Transplantation 2015 Mar;99(3):482-491.
KONGRESSBEITRÄGE VORTRÄGE:
K. JANSSON, J. HAHN, W. SOMMER, M. AVSAR, J. SALMAN, T. SIEMENI, A.-K. KNÖFEL, L.
PAUKSCH, M. HEWICKER-TRAUTWEIN, B. SCHRÖDER, A. HAVERICH, G. WARNECKE
Treatment with Donor Specific Alloantigen and Anti-Lymphocyte mAb Three Days after Lung Transplantation Differentially Affects Putative Effector and Regulatory T Cell Populations
45. Jahrestagung DGTHG, Leipzig, 13.-16.02.1016
K. JANSSON, W. SOMMER, M. AVSAR, J. SALMAN, A.-K. KNÖFEL, C. FALK, M. HEWICKER- TRAUTWEIN, D. JONIGK, A. HAVERICH, G.WARNECKE
Treatment with donor specific alloantigen before or on the day of lung transplantation in a large animal model 3rd International DZL Symposium, Hannover, 08.-10.05.2014
immunization rather than tolerance in miniature pigs 43. Jahrestagung der DGTHG, Freiburg, 09.-12.02.2014
POSTER:
J. HAHN, K. JANSSON, W. SOMMER, M. AVSAR, T. SIEMENI, J. SALMAN, A.-K. KNÖFEL, B.
SCHRÖDER, A. HAVERICH, G. WARNECKE
Treatment with donor specific alloantigen and anti-CD4 mAb 3 days after lung transplantation differentially affects putative effector and regulatory T cell populations
ISHLT, 35th Annual meeting, Nizza, 15.-18.04.2015
W. SOMMER, J. SALMAN, M. AVSAR, T. SIEMENI, K. JANSSON, K. HOEFFLER, C. KÜHN, I.
TUDORACHE, A. HAVERICH, G. WARNECKE
Differential outcomes for long term ex vivo lung perfusion in a porcine model - With or without red cells?
ISHLT, 35th Annual meeting, Nizza, 15.-18.04.2015
T. SIEMENI, A.-K. KNÖFEL, N. MADRAHIMOV, W. SOMMER, I. TUDORACHE, C. KÜHN, M. AVSAR, F. IUS, K. JANSSON, J. SALMAN, A. HAVERICH, G. WARNECKE
In vivo development of transplant arteriosclerosis in humanized mice reflects alloantigen recognition of lung transplant recipients and is controlled by autologous regulatory T cells
ISHLT, 35th Annual meeting, Nizza, 15.-18.04.2015
K. JANSSON, J. HAHN, W. SOMMER, M. AVSAR, T. SIEMENI, J. SALMAN, A.-K. KNÖFEL, M.
HEWICKER-TRAUTWEIN, C. FALK, D. JONIGK, J. FRÜHAUF, A. HAVERICH, G. WARNECKE
The crucial role of sufficient induction to promote peripheral longterm allograft acceptance- a comparison of different protocols in a large animal model
Helmholtz Research School ‘Lung Biology and Disease’, Tegernsee, 24.-27.03. 2015
CD4+CD25high T cells develop less severe donor-specific transplant arteriosclerosis in humanized mice 44. Jahrestagung der DGTHG, Freiburg, 08.-11.02.2015
T. SIEMENI, A.-K. KNÖFEL, N. MADRAHIMOV, W. SOMMER, I. TUDORACHE, C. KÜHN, M. AVSAR, F. IUS, K. JANSSON, J. SALMAN, A. HAVERICH, G. WARNECKE
Transplant arteriosclerosis in humanized mice reflects alloantigen recognition of lung transplant recipients and is controlled by autologous regulatory T cells
44. Jahrestagung der DGTHG, Freiburg, 08.-11.02.2015
K.JANSSON, A.-K.KNÖFEL, W.SOMMER, J.SALMAN, T.SIEMENI, L.PAUKSCH, J.HAHN, M.AVSAR, C.FALK, M.HEWICKER-TRAUTWEIN, D.JONIGK, A.HAVERICH, G.WARNECKE
Verification of alloantigen-priming due to pre-transplantational conditioning in a porcinised mouse model DZL Annual Meeting, Hamburg, 26.-27.01.2015
K. JANSSON, W. SOMMER, M. AVSAR, J. SALMAN, A.-K. KNÖFEL, C. FALK, M. HEWICKER- TRAUTWEIN, D. JONIGK, A. HAVERICH, G.WARNECKE
Treatment with donor specific alloantigen 28 days before or on the day of lung transplantation – a comparison in a large animal model
World Transplant Congress, San Francisco, 26.-31.07.2014
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Die Transplantation………... 3
2.1.1 Die Lungentransplantation……….. 3
2.2 Transplantationsimmunologie………... 5
2.2.1 Das Immunsystem………... 5
2.2.2 Abstoßung von Transplantaten……… 7
2.2.2.1 Die hyperakute Abstoßung……….. 9
2.2.2.2 Die akute Abstoßung………... 9
2.2.2.2.1 Die direkte Abstoßung………. 10
2.2.2.2.2 Die indirekte Abstoßung……….. 11
2.2.2.3 Die chronische Abstoßung……….. 11
2.3 Immunsuppressive Medikamente……….. 12
2.3.1 Immunsuppressive Induktionstherapie mit Antikörpern………... 13
2.3.1.1 Polyklonale und monoklonale Antikörper……….. 13
2.4 Toleranzmechanismen………... 14
2.4.1 Zentrale Toleranz……….. 14
2.4.2 Periphere Toleranz……….... 16
2.4.2.1 Passive Toleranz-Mechanismen……….. 16
2.4.2.1.1 Ignoranz und Anergie………... 16
2.4.2.1.2 Activation Induced Cell Death (AICD)………... 16
2.4.2.2 Aktive Toleranz (regulatorische T-Zellen)………. 17
2.4.2.2.1 Mechanismen der Suppression durch Tregs………. 18
2.4.2.2.2 Immunologischer Phänotyp der regulatorischen T-Zelle……. 20
2.5 Die Bedeutung der Tregs für die Transplantattoleranz……….. 21
2.6 Die Bedeutung des Leukozyten-Chimärismus für die Transplantattoleranz…………. 22
2.7 Toleranzinduktion……….. 23
2.7.1 Induktion zentraler Toleranz………. 24
2.7.2 Induktion peripherer Toleranz………... 25
2.7.3 Bestrahlung zur Toleranzinduktion bei porziner allogener Lungentransplantation……….. 25
2.7.4 Toleranzinduktion durch monoklonale anti-T-Lymphozyten Antikörper………. 26
2.8 Ziel der Arbeit………... 27
3 Material und Methoden 29 3.1 Versuchsaufbau………. 29
3.2 Versuchstiere………. 30
3.2.1 Herkunft……… 31
3.2.2 Charakterisierung des genetischen Phänotyps……….. 31
3.2.3 Unterbringung………... 31
3.3 Anästhesie……….. 32
3.4 Operationstechnik………. 33
3.5 Verabreichte Substanzen………... 34
3.5.1 Immunsuppression……… 34
3.5.2 Splenozyteninfusion……….. 35
3.5.3 Antibiotikatherapie……… 36
3.5.4 Analgesie………... 36
3.6 Postoperatives Abstoßungsmonitoring der Tiere……….. 37
3.6.1 Blutentnahme……… 37
3.6.2 Röntgenologische Untersuchung des Thorax……… 38
3.6.3 Bronchoskopie………... 39
3.6.4 Elektive Euthanasie………... 39
3.6.5 Autopsie……… 40
3.6.6 Histologische Beurteilung der Lungenbiopsien……… 40
3.7 Zusammensetzung der untersuchten Gruppen………... 41
3.8 Charakterisierung des immunologischen Phänotyps………. 42
3.8.1 Isolation peripherer Blutlymphozyten………... 42
3.8.2 Durchflusszytometrische Analyse………. 42
3.8.3 Verwendete Antikörper………. 43
3.9 Untersuchungen zum Spenderzellchimärismus………. 45
3.10 Gewinnung monoklonaler Antikörper für die Induktionstherapie……….. 47
3.10.1 Qualitätskontrolle der gewonnenen Antikörper……….. 48
3.10.2 Nachweis von überschüssigen Antikörpern im peripheren Blut………. 50
3.10.3 Effekt der verabreichten Antiköper auf mononukleäre Zellen in vitro……... 51
3.11 In Vivo Untersuchung der immunologischen Mechanismen anhand von porzinisierten Mäusen………... 53
3.11.1 Versuchstiere………... 56
3.11.2 Versuchsgruppen………. 56
3.12 Detektion von Zytokinen im Serum oder Zellkulturüberstand……….. 57
3.13 Statistik………... 58
4 Ergebnisse 60 4.1 Auswahl der Tiere………. 60
4.2 Transplantatüberleben………... 62
4.3 Röntgenologische Befunde……… 65
4.4 Histologische Befunde der Lungen………... 67
4.5 Auswertung der Differentialblutbilder……….. 69
4.5.1 Leukozyten……… 69
4.5.2 Lymphozyten………. 70
4.5.3 Thrombozyten………... 71
4.6 Durchflusszytometrische Analyse der peripheren Blutlymphozyten……… 74
4.6.1 FACS-Ergebnisse der perioperativ mit Splenozyten behandelten Gruppen... 76
4.6.2 FACS-Ergebnisse der mit Splenozyten vorbehandelten Gruppen……… 78
4.7 Chimärismusanalysen……… 82
4.7.1 Spenderzellgehalt im peripheren Blut………... 82
4.7.2 Spenderzellgehalt im Lungengewebe………... 83
4.8 Antikörper………. 84
4.8.1 Lipopolysaccharidnachweis in den aufgereinigten Antikörpern……….. 84
4.8.2 Nachweis überschüssiger Antikörper im Serum………... 85
4.8.3 Einfluss der Antikörper auf mononukleäre Zellen in vitro………... 87
4.9 Experimentelle Analyse der immunologischen Mechanismen im trans vivo Modell………... 90
4.10 Expression von Zytokinen im Serum……….. 91
4.10.1 Analyse des Maus-Serums aus dem trans vivo Modell……….. 91
4.10.2 Auswertung der Zytokine in den Minipig-Serumproben……… 93
5 Diskussion 95 5.1 Experimentelles Design………. 95
5.1.1 Inkompatibilität der genetischen Phänotypen………... 95
5.1.2 Wahl des im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Induktionsprotokolls………... 95
5.2 Transplantatüberleben in den ausgewählten Tieren……….. 97
5.3 Antikörper zur Toleranzinduktion………. 99
5.3.1 Wahl der Antikörper………. 99
5.3.2 Mechanismus der verwendeten Antikörper……….. 100
5.3.3 Dosierung der eingesetzten Antikörper………. 101
5.3.4 Lipopolysaccharid-Nachweis in den verabreichten Antikörpern……….. 102
5.4 Bestrahlung zur Toleranzinduktion………... 103
5.5 Toleranz durch T-Zell Regulation………. 103
5.5.1 Phänotypisierung der putativen regulatorischen T-Zellen……… 103
5.5.2 Verhalten der putativen regulatorischen T-Zellen im peripheren Blut………. 104
5.6 Gemischter Chimärismus in der Toleranzerhaltung……….. 105
5.6.1 Nachweis von Spenderzellen im peripheren Blut des Empfängers………….. 105
5.6.2 Nachweis von Spender-DNA in Lungenbiopsien………. 106
5.7 Porzinisiertes Mausmodell……… 106
5.7.1 Rejection Score………. 106
5.7.2 Zytokinprofil………. 107
5.8 Zytokinexpression im Serum von Minipigs……….. 108
5.9 Limitationen der Statistik……….. 108
6 Schlussfolgerung 109
7 Zusammenfassung 111
8 Summary 114
9 Literaturverzeichnis 116
10 Anhang 131
Erklärung 149
Danksagung 151
Abkürzungen
Abb. Abbildung
Abt. Abteilung
AICD Activation induced cell death APC Antigenpräsentierende Zellen AUC Area Under the Curve
BGBl Bundesgesetzblatt
BOS Bronchiolitis Obliterans Syndrom
Bp Basenpaare
BronchusTx Bronchustransplantation bzw. Beziehungsweise
°C Grad Celsius
CD Cluster of Differentiation
Cm Zentimeter
COPD Chronical Obstructive Pulmonary Disease CO2 Kohlenstoffdioxid
DC Dentritische Zellen
DNA Desoxyribonukleinsäure DNAse Desoxyribonuklease
dsDNA Doppelstrang-DNA
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EU Endotoxin Units EvG Elastika van Gieson evtl. eventuell
FACS Durchflusszytometrie
FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Association FITC Fluoresceinisothiocyanat
FiO2 Fraction of Inspired Oxygen FSC Forward Scatter
G Giga
G gram
GvHD Graft versus Host Disease
H Stunde
HAR Hyperakute Abstoßung
H/E Hämatoxylin/Eosin
HTTG Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie HvGD Host versus Graft Disease
IE Internationale Einheiten
IFB Tx Interdisziplinärer Forschungsbereich Transplantation
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
IPPV Intermittent Positive Pressure Ventilation
IRR Bestrahlung
ISHLT International Society for Heart and Lung Transplantation iTreg induzierbare regulatorische T-Zelle
kg Kilogramm
KM Körpermasse
KoGru Kontrollgruppe
L Liter
LTx Lungentransplantation
M Molar
mAb monoclonal Antibody = monoklonaler Antikörper
mbar Millibar
MEZ Mitteleuropäische Zeit
Mg Milligram
MHC Major Histocompatibility Complex MHH Medizinische Hochschule Hannover
Min Minute
Ml Milliliter
mM Millimolar
mm Millimeter
MSR Male Specific Repeat
µg Mikrogramm
μl Mikroliter
µm Mikrometer
NFκB nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells
Ng Nanogramm
Nm Nanometer
NK-Zellen Natürliche Killer-Zellen NRG NOD.rag-/-γc-/-
nTreg natürlich vorkommende regulatorische T-Zelle
OD Optische Dichte
o.g. oben gennant
OP Operation
Pa Pascal
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells PBS Phosphate-buffered Saline
PCMV Porzines Cytomegalie Virus PCR Polymerase Chain Reaction
PE Phycoerythrin
PEEP Positive Endexpiratory Pressure Pmax maximaler Beatmungsdruck
Pmol picomol
POD Postoperativer Tag
PPHT Primäre Pulmonale Hypertonie RFU Relative Fluoreszenz-Einheiten Rpm rounds per minute
RT PCR Real Time PCR
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SLA Swine Lymphocyte Antigen
SPF Spezifiziert Pathogenfrei
SpTx Übertragung von Spendersplenozyten in das Empfängertier
SQ Ausgangskonzentration
SSC Side Scatter TCR T-Zell Rezeptor
TE Time of Expiration
TGF Tumor Growth Faktor
Th T-Helferzellen
TI Time of Inspiration / Thymusbestrahlung TiHo Tierärztliche Hochschule Hannover TLR Toll like Rezeptor
TNF Tumor Nekrose Faktor
U Unit
V.a. Verdacht auf
vs. versus
WBI Whole Body Irradiation
z.B. zum Beispiel
ZTL Zentrales Tierlabor
Statistische Größen
n Anzahl der Versuche
n.s. nicht signifikant
p propability, Irrtumswahrscheinlichkeit (Signifikanzniveau) SD Standard Deviation, Standardabweichung
SEM Standarderror of Mean, Standardfehler des Mittelwertes xˉ arithmetischer Mittelwert
1 Einleitung
Die Transplantation von Organen als Therapie bei unheilbarem Organversagen ist ein heutzutage hoch aktuelles Thema, dessen Bedeutung aufgrund des wachsenden Erfolges stetig zunimmt (1). In der Lungentransplantation ist es technisch inzwischen mit niedriger Komplikationsrate möglich Einzellungen, Doppellungen oder nur einzelne Lappen zu transplantieren (2). So bleibt der limitierende Faktor dieser Therapiemethode die immunologische Toleranz gegenüber dem Transplantat. Seit der Einführung immunsupprimierender Medikamente ist es zwar möglich akute Abstoßungsreaktionen gegen transplantierte Organe zu vermindern, chronische Abstoßungsreaktionen können durch sie allerdings nur verlangsamt, nicht verhindert werden. Hinzu kommen deren Nebenwirkungen wie erhöhte Infektanfälligkeit und das erhöhte Risiko für die Bildung von Neoplasien. So ist es bis heute das höchste Ziel in der Transplantationsmedizin, immunmodulierende Protokolle zu entwickeln, aus denen eine zuverlässige Transplantattoleranz resultieren würde (3,4).
Ab 1999 wurde an der Medizinischen Hochschule Hannover ein porzines Modell zur Induktion spenderspezifischer Immuntoleranz nach allogener Lungentransplantation etabliert (5-8). Im Rahmen dieser Versuchsreihen ist es bereits gelungen, bei einem Teil der Tiere eine langfristige periphere Toleranz in Abwesenheit systemischer Immunsuppression gegenüber dem Lungentransplantat zu induzieren. Diese Tiere durchliefen ein Protokoll aus präoperativer Bestrahlung, Einzellungentransplantation, 28-tägiger medikamentöser Immunsuppression und perioperativer Spender-Splenozyteninfusion (9). Allerdings ist dieses Protokoll aufgrund der unspezifischen, zellschädigenden Wirkung der Bestrahlung für einen Einsatz in der Klinik nur bedingt geeignet.
Ziel dieser Arbeit ist es ein weiteres, weniger invasives, zytoreaktives Protokoll zu untersuchen, welches eine Alternative zur Bestrahlung darstellen könnte. Dieses soll die gezielte Verminderung von CD4+ und CD8+ T-Zellen im Empfänger beinhalten, da diese als Hauptakteure bei der Abstoßungsreaktion gelten (10). Außerdem wurde, in Anlehnung an ein erfolgreiches Mausmodell (11), der Versuch unternommen, einige Tiere schon 28 Tage vor der Transplantation, nach Induktion durch Antikörpergabe oder Bestrahlung, dem Antigen in
Form von Spendersplenozyten auszusetzen. Diese Präkonditionierung sollte dazu dienen, die Lunge in ein bereits tolerogenes Milieu verpflanzen zu können.
Die hier vorliegende Dissertationsschrift knüpft inhaltlich an die im Jahre 2007 angefertigten Dissertationen von Bianca Kruse und Stefanie Thissen an.
2 Literaturübersicht
2.1 Die Transplantation
Unter dem Begriff der Transplantation versteht man die Verpflanzung von lebenden Zellen, Geweben oder Organen in einen Empfänger (12). In Abhängigkeit des Verhältnisses vom Spenderorgan zum Empfänger unterscheidet man verschiedene Formen der Transplantation:
Die syngene Transplantation zwischen genetisch identischen Organismen wie eineiigen Zwillingen, die autologe Transplantation innerhalb eines Individuums, wie zum Beispiel Eigenhautverpflanzung nach Verletzungen, die allogene Transplantation zwischen Individuen derselben Spezies und die xenogene Transplantation bei Übertragung von Organen zwischen Individuen verschiedener Spezies (13). Die ersten Versuche zur Transplantation von Organen wurden in der Zeit zwischen 1880 und 1930 unternommen (14). Damals fehlte es allerdings an Wissen um Technik und Immunologie, was dazu führte, dass die transplantierten Organe innerhalb kurzer Zeit abgestoßen wurden. 1943 konnte erstmalig der Einfluss des Immunsystems auf das Transplantationsergebnis anhand von Hautverpflanzungen demonstriert werden (15). Außerdem wurde erkannt, dass möglichst frische Organe verwendet werden sollten, um Ischämie-Reperfusionsschäden zu vermeiden (16). 1962 gelang in Boston die erste erfolgreiche Nierentransplantation unter chemischer Immunsuppression.
Zuvor waren erfolgreiche Organübertragungen nur zwischen monozygoten Zwillingen möglich gewesen (17). Kurze Zeit später gelang dem Chirurgen Starzl die erste erfolgreiche Lebertransplantation im Menschen (16). Ein Jahr darauf folgten die ersten erfolgreichen Lungentransplantationen (18). Heute gehören Herz, Lunge, Leber, Niere, Bauchspeicheldrüse, Hornhaut und Knochenmark zu den in der klinischen Humanmedizin häufig transplantierten Geweben (19).
2.1.1 Die Lungentransplantation
Die Lungentransplantation stellt heute ein akzeptiertes Therapiekonzept terminaler Lungenerkrankungen dar (2,3). Jedoch war diese Ära zu ihrem Beginn geprägt von hohen frühpostoperativen Komplikationsraten. Technisch-chirurgische Komplikationen, erratische Indikationsstellung und die wenig ausgereifte immunsuppressive Therapie führten in nahezu allen Fällen zum Tod der Patienten innerhalb des ersten Monats nach der Transplantation
(20). Mit der Einführung von Cyclosporin A im Jahr 1980 begann die moderne Immunsuppression. Seither konnten in den Bereichen Spender-management, Lungenkonservierung, operative Techniken, immunsuppressive Therapie, Infektionsprophylaxe sowie Abstoßungsmonitoring große medizinische Fortschritte erzielt werden (3). Es werden heutzutage Einzellungen-, Doppellungen- sowie Herz-Lungen- Transplantationen erfolgreich durchgeführt (2). Auch Lebendspenden im Sinne einer Übertragung einzelner Lungenlappen gewinnen, gerade im Zusammenhang mit dem aktuell bestehenden Mangel an verfügbaren Spenderorganen, an Bedeutung (21). Anerkannte Indikationen für eine Lungentransplantation stellen Krankheiten dar, die mit einem fortschreitenden, irreversiblen Funktionsverlust der Lunge einhergehen. Dazu zählen emphysematöse Erkrankungen wie zum Beispiel die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (chronical obstructive pulmonary disease, COPD), Erkrankungen des Parenchyms wie die idiopathische pulmonale Fibrose, primäre pulmonale Hypertonie (PPHT) und Gendefekte wie die Zystische Fibrose, aber auch Bronchiektasen, zum Beispiel als Folge chronischer infektiöser Erkrankungen (22). Da die Inzidenz der Erkrankungen, die eine Transplantation nötig machen, stetig zunimmt, besteht ein erhebliches Missverhältnis zwischen verfügbaren Spenderorganen und potentiellen Organempfängern. So kommt es, dass in den westlichen Ländern noch etwa jeder sechste Patient stirbt bevor ein Organ für ihn verfügbar wird (23).
Doch auch nach erfolgreicher Transplantation sind die Langzeitprognosen von lungentransplantierten Patienten, verglichen mit Empfängern anderer solider Organe, ungünstig (2). Die Neunjahres-Überlebensrate einzellungentransplantierter Patienten liegt bei nur 36 %, verglichen mit einem Zehnjahres-Überleben von 52 % bei Herztransplantatempfängern (24). Hauptgrund hierfür ist die schwierige Gratwanderung zwischen maximaler transplantatschützender Immunsuppression und minimaler Beeinträchtigung der Infektabwehr. Lungentransplantate sind über die Atemluft permanent einem höheren Keimdruck ausgesetzt als alle anderen transplantierten Organe. Dies bedingt eine erhöhte Morbidität und Mortalität durch opportunistische Infektionen, getriggert durch die intensive Immunsuppression zur Verhinderung einer Abstoßung in den ersten Monaten nach Transplantation (25). Durch rezidivierende Pneumonien können sogenannte Infekt- vermittelte Abstoßungsreaktionen begünstigt werden. Diese schränken die Transplantatfunktion erheblich ein oder können sogar lebensbedrohend sein (2). Die
Mehrzahl der Patienten durchläuft mindestens eine akute Abstoßungsreaktion, wobei mehrere akute Abstoßungsreaktionen einen Risikofaktor für die Entstehung einer chronischen Abstoßung (Bronchiolitis obliterans Syndrom, BOS) darstellen (26). Fast 50 % aller Lungentransplantatempfänger entwickeln ein BOS innerhalb von fünf Jahren nach der Transplantation, nach zehn Jahren sind etwa 76 % der Empfänger davon betroffen (27). Diese oft therapieresistente, fortschreitende Atemwegserkrankung geht mit dem Funktionsverlust des Spenderorgans aufgrund einer fibroproliferativen Obstruktion der Bronchiolen einher und führt in 30 % der Fälle zum Tode oder macht eine Retransplantation notwendig (28). Vor diesem Hintergrund wird deutlich, wie wichtig es ist, wiederholte akute Abstoßungsepisoden zu verhindern, bzw. die Inzidenz der chronischen Abstoßung zu reduzieren (29).
2.2 Transplantationsimmunologie 2.2.1 Das Immunsystem
Der Organismus muss sich permanent gegen eine Vielzahl möglicher Krankheitserreger zur Wehr setzen. Damit das Immunsystem diese Aufgabe effektiv erfüllen kann, ist es von großer Bedeutung, dass es in der Lage dazu ist Selbst- von Fremdantigen zu unterscheiden (30). Auf dieser Grundlage agieren und interagieren eine Vielzahl von verschiedenen Zellen, die durch unterschiedliche Mechanismen dafür sorgen, dass körpereigene Strukturen geschützt, und als fremd erkannte Strukturen eliminiert werden (30).
In der Literatur wird zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem unterschieden. Zum angeborenen Immunsystem gehören Makrophagen, Monozyten, Granulozyten und natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Zellen dieses Systems können unspezifisch, beispielsweise durch Lipopolysaccharidrezeptoren, welche an die Zellmembran gram-negativer Bakterien binden, Fremdantigen erkennen (19). Es ist das System, welches am schnellsten (innerhalb von Minuten) nach Kontakt mit einem Antigen reagieren kann und stellt damit, nach Überwindung der Haut beziehungsweise Schleimhaut, die erste Barriere für potentielle Krankheitserreger dar. Monozyten, Makrophagen und neutrophile Granulozyten können durch Phagozytose Pathogene intrazellulär abtöten, oder sie degranulieren, wobei Enzyme wie Perforin freigesetzt werden, welche durch Zerstörung der Zellmembran eine extrazelluläre Abtötung herbeiführen (19). Außerdem sind sie dazu in der Lage chemische Mediatoren wie Zytokine und Chemokine zu sezernieren. Diese rufen dann weitere
Immunzellen und Plasmaproteine zum Infektionsherd (19). NK-Zellen töten grundsätzlich alle Zellen, die Eigenschaften von Fremdantigen aufweisen. Reguliert bzw. inhibiert werden sie dabei durch Rezeptoren, die an Major Histocompatibility Complex (Haupt Histokompatibilitätskomplex, MHC) -Klasse-I Moleküle auf dieser Zelle binden. Wird dieser Komplex als körpereigen erkannt, wird die Zelle nicht abgetötet (31). Fehlt dieser Rezeptor oder ist er verändert, führen die NK-Zellen nach dem sogenannten ‚missing-self‘- Prinzip den Zelltod herbei (32).
Das adaptive Immunsystem unterscheidet sich im Wesentlichen durch die spezifische Antigenerkennung vom angeborenen Immunsystem. Die zelluläre Komponente dieses Systems stellen die Lymphozyten und die dentritischen Zellen (DC) dar. Sowohl B- als auch T-Lymphozyten entstehen aus lymphoiden Vorläuferzellen im Knochenmark (19). Während die Vorläuferzellen der B-Lymphozyten jedoch im Knochenmark verbleiben und sich dort zu unreifen B-Zellen weiterentwickeln, wandern die T-Vorläuferzellen in den Thymus aus und entwickeln sich dort weiter. Knochenmark und Thymus werden als primäre oder zentrale lymphatische Organe bezeichnet (19). Nach ihrer Reifung gelangen naïve Lymphozyten beider Arten in den Blutkreislauf und siedeln sich in den sogenannten sekundären beziehungsweise peripheren lymphatischen Organen wie den Lymphknoten, der Milz und den mukosalen lymphatischen Geweben an, wo sie bis zu ihrer Aktivierung ausharren (19).
Immunzellen besitzen auf ihrer Oberfläche Marker, anhand derer sich ihre Funktion und ihr Entwicklungszustand erkennen lässt (30). Diese sogenannten Cluster of Differentiation (CD)- Moleküle stellen ein phänotypisches Unterscheidungskriterium dar und können dazu benutzt werden die Zelltypen zu charakterisieren (33). CD3 ist ein Leitmarker für T-Zellen, der an der Signaltransduktion ins Innere der T-Zelle beteiligt ist (34). Zusammen mit dem CD3-Molekül bildet der T-Zell-Rezeptor (TCR) den T-Zell-Rezeptor-Komplex (19). Der membranständige TCR ist in seiner hochvariablen Struktur den Immunglobulinen der Antikörper ähnlich und ist wie diese antigenspezifisch. Er erkennt an MHC-Moleküle gebundene Peptide auf Antigenpräsentierenden Zellen (APC) (34). CD4+ T-Zellen tragen am TCR einen Co- Rezeptor, das CD4-Molekül, welches spezifisch für MHC Klasse II-Moleküle ist. CD4+ T- Zellen werden ihrer Funktion nach in T-Suppressor- und T-Helferzellen (Th) unterteilt, letztere leisten einen wichtigen Beitrag bei der Aktivierung der B-Zellen und erhöhen die Effektivität von Makrophagen. CD8+ T-Zellen erkennen hingegen Peptide, welche an MHC I-
Moleküle gebunden sind und werden als zytotoxische T-Zellen bezeichnet, da sie bei erfolgreicher Fremd-Antigenerkennung die Apoptose der antigentragenden Zelle herbeiführen können (19). Als wichtigstes Bindeglied zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem nehmen die DC, welche wie Makrophagen und B-Zellen zu den APC zählen, Pathogene auf und wandern aus dem Gewebe in die sekundären lymphatischen Organe. Dort präsentieren sie den Lymphozyten auf ihrer Zelloberfläche, gebunden an MHC II-Moleküle, Peptidfragmente des Pathogens (35). Außerdem exprimieren gereifte DC kostimulierende Moleküle, welche notwendig sind, um die naïven T-Lymphozyten, welche die Antigenfragmente erkennen, zu aktivieren. Vor allem CD4+ T-Zellen beginnen daraufhin zu proliferieren und sich zu ihrer endgültigen, funktionsfähigen Form auszudifferenzieren. Sie können dann, wenn sie auf B-Lymphozyten treffen, die zuvor ein Antigen aufgenommen und prozessiert haben, welches sie nun an ihrer Oberfläche präsentieren, diese mit Hilfe ihrer eigenen kostimulierenden Moleküle aktivieren (19). Das wiederum führt zur klonalen Expansion dieser B-Zellen. Sie differenzieren sich zu Plasmazellen aus, welche antigenspezifische Antikörper sezernieren. Insgesamt dauert es etwa sechs Tage vom ersten Antigenkontakt bis zum Erreichen der aktivierten Lymphozyten im Zielgewebe (19). Nach Beseitigung des Antigens sterben schließlich die meisten durch klonale Expansion entstandenen Lymphozyten ab. Es bleibt jedoch eine gewisse Anzahl von aktivierten antigenspezifischen B- und T-Zellen erhalten, welche als Gedächtniszellen bezeichnet werden und die dafür sorgen, dass bei erneuten Kontakt mit demselben Antigen eine Reaktion schneller und wirksamer erfolgt (19).
2.2.2 Abstoßung von Transplantaten
Dieses hoch komplexe System, welches dazu in der Lage ist, den Körper vor vielen Krankheiten zu schützen, verhindert wiederum auch, dass Transplantate genetisch verschiedener Individuen einfach in den Organismus integriert werden können, da diese als körperfremd erkannt werden. Auto- und syngene Transplantationen hingegen führen zu einer Organakzeptanz (36). Interaktionen zwischen dem Empfänger und seinem Spenderorgan sind vor allem auf eine genetische Differenz von zellulären Oberflächenantigenen (MHC- Molekülen) zurückzuführen und somit entscheidend vom Verwandtschaftsgrad abhängig (37).
Die MHC-Moleküle werden von 3 verschiedenen Genloci kodiert. Die vom MHC I-Lokus
kodierten und ebenso genannten MHC I-Moleküle befinden sich auf allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten jedoch nicht auf Erythrozyten (13). Der MHC II-Lokus kodiert die MHC II-Moleküle, die nur auf bestimmten Zellen des Immunsystems existieren. Hierzu gehören B- Zellen, Monozyten und Makrophagen, dendritische Zellen, Thymusepithelzellen und T-Zellen nach ihrer Aktivierung, aber auch Endothelzellen (13). Im MHC III-Lokus schließlich sind
‚minor histocompatibility complex‘-Antigene kodiert. Für das Auslösen einer Immunantwort sind jedoch hauptsächlich die MHC I-und II-Moleküle von Bedeutung. Sahara et al.
beschrieben 2006, dass besonders der MHC I-Lokus für die Vermittlung einer Transplantatabstoßung verantwortlich sei (38). Die beiden Haupt Histokompatibilätskomplexe I und II transportieren Peptidfragmente aus dem Zellinneren an die Oberfläche, um sie dort den T-Zellen zu präsentieren, wobei die Herkunft der Peptidfragmente in MHC I-und II-Molekülen unterschiedlich ist. MHC I präsentiert im Zytosol produzierte Peptidfragmente von intrazellulären Pathogenen wie z.B. Virusproteinen, die vordergründig von CD8+ zytotoxischen T-Zellen erkannt werden, welche in der Folge die infizierte Zelle direkt abtöten. MHC II präsentiert Peptide von phagozytiertem Fremd- Antigen, folglich befinden sich diese MHC/Peptid-Komplexe auf phagozytosefähigen Zellen wie Makrophagen, DC und B-Zellen und werden in erster Linie von CD4+ T-Zellen gebunden (19). T-Lymphozyten binden sich mittels ihrer TCR spezifisch an die MHC/Peptid- Komplexe. Bei der ersten Begegnung mit einem Antigen benötigen sie neben der Rezeptorbindung für ihre Aktivierung eine Kostimulation über ihr Oberflächenmolekül CD28. Die Liganden für dieses Molekül (CD80 und CD86, auch als B7.1 bzw. B7.2 bezeichnet) befinden sich ausschließlich auf professionellen APC wie DC und spielen beim Auslösen der adaptiven Immunantwort eine essentielle Rolle, da naïve Lymphozyten ohne Kostimulation inaktiviert werden (19). Es kommt dann entweder zur klonalen Deletion oder zur Anergie, was bedeutet, dass es auf das präsentierte Antigen auch in Zukunft keine Reaktion mehr geben wird. Hierdurch inaktiviert das Immunsystem in die Peripherie gelangte autoreaktive T-Zellen und sichert die Toleranz gegenüber körpereigenem Gewebe (19). Bei voller Funktion des Immunsystems wird aber folglich gegen die als fremd erkannten Oberflächenantigene auf den Zellen des Spenderorgans eine Abwehrreaktion nach oben genanntem Mechanismus initiiert. Man spricht dann korrekterweise von der Host-versus- Graft-Disease (HvGD), welche im Weiteren als Abstoßung bezeichnet wird (19). Analog
dazu kommt es in seltenen Fällen, bevorzugt nach Kochenmarktransplantationen, welchen eine hohe myeloablative Konditionierung vorangegangen ist, zu einer Reaktivität der übertragenen Spenderzellen gegenüber dem Gewebe des Empfängers. Dabei werden durch APC des Empfängers die Spender-T-Zellen aktiviert, man spricht hier von der Graft-versus- Host-Disease (GvHD) (39).
Abstoßungsreaktionen können nach verschiedenen Kriterien eingeteilt werden, wobei jedoch in vivo eine scharfe Trennung nicht immer möglich ist. Teilt man die Abstoßungen nach zeitlichen Kriterien ein, so kann man hyperakute, akute und chronische Abstoßungen unterscheiden. Ausgehend von der Pathogenese unterscheidet man humorale von zellvermittelten Abstoßungsreaktionen (19).
2.2.2.1 Die hyperakute Abstoßung
Bei der hyperakuten Abstoßung handelt es sich um eine vornehmlich humoral bedingte Reaktion. Binnen Minuten kommt es auf Grund präformierter Antikörper gegen MHC- oder Blutgruppenantigene des Spenders zu einer Komplementaktivierung und intravasalen Koagulation im Transplantat mit einer massiven hämorrhagischen Infarzierung (40). Diese präformierten Antikörper stellen das Hauptproblem bei der Abstoßung von Xenotransplantaten dar. Außer beim Mensch und beim Altweltaffen befindet sich auf den Endothelzellen aller Säugetiere eine Kohlenhydratkette Namens alpha Gal (Galactose alpha 1- 3galactose) (41). Bei der Verpflanzung von Schweinegewebe in den Menschen kommt es deshalb durch im Menschen natürlich vorkommende anti-alpha Gal Antikörper zu einer hyperakuten Abstoßungsreaktion (42).
2.2.2.2 Die akute Abstoßung
Bei der akuten Abstoßung erkennen alloreaktive T-Zellen durch antigenspezifische T-Zell- Rezeptoren das körperfremde Gewebe. Nach erfolgreicher Antigenerkennung und Kostimulation der T-Zellen kommt es zur Interleukin 2 (IL-2)-abhängigen Aktivierung (43).
Im naïven Zustand besteht der IL-2 Rezeptor aus einer β− und einer γ−Kette und bindet IL-2 mit geringer Affinität. Bei Aktivierung der T-Zelle wird zusätzlich eine α-Kette (CD25) exprimiert, wodurch der IL-2 Rezeptor eine sehr hohe Affinität erhält und die Bindung von IL-2 zur Differenzierung und klonalen Expansion der T-Zelle führt (19). Nach ihrer
Aktivierung können T-Zellen ohne Kostimulation agieren. Für die differentielle Erkennung von MHC-Molekülen sind zusätzlich auf zytotoxischen T-Zellen CD8 Moleküle und auf T- Helferzellen CD4-Moleküle von Bedeutung. Sie assoziieren sich während der Antigenerkennung mit dem T-Zell Rezeptor und binden sich zusätzlich an den MHC/Peptid/T-Zell Rezeptor Komplex (19). Zytotoxische T-Effektorzellen induzieren bei Erkennung des MHC I/Peptid-Komplexes den Tod der präsentierenden Zelle. Aktivierte T- Helferzellen verstärken durch Bindung an den MHC II/Peptid-Komplex die Aktivität von Makrophagen und B-Zellen. Die akute Abstoßung kann abhängig von ihrem Pathomechanismus in zwei weitere Untergruppen gegliedert werden, die direkte und die indirekte Abstoßung (19).
2.2.2.2.1 Die direkte Abstoßung
Bei der direkten Abstoßung erkennen T-Zellen des Empfängers direkt MHC/Peptid- Komplexe auf Antigenpräsentierenden Zellen des Spenders. Dies stellt nicht den physiologischen Weg der Antigenerkennung dar, da die T-Zell-Rezeptoren des Empfängers auf die Erkennung von Selbst-MHC beschränkt sind, und eigentlich nicht in der Lage sein sollten, Fremd-MHC-Moleküle zu erkennen (44). Eine Zeit lang war unklar, ob diese Reaktion möglicherweise durch eine Subpopulation von T-Zellen hervorgerufen wird, die sich der Positivselektion im Thymus entzogen hat. Inzwischen besteht weitestgehend Einigkeit darüber, dass reguläre T-Zellen, über den Mechanismus der Kreuzreaktivität, auch Fremd-MHC Moleküle binden können (44). Die Bindung einer T-Zelle ist von der räumlichen Struktur des gesamten MHC/Peptid-Komplexes abhängig. Aufgrund der Vielfalt des T-Zell- Rezeptorrepertoires, der hohen Zahl an verschiedenen Fremd-MHC/Peptid-Komplexen auf einem Transplantat und der relativ geringen Affinität des T-Zellrezeptors zu seinem MHC/Peptid-Liganden wird davon ausgegangen, dass alle T-Zellrezeptoren eine gewisse Kreuzreaktivität besitzen (44). T-Zellen können sowohl Allo-MHC Moleküle unabhängig von dem gebundenen Peptid erkennen (45), als auch das Peptid unabhängig vom präsentierenden MHC-Molekül (46). Auf die Aktivierung der T-Zellen folgt deren Differenzierung und Proliferation mit Aufnahme ihrer Effektorfunktionen.
2.2.2.2.2 Die indirekte Abstoßung
Die indirekte Abstoßung erfolgt über die physiologischen Mechanismen der Ausbildung einer Immunreaktion gegen Fremdantigene. Hierbei werden Alloantigene von APC des Empfängers phagozytiert, prozessiert und im Lymphknoten den T-Zellen präsentiert (46). Bei erfolgreicher Antigenerkennung proliferieren diese und differenzieren sich zu Effektor-T- Zellen aus. Beide Formen, die direkte wie auch die indirekte Abstoßung, beziehen über Zell- Zell-Interaktionen und über Sekretion von Zytokinen immer auch andere Arten von Immunzellen in die Reaktion mit ein (47). Auch läuft in vivo nicht entweder eine direkte oder eine indirekte Abstoßung ab, sondern stets beide parallel zueinander, wenn auch zu unterschiedlichen Anteilen. Betrachtet man die akute Abstoßung und das chronische Transplantatversagen, so scheinen die direkte und die indirekte Alloantigenerkennung unterschiedlichen Anteil an deren Entstehung und Ausmaß zu haben (47).
2.2.2.3 Die chronische Abstoßung
Die chronische Abstoßung ist multifaktoriell bedingt. An ihr sind neben alloreaktiven T- Zellen und Antikörper-sezernierenden aktivierten B-Lymphozyten auch Makrophagen- vermittelte Entzündungs- und Umbauprozesse beteiligt. Wiederholte akute Abstoßungsreaktionen erhöhen das Risiko eine chronische Transplantatabstoßung zu entwickeln. Außerdem spielen Pilz- Bakterien- oder Virusinfektionen und die dadurch bedingte Reaktivierung des Immunsystems eine Rolle (48). Da hier neben der Abstoßung im immunologischen Sinne auch andere Faktoren an der progredienten Schädigung des Transplantates beteiligt sind, wird der Prozess in letzter Zeit auch als chronisches Transplantatversagen bezeichnet. Klinisch manifestiert sich dieser Prozess als sogenanntes Bronchiolitis obliterans Syndrom und stellt die Hauptursache für das Verfehlen des Langzeitüberlebens der transplantierten Lunge dar (28). Beim BOS handelt es sich um eine fortschreitende Funktionseinschränkung, die Monate bis Jahre nach der Transplantation auftritt und schließlich zum Funktionsverlust des Transplantats führt. Unter den potentiellen Risikofaktoren für die chronische Transplantatdysfunktion scheinen akute Abstoßungsreaktionen eine herausragende Rolle zu spielen (49). Klinisch wird dies vor allem durch die enge Korrelation zwischen der Anzahl akuter Abstoßungsepisoden und dem Risiko einer chronischen Abstoßung belegt (50). Dieses Risiko bleibt auch nach erfolgreicher
Therapie der akuten Abstoßung bestehen (51). Das BOS ist kaum medikamentös beeinflussbar, so dass als einzig effektive Therapie eine Retransplantation in Frage kommt (24).
2.3 Immunsuppressive Medikamente
Die heute verfügbaren immunsuppressiven Medikamente sind in den meisten Fällen in der Lage, akute Abstoßungsreaktionen zu kontrollieren (4). In Kombination werden heutzutage üblicherweise folgende drei verschieden wirkende Immunsuppressiva benutzt:
Kortikosteroide, Zellproliferationshemmer und Calcineurininhibitoren (3,19). Kortikosteroide sind hochwirksame, entzündungshemmende Mittel, welche das Immunsystem unspezifisch hemmen. Zu ihnen zählt Prednisolon, ein synthetisches Analogon zu Kortisol. Es entfaltet seine Wirkung hauptsächlich über intrazelluläre Rezeptoren der Steroidrezeptorsuperfamilie, die in fast jeder Körperzelle vorkommen. Im Zellkern bindet es entweder an spezifische DNA-Sequenzen oder tritt mit Transkriptionsfaktoren wie NFκB (nuclear factor 'kappa-light- chain-enhancer' of activated B-cells) in Wechselwirkung (19). So regulieren Kortikosteroide die Expression vieler Gene, sie vermindern beispielsweise die Leukozytenmigration aus den Blutgefäßen indem sie die Expression der entsprechenden Adhäsionsmoleküle verhindern.
Außerdem induzieren sie Apoptose bei Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten und supprimieren die Produktion entzündlicher Proteine (19). Um die Dosis und die damit einhergehenden typischen Nebenwirkungen der Kortikosteroide gering zu halten, werden sie in Kombination mit weiteren Immunsuppressiva aus anderen Substanzklassen eingesetzt. Zu ihnen gehören Zellproliferationshemmer wie Mycophenolat oder Azathioprin. Diese interferieren mit der DNA-Synthese und zeigen somit ihre stärkste Wirkung in sich teilenden Zellen (19). Der Einsatz als Immunsuppressivum basiert auf ihrer Toxizität für sich teilende Lymphozyten, es beeinflusst aber unspezifisch die Entwicklung und das Wachstum verschiedener Zellen des Immunsystems. Darüber hinaus gibt es inzwischen Medikamente, welche spezifisch die Signalwege der T-Zellen hemmen und so etwas weniger toxisch für den Rest des Organismus sind. Zu ihnen gehören Calcineurininhibitoren wie z.B. Cyclosporin A und Tacrolimus (19). Das Calciumabhängige Enzym Calcineurin ist an der Signalweiterleitung vom TCR zum Zellkern beteiligt, die Hemmung seiner Phosphataseaktivität stört die T-Zell-Proliferation durch die Verminderung der Expression
mehrerer Zytokin-Gene, die normalerweise bei der T-Zell-Aktivierung induziert werden (19).
Dazu zählt auch das Gen für IL-2, dessen Synthese durch T-Lymphozyten ein wichtiges Wachstumssignal für T-Zellen darstellt. Zwar sind T-Zellen gegenüber diesen Medikamenten besonders empfindlich, dennoch kommen die Zielmoleküle auch auf anderen Körperzellen vor, welche so in ihrer Funktion negativ beeinflusst werden. So wirken Cyclosporin A und Tacrolimus unter anderem nephrotoxisch (19). Infolge der chronischen Immunsuppression entwickeln viele Patienten opportunistische Infektionen oder maligne Tumoren, die nicht selten zum Tode führen (2).
2.3.1 Immunsuppressive Induktionstherapie mit Antikörpern
Eine weitere Möglichkeit regulierend in das Immunsystem einzugreifen, stellen Antikörper dar. Sie finden Anwendung als sogenannte Induktionstherapie zum Zeitpunkt der Transplantation und als Rescuetherapie bei rezidivierenden akuten Abstoßungen (52). Ob diese Art der Therapie mit den derzeit verfügbaren Präparaten allerdings tatsächlich zu einer Verbesserung hinsichtlich des Transplantatüberlebens führt ist noch nicht endgültig bewiesen (53).
2.3.1.1 Polyklonale und monoklonale Antikörper
Polyklonale Antikörper wie Anti-Lymphozytenglobuline (ALG) und Anti- Thymozytenglobuline (ATG) werden aus dem Serum von Pferden oder Kaninchen gewonnen, die zuvor mit menschlichen Lymphozyten bzw. Thymozyten immunisiert wurden. Sie stellen somit ein Gemisch aus Antikörpern dar, die gegen eine zufällige Vielzahl von Epitopen auf Lymphozyten (ALG) bzw. Thymozyten (ATG) gerichtet sind. Da sowohl Pferde- als auch Kaninchenimmunglobuline für Menschen ein starkes Antigen darstellen, kann es infolge der Therapie aber auch zur Immunkomplexbildung mit konsekutiver Serumkrankheit kommen (19,54). Im Gegensatz zu polyklonalen Antikörpern richten sich monoklonale Antikörper gegen genau ein Epitop und sind damit sehr gezielt einsetzbar. Um eine Produktion von tatsächlich ausschließlich homogenen Antikörpern zu gewährleisten wurde ein Verfahren entwickelt, welches 1975 erstmalig von Georges Köhler und Cesar Milstein beschrieben wurde (55). Sie fusionierten dabei gegen ein bestimmtes Antigen immunisierte B-Zellen der Milz einer Maus mit einer Myelomzelle. Myelomzellen sind entartete Plasmazellen, welche
die Eigenschaft haben Antikörper zu produzieren. Aus den dabei entstandenen, sogenannten Hybridomzellen werden diejenigen Zellen herausselektiert, welche den Antikörper in der gewünschten Spezifität produzieren, und anschließend kloniert, sodass jedes dieser Hybridome den Klon einer einzigen B-Zelle darstellt und nur Antikörper mit derselben Struktur und demselben Isotyp produziert. 1984 erhielten Köhler und Milstein für die Erfindung dieses Verfahrens den Nobelpreis (55,56). Bis heute können allerdings nur monoklonale Antikörper aus der Maus routinemäßig hergestellt werden. Versuche, dieses Verfahren auch auf menschliche Antikörper anzuwenden, verliefen noch wenig erfolgreich (19). Allerdings gibt es inzwischen diverse Verfahren, bei welchen durch den Austausch der konstanten Regionen der Antikörper, diese ‚humanisiert‘ werden können (57). Ein über Jahre in der klinischen Praxis verwendeter monoklonaler Antikörper ist OKT3, der spezifisch an die ε-Kette des CD3 Moleküls, das auf allen reifen T-Zellen exprimiert wird und für die Signaltransduktion des T-Zell-Rezeptors verantwortlich ist, bindet. OKT3 führt so zur raschen Eliminierung aller reifen CD3+ T-Zellen. Basiliximab und Daclizumab richten sich gegen die α-Kette des IL-2-Rezeptors CD25 und verhindern dadurch die Proliferation von aktivierten T- Zellen (52). Man unterscheidet depletierende Antikörper, welche in vivo die Zerstörung von Lymphozyten auslösen und maskierende Antikörper, welche zwar die Funktion der Zielproteine blockieren, sie dabei aber nicht zerstören (19). Mögliche Mechanismen für die Elimination von Lymphozyten durch depletierende Antikörper stellen die Komplement- vermittelte Lyse oder die zur Phagozytose führende Opsonierung dar (58).
2.4 Toleranzmechanismen
Als Toleranz bezeichnet man die Unfähigkeit des Immunsystems, auf ein Antigen zu reagieren. Die Selbsttoleranz gegenüber körpereigenem Antigen ist eine wichtige Eigenschaft des Immunsystems. Von der zentralen Toleranz, die während der Lymphozytenentwicklung in den zentralen Immunorganen entsteht, wird die periphere Toleranz unterschieden, welche schon reife Lymphozyten in peripheren Geweben entwickeln (19,59).
2.4.1 Zentrale Toleranz
T-Zellen, die an einer Transplantatabstoßung beteiligt sind, erkennen das Alloantigen über spezifische T-Zell-Rezeptoren. Diese bestehen aus zwei Transmembranproteinen, die zur
spezifischen Erkennung einer Vielzahl von Antigenen variable Regionen besitzen. Die Diversität dieser Rezeptoren ist genetisch festgelegt und entsteht während der T-Zell- Entwicklung durch somatische Rekombination verschiedener Gensegmente (19). T-Zellen erkennen das Antigen nur in Verbindung mit körpereigenen MHC Molekülen. Während der Thymusreifung durchlaufen die T-Zellen eine positive und negative Selektion. Durch die positive Selektion proliferieren nur Lymphozyten bei erfolgreicher Erkennung von körpereigenen MHC Molekülen, während durch die negative Selektion eine Entwicklung von autoreaktiven T-Zellen verhindert wird (19). Die zentrale Toleranz gegenüber körpereigenem Antigen entsteht durch negative Selektion im Thymus und beruht auf dem Prinzip, dass zu diesem Zeitpunkt der Entwicklung die unreifen T-Zellen der Apoptose zugeführt werden, sobald sie ein Eigen-Antigen hochaffin erkennen. Deshalb wird im Thymus eine große Auswahl an Selbstantigen präsentiert. Man geht davon aus, dass T-Zellen, deren TCR eine hohe Affinität und Avidität gegenüber dem dort präsentierten Autoantigen aufweist, deletiert werden (60,61), während T-Zellen mit geringerer Affinität/Avidität dieser Deletion entgehen und als potentielle Effektor-T-Zellen den Thymus verlassen (62,63). Affinität beschreibt hierbei die Stärke der Antigen-Rezeptor-Wechselwirkung und Avidität stellt das Produkt aus Affinität und der Anzahl der vorhandenen Rezeptoren dar. Im Laufe ihrer Entwicklung überleben nur etwa 2 % der T-Zell-Vorläufer aus dem Knochenmark diese Selektionsmechanismen und werden als reife CD4+ oder CD8+ T-Zellen in die Peripherie entlassen (19). Dieser Mechanismus bietet allerdings keine Erklärung für die Toleranz gegenüber Selbstantigenen beispielsweise aus Auge, Gehirn und Hoden, die nicht im Thymus präsentiert werden. Auch übertrifft die Anzahl möglicher Kombinationen fremder MHC- assoziierter Peptide die Anzahl potenzieller T-Zell-Rezeptor-Klontypen mindestens um den Faktor 1000 (64). Um also jedes eindringende Pathogen erkennen und effizient zerstören zu können, muss ein TCR eine relativ starke Kreuzreaktivität aufweisen. Mathematische Näherungen gehen davon aus, dass eine T-Zelle mit ihrem TCR bis zu 100 verschiedene MHC-gebundene Peptide erkennen kann (65). Es wird deshalb angenommen, dass das Immunsystem auch einen gewissen Anteil potentiell autoreaktiver T-Zellen positiv selektioniert, um das T-Zellrepertoire zu erweitern. Dieser Vorteil wird mit dem Risiko erkauft, dass gesunde Individuen in der Peripherie autoreaktive T-Zellen mit einem schwach- affinen Rezeptor gegen verschiedene Autoantigene besitzen (65-68). Als Konsequenz kann
die zentrale Toleranzentwicklung nur ein Teil der Mechanismen sein, welche Autoimmunreaktionen verhindern.
2.4.2 Periphere Toleranz
Viele Studien zeigen, dass die negative Selektion im Thymus keine vollständige Elimination aller autoreaktiven T-Zellen zur Folge hat (59). Die ergänzenden Mechanismen werden unter dem Begriff der peripheren Toleranz zusammengefasst, wobei weiterhin zwischen passiven und aktiven Mechanismen unterschieden wird (19,69).
2.4.2.1 Passive Toleranz-Mechanismen 2.4.2.1.1 Ignoranz und Anergie
Die theoretisch einfachste Form der peripheren Toleranz stellt die Ignoranz dar. Werden Autoantigene entweder an immunprivilegierten Stellen wie z.B. Placenta, Auge oder Hoden (70,71) oder in zu geringer Zahl präsentiert, so dass eine T-Zelle nicht ausreichend stimuliert wird, spricht man von Ignoranz (69). Einen weiteren Mechanismus, bei dem das Antigen zwar erkannt wird, aber keine Effektorfunktionen der T-Zellen induziert, stellt die sogenannte Anergie dar. T-Zellen erlangen einen anergen Zustand gegenüber bestimmten (Auto-) Antigenen durch eine funktionelle Inaktivierung. Dieser Inaktivierung liegt eine TCR- Stimulation zu Grunde, bei der das kostimulierende Signal fehlt (72,73). Heutzutage weiß man allerdings, dass neben der Kostimulation noch eine Vielzahl weiterer Faktoren über das Schicksal der T-Zellen entscheiden. So kann zum Beispiel die Bindung von IL-2 an den IL-2 Rezeptor und die dadurch ausgelöste Signalkaskade auch bei fehlender Kostimulation den Übertritt in den anergen Zustand verhindern (74).
2.4.2.1.2 Activation Induced Cell Death (AICD)
Ein besonders rigoroser Mechanismus der peripheren Toleranz ist die Eliminierung autoreaktiver T-Zellen in der Peripherie durch den so genannten Activation induced cell death (AICD). Zytotoxische T-Zellen zerstören ihre Zielzellen nach erfolgreicher Antigenerkennung über die Auslösung von Apoptose durch die gezielte Degranulation von Zytotoxinen (Perforine und Granzyme). Bei der Apoptose handelt es sich um einen aktiven Prozess der apoptotisch werdenden Zelle, bei der die Zelle zunächst ihren Zellkern aufspaltet und
anschließend durch die Absonderung von Vesikeln in sich zusammen schrumpft (75). T- Zellen können auch selbst von anderen T-Zellen durch diesen Mechanismus getötet werden.
Ein Schlüsselmechanismus des AICD ist die Bindung des Tumor Nekrose Faktor (TNF)- Rezeptors FasR (CD95) auf der T-Zelle mit seinem Liganden FasL (CD95L) auf zytotoxischen T-Zellen. Bei einer Fehlfunktion von FasR oder FasL kann es zu lymphoproliferativen Erkrankungen wie dem Lupus-ähnlichen Syndrom kommen, einer Autoimmunkrankheit, die mit einer Anhäufung von CD8-/CD4-, also unreifen T-Zellen einhergeht (76,77). Weitere Studien zeigen, dass das für die Proliferation von T-Zellen wichtige Zytokin IL-2 beim AICD eine entscheidende Rolle spielt (78). So konnte gezeigt werden, dass T-Zellen aus Mäusen, welche defizient für IL-2 oder den hochaffinen IL-2 Rezeptor sind, durchaus proliferieren können, jedoch keine Fas-vermittelte Apoptose zeigen (79). Infolge dieser Defekte entwickeln solche Mäuse schwere Autoimmunerkrankungen, welche zum Tod der Tiere führen (80).
2.4.2.2 Aktive Toleranz (regulatorische T-Zellen)
Bei den aktiven Toleranzmechanismen werden in die Peripherie entlassene autoreaktive T- Zellen durch sogenannte regulatorische T-Lymphozyten (Treg) kontrolliert (81-83). Diese Subpopulation von T-Zellen, welche in der Lage ist, neben B-Zellen und Antigenpräsentierenden Zellen, auch T-Zellen in ihrer Aktivierung zu supprimieren, wurde im Jahr 1970 zuerst von Gershon und Kondo beschrieben (84). Da diese Theorie damals aber nicht durch molekulare Marker gestützt werden konnte, wurde sie zunächst wieder fallen gelassen und die weitere Forschung an, seinerzeit noch sogenannten, suppressorischen T- Zellen eingestellt. Erst 1995 identifizierten Sakaguchi et al. CD25 als einen phänotypischen Marker für suppressive CD4+ T-Zellen in Mäusen (85). Sakaguchi konnte zeigen, dass das suppressive Potential in einem naïven Tier sich auf diejenigen CD4+ T-Zellen beschränken lässt, welche auch die α-Kette des IL-2-Rezeptors (CD25) auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Diese, nun als regulatorische T-Zellen (Treg) bezeichneten Suppressorzellen, stellen in einem naïven Tier ca. 5-10 % der peripheren CD4+ T-Zellen dar (86). Ihr suppressives Potential konnte in adoptiven T-Zell-Transfermodellen gezeigt werden. Hierbei wurden Autoimmunerkrankungen durch den Transfer von CD4+CD25- T-Zellen in T-Zell-defizienten Mäusen induziert, die alleine durch den Kotransfer von Tregs verhindert werden konnten
(85). Tregs sind nicht nur dazu in der Lage, die Aktivierung von noch naϊven T-Zellen zu unterdrücken, sie können auch schon aktivierte Effektor T-Zellen in ihrer Funktion inhibieren (87,88). Stefanie Thissen aus unserer Arbeitsgruppe konnte 2007 im Rahmen ihrer Dissertation zeigen, dass durch Zugabe von autologen porzinen CD25+ Lymphozyten in einer gemischten Lymphozytenkultur die Proliferation von Empfängerlymphozyten bis auf den Mediumblindwert gesenkt werden konnte (89). Im Gegensatz zu Mäusen besitzen im Menschen nur CD4+CD25high T-Zellen regulatorisches Potential (90). In Schweinen verhält es sich ähnlich wie im Menschen, allerdings wird hier einigen Zellen aus der CD4+CD25low Population ein unspezifisches immunmodulatorisches Potential zugeschrieben (91). Unter den CD4+CD25high Treg werden natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (nTreg) und induzierbare regulatorische T-Zellen (iTreg) unterschieden. Während nTregs sich im Thymus entwickeln und hauptsächlich gegen autoreaktive T-Zellen gerichtet sind, entstehen die iTregs unter bestimmten Bedingungen in der Peripherie aus naїven CD4+ T-Zellen. Ein Großteil dieser iTregs befindet sich im Darm, wo sie Immunreaktionen gegen Mikrobiota oder Nahrungsbestandteile regulieren und somit die intestinale Homöostase aufrecht erhalten (92).
2.4.2.2.1 Mechanismen der Suppression durch Tregs
In aktuellen Untersuchungen wird immer offensichtlicher, dass regulatorische T-Zellen über ein großes Repertoire verschiedener Wirkmechanismen verfügen. Bis heute ist allerdings noch unklar, wie Tregs für einen dieser Mechanismen spezifisch werden; ob sie verschiedene Mechanismen gleichzeitig anwenden und ob sie zwischen den Mechanismen wechseln können (93). Man geht aber davon aus, dass der Suppressionsmechanismus abhängig vom Zielgewebe, den involvierten Zelltypen, und dem Aktivierungsstatus sowohl der Zielzellen als auch der Tregs gewählt wird. Darüber hinaus muss noch geklärt werden, ob verschiedene Treg-Subtypen auf bestimmte Mechanismen spezialisiert sein könnten (93). Obwohl die molekularen Mechanismen, welche der T-Zell Suppression durch Tregs zugrunde liegen, noch unvollständig aufgeklärt sind, kann man grob direkte und indirekte Suppression unterscheiden. Bei der direkten Suppression inhibieren die Tregs die Zytokinproduktion und die Proliferation von Effektor T-Zellen über immunsupprimierende Zytokine wie TGF-β, IL- 10 oder IL-35 (94-96) oder über direkten Zellkontakt. Dabei wird beispielsweise cAMP über gap junctions, aus der Treg in die Effektorzelle übertragen, welches die Signaltransduktion
des aktivierten TCR behindert (97). Grossman et al. konnte zeigen, dass unter bestimmten Umständen aktivierte Tregs dazu in der Lage sind autologe Effektor-T-Zellen Perforin- abhängig über sezernierte Granzyme (Gzm) direkt abzutöten (98). Indirekt verhindern die Tregs die Stimulation der Effektorzellen durch APC, indem sie wiederum deren Aktivierungsstatus kontrollieren. So werden beispielsweise die zur Kostimulation nötigen Moleküle B7.1 und B7.2 (CD80 und CD86) auf den APC durch das sich auf Tregs befindliche koinhibitorische Molekül CTLA-4 besetzt. CTLA-4 ähnelt in seiner Struktur dem eigentlichen Liganden von B7.1 und B7.2, dem kostimulierenden Molekül CD28 auf den T- Effektorzellen. Dieses kann nun nicht mehr binden, womit es zu keiner Kostimulation und in der Folge zu keiner T-Zell-Aktivierung kommt (99,100). Allerdings lassen sich diese Mechanismen nicht klar voneinander trennen und ihre Untersuchung in vivo sowie in vitro führt zu unterschiedlichen, teils kontroversen Ergebnissen. In vitro zeigen die Tregs eine Zellkontakt-abhängige, jedoch weitgehend Zytokin-unabhängige Hemmung (101-103). Ein Zytokin, welches in der Treg/Effektor-T-Zell Interaktion eine wichtige Rolle spielt ist IL-2, das grundsätzlich das Überleben und die Proliferation von Effektor-T-Zellen fördert. Exogen vorliegend kann es, in vitro in einer Kokultur von Tregs und Responder-T-Zellen, den supprimierenden Effekt der Tregs aufheben. Man geht davon aus, dass der Verbrauch von IL- 2 durch die Tregs als Mechanismus genutzt wird, um diesen positiven Mehrwert auf die Effektorzellen zu reduzieren (90,104,105).
© modifiziert nach Schmidt et al. 2012
Abb. 2.1: ÜBERSICHT DER TREG-VERMITTELTEN MECHANISMEN ZUR SUPPRESSION VON T-EFFEKTORZELLEN. Die Abbildung stellt verschiedene Mechanismen zur Suppression durch Tregs dar, welche abhängig vom experimentellen Setup, Gewebetyp oder dem Aktivierungsstatus der zu supprimierenden Zellen zur Anwendung kommen. Konventionelle T-Zellen (Tcon) stellen hier die Effektor-T-Zellen dar. Tregs regulieren die Effektor-T-Zellen durch die Produktion von immunsupprimierenden Zytokinen (IL-10, TGF-β, IL-35) und durch den Verbrauch von exogenem IL-2. Außerdem induzieren sie den Tod der Effektorzellen duch Granzyme und Perforin. Darüber hinaus können sie die Effektor-T-Zellen indirekt durch die Antagonisierung von CD80 sowie CD86 auf APC wie DC durch CTLA-4 unterdrücken. Die durch cAMP regulierten endogenen Mechanismen in den Effektorzellen werden hier nicht näher beschrieben.
2.4.2.2.2 Immunologischer Phänotyp der regulatorischen T-Zelle
Bei den klassischen Tregs handelt es sich um CD4+CD8- T-Zellen, die das Oberflächenmolekül CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors) koexprimieren (85). Im Rahmen der T-Zellaktivierung steigt durch die Expression der α-Kette die Affinität des Rezeptors für IL-2 deutlich an (106,107). Daher wurde CD25 lange Zeit hauptsächlich als Marker für aktivierte
T-Zellen angesehen. Bei menschlichen Lymphozyten wird von den CD4+CD25low T-Zellen mit schwacher CD25 Expression zusätzlich eine CD4+CD25high T-Zellsubpopulation mit starker CD25 Expression und ausgeprägter Suppressorfunktion abgegrenzt (90). Da Kaser et al. 2008 zeigen konnte, dass es in vitro hauptsächlich porzine CD4+CD25low T-Zellen sind, welche das supprimierende Zytokin IL-10 produzieren (91), wird angenommen, dass diese Zellsubpopulation in Schweinen eine unspezifische immunmodulatorische Funktion besitzt.
Obwohl CD25 immer noch ein sehr guter Marker für CD4+CD25+ Tregs ist, bleibt eines der größten Probleme bei der Erforschung dieser Zellen die genaue Identifizierung durch Moleküle, welche exklusiv auf ihrer Zelloberfläche exprimiert werden. Zwar wurden neben CD25 verschiedene Oberflächenmoleküle, wie GITR (108,109) oder CTLA-4 (110) mit CD4+CD25+ Tregs assoziiert, jedoch findet man diese Moleküle auch auf verschiedenen Aktivierungs-, Differenzierungs- und Entwicklungsstadien von CD4+ Effektor-T-Zellen (111). Der Transkriptionsfaktor Forkhead-box p3 (Foxp3) wird, verglichen mit anderen CD4+ T-Zellen, vor allem von CD4+CD25+ Tregs exprimiert (112-114). Mäuse, welche eine natürlich auftretende Mutation im Foxp3-Gen tragen (Scurfy-Maus), entwickeln schwere Autoimmunerkrankungen, die sogar verheerender verlaufen als nach Depletion von CD4+CD25+ Tregs in naiven Mäusen (115). Zudem konnte gezeigt werden, dass in der Peripherie induzierte Foxp3+ Zellen wiederum noch naïve T-Zellen zu Foxp3+ Zellen umwandeln (113,116). Somit scheint Foxp3 ein wichtiger molekularer Schalter für die Entwicklung und Funktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen zu sein.
2.5 Die Bedeutung von Tregs für die Transplantattoleranz
Für die Toleranzentwicklung in der Transplantationsmedizin scheinen sowohl natürlich vorkommende als auch induzierte Tregs eine Bedeutung zu haben (117,118). Obwohl inzwischen bekannt ist, dass die nTregs in ihrer Aufgabe Autoimmunität und chronische Entzündungen zu verhindern durch die iTregs unterstützt werden, ist nicht bekannt wie hoch der relative Beitrag dieser beiden Subpopulationen zur Transplantationstoleranz ist. Schuld daran ist der Mangel an bis heute bekannten, verlässlichen Markern zur Unterscheidung dieser Zellsubpopulationen (119). Das vermehrte Vorkommen von Foxp3+ Tregs im peripheren Blut von Leber- oder Nierentransplantierten Menschen, die gegenüber ihrem Transplantat tolerant geworden sind zeigt die Bedeutung der Tregs für die Induktion und
